专利名称：丙戊酸钠在制备治疗视网膜疾病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及丙戊酸钠在制备治疗视网膜疾病的药物中的应用。
背景技术：
在许多视网膜疾病(如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑病变等)中，视网膜光 感受器细胞的丢失可导致不可逆的视力丧失。对于此类疾病，人们尝试了很多方法来 阻止视网膜光感受器细胞的丢失、修复视网膜细胞变性，包括营养支持治疗、基因治 疗、视网膜细胞的移植等。然而这些方法都未能取得确切的临床疗效。
其中，视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是一组以光感受器细胞—— 视锥和视杆细胞变性、色素上皮功能进行性受损为特征的遗传性视网膜病变，是眼 科十分常见的致盲性疾病。目前世界范围内发病率约为1/4000，全世界有超过一百 万人罹患本病(Haim H. Epidemiology of retinitis pigmentosa in Denmark [J]. 2002(233):1-34; Hartong D T， Berson E L， Dryja T P. Retinitis pigmentosa[J] Lancet, 2006, 368(9549) :1795-1809)。引起RP的原因目前尚不清楚， 一般认为与 基因缺陷有关，目前已经发现至少45种基因的突变与本病有关，这些基因大部分都 表达于视杆细胞(Hartong DT， Berson E L， Dryja T P. Retinitis pigmentosa[J] Lancet, 2006， 368 (9549) :1795-1809)，基因缺陷使视杆细胞发生营养障碍，最终引 起凋亡。目前临床上对RP尚无有效的治疗方法。
VPA是一种临床常用的广谱抗惊厥药，主要用于癲痫、双向性精神障碍的治疗。 VPA是否能够通过抑制光感受器细胞凋亡发挥视神经保护作用尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供丙戊酸钠在制备治疗视网膜疾病药物中的应用。 本发明提供的丙戊酸钠在制备治疗视网膜疾病药物中的应用，具体是丙戊酸钠
在制备治疗视网膜色素变性疾病的药物中的应用，特别是丙戊酸钠在制备保护视网
膜光感受器细胞的药物中的应用。
本发明还提供一种治疗视网膜色素变性药物，其活性成分为丙戊酸钠。 丙戊酸钠应用于人视网膜疾病中，可采用口服给药、静脉注射等方法给药，可
制成普通片剂、肠衣片、缓释片、糖浆、喷淋胶囊、针剂和凝胶药膏等多种剂型。 本发明以视网膜色素变性小鼠作为视网膜疾病模型，通过观察在视网膜变性小鼠(Retinal Degeneration Mouse, rd小鼠)视网膜色素变性过程中研究VPA对光感受 器细胞的保护作用，即丙戊酸钠(Valproate Sodium, VPA)是否对光感受细胞具有保护 作用。实验结果显示:(l)rd小鼠出生后7天注射VPA组光感受器细胞数和外核层厚 度与不注射VPA (注射相同体积的生理盐水)的对照组相比并无统计学差异，出生 后14天、21天、28天，VPA组光感受器细胞和外核层厚度多于对照组，两者具有 统计学差异(P<0.05) ; (2)两组光感受器细胞均于出生后7天开始出现凋亡，在出 生后7天、14天VPA组外核层凋亡数少于对照组，两者具有统计学差异。
上述实验表明，丙戊酸钠具有对抗视网膜色素变性小鼠光感受器细胞凋亡的作 用，能延缓光感受器细胞的进行性退变，可作为活性成分制备治疗视网膜疾病药物， 特别是制备保护光感受器细胞的药物，并可达到很好的效果。
图1为TUNEL实验中对照组出生14天小鼠外核层TUNEL阳性细胞照片 图2为TUNEL实验中VPA组出生14天小鼠外核层TUNEL阳性细胞照片
具体实施例方式
下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规方法。
下述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、丙戊酸钠对视网膜色素变性小鼠光感受器细胞的保护作用验证 一、材料与方法
1、 研究对象及分组
实验动物选用视网膜变性小鼠(Retinal Degeneration Mouse, rd小鼠；购自 美国Charles River Laboratories)，由北京大学第一医院实验动物中心配种饲养， 循环光照(光照12小时，黑暗12小时)。选用rd新生小鼠48只，随机分为8组， 其中4组为VPA组，4组为对照组，每组6只，雌雄不限。
2、 给药方式
从rd小鼠出生到28天每日称体重，并每日根据体重注射药物。其中VPA组 VPA (Sigma公司产品，丙戊酸钠(Valproate Sodium， VPA))用生理盐水稀释成10g/L
(1%)，每lmL溶液含生药O. Olg，按小鼠每lOg体重O. lraL腹腔注射给药，每日 给药1次，相当于生药100mg/kg'd;对照组单位体重给予与VPA组相同体积的生 理盐水(0.9%氯化钠)腹腔注射，每日一次。
3、 取材及切片制作采用过量麻醉的方法在出生后7、 14、 21、 28天分别处死一组实验组和一组对 照组小鼠，摘除眼球，OCT (购自日本Sakura公司)包埋，迅速放入冰冻切片机冷 冻，经视网膜后极部及锯齿缘制成7pm和l(^m厚冰冻切片。其中7nm的切片用于 HE染色，10pm的切片用于脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 (Terminal Deoxy加cleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick-end Labeling, TUNEL法)检测凋亡细胞数，并对凋亡细胞数目进行统计分析。
4、 视网膜形态学观察
将上述获得的7nm的切片放入新鲜配制的多聚甲醛溶液中20min，磷酸盐缓冲 液(PBS)清洗5minx3次，室温干燥。每个标本选不连续的3张7pm的切片进行苏 木苏-伊红(HE)染色将切片在蒸馏水中浸泡5min;酸性苏木苏浸泡5min，染细 胞核；流水冲洗；1%盐酸乙醇分色305; 1%氨水乙醇返蓝；蒸馏水浸泡2min;入1% 伊红染液，染色90s;流水冲洗，梯度酒精脱水lOmin， 二甲苯透明15niin，中性树 胶封片，光镜下观察。
5、 TUNEL法检测视网膜凋亡细胞
将上述获得的1(^m的使用Roche公司原位凋亡检测试剂盒进行检测。每个标 本取不连续的3张10pm切片，固定后室温下PBS浸泡5minx3次；将切片置于新鲜 配制的0. l%TritonX-100的0. 1%枸橼酸钠溶液中，冰上破膜2min;室温下PBS浸洗 5minx3次；加入50pL TUNEL反应混合物(购于Roche公司)，覆上Paraf ilm膜， 37i:孵育lh，室温下PBS浸洗5minx3次，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下 观察。
6、 形态计量学分析
光镜下观察HE染色切片的视网膜形态学特征，将距视乳头200,处作为起始测 量区，每个测量区宽30nin，利用计算机图像分析软件测量后极部视网膜外核层厚度 和外核层细胞数目。同样的方法在荧光显微镜下选取100,的测量区，对区域内的 外核层TUNEL阳性细胞数进行计数。
7、 统计学分析
采用SPSS13. 0软件包对实验数据进行统计学处理，应用独立样本t检验对组间 差异性进行检验。 二、结果
1、 VPA对rd小鼠视网膜外核层厚度和光感受器细胞数的影响 光镜下对照组rd小鼠视网膜经HE染色显示，在7天时视网膜分化成内核层和 外核层，视网膜发育较为成熟；随着时间的延长，外核层厚度逐渐变薄14天时可见外核层厚度明显小于7天时的厚度，21天与14天相比更薄，到了28天已经减至 不连续单层。VPA组与对照组在7天时外核层厚度并无显著差异，其后的时间点， 外核层厚度变化趋势与对照组相似，14天、21天、28天时外核层厚度减小，但其 厚度明显大于对照组，两组厚度具有统计学差异。外核层的光感受器细胞数也随着 时间的延长逐渐减少，VPA存活细胞数在14天、21天、28天都比同时间点的对照 组多，说明VPA对光感受器细胞是具有保护作用的。具体结果见表1和表2。
表l不同鼠龄视网膜外核层厚度(x士力
组另IJP7P14P21P28
对照组60.49±3.9835.96±6.5312.03±3.813.49±1.15
实验组61. 86±3.9549.11士3.82"18.66±6.26**7,28±2.43**
注与对照组比较，*表示尸<0.05， 表示PO.Ol
表2不同鼠龄视网膜外核层光感受器细胞数(x±s )
组另IJP7P14P21P28
对照组86,11±5.3640.95±127.50±1.863.94±1.16
VPA组85.39±4.7365,78±11.79**15.33±3.82 **10.11士2.78"
注与对照组比较，*表示尸<0.05， 表示户O.Ol
2、 VPA对rd小鼠视网膜外核层细胞的抗凋亡作用
TUNEL结果显示，阳性细胞均存在于视网膜外核层，在7天、14天rd小鼠外核
层凋亡细胞数均明显少于对照组。说明VPA对rd小鼠视网膜外核层细胞的凋亡有明
显抑制作用。具体结果见图l、图2、表3。由图1可看出对照组出生14天小鼠外
核层中见多个TUNEL阳性细胞；图2可见VPA组小鼠出生后14天外核层内可见数个
TUNEL阳性细胞，阳性细胞数量远小于对照组。
表3不同鼠龄外核层TUNEL阳性细胞数目(x士"
组另ljP7P14P21P28
对照组1.67±0.9714,72±2.492.17±0.791.22±1.0
实验组0**6,94士1.2广3.11±0.9*1.67±0.97
注与对照组比较，*表示P〈0.05; **表示P<0.01
三、讨论
视网膜疾病是常见的眼科疾病，包括老年黄斑变性、视网膜色素变性、视网膜 血管阻塞等，多种视网膜疾病发展过程中都存在着神经细胞的死亡。本实验以视网膜色素变性为模型，观察丙戊酸钠对视网膜疾病的保护作用。
1857年Dander首次报道了视网膜色素变性， 一百多年来科学家对视网膜色素 变性进行了广泛、深入的研究。在对人类RP患者进行病因、病理、遗传等研究的同 时，还发现了一些与人类视网膜色素变性基因突变位点相似的天然动物模型。rd小 鼠就是其中之一，它是1951年Bruchner在一个野生鼠群中发现的一种视网膜变性 鼠，是一种由于视网膜中环磷酸鸟苷(cGMP)磷酸二酯酶(3亚单位 (phosphodiesterase p subunit， PDE6B)等位基因突变(Pde6brd-Zrd-)导致常染 色体隐性遗传视网膜色素变性(autosomal recessive retinitis pigmentosa, ARRP) 的动物模型(Bowes C， Li T> Danciger M， et al. Retinal degeneration in the rd mouse is caused by a defect in the beta subunit of rod cGMP-phosphodiesterase [J]. Nature, 1990, 347(6294) :677-680)，小鼠视网膜内 cGMP磷酸二酯酶失活，cGMP无法有效水解，视杆细胞外节cGMP水平异常增高，cGMP 离子门控通道持续开放，使得Na+、 Ca2+内流增加，并最终导致光感受器细胞的凋亡。 人类RP患者也存在PDE6B基因突变，因此rd小鼠成为了研究视网膜色素变性的经 典动物模型，可以模拟人类视网膜色素变性的病情进展，为人类视网膜色素变性提 供突变的候选基因，分析基因突变的病理变化、细胞生物学过程；同时还可以检验 新的药物、治疗方法的有效性和安全性，并有助于推进人体实验的进行。对rd小鼠 的研究在视网膜色素变性的病因学、遗传学、病理学和治疗学等方面都具有很强的 理论意义和实用价值。
丙戊酸钠是一种短链分支脂肪酸，作为情绪稳定剂已经使用了近40年，是目前 常用的抗癫痫药物，可以用于各种癫痫的治疗，还可以治疗偏头痛、慢性神经性头 痛，且副作用较小。在临床应用过程中，发现长期服用丙戊酸钠的患者在停药后作 用不会立即消失。VPA的治疗机制可能与信号传导途径和基因水平改变。国内外许 多实验室致力于研究VPA等情绪稳定剂的祌经保护作用，并对其作用机制进行了深 入探索。
本研究中对照组rd小鼠在出生后的第7天可见内核层、外核层分化出来；其后 厚度不断变薄，到了28天外核层减至不连续单层。丙戊酸钠组外核层自第7天开始 分化形成，厚度与对照组相比并无显著差异，-14天、21天、28天时丙戊酸钠组外 核层厚度明显多于对照组，具有显著性差异。在同一时间丙戊酸钠组存活的光感受 器细胞数量更多，也就是有更多的细胞能够行使功能。细胞凋亡时间后延，说明丙 戊酸钠对视网膜外核层光感受器细胞的具有一定的保护作用。
尽管遗传性视网膜色素变性存在高度的遗传和临床异质性，但其最终的病理结局是视网膜光感受器细胞凋亡，本实验应用目前广泛使用的TUNEL法检测光感受器 细胞的凋亡，对照组rd小鼠在各个时间点都可以见到T丽EL阳性的凋亡细胞，可见 RP过程中，光感受器细胞是持续凋亡的。14天时对照组外核层出现了很多凋亡的光 感受器细胞，而在21、 28天凋亡细胞数明显减少，这可能与凋亡过度导致外核层细 胞总数减少有关。VPA组在出生7天时没有观察到凋亡细胞，从14天开始观察到凋 亡，但凋亡细胞明显少于对照组，说明VPA对出生早期的rd小鼠光感受器细胞是具 有保护作用的。
VPA对光感受器细胞保护作用还不能完全阻止细胞的凋亡，这可能与神经系统 发育成熟过程中周围环境发生变化、巨噬细胞吞噬等非凋亡途径的细胞丢失有关。
综上所述，VPA已经广泛应用于临床治疗其他疾病，并具有很好的安全性。VPA 可以部分抑制rd小鼠光感受器细胞的凋亡，使病程进展的速度减慢。虽然单纯使用 不能完全阻止RP的进展，但对于保护神经细胞、改善生活质量还是具有非常重要的 意义的。
权利要求
1、丙戊酸钠在制备治疗视网膜疾病的药物中的应用。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述视网膜疾病为视网膜色素变 性疾病。
3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述治疗视网膜疾病为保护视网 膜光感受器细胞。
4、 一种治疗视网膜疾病的药物，其活性成分为丙戊酸钠。
全文摘要
本发明公开了丙戊酸钠在制备治疗视网膜疾病药物中的应用。所述治疗视网膜疾病可为保护视网膜光感受器细胞。实验证明，将丙戊酸钠应用于在视网膜疾病中的一种——视网膜色素变性的动物模型中，具有对抗光感受器细胞凋亡的作用，能延缓光感受器细胞的进行性退变，可作为活性成分制备视网膜疾病神经保护药物，特别是制备保护光感受器细胞的药物，并可达到很好的效果。
文档编号A61P9/10GK101584686SQ20091008789
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者柳 杨 申请人:北京大学第一医院