三七提取物在制备预防及治疗帕金森病药物中的应用的制作方法

专利名称：三七提取物在制备预防及治疗帕金森病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切地说是三七提取物三七三醇组皂苷的医药用途。
背景技术：
硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一种普遍存在于原核生物和真核生物中 的小分子蛋白质，它与NAPDH和硫氧还蛋白还原酶组成细胞内主要的氧化还原系 统。根据表达部位的不同，硫氧还蛋白分为3类Trx-1、 Trx-2和spTrx。到目 前为止，人类疾病中有关Trx的研究大都集中在Trx-l。 TRX-1是生物体所必须的 基因，如果选择性地敲除小鼠的Trx-l基因，小鼠则早期胚胎致死，不能存活 (Matsui M., 0shima M., Oshima H. ， Takaku K. ， Maruyama T. ， Yodoi J". ， and Taketo M. M. Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse thioredoxin gene. "ey. 178: 179-185)。 Trx-1是细胞
内一种有效的抗氧化剂，能保护细胞、减轻氧化应激所致的损伤。Trx-l能抑制 p38 MAPK和凋亡信号调节激酶1相关的凋亡信号传导途径，增强细胞的抗凋亡能 力(SaitoM. ， Nishitoh， H. ， Fujii， M., Takeda， K. ， Tobiume， K. ， Sawada， Y.， Kawabata, M., Miyazono, K., and Ichijyo， H. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1. ^M。, 7卯《 17: 2596-2606; Hashimoto S" Matsumoto K. ， Gon Y. ， Furuichi S.， Maruoka S. ， Takeshita I. ， Hirota K., Yodoi J. ， and Horie T. Thioredoxin negatively regulates p38 MAP kinase activation and IL_6 production by tumor necrosis factor-alpha. A'oc/ e瓜SiopArs. 6b鹏w". 258: 443-447.)。同时，
硫氧还蛋白在神经生长因子调节的信号传导和神经突起生长中起着重要作用，是神经生长因子的一个重要候补要素(Bai J. ， NakamuraH. ， Kwon Y. W. ， Hattori L , Yamaguchi Y., Kim Y. C., Kondo N. ， Oka S., Ueda S. ， Masutani H. ， and Yodoi J. Critical roles of thioredoxin in nerve growth factor—mediated signal transduction and neurite outgrowth in PC12 cells. 7! 7Vfei/msc力，似 23: 503-509.)。与对照组小鼠相比，硫氧还蛋白高表达小鼠的寿命增加了 30% (Mitsui A，Hamuro J，Nakamura H,Kondo N，Hirabayashi Y， Ishizaki-Koizumi S， Hirakawa T, Inoue T， Yodoi J". Overexpression of human thioredoxin in transgenic mice controls oxidative stress and life span. Antioxid Redox Signal. 2002， (4) :693-6.)。随着研究的深入，硫氧还蛋白在 祌经退行性疾病中的作用越来越受到人们的重视，并成为神经保护药物的重要靶 占。
帕金森病是常见于中老年人的神经系统退行性疾病，其患病率和发病率随年 龄的增长而增加。帕金森病的主要病理表现是大脑内多巴胺能神经元的变性和坏 死(FahnS， Parkinsonism. In: J. B. Wyngaarden and L H. Smith, Jr. ， Editors. Cecil， s Textbook of Medicine, Saunders, Philadelphia, PA， 1998.2143-2147)。目前有关帕金森病发病机制的学说很多，自由基学说被人们广 泛认可。该学说认为随着年龄的增加，中枢神经系统的抗氧化能力下降，脑组 织细胞代谢产生过多的活性氧自由基，从而导致多巴胺能神经元的变性和减少， 并最终弓I起多巴胺分泌的减少及纹状体内多巴胺水平的降低(Przedborski S， Jackson-Lewis V， Experimental developments in movement disorders: update on proposed free radical mechanisms. Curr 0pin Neurol， 1998, 11 (4) : 335-9)。 迄今为止，临床上还没有一种药物可以减缓、阻止甚至逆转帕金森病中神经元的 退行性变性过程。硫氧还蛋白在帕金森病的防治中起重要的作用。研究表明硫 氧还蛋白的高表达、外源性硫氧还蛋白的给予或硫氧还蛋白诱导物能有效地保护细胞免受帕金森毒性药物1-甲基-4-苯基-1, 2， 3, 6四氢基吡啶(1-methyl-4-phenyl-l， 2， 3， 6-tetrahydropyridine， MPTP)或1-甲基_4-苯基吡啶离子
(1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)的作用(Bai J， NakamuraH， Hattori I，Tanito M，Yodoi J. Thioredoxin suppresses l-methy1-4-phenylpyridinium -induced neurotoxicity in rat PC12 cells. Neurosci Lett. 2002 ; 321(1-2): 81—4; Bai丄NakamuraH, Kwon YW， Tanito M， Ueda S， Tanaka T， Hattori I， Ban S， Momoi T， Kitao Y， Ogawa S， Yodoi J. Does thioredoxin-l prevent mitochondria— and endoplasmic reticulum—mediated neurotoxicity of l-methyl-4-phenyl-1，2，3, 6-tetrahydropyridine7 Antioxid Redox Signal. 2007 May; 9(5) :603-8.)。因此，许多研究人员都开始致力于寻找疗效高、副作 用小，能诱导硫氧还蛋白表达增加的药物用于防治及治疗帕金森病，其中中药治 疗获得了广泛地关注。
三七，又名田七、人参三七，是五加科人参属植物Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen的根茎，是我国特产的珍贵药材，主要产于云南、广西等地。三七总 皂苷是三七的主要活性成分，药理作用广泛，如具有抗疲劳、提高耐缺氧能力、 降血糖、活血化瘀、提高机体免疫功能、清除自由基、抗炎、抗氧化等药理作用。 近年来对三七的进一步研究表明三七总皂苷中的有效成分是三七三醇组皂苷
(Protopanaxatriol-type saponins from panax notoginseng ， PTS)。三七三 醇组皂苷是以三七三醇型皂苷Rgl为主的从三七中分离提取出的有效部分。到目 前为止，有关三七三醇组皂苷的医药用途主要集中在心血管疾病的活血化淤(抗 血栓)及提高氧分压上，而对其具有诱导细胞内硫氧还蛋白表达增加的作用，以 及在防治及治疗帕金,病上的应用却未见报道。

发明内容
本发明旨在寻找硫氧还蛋白诱导物以用于帕金森病的防治及治疗。三七是药用价值极高的传统名贵药材，使用历史已有600多年。从而提示我 们对来源于三七的成分三七三醇组皂苷是否能诱导硫氧还蛋白表达的增加进行探
索，以拓宽三七的药用领域。结果表明三七三醇组皂苷在SH-SY5Y细胞和PC12
细胞中能诱导硫氧还蛋白表达的增加(图l，图2);注射三七三醇组皂苷的昆明
种小白鼠，在其大脑皮层和海马区的神经细胞中，硫氧还蛋白的表达都出现显著
地增加(图3，图4);三七三醇组皂苷预处理的PC12细胞能抵抗帕金森毒害物 MPP+的作用(图5，图6)。这说明三七三醇组皂苷能诱导硫氧还蛋白表达的增加， 可用于帕金森病的防治及治疗。
由于三七三醇组皂苷诱导硫氧还蛋白表达的增加及其在防治及治疗帕金森病 中的应用是发明人的首次发现，因此，无论是三七三醇组皂苷单独使用为活性成 分制成的药剂，还是利用三七三醇组皂苷的抗帕金森病活性与其他活性成分配合 使用制成的药剂，均在本专利的保护范围之内。
本发明通过下列^施方式证明了三七三醇组皂苷能诱导硫氧还蛋白表达的增 加并能用于帕金森病的防治及治疗，但不仅限于这些实施例子。


图1是三七三醇组皂苷(PTS)对PC12细胞中Trx含量的影响。 图2是三七三醇组皂苷(PTS)对SH-SY5Y细胞中Trx含量的影响。 图3是三七三醇组皂苷(PTS)对小鼠大脑皮层神经元中Trx含量的影响。 图4是三七三醇组皂苷(PTS)对小鼠大脑海马区神经元中Trx含量的影响。 图5是三七三醇组皂苷(PTS)对MPP+诱导PC12细胞增殖降低的拮抗作用。 图6是三七三醇组皂苷(PTS)对MPP+诱导PC12细胞活性降低的拮抗作用。
具体实施例方式
下面描述本发明的具体实施方式
，但是本发明的内容完成不局限于此。 1.动物及细胞昆明种小白鼠雄性，6 8周周龄。购自昆明医学院，所有小白鼠安静 环境伺养，自由饮水进食。
PC12细胞大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，购自中国科学院昆明动物所。 SH-SY5Y细胞人神经母细胞瘤细胞，购自中国科学院昆明动物所。
2. 药品及主要试剂
三七三醇组皂苷，由昆明制药集团股份有限公司提供；l-甲基-4-苯基吡啶 (l-methy1-4-phenylpyridinium ion， MPP+)，购自Sigma公司；-抗Anti-mouse Trx和Anti-human Trx，由日本京都大学淀井溶司教授提供；Protein Marker, 购自Fermentas公司；RPMI Medium 1640禾口 Minimum Essential Medium,购自 Invitrogen corporation;蛋白质定量试剂盒(BCA法)，购自Beyotime公司； Chemiluminesent substrate,购自生物晶美公司；PVDF膜，购自Millipore公 司；TRISBase，购自N0V0N公司;Acrylamide，购自Solarbio公司；十二烷基硫 酸纳，购自xiamen sanland chemicals company limited;琼月旨糖、考马斯亮蓝 R—250、 Aprotimin、 PMSF禾B NP-40，均购自Sanland-chem International InC; TEMED，购自HUALVYUAN BIOTECHNOLOGY; X射线胶片，购自中国乐凯胶片集团公 司5 二抗affinity purified antibody peroxidase labled goat anti-mouse lgG(H+U HSA liquid conjugate和affinity purified antibody peroxidase labled goat anti-rabbit lgG(H+U HSA liquid conjugate,购白美国Kirkegaard & laboratories。四噻唑蓝(MTT)、乳酸脱氢酶检测试剂盒，购自美国Promega 公司。
3. 主要实验仪器
BHC-1300II A/B3生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司生产；TDL-40B 台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；TS—1脱色摇床，金纭市杰瑞尔电器有 限公司生产；电子分析天枰，北京塞多利斯仪器系统有限公司生产；旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；BYY-6C双稳定时电泳仪，北京六一仪器
有限公司生产；TS100生物倒置相差显微镜，日本NIKON公司生产；DYCP-31D水 平电泳槽，北京六一仪器有限公司生产；C02培养箱，美国NBS公司生产；酶标 仪，美国MD公司生产；J-25离心机，美国贝克曼公司生产；BG-transBLOT转移 芯，北京百晶生物技术有限公司生产；XJX-IIX射线摄影暗匣，上海跃进医用光 学器械厂生产。
实施例l:三七三醇组皂苷诱导细胞内硫氧还蛋白表达的增加
(一) 细胞株培养和三七三醇组皂苷刺激处理
PC12细胞和SH-SY5Y细胞用含10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和IOO u g/mL链 霉素的1640培养基，于37。C、 5 % C02和95。/。湿度下进行贴壁培养。每2-3天更换 培养基一次，细胞达约70% 80%融合时，传代或用于实验。
将细胞接种于平板中，培养过夜后，三七三醇组组皂苷处理细胞。分组处理 如下对照组不加药，实验组分别加250 Pg/ml， 500 Pg/ml， 1000 Pg/ml的三七三 醇组皂苷。上述处理后，置于37"C和5Q^ C02培养箱中培养24小时，然后收集 细胞，提取蛋白离心1000rpmX10 min收获细胞，分别加入80微升细胞裂解液 (150 mM NaCl， 0.5% NP-40， 10mM Tris-HC1， pH 7.2， 0. lmM PMSF， 2ug/ml aprotinin， 200ug/ml NaN3)，充分混悬后于冰浴下放置裂解40min (中间振荡2 3次)，4。C下15000 rpm离心15min，转上清至新离心管中，-8CrC保存。
(二) 三七三醇组皂苷给药和组织取材方法
雄性清洁级昆明种小白鼠8只，随机分成对照组和给药组(三七三醇组皂苷 100mg/kg)。对照组腹腔注射生理盐水，给药组腹腔注射上述剂量的药物， 一天一 次，连续7天，第8天将之猝死后取相应组织。
组织取材方法小鼠猝死后，用生理盐水进行灌流，然后分别取小鼠人脑皮 层脑组织和海马区脑组织，液氮冷冻后，-8(TC保存。
8蛋白提取:将各脑组织在冰浴下匀浆，并加入适量的细胞裂解液(150 mM NaCl， 0. 5% NP-40, lOraM Tris-HCl， pH 7. 2， 0. lmM PMSF， 2 Pg/ml aprotinin, 200 PgM NaN:,)，然后转移到离心管屮，冰浴下放置裂解30min (中间振荡2 3次)，4°C 下15000 rpm离心15min，转上清至新离心管中，-8(TC保存。
(三)免疫印迹
1. 蛋白含量的测定
用BCA试剂盒测定将10 W标准品或待测样本与200ulWR工作溶液混合， 37"C孵育30min，将反应管温度冷却至室温。测定562nm光密度值，绘制标准曲 线，并计算蛋白浓度。
2. 蛋白免疫印迹
总蛋白加样量为7Pg，与2XSDS凝胶加样缓冲液混合后，95。C热变性5min，用 15Q/o的SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白条带用电转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶4 。C封闭过夜；取出PVDF膜，用含O. 1% Tween-20的TPBS冲洗后，加入2000倍稀释的 一抗室温孵育75min;用含O. 1% Tween-20的TPBS冲洗，加入5000倍稀释的二抗室温 孵育75min;用含O. 1% Tween-20的TPBS冲洗，将PVDF膜浸入发光底物溶液中,反应 lmin， X射线胶片曝光。
实施例2:三七三醇组皂苷保护神经细胞免于帕金森毒性药物MPP+的作用
(一) 实验分组和处理
细胞的初始密度为5X104cell/well。根据不同实验要求，分为以下各组(1) 空白对照组在细胞培养体系中未加任何药物；(2) MPP+处理组在细胞培养体 系中只加入lmmol/LMPP+;(3)三七三醇组皂苷预处理组先加入三七三醇组皂苷 (500ug/ml)预处理4h后，再加入lmmol/L的MPP+。上述各组细胞继续培养24h 后，按不同实验要求处理细胞。各组设4个平行对照。
(二) 检测方法1. 四噻唑蓝(MTT)试验
取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 W，继续孵育4 小时后，每孔加入100 W 0.04N盐酸的异丙醇溶液，混匀吹打20 30次后，用 酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。
2. 乳酸脱氢酶(LDH)释放法 培养基和细胞内的乳酸脱氢酶含量用LDH检测试剂盒测定，测定过程根据其
说明书进行。
权利要求
1、一种三七提取物，其特征在于为三七三醇组皂苷，能诱导细胞内硫氧还蛋白表达增加。
2、 权利要求1的所述三七提取物，其特征在于所述的三七三醇组皂苷在制 备预防及治疗帕金森病药物中的应用。
3、 根据权利要求1所述的三七提取物，其特征是三七三醇组皂苷应用于与 氧化应激损伤有关的药品、医疗、保健食品等领域。
4、 根据权利要求1所述的三七提取物，其特征是三七三醇组皂苷单独使用 为活性成分制成的药剂或与其他活性成分配合使用制成的药剂在制备预防及治 疗帕金森病药物中的应用。
5、 根据权利要求1所述的三七提取物，其特征在于三七三醇组皂苷中人 参皂苷Rgl含量为49% 70%。
全文摘要
本发明为三七提取物在制备预防及治疗帕金森病药物中的应用。本发明涉及医药技术领域。本发明公开了三七三醇组皂苷具有诱导细胞内硫氧还蛋白表达增加的作用，提出了三七三醇组皂苷对1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP⁺)致帕金森病细胞模型具有保护作用。并可应用于与氧化应激损伤有关的药品、医疗、保健食品等领域。
文档编号A61K125/00GK101502547SQ20091009418
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者华 刘, 普俊学, 杨兆详, 王晟东, 洁 白, 罗富成 申请人:昆明理工大学