专利名称：联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取方法，具体地涉及一种联合应用全仿生消化技术和细胞 膜仿生固相萃取技术的中药提取方法。
背景技术：
中药的成分异常复杂，且多种有效成分在进入人体后相互配合、协同作用，而后起 到疾病的治疗作用。传统的提纯分离技术(如煎煮法、回流、浸渍、渗漉等)和现代中药提 纯分离技术(如超微粉碎技术、超临界萃取技术、逆流动态提取技术、吸附分离纯化技术、 膜分离技术、多效薄膜浓缩干燥技术、真空带式干燥技术、计算机控制技术等)均沿用“纯 粹”、“传统”的物理及化学手段，与吸收入人体的中药有效成分的协同作用无关，因此易破 坏中药有效成分的结构或组成，难以将中药中含有的有效成分完全提取出来。仿生提取法(Bionic Extration method)则与上述提纯方式不同，它是从生物药 剂学的角度将整体药物研究法与分子药物研究法相结合仿生提取法，它特别适用于中药复 方中有效成分的提取，中药复方是中医临床用药的一大特点，其化学成分非常复杂，很难用 现代提纯分离技术提纯的某一成分的药效和药代参数来代表整个中药复方。基于中药复 方中部分有效成分已知，部分有效成分未知的现实，SBE法坚持“有成分论，不唯成分论，重 在基体的药效学反应”的基本原则(郁威，中药提取分离技术原理与应用，中医药出版社 2005,364-369)，由于中药大多使用口服吸收，因此，仿生提取法主要模仿口服药物在口腔、 胃肠道中的吸收环境，以得到有效成分含量高的活性中药提取液。但是，现有的仿生提取技术仅仅停留在将中药中的有效成分萃取到胃、肠等仿生 液中，而上述仿生提取液存在溶液量大、口感差、易发生胃肠不适等的问题，无法像水煎剂 一样直接口服使用；当然，也可以将其浓缩、或将其烘干，但是，由于上述仿生液中带有大量 的生物酶及一系列成分复杂的化合物，在加热的过程中，其中所含有的有效成分易发生副 反应(如水解反应等)，导致有效成分的含量降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技 术的中药提取方法，以解决现有技术中存在的上述问题。本发明联合应用全仿生消化技术 和细胞膜仿生固相萃取技术，反应条件温和，可保持天然产物构象及有效成分原有药效。本发明提供的技术方案如下联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法，其特征在 于，它包括以下的步骤1)在一容器中加入中药，而后加入模拟唾液，在36 38°C下振荡3 6分钟；2)而后向上述容器中加入模拟胃液，在36 38°C下继续振荡1 4小时，获得中 药的体外胃仿生消化液；
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3)向步骤2中获得的体外胃仿生消化液中加入模拟十二指肠液和模拟胆汁，在 36 38°C下继续振荡5 10小时，而后使用孔径为0. 45 μ m的滤膜抽滤，获得体外胃肠全 仿生消化液；4)取蛋黄卵磷脂，将其溶于氯仿中，获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液；将上述溶液移 入具塞的圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发，使之形成均勻的多层脂质膜，而后 向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化；向其中加入步骤3中获得的体外胃肠全仿生消 化液，将其加入水浴恒温振荡器中，在36 38°C下振荡，使多层脂质膜全部进入全仿生消 化液中，而后在-80 -71°C冷冻lh，在36 38°C下融化，反复冻融3次后，得到含单层脂 质体的冻融液，该单层脂质体中负载有中药有效成分群；5)依次用孔径为0. 45 μ m和0. 22 μ m的滤膜抽滤冻融液，从溶液中分离获得负载 有中药有效成分群的单层脂质体(单层脂质体粒径为0. 3 0. 35 μ m)。本发明建立体外全仿生消化技术并应用于中药提取的前处理，即一句化学仿生 (人工胃、人工肠)与医学仿生(酶的作用)原理，建立人体仿生消化体系在不同消化阶 段按照不同消化器官在一定时间内分泌出的消化液的成份和量，加入相应的仿生消化液， 再根据中药不同剂型在人体消化器官中的排空时间合理安排各个阶段的消化时间，并模拟 消化器官有规律的蠕动，建立中药材和中药水煎液的模拟消化过程，以此来获得全仿生消 化液，该全仿生消化液更接近药物在体内达到平衡后的有效成分群，合乎中医药理论的系 统观、整体观；另外，鉴于消化管和血管间的生物膜是类脂质膜，因此，本发明建立细胞膜仿 生萃取技术，提取可与模拟细胞膜(即单层脂质体)结合的有效成分群，达到中药成份的活 性化、浓缩化，并具有可直接吸收的特点。模拟唾液、模拟胃液，模拟十二指肠液和模拟胆汁 的组成成分及制备方法可如表1中所示表1模拟唾液、模拟胃液、模拟十二指肠液及模拟胆汁的组成成份及制备方法模拟唾液模拟胃液模拟十二指肠液模拟胆汁IOmL15.7mL40mL30 mL89.6g/LKClNaCl 175.3g/LNaCl 175.3g/LNaCl 175.3g/LIOmL3.0mL40mL68.3 mLKSCN20g/LNaH2P0488.8g/LNaHCO3 84.7g/LNaHCO3 84.7g/LIOmL9.2 mLIOmL4.2 mLNaH2P0488.8g/LKCl 89.6gKH2PO4 8g/LKCl 89.6g/LIOmL18mL6.3 mL0.2 mLNa3P0457g/LCaCl2.2H20 2.2g/LKCl 89.6g/LHCl 37%g/g1.7 mLIOmLIOmLIOmLNaCl 175.3g/LNH4Cl 30.6g/LMgCl2 5g/LCaCl2.2H20 22.2g/L1.8 mL8.3 mL0.18 mLNaOH40g/LHCl 37%g/gHCl 37%g/g9mLCaCl2.2H2022.2g/L8mLIOmL4mL尿素25g/L葡萄糖65g/L尿素25g/LIOmL葡萄糖醛酸2g/L3.4 mL尿素25g/LIOmL33g/L葡萄糖胺盐酸 ±k145 mg a-淀粉酶m Ig牛血清蛋白Ig牛血清蛋白1.8 g牛血清蛋白15 mg尿酸Ig胃蛋白酶3g胰酶6g胆汁50mg粘液素3g粘液素0.5 g月旨肪酶6.5±0.21.07±0.077.8±0.28.0tt0.2
用盐酸或氢氧化钾稀溶液调PH值，用超纯水定容至500mL,在4Γ下保存。需要说明的是，人体在患病时，特别是患有消化系统疾病时，消化、吸收能力下降， 影响药物的吸收，而本方法中获得的负载有中药有效成分群的单层脂质体具有高度活性 化、浓缩化、可直接吸收的特点，有助于保证药效，并减轻消化系统负荷。在推荐的实施例中，还包括将步骤2中获得的体外胃仿生消化液用孔径为 0. 45 μ m的滤膜过滤的步骤。本发明中涉及的中药可以是中药材或中药复方的粉剂或水煎液等，且每日/每次 给药量的粉剂或水煎液中均含有有效剂量的药物有效成分，在使用粉剂时，每克粉剂中依 次加入模拟唾液2. 0 3. OmL,模拟胃液90 IlOmL,模拟十二指肠液110 135mL和模拟 胆汁40 60mL ；在使用水煎液时，每mL水煎液中依次加入模拟唾液0. 01 0. 03mL,模拟 胃液0.5 0. 7mL,模拟十二直肠液0. 7 0. 9mL和模拟胆汁0. 28 0. 35mL。另外，相对 于粉剂而言，水煎剂在模拟胃液、模拟十二直肠液和模拟胆汁中的消化时间均有所下降。本发明中使用的蛋黄卵磷脂与全仿生消化液的重量体积比是0. 01g/1000mL。
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无机试剂 有机试剂 生物酶押备注
本发明中所述的超纯水是指将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离 解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水，电阻率大于18MQ*cm，或接近 18. 3MQ*cm 极限值。与现有技术相比，本发明以单层脂质体为细胞生物膜模型，以单层脂质体-水分 配体系模拟中药粉剂及水煎液在胃、肠中的全仿生消化液分别在人体胃肠中的分配、吸收 情况，以单层脂质体为固相萃取剂，提取负载有中药有效成分群的单层脂质体，更合乎中医 药理论的系统观、整体观。本发明联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术，反 应条件温和，具有保持天然产物构象及有效成分原有药效的有益效果。
具体实施例方式实施例1按传统煎煮方法获得中药水煎液，称取黄芪粉末300g，放入600mL的烧杯中，每次 加超纯水400mL，加热至沸腾并保持微沸约lh，煎煮三次，合并三次煎煮液并加热浓缩，用 0. 45 μ m滤膜过滤定容至IOOOmL,获得黄芪的水煎液IOOOmL ；取黄芪的水煎液250mL加入容量瓶中，而后向其中加入模拟唾液5mL，在37°C下恒 温下振荡5min ；而后加150mL模拟胃液，继续在37°C下振荡2h，获得405mL体外胃仿生消 化液；在所获得的405mL黄芪水煎液体外胃仿生消化液中，加入195mL十二指肠模拟液 和75mL模拟胆汁，在37°C下继续振荡7h，取消化液用0. 45 μ m滤膜抽滤，获得675mL体外 胃肠全仿生消化液；将体外胃肠全仿生消化液在4°C下恒温保存。取0. 250mg蛋黄卵磷脂，将其溶于5mL氯仿中，获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液；将上 述溶液移入具塞的圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发lOmin，使之形成均勻的多 层脂质膜，而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化；向其中加入上述步骤中获得的 全仿生消化液25mL，将其加入水浴恒温振荡器中，在37°C下振荡0. 5h，使多层脂质膜全部 进入全仿生消化液中，而后在-71 °C冷冻lh，在37°C下融化，反复冻融3次后，得到含单层脂 质体的冻融液，该单层脂质体中负载有中药有效成分群；依次用孔径为0. 45 μ m和0. 22 μ m 的滤膜抽滤所获得的全部冻融液，从冻融液中分离获得负载有中药有效成分群的单层脂质 体(固体，粒径为0. 3 0. 35 μ m)，冷冻干燥后得到1. 25mg负载有黄芪水煎液仿生消化液 中有效成分群的单层脂质体；而后重复上述步骤，每次加全仿生消化液25mL，直到675mL的 胃肠全仿生消化液都制成冷冻干燥的单层脂质体。取黄芪水煎液25mL浓缩成5mL的黄芪浓缩液，作为对照例备用。实施例2按传统煎煮方法获得双黄连水煎液，称取金银花375g、黄芩375g和连翘750g，放 入600mL的烧杯中，每次加超纯水400mL，加热至沸腾并保持微沸约lh，煎煮三次，合并三次 煎煮液并加热浓缩，用0. 45 μ m滤膜过滤定容至IOOOmL,获得双黄连水煎液IOOOmL ；取双黄连水煎液250mL加入容量瓶中，向其中加入模拟唾液2. 5mL,在36°C下恒温 下振荡6min ；而后加125mL模拟胃液，继续在36°C下振荡4h，获得377mL体外胃仿生消化 液；向上述获得377mL体外仿生胃消化液中，加入178mL十二指肠模拟液和70mL模拟胆汁，在36°C下继续振荡10h，取消化液用0. 45 4!11滤膜抽滤，获得6251^体外胃肠全仿生 消化液；将全仿生消化液在4°C下恒温保存。取0. 250mg蛋黄卵磷脂，将其溶于5. OOmL氯仿中，获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液； 将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发lOmin，使之形成均勻 的多层脂质膜，而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化；向其中加入上述步骤中获 得的全仿生消化液25mL，将其加入水浴恒温振荡器中，在36°C下振荡0. 8h，使多层脂质膜 全部进入全仿生消化液中，而后在-80°C冷冻lh，在36°C下融化，反复冻融3次后，得到含 单层脂质体的冻融液，该单层脂质体中负载有中药有效成分群；依次用孔径为0. 45 μ m和 0. 22 μ m的滤膜抽滤所得的全部冻融液，从冻融液中分离获得负载有中药有效成分群的单 层脂质体(固体，粒径为0. 3 0. 35 μ m)，冷冻干燥后得到1. 65mg负载有双黄连水煎液仿 生消化液中有效成分群的单层脂质体。而后重复上述步骤，每次加体外胃肠全仿生消化液 25mL，直到625mL的胃肠全仿生消化液都制成冷冻干燥的单层脂质体。取25mL双黄连水煎液浓缩成5mL双黄连浓缩液，作为对照例备用。实施例3准确称取2. 50g桃仁粉末于IOOOmL容量瓶，加7. 5mL唾液，在38°C水浴恒温下振 荡3min后，加270mL胃液，继续在38°C下振荡lh，获得桃仁粉末的胃仿生消化液，往其中加 332. 5mL十二指肠液和140mL胆汁，继续在38°C下振荡5h，用0. 45 μ m滤膜抽滤，获得桃仁 粉末的胃肠全仿生消化液750mL，于4°C下保存待用。取0. 250mg蛋黄卵磷脂，将其溶于5. OOmL氯仿中，获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液； 将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发lOmin，使之形成均 勻的多层脂质膜，而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化；向其中加入上述步骤中 获得的全仿生消化液25. OOmL，将其加入水浴恒温振荡器中，在38°C下振荡0. 8h，使多层脂 质膜全部进入全仿生消化液中，而后在_75°C冷冻lh，在38°C下融化，反复冻融3次后，得 到含单层脂质体的冻融液，该单层脂质体中负载有中药有效成分群，依次用孔径为0. 45 μ m 和0. 22 μ m的滤膜抽滤所得的全部冻融液，从冻融液中分离获得负载有中药有效成分群的 单层脂质体(固体，粒径为0. 3 0. 35 μ m)，冷冻干燥后得到0. 75mg负载有桃仁粉末仿生 消化液中有效成分群的单层脂质体。而后重复上述步骤，每次加全仿生消化液25mL，直到 750mL的胃肠全仿生消化液都制成冷冻干燥的单层脂质体约22. 5mg。试验例1本试验例探讨实施例1中负载有黄芪水煎液仿生消化液中有效成分群的单层脂 质体对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用，并使用实施例1中浓缩的黄芪水煎液为对照进 行试验。本试验例采用CCl4诱导小鼠急性肝损伤为模型，检测血清中丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和肝勻浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷 胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量，HE染色法对肝脏作病理检查。结果负载有黄芪水煎液 中有效成分群的单层脂质体喂食小鼠后能显著降低小鼠血清ALT、AST、肝勻浆MDA水平，升 高SOD和GSH-Px酶活性，减轻肝细胞损伤。比单纯黄芪水煎液喂食小鼠，作用时间短，疗效 更显著。实验方法
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分组与给药KM清洁剂小鼠90只，雄性，体重(18 22) g，按体重随机分成4组， 分别为正常组、CCl4模型组、25mL黄芪浓缩液组、负载25mL黄芪水煎液中有效成分群的单 层脂质体。造模前灌胃给药，负载25mL黄芪水煎液仿生消化液中有效成分群的单层脂质体 冷冻干燥后称重后以每次1. 25mg/kg灌胃，25mL黄芪水煎液组浓缩成5mL后，以5mL/kg灌 胃，每天给药1次，连续7d，正常对照组和模型组给予等量溶媒。末次给药后lh，除正常组外，其它各组小鼠按10ml/kg体重腹腔注射0. 014精 制花生油溶液，正常组注射相应体积的生理盐水，禁食18h后，自小鼠后眼眶静脉丛采血， 取肝脏、脾脏、胸腺称重作相关指标检测。观察指标(1)收集血液，分离血清检测ALT、AST水平；(2)取肝脏、脾脏、胸腺称 重，计算肝脏、脾脏、胸腺指数。(3)取肝右叶制备10%肝勻浆，分别采用相关试剂盒测MDA、SOD、GSH-Px0 (4)取 肝左叶经10%甲醛固定，进行组织病理学检查。统计分析病理组织学检查结果采用Ridit分析方法，其它数据均以均值士标准 差( Γ 土s)表示，采用ANOVA，Dun-can’ s test进行分析处理。1、黄芪提取物对小鼠血清转氨酶的影响表2结果显示，模型组小鼠血清ALT、AS水平显著升高。与模型组比较，黄芪水煎 液和负载有黄芪水煎液中有效成分群的单层脂质体均均能降低CCl4升高的ALT、AST水平。表2黄芪水煎液及有效成分群的单层脂质体对CCl4所致肝损伤小鼠血清ALT、 AST水平的影响(η= 10, T 士s)
权利要求
联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法，其特征在于，它包括以下的步骤1)在一容器中加入中药，而后加入模拟唾液，在36～38℃下振荡3～6分钟；2)而后向上述容器中加入模拟胃液，在36～38℃下继续振荡1～4小时，获得中药的体外胃仿生消化液；3)向步骤2中获得的体外胃仿生消化液中加入模拟十二指肠液和模拟胆汁，在36～38℃下继续振荡5～10小时，而后使用孔径为0.45μm的滤膜抽滤，获得体外胃肠全仿生消化液；4)取蛋黄卵磷脂，将其溶于氯仿中，获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液；将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发，使之形成均匀的多层脂质膜，而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化；向其中加入步骤3中获得的体外胃肠全仿生消化液，将其加入水浴恒温振荡器中，在36～38℃下振荡，使多层脂质膜全部进入全仿生消化液中，而后在 80～ 71℃冷冻1h，在36～38℃下融化，反复冻融3次后，得到含单层脂质体的冻融液，该单层脂质体中负载有中药有效成分群；5)依次用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜抽滤冻融液，从溶液中分离获得负载有中药有效成分群的单层脂质体。
2.根据权利要求1中所述的联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的 中药提取方法，其特征在于还包括将步骤2中获得的体外胃仿生消化液用孔径为0. 45 μ m 的滤膜过滤的步骤。
3.根据权利要求2中所述的联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术 的中药提取方法，其特征在于所述的中药为粉剂，每克粉剂中所依次加入的模拟唾液为 2. 0 3. OmL，模拟胃液为90 IlOmL,模拟十二指肠液为110 135mL，模拟胆汁为40 6 OmL ο
4.根据权利要求2中所述的联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的 中药提取方法，其特征在于所述的中药为水煎液，每mL水煎液中所依次加入的模拟唾液 为0. 01 0. 03mL，模拟胃液为0. 5 0. 7mL，模拟十二直肠液为0. 7 0. 9mL和模拟胆汁 为 0. 28 0. 35mL。
5.根据权利要求3或4中所述的联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取 技术的中药提取方法，其特征在于所使用的蛋黄卵磷脂与全仿生消化液的重量体积比是 0. 01g/1000mL。
全文摘要
本发明提供了一种联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术的中药提取方法，该中药提取方法主要包括以下的步骤在不同消化阶段按照不同消化器官在一定时间内分泌出的消化液的成份和量，加入相应的仿生消化液(模拟唾液、模拟胃液、模拟十二指肠液和模拟胆汁)，再根据中药不同剂型在人体消化器官中的排空时间合理安排各个阶段的消化时间，获得全仿生消化液；而后以单层脂质体-水分配体系模拟全仿生消化液在人体胃肠中的分配、吸收情况，得到负载有中药有效成分群的单层脂质体。本发明联合应用全仿生消化技术和细胞膜仿生固相萃取技术，反应条件温和，具有保持天然产物构象及有效成分原有药效的有益效果。
文档编号A61K36/00GK101961355SQ20091011273
公开日2011年2月2日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者李顺兴, 郑凤英 申请人:漳州师范学院