专利名称：甲型流感病毒Vero细胞适应株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甲型流感病毒Vero细胞适应株，还涉及以此适应株作为供体株与 流行株重配，获得流行株的Vero细胞适应株，以制备Vero细胞流感疫苗，属于生物技 术领域。
背景技术：
流感(influenza )是由流感病毒引起的一种急性呼吸道感染，具有高度传染性， 主要经空气飞沫传播，因此它能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行， 甚至世界大流行，发病率高并伴有一定的死亡率，是目前人类尚不能有效控制的世界性 传染病。
流感病毒属于正粘病毒科，根据病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)的抗原性，可 将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒常以流行形式出现，乙 型流感呈局部爆发，丙型流感主要是以散发形式出现。其中甲型和乙型流感病毒与人类 有密切联系，甲型流感病毒除感染人外还可感染飞禽、猪、马等动物，其亚型H5或H7 易引起高致病性禽流感(HPAI)。因此人在生活中与这些动物接触频繁的地方，为流感 病毒产生变异提供了良好的环境，变异后的病毒会导致流感流行，变异程度大则导致大 流行。
流感病毒表面抗原的变异是流感流行的主要原因，其表面抗原的变异存在两种机 制 一种被称为抗原漂移，包括甲型流感病毒和乙型流感病毒，主要是通过在HA和NA 基因上的点突变和多种氨基酸选择性突变，逃过机体的免疫作用和以前感染病毒后获得 的抗体对病毒的抑制作用。抗原的漂移可产生新的流行株，同时它也是流感病毒能感染 人类，并继续进化的武器；另一种变异被称为抗原大变异，仅发生在甲型流感病毒上， 当宿主细胞同时被两种不同亚型的甲型流感病毒感染时，新生的子代病毒可获得来自两 个亲代病毒的基因片断，成为基因重配病毒。基因重配能产生甲型流感病毒抗原性突变 株，如果该突变株能在未免疫接种的易感人群中传播就会引起流感在世界大流行。
在人群中广泛流行的甲型流感病毒有H1N1， H2N2和H3N2三个亚型。流感病毒A型 中的16种HA和9种NA组成的亚型广泛存在于一些野生动物如水鸟中。如果病毒没有经过遗传重配，禽流感亚型一般不对人产生有效的感染。但这种迅速扩散的病毒由于 经常性的基因再分化，从而可能使其感染人类，例如，自从1997年香港爆发禽流感以 来，H5N1型经过遗传修饰除了导致大规模的在禽类中爆发，而且产生了多例人感染的事 件。2003年发现了该病毒株的变异，出现了可以感染人的新变异株，可能引起新的流感 大流行，WHO预测自从1968年后一场新的流感大流行正在逼近。
接种流感疫苗是预防流感及其并发症的主要手段。1941年鸡胚制备的流感灭活疫苗 在美国首次获得批准，在全世界得到广泛应用。目前使用的流感疫苗主要是用鸡胚制备 的灭活的流感三联裂解疫苗，包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒毒株。 疫苗株的组分是由WHO根据每年全球流感病毒的变化规律推荐的用于下一年度疫苗生产 用流感病毒流行株的表面抗原來确定的。甲型流感病毒联合体实验室利用遗传重配技术 将鸡胚高产株与野生流行株进行重配，得到的含有流感病毒流行株的HA和NA表面糖蛋 白的新疫苗株，具有在鸡胚上高产的特性。但是，鸡胚作为培养基质生产流感疫苗需要 复杂的纯化过程，以降低人们对鸡胚蛋白产生的变态反应；而且流感病毒在鸡胚中传代 后病毒的血凝素抗原易产生变化使疫苗效力降低；另外鸡胚难于大规模生产以满足流感 大流行突发性需求；尤其是2003年以来全世界范围内高致病性禽流感的流行，使采用 鸡胚生产流感病毒疫苗风险性增加。研究出安全有效的疫苗已经成为流感疫苗重要研究 方向，尤其是要在应对流感大流行时不受鸡胚来源限制，世界卫生组织敦促世界各国研 究新的流感疫苗生产基质。
目前用于制备流感疫苗的哺乳动物细胞主要是MDCK细胞和Vero细胞，虽然MDCK 细胞是培养和分离流感病毒的较好的哺乳动物细胞系，但其存在潜在的致瘤性，使得其 应用于疫苗生产顾虑重重。非洲绿猴肾细胞(Vero)是世界卫生组织推荐的疫苗生产细 胞系，现在采用Vero细胞生产的疫苗已批准上市的有脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗、 乙型脑炎疫苗等。1998年开始,Kistnar等人在奥地利用Vero细胞研制纯化的流感全病 毒灭活疫苗，免疫BALB/c小鼠后激发产生了较高的血凝抑制抗体，T细胞免疫应答和 细胞因子的释放水平也高。但Vero细胞并不是流感病毒的敏感培养基质，产量较低且 多数病毒不能在Vero细胞上连续增殖，使得Vero细胞流感疫苗成本高，难于在市场上 使用。因此如何快速培育流感病毒Vero细胞高产适应株，成为了 Vero细胞流感疫苗研 发的难题。人类细胞系PER.C6能使流感病毒在其中有效的生长，是流感病毒培养的最 佳细胞之一，但它属于荷兰抗体和疫苗Crucell公司专利所有。
5反向遗传学，是相对于经典遗传学而言的，是在获得生物体基因组全部序列的基础 上，通过对耙基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等， 再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体， 研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响 等方面的内容。目前反向遗传学己应用于流感病毒跨种属传播机制研究，病毒毒力及其 致病性研究，疫苗研发等方向。疫苗研发的做法就是把鸡胚高产的实验室毒株A/PR/8/ 34 (H1N1)和当前流行毒株加以重配,获得流行株的鸡胚高产株，用以生产疫苗。相对 于传统流感疫苗研制方法耗时繁琐，并且要求足够的鸡胚供应，反向遗传学可以使疫苗 的研制周期縮短，工艺简化，因此反向遗传学是应对流感大流行的一个重要手段。
综上所述，流感仍是人类尚不能有效控制的世界性传染病，接种流感疫苗是预防流 感主要手段。目前使用鸡胚作为制备流感疫苗的基质，存在很多不足之处，如难以规模 化生产、工艺复杂、还有外源因子污染的可能等缺点。因此，使用传代细胞如Vero细 胞制备流感疫苗成为流感疫苗发展的重要方向，而如何快速培育流感病毒Vero细胞高 产适应株是Vero细胞流感疫苗和大流行流感疫苗研发的难题。
发明内容
本发明目的之一是克服现有技术的不足，提供一种甲型流感病毒Vero细胞高产适 应株，该毒株在Vero细胞上传代培养，血凝滴度可保持在1024以上。 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的
一种流感病毒Vero细胞适应株，命名为A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)，该毒株的保 藏号为CCTCCNO: V200514，保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏地址武汉市， 武汉大学；保藏日期2005年11月30号。
本发明目的之二是提供制备保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适 应株的方法。
本发明提供的保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株，是将采 集得到的数十种野生流感病毒毒株在Vero细胞上连续传代培养，培育25代之后得到的， 它具有H3亚型血凝素基因、N2亚型神经氨酸酶基因和具有在Vero细胞上高产性状的6 个内部基因片段。
本发明提供的保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株的基本特 征(a)透射电镜观察到所得的流感病毒直径约为80-120nm，具有囊膜的较为典型的流
6感病毒形态；(b)基因序列分析表明在连续传代培养过程中，不易产生流感病毒基因 变异；(c)流感病毒在Vero细胞上连续传代培养，血凝滴度可保持在1024以上；(d) HI实验表明病毒的HA抗原可被羊抗或其它动物抗H3亚型流感病毒高免血清特异性识 别；(e) A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)活病毒经自然途径感染SPF鸡后，感染鸡无发 病和死亡。
本发明所述保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株，经过下列 方法获得
A、 将临床样本中分离获得的野毒株接种到已长成致密单层的Vero细胞上，以 簡EM/F12或者MEM作为基础培养基，其中再添加TPCK-胰酶至浓度为0. 2-1. 5ug/ml、牛 血清白蛋白至浓度为0. l-2ug/ml，以NaHCO:,调节培养液pH值为7-8;于33士2。C培养 48-96h后，收获病毒液，完成第l次传代培养；
B、 将上述第1代收获的病毒液再次接种到Vero细胞上，按A步骤的方法培养后， 收获病毒液；如此连续传代至25代时，收获病毒液，即得保藏号为CCTCC NO: V200514 的流感病毒Vero细胞适应株。
本发明目的之三是提供流感病毒Vero细胞适应株在制备流行株的Vero细胞适应株 中的应用。
本发明目的之四是提供流感病毒Vero细胞适应株在制备流感疫苗中的应用。 本发明目的之五是提供一种制备流感病毒Vero细胞适应株的方法，以使用这一适
应株制备Vero细胞流感疫苗。即以保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞
适应株作为供体株，与流行株重配后，获得流行株的Ver。细胞适应株，最终使用这一
适应株制备Vero细胞流感疫苗或Vero细胞大流行流感疫苗。
本发明提供的保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株与流行株
用传统方法重配制备流感病毒Vero细胞适应株的方法，包括以下歩骤
1) 将保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株与流行的亚型流感 病毒按比例进行混合，具体比例由病毒血凝滴度和不同毒株生长特性而决定；
2) 将上述混合物接种于9 10日龄SPF鸡胚或者Vero细胞或者MDCK细胞上，其 中接种SPF鸡胚时，每胚接种O. l-0.3ml，于33土2。C孵育12-48h， 2-8'C过夜冷胚， 收集鸡胚尿囊液即为病毒收获液；接种Vero细胞时，每个小方瓶接种量为0. 05-0. 2ml， 置于33土2t:培养48-96h，收获病毒液；接种MDCK细胞时，每个小方瓶接种量为
70. 05-0. 2ml，置于33土2。C培养48-96h，收获病毒液；
3) 将2)收获的病毒液中加入抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)的抗血清至浓度为 1%-80%，具体浓度由抗体血凝抑制效价和病毒的血凝滴度而定，接种在Vero细胞上传 代培养1次；或者将2)收获的病毒液不加抗血清直接接种在Vero细胞上传代培养1 次；
4) 反复重复3)步骤，使细胞传代，并进行抗体筛选，选育出流行株的Vero细胞 适应株，以便使用这一适应株制备Vero细胞流感疫苗或Vero细胞大流行流感疫苗。
本发明提供的保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株与流行株 用反向遗传学技术重配制备流感病毒Vero细胞适应株的方法，包括以下歩骤
1) 将保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株的6个内部基因分 别克隆于双向转录载体中，分别获得6个内部基因的重组质粒；
2) 将流行株的2个表面蛋白基因同样克隆于双向转录载体中，分别获得2个表面 蛋白基因的重组质粒；
3) 将上述1)和2)的8个质粒混合，共转染在哺乳动物细胞293T或者COS或者 MDCK上，或者转染在MDCK与293T的混合细胞上、或者MDCK与COS的混合细胞上，培 养18-24h，取细胞培养物上清，即获得流行株的Vero细胞适应株，以便使用这一适应 株制备Vero细胞流感疫苗或Vero细胞大流行流感疫苗。
所述双向转录载体为流感病毒基因双向转录载体pHW2000。 本发明与现有技术相比具有下列优点和效果
(1) 采用本发明提供的保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株 后，较现有技术的以鸡胚作为培养基质生产流感疫苗具有以下优点①可以采用微载体 发酵罐大规模培养Vero细胞和流感病毒，生产工艺易于标准化；②采用标准化的Vero 细胞，不含外源生物因子污染；③不含易于引起人体过敏的鸡胚蛋白；④避免了流感病 毒在鸡胚培养后病毒的血凝素抗原易产生变化使疫苗效力降低；⑤在流感大流行突发性 时，不受鸡胚来源的影响，能够生产出足够的满足市场需求的疫苗。
(2) 目前所用的流感疫苗生产用毒种都是与鸡胚高产株重配或天然的鸡配适应株， 其一般在Vero细胞上不敏感。有的厂家直接将冊0提供的流感疫苗生产毒种接种到Vero 细胞上，但产毒量低或产量不稳定，制约了利用Vero细胞培养流感病毒、制备流感疫 苗的应用。我们将临床样本中分离获得的流感病毒，接种在Vero细胞上进行连续传代培养，培育出保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株，并将其作为 供体株与流行的流感病毒株重配后，获得Vero细胞疫苗生产用毒株，促进了Vero细胞 流感疫苗和Vero细胞大流行流感疫苗的开发与应用。
具体实施例方式
以下通过实施例来进一歩描述本发明方法，应该理解的是，这些实施例仅用于例证 的目的，决不限制本发明的范围。 实施例1
保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株的制备方法
1) 将临床样本中分离获得的流感病毒接种到己长成致密单层的Vero细胞上，以 DMEM/F12作为基础培养基，其中再添加TPCK-胰酶至浓度为lug/ml，牛血清白蛋白至浓 度为lug/ml，以NaHC03调节培养基pH值为7.5;于33±KC培养72h后，收获病毒液， 完成第1次传代培养；
2) 将第1次传代培养收获的病毒液再次接种到Vero细胞上，用与1)步骤相同的 方法及条件进行培养后，收获病毒液；如此在Vero细胞上连续传代，传代至25代时， 收获病毒液即得流感病毒Vero细胞适应株，命名为A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)，保藏 号为CCTCCNO: V200514，以此株作为供体株，与其它流行重配后获得流行株的Vero 细胞适应株，以用于Vero细胞流感疫苗和Vero细胞大流行流感疫苗的开发与应用。
实施例2
流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)在无血清Vero细胞上连续 传代培养保持稳定高产。
1) 将实施例1所得的流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)接种 到无血清培养的已长成致密单层的Vero细胞上，接种量为每小方瓶0.2ml，维持母液成 分为SFM (Hyclone) ， TPCK-胰酶0. 5ug/ml，牛血清白蛋白L5ug/ml，用NaHCO,调整 pH值至7.2，置于33土rC培养72h，收获病毒液，即完成第1代培养；
2) 将上述l)所得的第l代收获的病毒液再次接种到无血清培养的Vero细胞上， 采用与l)相同的方法及条件进行培养后，收获病毒液；如此在Vero细胞上连续种毒传 代，每代收获液反复冻融三次后测其血凝滴度，血凝滴度维持在1024以上，表明毒株 A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)具有Vero细胞高产稳定特性。
实施例3实施例1所得的流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)与 A/Caledonia/20/99 (H1N1)重配获得H1N1流感病毒Vero细胞适应株的方法
① 流感病毒重配
将Vero细胞非适应株A/Caledonia/20/99 (H1N1)与流感病毒Vero细胞适应株 A/Y腿an/l/2005Va (H3N2)按9 : 1体积比混合，接种9 10日龄SPF鸡胚，每胚接种 0.2ml， 33土2'C孵育24h， 2'C过夜冷胚，收集鸡胚尿囊液即为病毒收获液；
② 重配后流感病毒H1N1 Vero细胞适应株的选育
将①收获的病毒液与抗体血凝抑制效价为1 : 640的抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2) 的抗血清按2 : l的体积比混合，37。C中和2小时后，接种到Vero细胞上培养48h，收获病 毒液；再将收获的病毒液同比例加入相同抗血清混合，37。C中和2小时后，接种到Vero 细胞上培养48h，收获病毒液；再将收获的病毒液不加抗血清，在Vero细胞上再连续传 IO代，最终获得第12代细胞种毒收获液；
③ 血清学鉴定病毒型别
取第12代收获的病毒液，测其血凝滴度并配置成4个血凝单位抗原，用H3N2阳性 血清、H1N1阳性血清、B型阳性血清与病毒液以半加敏法进行血凝抑制试验(H I)，血 凝滴度512，经鉴定为H1N1流感病毒，以此株可用于Vero细胞流感疫苗的制备，或者 以此株再次作为供体株与其他流行株重配，从而获得流行株的Vero细胞适应株。 实施例4
实施例3所得的流感病毒Vero细胞适应株H1N1与A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) 重配获得H3N2流感病毒Vero细胞适应株的方法
① 流感病毒重配
将Vero细胞非适应株A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)与实施例3所得流感病毒Vero 细胞适应株H1N1按1 : 1体积比混合，接种已长成致密单层的MDCK细胞，每小方瓶接 种O. lml， 33土2'C培养72h，收获病毒液；
② 重配后流感病毒H3N2 Vero细胞适应株的选育
将①收获的病毒液接种到Vero细胞上，每小方瓶接种0.05ml病毒液，33'C培养72小 时，收获病毒液。再将收获的病毒液与抗体血凝抑制效价为l : 3200的抗H1N1的抗血清 按5:1的体积比混合，37。C中和2小时后，接种到Vero细胞上培养72h，收获病毒液；再 次将收获的病毒液同比例加入相同抗血清混合，37'C中和2小时后，接种到Vero细胞上
10培养72h，收获病毒液；再将收获的病毒液不加抗血清，在Vero细胞上再连续传5代，最 终获得第8代细胞种毒收获液；
③血清学鉴定病毒型别 取第8代收获的病毒液，测其血凝滴度并配置成4个血凝单位抗原，用H3N2阳性血 清、H1N1阳性血清、B型阳性血清与病毒液以半加敏法进行血凝抑制试验(H I)，血凝 滴度512，经鉴定为H3N2流感病毒，此株可用于Vero细胞流感疫苗的制备，或者以此 株再次作为供体株与其他流行株重配从而获得流行株的Vero细胞适应株。
实施例5
实施例1所得的流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)与流感病毒 H5N1重配获得H5N1流感病毒Vero细胞适应株的方法
① 流感病毒重配
将非流感病毒Vero细胞适应株H5N1与流感病毒Vero细胞适应株 A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)按1 : 1的体积比混合，接种到新鲜的Vero细胞上，接种 量为每小方瓶0. 15ml，维持母液成分为MEM， TPCK-胰酶L2ug/ml，牛血清白蛋白 1.7ug/ml ，用NaHC0:,调整pH值至7.4，置于33土2。C培养72h，收获病毒液；
② 重配后流感病毒H5N1 Vero细胞适应株的选育
将①收获的病毒液与抗体血凝抑制效价为1: 128的抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2) 的抗血清，按5 : 8的体积比混匀，37t:中和2小时后，接种到Vero细胞上，33。C培养 96h，收获病毒液，完成第l次传代培养；再将收获的病毒液不加抗血清，接种到Vero 细胞上34土rC培养96h，收获病毒液，如此在Vero细胞上连续传4代；再将第5次传 代培养收获的病毒液，于4 8。C 10000rpm离心分离20分钟，取上清；将所取上清按4 : 1的体积比与抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)的抗血清混匀，于37。C中和2小时，接种 到Vero细胞上，于33。C培养96h，收获病毒液，完成第6次传代培养；如此再依次按 20 : 1， 1 : 40， 1 : 80的体积比，与抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)的抗血清混匀，于 37。C中和2小时，接种到Vero细胞上，于33。C培养96h，传代培养至第9代，收获病 毒液；
③ 血清学鉴定病毒型别
取第9代收获的病毒液，测其血凝滴度并配置成4个血凝单位抗原，用H3N2阳性血 清、H1N1阳性血清、B型阳性血清与病毒液以半加敏法进行血凝抑制试验(H I)，病毒
11血凝滴度512，经鉴定为流感病毒H5N1，此重配毒株用于Vero细胞流感疫苗或Vero细 胞大流行流感疫苗的制备。 实施例6
实施例1所得的流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)，用反向遗 传学技术重配获得A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)流感病毒Vero细胞适应株的方法
1) 将实施例1所得的流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)的6
个内部基因克隆于双向转录载体raw20oo;
2) 将非流感病毒Vero细胞适应株A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)的2个表面蛋白
基因克隆于双向表达载体raw2ooo;
3 )将流感病毒A/Yunnan/l/2005Va ( H3N2 )的6个内部基因质粒与 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)的2个表面蛋白基因质粒共8个混合，质粒总2 n g，与 脂质体8ul混匀后，共转染生长18 24小时，于致密单层的COS细胞，培养24h，收获 培养物上清，测其血凝滴度为64，获得具有A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)的HA/NA的 流感病毒Vero细胞适应株，此株用于Vero细胞流感疫苗的制备及大流行流感疫苗的制 备。
权利要求
1、一种流感病毒Vero细胞适应株，命名为A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)，该毒株的微生物保藏号为CCTCC NOV200514。
2、 如权利要求1所述的流感病毒Vero细胞适应株，其特征在于它具有H3亚型血 凝素基因、N2亚型神经氨酸酶基因和具有在Vero细胞上高产性状的6个内部基因片段。
3、 一种制备如权利要求l所述的流感病毒Vero细胞适应株的方法，其特征在于经 过下列步骤A、 将临床样本中分离获得的野毒株接种到已长成致密单层的Vero细胞上，以 DMEM/F12或者MEM作为基础培养基，其中再添加TPCK-胰酶至浓度为0. 2-1. 5ug/ml、牛 血清白蛋白至浓度为0. l-2ug/ml，以NaHCO:,调节培养液pH值为7-8;于33±2"培养 48-96h后，收获病毒液，完成第l次传代培养；B、 将上述第l代收获的病毒液再次接种到Vero细胞上，按A步骤的方法培养后， 收获病毒液；如此连续传代至25代时，收获病毒液，即得保藏号为CCTCCNO: V200514 的流感病毒Vero细胞适应株。
4、 如权利要求1所述流感病毒Vero细胞适应株在制备流行株的Vero细胞适应株 中的应用。
5、 如权利要求1所述流感病毒Vero细胞适应株在制备流感疫苗中的应用。
6、 一种制备流行株的Vero细胞适应株的方法，其特征在于经过以下步骤1) 将保藏号为CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero细胞适应株与流行的亚型流感 病毒按比例进行混合，具体比例由病毒血凝滴度和不同毒株生长特性而决定；2) 将上述混合物接种于9 10闩龄SPF鸡胚或者Vero细胞或者MDCK细胞上，其 中接种SPF鸡胚时，每胚接种O. 1-0. 3ml，于33士2。C孵育12-48h， 2-8。C过夜冷胚， 收集鸡胚尿囊液即为病毒收获液；接种Vero细胞时，每个小方瓶接种量为0. 05-0. 2ml， 置于33土2'C培养48-96h，收获病毒液；接种MDCK细胞时，每个小方瓶接种量为 0. 05-0. 2ml，置于33士2。C培养48-96h，收获病毒液；3) 将2)收获的病毒液中加入抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)的抗血清至浓度为 1%-80%，具体浓度由抗体血凝抑制效价和病毒的血凝滴度而定，接种在Vero细胞上传 代培养1次；或者将2)收获的病毒液不加抗血清直接接种在Vero细胞上传代培养1 次；4)反复重复3)步骤，使细胞传代，并进行抗体筛选，选育出流行株的Vero细胞 适应株，以便使用这一适应株制备Vero细胞流感疫苗或Vero细胞大流行流感疫苗。
7、 一种制备流行株的Vero细胞适应株的方法，其特征在于经过以下歩骤1) 将保藏号为CCTCC N0: V200514的流感病毒Vero细胞适应株的6个内部基因分 别克隆于双向转录载体中，分别获得6个内部基因的重组质粒；2) 将流行株的2个表面蛋白基因同样克隆于双向转录载体中，分别获得2个表面 蛋白基因的重组质粒；3) 将上述l)和2)的8个质粒混合，共转染在哺乳动物细胞293T或者COS或者 MDCK上，或者转染在MDCK与293T的混合细胞上、或者MDCK与COS的混合细胞上，培 养18-24h，取细胞培养物上清，即获得流行株的Vero细胞适应株，以便使用这一适应 株制备Vero细胞流感疫苗或Vero细胞大流行流感疫苗。
8、 根据权利要求7所述的制备流行株的Vero细胞适应株的方法，其特征在于所述 双向转录载体为流感病毒基因双向转录载体pHW2000。
全文摘要
本发明公开了一种甲型流感病毒Vero细胞适应株及其应用，所述甲型流感病毒Vero细胞适应株命名为A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)，该毒株的保藏号为CCTCC NOV200514。该毒株含有H3亚型血凝素基因、N2亚型神经氨酸酶基因和具有在Vero细胞上高产性状流感病毒的6个内部基因。将该毒株在Vero细胞上连续传代培养，血凝滴度可保持在1024以上。该毒株可作为供体株与流行株遗传重配，或采用反向遗传学技术，将其6个内部基因与流行株2个表面蛋白基因进行基因重配，获得流行株的Vero细胞适应株，最终使用这一适应株制备Vero细胞流感疫苗或Vero细胞大流行流感疫苗。
文档编号A61K39/145GK101560503SQ20091009422
公开日2009年10月21日 申请日期2009年3月13日 优先权日2009年3月13日
发明者健 周, 姜述德, 孙明波, 廖国阳, 张英伟, 李卫东, 范东瀛 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所