专利名称：：含磁共振对比剂的脂质纳米粒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及负载磁共振对比剂的脂质纳米粒及其制备方法和在肠道磁共振成像中的应用。
背景技术：
：各种影像检査方法包括气钡双重造影、CT、MRI等在肠道病变的检査中均具有重要的作用。所涉及的各种阳性对比剂，如钡剂、含碘造对比及轧喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)等消化道均不易吸收或不能吸收。MRI与CT相比具有极高的软组织分辨率，且无辐射，因此近年来在肠道病变检査中备受关注。目前应用于临床最广泛的MR对比剂是Gd-DTPA。Gd-DTPA是阳性对比剂，消化道不吸收。其在消化道中的应用主要有两种方法。第一种方法是通过对比剂口服(MR小肠成像)或灌肠(MR大肠成像)方法充盈肠道，使肠管扩张，并增加管腔与肠壁粘膜面的对比而显示病变。第二种方法是对比剂静脉注射后，经血液循环至肠壁，增强正常肠壁，病变的强化程度由病变血液供应所决定的，通过病变与正常肠壁的强化差异来显示病变并能够了解病变血供情况。第一种方法对于小病灶检出率低，且对于粘膜起源的小病灶难以与肠内容物区分。第二种方法对于病变检出及病变定性优于第一种方法，然而静脉用药后属于全身分布，无组织器官靶向性及特异性，分布于细胞间隙而不能进入细胞内，在病变内的分布只与血供有关，对于病变也无靶向性及特异性。小肠及大肠均具有很强的吸收功能，很多药物均能通过肠道吸收而进入体内。因此，如果肠道不吸收的Gd-DTPA通过肠道易吸收的载体包裹，借助载体的吸收Gd-DTPA可以进入肠壁内并可在MR上增强肠壁，病变的强化程度由病3变对于载体吸收量所决定的，因此可以通过病变与正常肠壁的强化差异来显示病变并能够了解病变的吸收功能状况。此外，还可以在MR上观察药物吸收代谢过程。脂质纳米粒是指粒径在501OOOnm之间的固态胶体颗粒，它以固态天然或合成的类脂为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成固体胶粒给药系统，是20世纪90年代初发展起来的一种新型胶体给药系统。除具有纳米材料特性外，其最突出的优点是生理相容性好，可生物降解，口服生物利用度高，可控制药物释放及有良好的靶向性。固体粒子摄取及转运是其穿过细胞膜及细胞间隙进入肠壁细胞内及细胞间隙，然后通过淋巴途径及血液途径转运。吸收量大，进入肠壁内纳米颗粒以淋巴转运为主。脂质纳米粒应用广泛，可以包裹化疗药、基因、蛋白质及多肽等多类物质。目前有部分采用脂质体包裹Gd-DTPA的研究报道，主要应用于静脉注射，改变钆喷替酸葡甲胺在体内的分布，提高对耙组织的显像能力，但有关采用脂质纳米粒包裹显示Gd-DTPA，并将其应用于肠道吸收显影尚未见报道。由于钆喷替酸葡甲胺为一种易溶于水的药物，与脂质材料亲和力比较弱，采用常见的脂质纳米粒制备方法，如溶剂扩散法、乳化法、高压乳匀法等，难以将药物有效包封于纳米粒中，因此对制备方法和纳米粒的配方提出了比较高的要求。
发明内容本发明首先所要解决的技术问题是提供一种能被小肠及大肠吸收的含磁共振对比剂的脂质纳米粒。为此，本发明采用以下技术方案负载的药物为轧喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA),其脂质材料选用单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、三硬脂酸甘油酯中的一种或多种组合，负载钆喷替酸葡甲胺的质量为脂质纳米粒质量的4%~35%，余量为脂质材料。由于采用本发明的技术方案，本发明脂质纳米粒能够局部给药，不需要静脉及全身用药；可能实现肠道吸收功能的评价；纳米颗粒进入细胞内而实现细胞水平的显像；而且纳米粒以淋巴转运为主可以实现淋巴显像，有助于肠道病变的淋巴(包括肿瘤前哨淋巴结)靶向显示。本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种上述含磁共振对比剂的脂质纳米粒的制备方法。为此，本发明采用以下技术方案它采用以下步骤制备-(1)将司盘-80溶解于有机溶剂中，浓度为2%,制备乳液的有机相；将钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)与吐温-80溶解于蒸馏水，组成水相，Gd-DTPA的浓度为0.5~5%、吐温-80的浓度为1.8%，所述百分比为每100毫升中的溶质克数；(2)在搅拌条件下，将所述水相加入有机相形成油包水(W/0)微乳液；(3)称取脂质材料溶解于称取脂质材料溶解于与水互溶的有机溶剂中，将此溶液迅速倒入所述油包水(W/0)微乳液中，室温条件下继续搅拌，得脂质纳米粒分散体系；(4)脂质纳米粒分散体系经离心分离得到脂质纳米粒沉淀；(5)洗涤并沉淀步骤(4)分离得到的脂质纳米粒；(6)将脂质纳米粒用泊洛沙姆溶液分散，得到顺磁性标记的负载钆喷替酸葡甲胺的脂质纳米粒分散液。步骤(1)所选用的有机溶剂为与水不互溶且对步骤(3)所选用的有机溶剂的亲和力小于对水的亲和力，如正己烷、环己垸等。由于本发明采用微乳液中进行溶剂扩散的方法，有利于实现水溶性药物在脂质纳米粒中的包封，能够有效提高水溶性药物在脂质纳米粒中的包封率，采用本发明的方法，所制备得到的纳米粒径为50300nrn。进一步地，在纳米粒制备过程中通过加入具有两亲性的脂质材料卵磷脂，能够更进一步地提高水溶性药物在脂质纳米粒中的包封率。通过本发明所提供的方法，可以制备得到钆喷替酸葡甲胺负载量达到或接近质量百分比35.8%的脂质纳米粒。为此，用于制备的质量配比为钆喷替酸葡甲胺50%、卵磷脂5~7.5%、单硬脂酸甘油酯42.5~45%。本发明再一个所要解决的技术问题是提供含磁共振对比剂的脂质纳米粒在5肠道磁共振成像中的应用。它可采用口服小肠吸收所述含磁共振对比剂的脂质纳米粒应用于小肠MR检査，采用保留灌肠后大肠吸收所述含磁共振对比剂的脂质纳米粒应用于大肠MR检査。小肠MR成像方法是基于小肠通过口服吸收负载Gd-DTPA的脂质纳米粒以实现，大肠MR成像方法是基于大肠通过保留灌肠吸收负载Gd-DTPA的脂质纳米粒以实现。Gd-DTPA借助载体——脂质纳米粒的吸收进入肠壁内，通过正常肠壁与病变对于Gd-DTPA脂质纳米粒吸收差异以及肠壁中分布差异而造成正常肠壁与病变间强化程度差异，从而在MR上突出显示病变，并可以了解病变吸收功能状况。此外，还能够在MR上活体动态观测Gd-DTPA脂质纳米粒的吸收、分布及代谢过程，尤其是该纳米粒大部分通过淋巴通路代谢，从而可展示腹部淋巴结的状况，有助于肠道病变的淋巴(包括肿瘤前哨淋巴结)耙向显示。图1为实施例1中处方5制备的负载Gd-DTPA脂质纳米粒的电子显微镜照片，放大倍数为15000倍。图2A为Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)灌胃后30分钟T1WI的MR图像，图2B是Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)灌胃后2小时T1WI的MR图像，它们显示了负载Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)口服小肠MR成像方法的建立；图3A为Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)保留灌肠前T1WI的MR图像，图3B是Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)保留灌肠20分钟T1WI的MR图像，它们显示了负载Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)保留灌肠大肠MR成像方法的建立；图4A为Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)保留灌肠20分钟T1WI的MR横断位图像，图4B是Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)保留灌肠20分钟T1WI的MR矢状位图像，它们显示负载Gd-DTPA脂质纳米粒水剂(40mg/ml)保留灌肠大肠癌MR成像方法的建立；图5A为Gd-DTPA水剂(10mg/ml)保留灌肠前T1WI的MR图像，图5B是Gd-DTPA水剂(10mg/ml)保留灌肠20分钟T1WI的MR图像，它们显示了大肠壁灌药后T1WI的MRI上无明显强化，提示大肠壁对于Gd-DTPA水剂不吸收。具体实施例方式实施伊J13与负载Gd-DTPA脂质纳米粒的制备方法相关实施例1:负载Gd-DTPA脂质纳米粒的制备称取司盘-80200mg溶解于10mL正己烷中，组成乳液的有机相；另称取表1中记载的处方量的Gd-DTPA与18mg吐温-80，溶解于lmL蒸馏水中，组成水相。在400rpm搅拌条件下，将水相加入有机相中，形成油包水(W/0)微乳液；称取处方量的单硬脂酸甘油酯和卵磷脂混合物50mg溶解于lmL无水乙醇中，将此溶液迅速倒入llmL的W/0微乳液中，室温条件下继续搅拌5min,即得脂质纳米粒分散体系。分散体系经20000rpm高速离心，分离得到脂质纳米粒沉淀，用2mL正己烷洗涤脂质纳米粒沉淀2次，纳米粒沉淀用50ml0.1%泊洛沙姆溶液分散，得到包裹Gd-DTPA的脂质纳米粒分散液；在该分散液中加入适量甘露醇，溶解、冷冻干燥。表l:不同处方负载Gd-DTPA脂质纳米粒的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2:负载Gd-DTPA脂质纳米粒的理化性质考察(注意效果与权4比例的一致性)取上述制备的脂质纳米粒分散液适量，用0.1%泊洛沙姆溶液稀释20倍，用3000HS粒度及表面电位分析仪测定其粒径和表面电位。采用间接法测定计算纳米粒中Gd-DTPA的包封率。按上述方法制备纳米粒，脂质纳米粒分散液加入盐酸絮凝后离心，收集上清液，荧光分光光度法(Ex:495nm，Em=514nm，Slit=5nm)测定荧光值Ip计算溶液中游离的Gd-DTPA的量；按(1)式计算荧光嫁接物包封率『一『Gd-D7714包封率=~5x100%(i)『oGd-DTPA载药量按照(2)式计算，遞药量=^x汰物加县入tt，、包if洲田旦(2)(加入药物量x包封率)+载体材料用量实施例1各处方制备得到的负载Gd-DTPA脂质纳米粒的理化性质见表2。表2:实施例1处方负载Gd-DTPA脂质纳米粒的理化性质处方体均粒径(nm)表面电位(mV)包封率(%)载药量(%)74.540.817.21-39.1±2.045.64.425.5243.9194.191.785.425.42-31.6±2.550.89.28.3266.374.452.1124.156.13-29.3±3,455.018.047.9300.8144,866.7100.647.34-27.3±3.157.931.633.3289.1117.582.5109.742.85-30.7±2.455.835.817.5277.4137.3图1为处方5负载Gd-DTPA脂质纳米粒的电子显微镜照片。在油包水(w/o)型微乳液中的内水相中进行溶剂扩散制备脂质纳米粒，由于内水相本身体积小，其尺寸在lOOnm左右，在这样的纳米级反应空间中进行溶剂扩散法，直接限制了制得纳米粒的粒径和药物随溶剂向水相扩散的过程，因此采用该制备方法制备具有较高水溶性药物的脂质纳米粒，具有较好的效果。Gd-DTPA是一种水溶性非常好的Gd鳌合物，采用一般的溶剂扩散法等脂质纳米粒制备方法，由于药物与脂质材料亲和力较弱而极易向水中渗漏，很难将其有效地包封于脂质纳米粒中；而采用本发明提供的方法，通过控制制备时Gd-DTPA的投料比，尤其是通过处方2、3、4、5添加脂溶性两亲性物质卵磷脂，改善水溶性药物Gd-DTPA与脂质纳米粒材料的亲和力，减少制备过程中药物的渗漏，使Gd-DTPA的包封率可达到50%以上，载药量为35.8%,可以提高在体内进行磁共振检测的灵敏度。通过本发明的研究，在加入量为5%-15%的情况下，卵磷脂可有效地改善脂质纳米粒对亲水性药物的包封率，但当卵磷脂的加入量超过脂质材料的20%以上时，肠壁对脂质纳米粒的吸收量反而会较加入量为5%-15%时的吸收量小。实施例3:负载Gd-DTPA脂质纳米粒的制备称取司盘-80200mg溶解于10mL正己垸中，组成乳液的有机相；另称取Gd-DTPA50mg与18mg吐温-80，溶解于lmL蒸馏水中，组成水相。在400rpm搅拌条件下，将水相加入有机相中，形成油包水(W/0)微乳液；按表3称取处方量的脂质或混合脂质45mg和卵磷脂5mg溶解于lmL无水乙醇中，将此溶液迅速倒入1lmL的W/0微乳液中，室温条件下继续搅拌5min，即得脂质纳米粒分散体系。分散体系经20000rpm高速离心，分离得到脂质纳米粒沉淀，用2mL正己烷洗涤脂质纳米粒沉淀2次，纳米粒沉淀用50ml0.1。/。泊洛沙姆溶液分散，得到包裹Gd-DTPA的脂质纳米粒分散液；在该分散液中加入适量甘露醇，溶解、冷冻干燥。Gd-DTPA脂质纳米粒的理化性质见表3。表3不同脂质材料制备得到的负载Gd-DTPA脂质纳米粒的理化性质处方体均粒径(nm)表面电位(mV)包封率(%)载药量(%)硬脂酸75.824.292.5277.242.1111.3-35.2±2.552.634.5三硬脂酸甘油酯82.517.5109.7277.442.8137.3-30.7±2.450.133.4单硬脂酸甘油酯硬脂酸(1:1)71.328.7124.3296.766.5141.2-33.4±2.054.635.3硬月旨酸三硬脂酸甘油酯(1:1)68.231.8144.6318.973.7162.9陽32.1土2.948.332.6由结果可知，采用硬脂酸、三硬脂酸甘油酯或单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、三硬脂酸甘油酯的混合脂质，在加入卵磷脂的情况下，纳米粒对Gd-DTPA的包封率都接近或超过50%，载药量在30%以上，其原因只是因为所采用的脂质材料理化性质比较接近，形成的脂质纳米粒在外观和载药性能上均比较相似，因此，参考载Gd-DTPA单硬脂酸甘油酯纳米粒的配方和制备方法，显然，无论是采用硬脂酸、三硬脂酸甘油酯或混合脂质，或者在卵磷脂的参与下的混合脂质，都能够满足载药量控制在4%-35%的要求。实施例4~6与采用Gd-DTPA脂质纳米粒进行小鼠肠道成像相关实施例4:负载Gd-DTPA脂质纳米粒的应用负载Gd-DTPA脂质纳米粒口服小肠MR成像方法的建立选用实施例l中按处方5制备的Gd-DTPA脂质纳米粒为成像剂，以40mg/ml的Gd-DTPA脂质纳米粒水剂灌胃后，MR的T1WI上看见小鼠胃充盈。十二指肠、空肠及回肠肠腔随胃肠蠕动而逐渐充盈，然后小肠壁吸收Gd-DTPA脂质纳米粒后肠壁均匀强化。其强化程度由Gd-DTPA脂质纳米粒吸收量所决定，吸收量越多，信10号越高，强化程度越重。见图2A和图2B。实施例5:负载Gd-DTPA脂质纳米粒的应用负载Gd-DTPA脂质纳米粒保留灌肠大肠MR成像方法的建立选用实施例l中按处方5制备的Gd-DTPA脂质纳米粒为成像剂，以40mg/ml的Gd-DTPA脂质纳米粒水剂经肛门注入正常小鼠大肠内，保留灌肠后大肠吸收Gd-DTPA脂质纳米粒于MR的T1WI上大肠壁增强，保留灌肠5分钟肠壁可见强化，10-20分钟即出现明显均匀增强现象，其强化程度也由Gd-DTPA脂质纳米粒吸收量所决定，吸收量越多，信号越高，强化程度越重。见图3A和图3B。实施例6:负载Gd-DTPA脂质纳米粒的应用负载Gd-DTPA脂质纳米粒保留灌肠大肠癌MR成像方法的建立采用二甲肼诱发小鼠大肠癌的方法建立小鼠大肠癌模型。选用实施例1中按处方5制备的Gd-DTPA脂质纳米粒为成像剂，同样以40mg/ml的Gd-DTPA脂质纳米粒水剂1.5ml保留灌肠20分钟，T1WI的MR成像检查显示正常肠壁明显均匀强化，而大肠癌病灶周边强化，肿瘤内散在强化，病变的主体部分强化程度较轻，病灶与正常肠壁对比鲜明，同时反映了肿瘤对于Gd-DTPA脂质纳米粒吸收量明显低于正常肠壁。见图4A和图4B。实施例7:Gd-DTPA对照实验Gd-DTPA保留灌肠大肠MR成像以10mg/ml的Gd-DTPA(与40mg/ml实施例1中按处方5制备的Gd-DTPA脂质纳米粒中所含Gd-DTPA量相当)水剂经肛门注入正常小鼠大肠内，保留灌肠后大肠壁对于Gd-DTPA不吸收，大肠壁灌药前后T1WI的MRI上无明显强化。提示大肠壁对于Gd-DTPA水剂不吸收，与文献一致。见图5A和图5B。11综合实施例4-7所述，目前应用于临床Gd-DTPA因肠道不吸收无法建立肠壁吸收对比剂MR成像方法。Gd-DTPA脂质纳米粒能够被肠壁充分吸收，通过肠道对于Gd-DTPA脂质纳米粒吸收MR成像方法可行，纳米粒中Gd-DTPA增加病变(肠道肿瘤)与正常肠壁的对比，有助于病灶的显示。其中，实施例l中按处方l-5制备的Gd-DTPA脂质纳米粒均能充分吸收，载药量越高、MR上信号越强，因处方5制备的纳米粒中所负载Gd-DTPA量最高，所以成像效果最佳。权利要求1.含磁共振对比剂的脂质纳米粒，其特征在于负载的药物为钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)，其脂质材料选用单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、三硬脂酸甘油酯中的一种或多种组合，负载钆喷替酸葡甲胺的质量为脂质纳米粒质量的4％～35％，余量为脂质材料。2.如权利要求1所述的含磁共振对比剂的脂质纳米粒，其特征在于脂质材料中含有卵磷脂，卵磷脂的用量占脂质材料总质量的5~15%。3.权利要求1或2所述的含磁共振对比剂的脂质纳米粒的制备方法，其特征在于它采用以下步骤制备-(1)将司盘-80溶解于有机溶剂中，浓度为2%，制备乳液的有机相；将钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)与吐温-80溶解于蒸馏水，组成水相，Gd-DTPA的浓度为0.5~5%、吐温-80的浓度为1.8%,所述百分比为每100毫升中的溶质克数；(2)在搅拌条件下，将所述水相加入有机相形成油包水(W/0)微乳液；(3)称取脂质材料溶解于与水互溶的有机溶剂中，将此溶液迅速倒入所述油包水(W/0)微乳液中，室温条件下继续搅拌，得脂质纳米粒分散体系；(4)脂质纳米粒分散体系经离心分离得到脂质纳米粒沉淀；(5)洗涤并沉淀步骤(4)分离得到的脂质纳米粒；(6)将脂质纳米粒用泊洛沙姆溶液分散，得到顺磁性标记的负载轧喷替酸葡甲胺的脂质纳米粒分散液；步骤(1)所选用的有机溶剂为与水不互溶且对步骤(3)所选用的有机溶剂的亲和力小于对水的亲和力。4.权利要求3所述的含磁共振对比剂的脂质纳米粒的制备方法，其特征在于用于制备的质量配比为钆喷替酸葡甲胺16.67~50%、卵磷脂4.17~8.33%、单硬脂酸甘油酯45~79.17%。5.含磁共振对比剂的脂质纳米粒在肠道磁共振成像中的应用。全文摘要本发明提供了一种肠道易吸收的脂质纳米粒，负载磁共振对比剂钆喷替酸葡甲胺，以单硬脂酸甘油酯与卵磷脂作为脂质材料。本发明应用肠道易吸收的脂质体纳米粒将临床上最常用的磁共振对比剂钆喷替酸葡甲胺进行包封，使消化道不吸收的磁共振对比剂钆喷替酸葡甲胺能大量吸收进入肠壁内使肠壁产生MRI增强，通过正常肠壁与病变对于该脂质纳米粒吸收及分布上的差异而显示病变，并能够反映病变对于纳米粒的吸收功能状况。该方法具有如下优点局部给药，不需要静脉及全身用药；可能实现肠道吸收功能的评价；纳米颗粒进入细胞内而实现细胞水平的显像；而且纳米粒以淋巴转运为主可以实现淋巴显像，有助于大肠病变的淋巴靶向显示。文档编号A61K49/06GK101496906SQ20091009590公开日2009年8月5日申请日期2009年2月19日优先权日2009年2月19日发明者孙继红,杜永忠,章士正,胡富强,弘袁,郑伟良申请人:浙江大学