专利名称：：3-羰基-12-烯-乌索烷化合物的抗肿瘤用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种三萜类化合物的抗肿瘤用途，具体涉及3-羰基-12-烯-乌索烷化合物的抗肿瘤用途，用于抑制胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404细胞增殖的。
背景技术：
：本发明使用3-羰基-12-烯-乌索垸化合物由药用植物苦j茶提取获得，其化学结构式如下Z—、A苦丁茶在我国作为药品和饮品使用有悠久历史。苦丁茶主产于广两、广东、海南、贵州、四川、福建等地。最早见于东汉时期的《桐君录》，明代李时珍《本草纲目》上记载其无毒，煮饮能止渴，明目除烦等。苦丁茶冬青(/toto^咖)，冬青科(Aquifoliaceae),冬青属，别名苦丁茶。常绿乔木，高达20米；树皮灰黑色，粗糙；枝条粗壮，平滑无毛，幼枝有棱。叶厚革质，长椭圆形，长8—20厘米，宽4.5—7.5厘米，顶端锐尖，基部楔形，主脉在表面凹陷，在背面显著隆起；叶柄粗壮，长约1.5厘米。聚伞花序密集于二年生枝条叶腋内，雄花序每1分枝有花3—9朵，雌花序每1分枝有花1一3朵；花瓣椭圆形，基部连合，长约为萼裂片的3倍。果实球形，红色或褐色；分核4。花期4一5月，果熟期10月。苦丁茶含有黄酮类、三砲及其皂武类、氨基酸类、多酚类与咖啡碱和维生素c等物质。冬青属苦丁茶在植物保健品产业化利用和临床应用上具有重要的药理价值，其药理作用包括保健心脑血管作用、降压作用、降脂减肥作用、抗炎杀菌作用、抗生育作用、抗氧化作用及提高免疫功能作用。目前，有关苦丁茶成分的研究报道包括(文永新等.苦丁茶化学成分的研究.广西植物，1990，10:364—368;文永新等.苦丁茶甙元I的结构鉴定.植物学报，1999,41:206—208;OuyangMAefa/.Triterpenesandtriterpenoidglycosidesfromtheleavesof/feeA:zW/"c/ra.尸/2;;tocAem/W7,1996，41(3):871-877;欧阳明安等.苦丁茶冬青化学成分的结构研究.天然产物研究与开发，1997，9(3):19—23;欧阳明安.新三萜及其皂甙化学结构的NM附开究.波谱学杂志，1996，13:231—237;OuyangMAa,.Triterpenoidglycosidesfrom//ex&M(if>7cA".P/zytoc/em/str_y,1996,43:443-445;欧阳明安等.二萜大叶冬青甙I和苦丁冬青甙K的NMR研究.波谱学杂;志,2001，18:155—160;KeiichiNa/.Activity-GuidedisolationoftriterpenoidacylCoAcholesterylacyltransferase(A-CAT)inhibitorsfrom//exJAto1999，62:1061-1064;KeiichiN"a/.Triterpenoidsaponinsfrom//ex/b^/"c/^./M^尸ra41999,62:1128-1131;刘韶等.苦丁茶化学成分的研究.中国中药杂志.2003，28:834—835)。有关冬青属苦丁茶药理作用的已有文献和专利报道(杨彪等.苦丁茶提取物抗氧化作用的研究.广西民族学院学报(自然科学版)，2000，6(2):108—110;陈一等.苦丁茶冬青叶的降压作用研究.中草药，1995，26:250—252;向华林.中国皋卢(苦丁)茶降脂作用的实验研究.中国中药杂志，1994，19:497—498)，近年来，已报道的有关苦丁茶药理作用的文献未见以三萜化合物作用于胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404的抗肿瘤活性作用及诱导凋亡的反应的报道
发明内容本发明的目的是将3-羰基-12-烯-乌索垸化合物(以下简称化合物A)应用于抑制癌细胞，具体用于抑制胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404的细胞增殖。1、本发明使用化合物A由苦丁茶A:^>ic/^)中分离，制备方法如下称取苦丁茶冬青叶a/exA"力'"c/m)5kg，粉碎后用70%乙醇回流提取3次，滤去不溶物，蒸干提取液，将浸膏悬乳分散在冷水中，浸膏分为水溶性和脂溶性两部分。取脂溶性提取物经洗脱液石油醚-丙酮(10:2)，过200-300目的硅胶柱；然后，经洗脱液正己垸—丙酮(10:1)反复硅胶(10-4(^m)分离，最后通过HPLC分离，得到化合物A。1抗肿瘤活性检测方法(1)称取化合物A2mg，用DMSO预溶，加入生理盐水溶解至供试浓度，抽滤后备用。所述供试浓度为100Mg/mL，50jug/mL，25pg/mL，12.5Mg/mL，6.25Mg/mL，3.13pg/mL，1.65ng/mL，0.83(ig/mL，0.42pg/mL。(2)根据MTT法检测化合物A对胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404的抑制活性。(3)根据供试浓度抗肿瘤活性抑制率值，通过曲线回归方程，计算ICs。值。2化合物A的诱导凋亡检测歩骤根据凋亡细胞DNA提取试剂盒说明提取细胞DNA，并用TE溶解。取20DNA上样于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。3化合物A对细胞凋亡相关基因Bax的作用检测。(1)细胞接种后24h，分别加入化合物A至504g/mL。(2)培养24h，然后以胰酶消化液5mL消化、于离心机上1000rpm/min离心5min后收集细胞。(3)根据RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明将提取的细胞总RNA反转录为cDNA,备用。(4)利用设计的Bax基因引物和P-actin内参基因引物，根据荧光定量PCR试剂盒说明进行实时定量PCR。所述Bax基因引物；Bax正向引物为5'-CGAGTGGCAGTGACATGT-3',Bax反向引物为5'陽TCTTCTTCCAGATGGTGAG-3'。所述(3-actin内参基因引物；(3-actin正向引物为5'-CCAAGGCCAACCGCGAAGATG-3'，p-actin反向引物为5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCA-3'。(5)根据以下公式计算结果实验组目的组基因的表达相对于对照组基因的表达的变化倍数—-[(ct处理组目的基因-ct处理组内参基因)-(ct对照组S的基因-ct对照组内参基因)]本发明的试验证明，化合物A能抑制肿瘤细胞株的生长，在以人胃癌细胞株和肝癌细胞株为靶细胞的抗肿瘤活性试验巾，化合物A的半数致死量IC50值分别为16.66pg/mL和1.48pg/mL,表明化合物A可用于制备抗肿瘤药物。通过电泳检测，化合物A能够诱导肝癌细胞株产生凋亡。更进一歩地通过实时定量PCR试验证明，化合物A诱导细胞凋亡的主要原因是通过促进细胞凋亡相关基因Bax表达量的增加来实现的，这是对上述抗肿瘤活性试验的进一步证明。上述试验表明化合物A用于抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404细胞增殖，效果明显。可用于制备抗肿瘤药物；电泳检测表明，化合物A可以用于促进肝癌细胞BEL-7404凋亡。荧光定量PCR实验证明，化合物A可以促进凋亡相关基因Bax表达量增加。具体表述为化合物A诱导细胞凋亡的主要原因是通过基因水平促进细胞凋亡相关基因Bax表达量的增加来实现。本发明的有益效果(1)本发明的试验证明，通过MTT法检测化合物A的抗肿瘤活性，具有抑制胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404细胞增殖的活性，能够抑制胃癌细胞系SGC-7901和肝癌细胞系BEL-7404的生长。(2)化合物A的半数致死量IC,值分别为16.66Mg/mL和1.48pg/mL，尤其是其对肝癌细胞系BEL-7404的半数致死量IC5。值与抗肿瘤临床用药5'-氟脲嘧啶对肝癌细胞系BEL-7404的半数致死量ICs。值相当。(3)化合物A诱导肝癌细胞凋亡效果明显，具有诱导肝癌细胞系BEL-7404凋亡的作用，同时可以促进凋亡相关基因Bax表达量增加，是可以用作抗肿瘤药物的先导化合物。可以用于制备抗肿瘤药物。(4)本发明涉及的化合物A来源于苦丁茶冬青，属于天然保健品，以苫丁茶为原材料的保健食品众多。化合物A相对于其他抗癌药物具有毒性和副作用都较小的特点。(5)苦丁茶冬青取材容易，价格低廉，化合物A的原材料成本低。(6)本发明涉及的化合物A结构复杂，结构中手性碳较多，该化合物主要来源于天然产物，不易人工合成。因此，由天然产物中分离获得该类化合物是最简捷实际的途径。图1为化合物A诱导肝癌细胞BEL-7404凋亡DM电泳图。其中，左图为正常肝癌细胞株的DNA电泳图；图中，第一泳道为DNAMarker,第一、三、四泳道分别为正常肝癌细胞BEL-7404培养12h、24h和48h后的DNA样品。右图为化合物A作用于肝癌细胞凋亡DNA电泳图；所述化合物A的浓度为50ng/mL。图中，第一泳道为DNAMarker,第二、三、泳道分别为化合物A作用于肝癌细胞BEL-7404培养12h、24h和48h后的DNA样品。具体实施例以下结合实施例对本发明作进一步说明。实施例l:化合物A的制备1.制备方法称取干燥的苦丁茶冬青叶5kg，粉碎后55。C下用70%乙醇冋流提取3次，滤去不溶物，合并提取液，在38t:条件下真空减压浓縮得浸膏，将浸膏悬乳分散在冷水中，浸膏分为水溶性和脂溶性两部分。取脂溶性提取物经洗脱液石油醚-丙酮(10:2)，过200-300目的硅胶柱；然后，经洗脱液正己烷-丙酮(10:1)反复硅胶(10—40pm)分离，最后通过HPLC分离，得到化合物A。2.试验结果化合物A为无色晶体，试验数据如下IR(cm"):2918，1707(00)，1659(C=C)，1456，1381;EI—MSm/z:424[M]+，409[M-CH3]+，218，203，189，149，133;1HNMR(400MHz,CDC13):S5.15(1H，m，《/=3.0Hz，H-12)，1.10(s,3H)，1.08(s,6H)，1.06(s,3H)，L05(s,3H)0.92(s,3H)，0.81(s,6H);"C画R(100顧z，CDC13):S217.8(C-3)，139.7(C-13)，24.2(C-12)59.1(C-18),55.3(C-5)47.9(C扁9)，42.2(C-14)，41.5(C-22)，40.0(C-8)39.7(C陽20)，39.6(C画19)，39.4(C-l)，36.6(C陽IO)，34.2(C-17)，33.8(C-4)，32.5(C-7)，31.2(C-21),28.7(C-15)，28.2(C-28)，28.1(C-2)，36.9(C-23)，26.6(C-16)，23.6(C画27)，23.2(C画ll)，21.5(C-30)，21.3(C-25)，19.6(C-6)，17.4(C-26)，16.8(C-29),15.4(C-24)。实施例2:MTT法检测化合物A抗肿瘤活性试验1.材料1.1培养基类RPMI1640(GibcoBRL)，小牛血清(杭州四季青)，青链霉素(Sigma)，胰蛋白酶(北京天象人生工)。1.2溶剂及溶液类MTT(厦门鹭隆生物公司)，DMSO(国产分析纯)。1.3细胞株人胃癌细胞系SGC-7901,人肝癌细胞系BEL-7404。2.操作步骤消化后的单细胞悬液，计数后细胞按180pL/孔，接种于96孔平底培养板中，37。C下于C02培养箱中培养过夜，按不同浓度加入经细菌过滤器处理后的化合物A溶液及标准品溶液20pL/孔，培养3天。倒去培养液用PBS清洗。加MTT(0.2mg/L)200)aL/孔，放入(302培养箱37。C培养4h。除去MTT，加入DMSO-甘氨酸缓冲液，摇床摇0.1-0.5h(细胞看不见为止)。设置入=570nm，酶标仪测定OD值(即此波长下的吸光度)。每个96孔板设阳性对照、阴性对照及空白对照。阳性对照加入50iag/mL的5'-氟脲嘧啶，阴性对照加入培养液。两种对照在边缘和中间各设二孔，以防边缘效应。空白对照设在右上角第一个孔。按下式计算抑制率对照组OD值一实验组OD值抑制率=对照组(9D值X100%抗癌药物活性以IC5。衡量，IC幼是抑制率为50%时的样品浓度。3.试验结果化合物A的抗肿瘤活性IC5。结果如表1所示，化合物A对胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404的活性作用IC5。值均较低，尤其是其作用于肝癌细胞BEL-7404的ICs。值，与标准品5'-氟脲嘧啶作用于肝癌细胞BEL-7404的IC5。值相当，因此可以确定化合物A具有较强的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。表1化合物A的抗肿瘤活性IC5。结果IC50IC50化合物(ng/mL±SD)(貼/mL士SD)X1^6±5.251.48±0.545'—氟脲嘧啶(5-FU)].01±0.041.45±0.21化合物A和标准品5'—氟脲嘧啶按照浓度梯度依次稀释为100化/mL，50Pg/mL，25Pg/mL，12.5Pg/mL，6.25^g/mL，3.13Pg/mL，1.65Pg/mL，0.83Pg/mL。表1中a为化合物A对胃癌细胞系SGC-7901的IC,。值，b为化合物A对肝癌细胞系BEL-7404的ICs。值。IG。值代表平均值±标准差，平行试验重复三次。实施例3:化合物A诱导肝癌细胞凋亡的检测1.材料凋亡细胞DNA提取试剂盒(TaKaRa)。细胞株人胃癌细胞系SGC-7901，人肝癌细胞系BEL-7404。2.操作步骤(1)细胞接种，24h后分别加入化合物A至终浓度50(ig/mL。(2)继续分别培养12h，24h，48h后以胰酶消化液5mL消化、于离心机上1000rpm/min离心5min后收集试验组及对照组细胞。(3)根据凋亡细胞DNA提取试剂盒说明提取细胞DNA，并用TE溶解。(4)取20pLDNA上样于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。3.试验结果如图1所示，左图中正常肝癌细胞DNA在培养12h、24h和48h后，DNA片段未出现任何异常情况。而右图中，肝癌细胞经50pg/mL的化合物A作用12h时，就开始出现DNA降解的现象，在24h时，DNA降解程度加强，到48h时，DNA降解程度最强，几乎完全降解。DNA成片段化降解是DNA凋亡的一个重要特征。因此，我们确定化合物A对肝癌细胞的活性是通过诱导肝癌细胞凋亡产生的，而且此过程产生于化合物A作用于细胞12h的时候。实施例4:化合物A对凋亡相关基因Bax的作用1材料RNA提取试剂盒(TaKaRa)，反转录试剂盒(TaKaRa)，SYBR/Vemix五;c7^荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa)。引物Bax正向引物5'—CGAGTGGCAGTGACATGT—3'，Bax反向引物5'—TCTTCTTCCAGATGGTGAG—3'。(3—actin正向引物5'—CCAAGGCCAACCGCGAAGATG—3'，p—actin反向引物5'—AGGGTACATGGTGGTGCCGCCA—3'。2操作步骤(1)细胞接种，培养24h分别加入化合物A至5吗/mL，10pg/mL，20吗/mL。(2)继续培养24h，然后后以胰酶消化液5mL消化细胞、于离心机匕1000rpm/min离心5min离心收集试验组和对照组细胞。(3)根据RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明将提取的细胞总RNA反转录为cDNA，备用。(4)利用设计的Bax及P-actin(内参基因)基因引物，根据荧光定量PCR试剂盒说明使用SYBRGreenI嵌合荧光法于ABI系列7700荧光仪—卜.进行实时定量PCR反应，反应条件如下94。C4minl个循环，94。C20s，40个循环，60°C30s，40个循环。(5)试验数据分析采用以下方法实验组目的组基因的表达相对于对照组基因的表达的变化倍数=-KCt处理组目的基因-Ct处理组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照組內参基因)]丄3试验结果如表2所示，5pg/mL标准品5'—氟脲嘧啶作用于肝癌细胞24h后Bax基因的表达量是正常细胞的3.18倍，促进其表达量增加；同浓度下的化合物A作用于肝癌细胞24h后Bax基因的表达量与正常细胞相当。但随着浓度的升高，化合物A对肝癌细胞Bax基因的表达量的促进作用是逐渐增强的，当浓度为lOpg/mL时，其表达量为正常细胞的4.12倍，与相同浓度的标准品作用下的基因表达量相当。当浓度为20pg/mL时，其表达量为正常细胞的9.56倍，比相同浓度的标准品作用下的基因表达量要高。综上所述，化合物A对肝癌细胞的凋亡作用可能一方面是通过对凋亡相关基因Bax表达量的增加来实现的。闵此，化合物A可以用于制备抗肿瘤药物。表2化合物A对肝癌细胞系BEL-7404凋亡相关基因Bax表达量的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2中，a为正常肝癌细胞BEL-7404中基因Bax的表达量，即未加化合物A和5'-氟脲嘧啶时肝癌细胞BEL-7404中基因Bax的表达量；b、c、d分别为化合物A和5'-氟脲嘧啶在浓度为5吗/mL、10pg/mL和2(^g/mL时，对肝癌细胞BEL-7404中基因Bax的表达量。基因表达量表示为平均值±标准差，平行试验重复三次。权利要求1、一种如下式所示的3-羰基-12-烯-乌索烷化合物的用途，其特征在于用于抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404细胞增殖。2、如权利要求1所述的3-羰基~12-烯-乌索烷化合物的用途，其特征在于用于促进凋亡相关基因Bax表达量增加，并促进肝癌细胞BEL-7404凋亡,全文摘要本发明涉及3-羰基-12-烯-乌索烷化合物抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404的用途。试验表明3-羰基-12-烯-乌索烷化合物用于抑制胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞BEL-7404细胞增殖，效果明显，可用于制备抗肿瘤药物。电泳检测表明，3-羰基-12-烯-乌索烷化合物可以通过促进凋亡相关基因Bax表达量的增加，促进肝癌细胞BEL-7404凋亡。文档编号A61K31/56GK101574352SQ200910111980公开日2009年11月11日申请日期2009年6月15日优先权日2009年6月15日发明者吴祖建,欧阳明安,硕沈,谢联辉申请人:福建农林大学