专利名称：miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
木发明涉及非编码小RNA基因miR-146a的应用，特别涉及miR-146a在制 备治疗胃炎药物中的应用，尤其是miR-146a在制备治疗由幽门螺杆菌感染引起
的胃炎药物中的应用。
背景技术：
微小RNA (microRNAs, miRNAs)是一类长度约为20 25 nt的内源性非编 码RNA分子，普遍存在于真核生物中，它不编码蛋白质或多肽，而是与耙基因 的信使RNA (mRNAs) 3'非翻译区互补结合，诱导耙mRNA降解或抑制耙mRNA 的翻译，从而实现转录后基因调控作用。许多证据表明，miRNAs在细胞增殖、 发育、分化等多种生物学过程中发挥重要的调节作用，且与肿瘤发生密切相关。
近年来，miRNAs与免疫系统的关系越来越受重视，miRNAs已被证实参 与了淋巴细胞的发育与分化、抗体的产生及固有性免疫应答调控等过程。在某 些病毒感染过程中，病毒可以通过自身合成的或利用宿主的特定miRNAs，调控 病毒或宿主的基因表达，利于病毒的生存、传播，或者调控机体的抗病毒免疫 反应。此外，在一些炎症性疾病中，如类风湿关节炎和银屑病，miRNAs也参 与了疾病的发生与发展。因此，miRNAs在病原体感染的诊断及相关炎症疾病 中的治疗中可能具有极为广阔的应用前景。
幽门螺杆菌(/^fco^cter;^/on'， Hp)是定植于人胃粘膜的重要致病菌，世界 人群Hp感染率超过50%。 Hp与慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织 淋巴瘤(MALT)和胃癌等多种疾病相关，对人类健康构成严重危害，世界卫生 组织(WHO)将其列为一类致癌因子。人体对于Hp感染的免疫反应十分复杂，虽然机体对于Hp感染能够引发强烈的细胞与体液免疫，但是并不能够有效地清除 细菌，感染状态常常持续存在。因此，Hp感染常常引起慢性胃炎，这也是Hp
的重要致病因素之一。临床治疗Hp感染相关胃炎首先要采用抗生素三联或四联 疗法，在一定程度上能清除Hp，但疗效不稳定，停药后易复发、副反应严重，
j「且耐药问题口趋严峻。
经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有关miRNAs与Hp感染相关 炎症的诊断和治疗的研究报道。
发明内容
本发明公开了小分子RNA基因miR-146a在制备胃炎药物中的应用，该 miR-146a能够有效抑制幽门螺杆菌感染相关的炎症反应。本发明所述的 miR-146a在幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞株和人胃粘膜组织中高表达，且分别 给胃上皮细胞GES-1转染miR-146a模拟体或miR-146a抑制剂后，miR-146a 模拟体能够显著减少炎症因子白细胞介素8、巨噬细胞炎症蛋白3cx和生长相关 癌基因a的蛋白分泌水平，表明miR-146a能够有效抑制幽门螺杆菌感染相关的 炎症反应。
本发明所述的应用中为治疗胃炎的药物；该治疗胃炎的药物为治疗由幽门 螺杆菌感染引起的胃炎的药物。
本发明提供的 miR-146a 由以下核苷酸组成5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU扁3'
本发明利用miRNAs微阵列芯片对幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞株GES-1 及未感染的GES-1细胞的miRNAs的表达情况进行了分析，结果表明，Hp感 染促进了GES-1细胞中miR-146a的表达，上调达2.46倍。进一步通过实时定量 PCR (real-time PCR)和Northern杂交(Northern blot) 技术对miR-146a的表达进 行分析，结果与miRNAs微阵列芯片相吻合，Hp感染能够诱导胃上皮细胞 miR-146a的表达上调。
其次，本发明选取了33例Hp阳性的慢性胃炎患者与15例Hp阴性的正常对照，利用real-timePCR技术对患者胃粘膜组织的miR-146a的水平进行检测，结 果表明，在Hp感染的慢性胃炎病人的胃粘膜组织中，miR-146a的表达量也要显 著高于Hp阴性的正常胃粘膜组织，这对于Hp感染的慢性胃炎的临床诊断和预后 判断具有重要的参考意义。
同时，本发明中分别给胃上皮细胞GES-1转染miR-146a模拟体(miR-146a mimics)后，miR-146a模拟体能够显著减少炎症因子白细胞介素8(interleukin-8， IL-8)、生长相关癌基因a (growth-related oncogene-a, GRO-a)和巨噬细胞炎症 蛋白3a (macrophage inflammatory protein-3a， MlP-3ct)的蛋白分泌7JC平，这表 明miR-146a能够有效抑制幽门螺杆菌感染相关的炎症反应，因此，miR-146a 在制备治疗胃炎药物方面，特别是在制备治疗由幽门螺杆菌感染引起的胃炎药 物方面有广泛前景。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳 实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图l: miRNAs芯片检测Hp感染胃上皮细胞miRNAs表达谱的变化；
图2A-2B: Hp感染促进胃上皮细胞miR-146a的表达；其中，图2A， real-time PCR技术检测Hp感染胃上皮细胞GES-l、 AGS和MKN45后miR-146a的表达；图 2B， Northern blot鉴定Hp感染诱导miR-146a的高表达；
图3: Hp感染胃炎患者和正常对照胃粘膜组织miR-146a的表达分析；
图4: miR-146a模拟体抑制Hp感染炎症因子IL-8、 GRO-a和MIP-3a的表达。
具体实施例方式
实施例l:Hp感染胃上皮细胞模型的建立
Hp 26695标准菌株培养至对数生长期，5000xg离心收集细菌，用无抗生素RPMI 1640培养基制备Hp细菌悬液，通过测定A600吸光度值调整细菌浓度 (lA600=lxl08cfU/ml)。以含10。/。小牛血清的RPMI 1640(青霉素100U/ml ;链霉 素100U/ml)为完全培养基，培养人胃上皮细胞株GES-1，贴壁生长至80%时，弃 掉培养基。按照感染复数(multiplicity of infection, MOI)(细菌数细胞数)为100: 1加入Hp， 37°C、 5%C02的条件下共培养24小时。
实施例2: miRNAs芯片检测Hp感染胃上皮细胞miRNAs表达谱的变化
Trizol法抽提细胞总RNA， lx107细胞加入1 ml Trizol,用枪头反复剧烈吹 打，漩涡器上充分振荡使细胞完全裂解，室温静置5 min;按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol的比例加入氯仿，充分漩涡，室温静置10min; 4°C， 12000xg离心15 min， 取上层无色液体于新的1.5 ml离心管中；按0.5 ml异丙醇/l ml Trizol的比例加 入异丙醇，充分混合，室温放置5-10 min，以形成RNA沉淀；4°C， 12000xg 离心10min，弃上清；加至少1 ml75。/。乙醇/1 mlTrizol，悬浮RNA沉淀；4°C， 7500xg离心5 min，弃上清；空气干燥5-10 min后，用30 pi无RNA酶的水溶 解。紫外吸收测定法和甲醛变性电泳检测总RNA的纯度与完整性。
胃上皮细胞miRNAs表达谱的检测采用博奥公司的miRNAs V3.0芯片，共 含有924条探针，包括人、大鼠和小鼠的成熟miRNAs的互补序列，同时还包 括122条预测的人miRNAs探针。把这些探针用芯片点样仪SmartArrayTM(博奥公 司)点制在一张75x25 mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包 括人的U6-tRNA作为内标；8个人工制备的30个碱基长度RNA对应的探针作 为芯片的外标(Zip5、 Zipl3、 Zipl5、 Zip21、 Zip23、 Zip25、 Y2、 Y3) ， Hex作 为点样阳性对照，50%DMSO作为杂交阴性对照。
采用miRCURY ARRAY标记试剂盒，用标记酶将CY3或CY5荧光基团标 记细胞总RNA，制备荧光标记探针。将标记的RNA溶于1^W杂交液中(15%甲 酰胺；0.2。/。SDS;3xSSC;50xDenhardt's)，于42。C杂交过夜。杂交结束后，先在42 "C含0.2。/。SDS， 2xSSC的液体中洗涤4分钟，而后在0.2xSSC液体中室温洗涤 4分钟。玻片甩干后即可用于扫描。芯片用LuxScanlOK/A双通道激光扫描仪进行扫描，采用LuxScan3.0图像
分析软件(博奧公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。将
负值信号校正到IO，如果基因在所有样品中的信号值都小于300，则判断为弱点，
删除弱点和坏点。数据预处理以后，再根据各张芯片的全局均值(global mean)
进行片间校正，使得各张的全局均值相同。最后GenePixPro5.0和
BIOCONDUCTOR软件进行数据归一化处理，SAM 2.1软件进行统计学分析，
筛选差异表达基因。为避免假阳性和假阴性，本次实验共检测5对感染前后的样 a
叩o
5组样品经过上述miRNAs芯片分析表明，Hp感染引起胃上皮细胞miR-146a 的高表达，上调达2.46倍(图l)。
实施例3: Real-time PCR技术检测miRNAs的表达
本实施例采用TaqMan miRNA Assay试齐U盒(Applied Biosystems)进行 miRNAs的Real-time PCR检测。
首先按照实施例l中所述的Trizol法提取细胞总RNA，分别取上述总RNA各 10ng为模板，然后利用试剂盒自带的miRNAs特异引物合成cDNA，反应体系如 下dNTPs (100 mM) 0.15 MultiScribe逆转录酶1 10xRT缓冲液1.5^1; RNase抑制剂(20 U/pl) 0.19 RT引物3 总RNA 5 pi; DEPC H20 4.16 pl。 反应条件16°C 30分钟，42°C 30分钟，85°C 5分钟反应，4。C保存。
再以cDNA为模板，利用试剂盒自带的miRNAs的特异引物和反向引物进行 TaqMan探针法Real-time PCR。体系如下2xPCR mix 10 pi; cDNA2(xl; Probe 0.4 jil; DEPCH20 7.6fxl。反应条件95。C反应2分钟，95°C 15秒，60°C 30秒 反应40个循环。以U6小RNA为内参对照，采用2'AAeT相对定量法处理数据。
Real-time PCR结果表明，Hp感染引起胃上皮细胞株GES-1 、 MKN45和AGS 中miR-146a的高表达，分别上调达8.04、 7.46和2.81倍(图2A)。
实施例4: Northern blot鉴定miR-146a的表达采用mirVanaTM miRNA提取分离试剂盒(Ambion)，收集细胞中小于200 nt的miRNA。取5 pg左右的miRNA， 15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时。
切下要检测的凝胶部分，放入0.5xTBE漂洗；将HybondN+membranes切成稍大于凝胶大小，在DEPC水中短暂浸润10 15秒，然后在0.5xTBE的转印液中平衡10-15分钟；将5-6张滤纸同样用转印液浸泡后，按照滤纸一凝胶—纤维膜一滤纸从上至下的顺序依次组好，放置于半干转移装置，玻璃棒各层排空气泡，胶面向阴极，膜面向阳极，装好电源装置；保持20V电压，电转移30-35分钟； '
转移完成后，移去凝胶，取出膜并标记好凝胶方向，放入紫外交联仪下交联30秒(120 mJ/cm2); 8(TC烤膜30分钟。
miR-146a的Northem blot采用的是美国Signosis公司的MiRNA Northern Blot试剂盒。按照每cm2膜lml的量添加预杂交液，42"C预杂交1小时；弃去预杂交液，更换新的杂交液4ml后，添加试剂盒自带的生物素标记的miR-146探针10Hl， 42T:杂交过夜；倒掉杂交液，用NB洗涤液42"C洗膜30分钟；室温下加入15 ml封闭液封闭30分钟后，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素和显色液进行显色。
通过Northemblot分析，结果表明Hp感染后胃上皮细胞miR-146a的表达明显上调(图2B)。
实施例5: Hp感染胃炎患者胃粘膜组织miR-146a的表达分析
为了确定Hp感染患者的胃粘膜组织miR-146a表达是否上调，选取了33例Hp阳性的慢性胃炎患者与15例Hp阴性的正常对照。Trizo胜提取组织总RNA后，按照实施例3所述的方法，检测两组患者胃粘膜组织miR-146a的表达情况，结果表明，在Hp感染的慢性胃炎病人的胃粘膜组织中，miR-146a的表达量也要显著高于Hp阴性的正常胃粘膜组织(上升达4.29倍，尸O.05)(图3)。
实施例6: miR-146a抑制Hp感染炎症因子IL-8、 MIP-3a和GRO-a的分泌
miR-146a模拟体由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列如下
85'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3'5 '-CCC AUGGAAUUC AGUUCUC AUU-3'
将miR-146a模拟体转染至GES-1细胞采用的是美国Promega公司的LipofectamineTM2000试剂，转染前24 h接种0.5-2 x 105细胞在500 ^1培养基中(24-well)，当生长至90-95%密度时开始转染。稀释适当体积的miR-146a模拟体或抑制剂在50 ^ Opti-MEM I Reduced Serum Medium培养基中，轻柔混和，使其终浓度为50 nM。使用甜先混合LipofectamineTM 2000，然后用50 plOpti-MEM I Reduced Serum Medium培养基稀释适当体积的LipofectamineTM2000，轻柔混合，室温放置5分钟。将稀释后的小分子RNA和转染试剂进行混合，室温孵育20分钟。将100pl小分子RNA-转染试剂混合物加至含细胞和培养基的培养孔，轻柔的来回摇动培养板。37t:孵育细胞18-48小时，4-6小时后可以更换含10°/。胎牛血清的1640培养基。
小分子RNA转染GES-1 24小时后，按照实施例1所述的方法用Hp 26695感染细胞12h后，收集上清，ELISA检测炎症因子IL-8、 MlP-3a和GRO-(x的农达水平，具体步骤参照美国R&D公司的DuoSet ELISA Development System试剂盒，结果表明，miR-146a模拟体能够显著减少炎症因子IL-8、 GRO-a和MlP-3a的蛋白分泌水平(尸<0.05)(图4)。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。
权利要求
1.miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述治疗胃炎的药物为治疗由幽门螺杆菌感染引起的胃炎的药物。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述miR-146a由以下核苷酸组成5'- UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3'。
全文摘要
本发明涉及一种非编码小RNA基因miR-146a在制备治疗胃炎药物中的应用，所述胃炎可以是由幽门螺杆菌感染引起。本发明所述的miR-146a在幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞株和人胃粘膜组织中高表达，且分别给胃上皮细胞GES-1转染miR-146a模拟体或miR-146a抑制剂后，miR-146a模拟体能够显著减少炎症因子白细胞介素8、巨噬细胞炎症蛋白3α和生长相关癌基因α的蛋白分泌水平和巨噬细胞炎症蛋白3α的蛋白分泌水平，表明miR-146a能够有效抑制幽门螺杆菌感染相关的炎症反应。
文档编号A61P1/00GK101670117SQ20091010476
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者真 刘, 彬 唐, 朱恩东, 娜 李, 毛旭虎, 斌 肖, 邹全明, 刚 郭, 黎伯胜 申请人:中国人民解放军第三军医大学