专利名称：抗人死亡受体5的单链抗体基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，尤其是涉及一种抗人死亡受体5(death rec印tor 5， DR5) 的单链抗体基因及其重组载体和表达产物。
背景技术：
单链抗体的出现是人们对抗体认识的加深和科学技术发展的必然结果。自从英国 和日本学者发现了白喉抗毒素，并首次将免疫血清用于传染病的被动免疫治疗和血清学诊
断以来，抗体技术作为一种治疗手段备受人们关注。 1975年，Kohler等(Kohler and Milstein. Nature, 1975， 256 :495)发现并利用杂 交瘤技术，成功地制备出具有高特异性和亲和力的单克隆抗体，克服了多克隆抗体特异性 差的缺点，所以单克隆抗体的出现受到人们的广泛关注，各国学者纷纷投入到单克隆抗体 的研究工作中，并期望找到诊断和治疗疾病的有效方法。目前，已经有多种单克隆抗体进入 临床使用。但是目前临床应用的单克隆抗体基本都是鼠源的，人源单克隆抗体的研究进展 缓慢。 虽然单克隆抗体技术得到了很大的发展，但是仍存在着局限性，其中最致命的缺
陷是单克隆抗体作为一种异源蛋白进入人体会引起免疫排斥反应，这不仅影响了单克隆抗
体疗效的发挥，还会干扰其在体内的正常分布，因而限制其在临床中的应用。 进入20世纪80年代后，分子生物学技术的快速发展促进了抗体技术研究的进
步，基因工程抗体应运而生，其中以单链抗体最受人们关注。自从1988年Bird等(Bird
andHuston，Procatl Acad Sci USA， 1988， 5 :5875-5879)成功研制了第一个单链抗体以来，
目前已研制成功并生产了多种单链抗体，除用于基础医学研究和疾病的体外诊断外，有一
些已开始用于临床治疗。作为一个新兴的事物，单链抗体技术现在已经成为抗体相关研究
领域的前沿和热点问题。它不仅可以对现有的抗体进行改造，还可以创造出自然界不存在
的全新的抗体，既可以降低抗体的免疫原性，还可以增强抗体的疗效。 单链抗体是用基因工程方法制备的小分子抗体，是由弹性连接肽(一般为12 15
个氨基酸)将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(、)连接而成的重组抗体，其分子量只
相当于原抗体的六分之一，但单链抗体含有全部的抗原结合位点，所以单链抗体最大程度
地保留了抗体的抗原结合活性，是具有亲本抗体抗原结合活性的最小片段。 单链抗体出现以后，人们在研究单链抗体的过程中，发现单链抗体具有的一些无
可比拟的优越性，所以人们就利用现有技术对单链抗体进行了改造和修饰，以完善单链
抗体的功能和发展新的用途，目前已经出现的基于单链抗体而开发出来的新抗体有以下
几种单链抗体多聚体、双特异性单链抗体、单域抗体、具有恒定区的单链抗体、胞内抗体
(intracellular antibodyor intrabody)。其中胞内抗体技术是近年来，随着人们对抗体
工程和细胞内信号传导的深入研究，派生出的一项全新的可阻断细胞内重要靶蛋白的抗体
技术。因而，单链抗体技术及其衍生技术的发展，为肿瘤、免疫相关疾病的诊断、治疗和研究
奠定了基础。
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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL(Tumor necrosis factor-Related
Apoptosis InducingLigand)是新近发现的TNF超家族的又一成员。与TNF家族其他成员
不同的是，TRAIL在体内仅以膜结合型存在。体外实验表明，无论膜结合型的，还是可溶型
的TRAIL,都能迅速诱导表达TRAIL特异性受体的细胞发生凋亡。体内外实验表明，TRAIL
与死亡受体结合可选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常细胞无明显的杀伤作
用。这一特性使其优于TNF配体家族的其它成员，成为肿瘤治疗的新动力。 DR5又称TRAIL-R2，属I型跨膜蛋白，富含半胱氨酸的结构域及死亡结构域。多项
研究成果表明，DR5在正常细胞和肿瘤细胞中都有表达，如在胎儿的肝、肺，以及成人的淋巴
细胞、肝、卵巢、脾和肺中等部位，尤其高水平地表达于许多肿瘤组织，如甲状腺癌、咽喉癌、
肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、直肠癌等。 1995年Wiley在Immunity, 1995， 3 (6) :673中克隆并发现了肿瘤坏死因子相关诱
导配体(Tumor necrosis factor related即optosis-inducing ligand， TRAIL)基因，由
Pitti等证实并又命名为Apo-2L。 TRAIL广泛表达于正常人的各种组织，如外周血淋巴细
胞、肺、肾、脾、胸腺、前列腺、卵巢、小肠、心脏、胎盘、骨骼肌等，而在脑、肝和睾丸中未检测 到表达。目前已知TRAIL有两种形式膜结合型TRAIL (全长的TRAIL)和可溶型TRAIL (胞 外区C端的168个氨基酸)，它们在体外均能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，作用范围很广。
2001年Ichikawa在Nat. Med. ，2001,7 :954中制备出人DR5特异的竞争性单克隆 抗体(Agonistic monoclonal antibody specific for human DR5， TRA-8)，这是特异性 针对人细胞膜表面的死亡受体DR5而合成的单克隆抗体，它与一般的抗人DR5的单克隆抗 体(Monoclonalantibody against human DR5)不同，它能特异性地与死亡受体DR5相结 合，发挥配体的作用，从而诱导细胞凋亡。制备该单抗的过程为，将人DR5的细胞外区和人 IgGl (DR5-Ig)的Fc段组成融合蛋白来免疫雌性BALB/c小鼠，从而合成了 TRA-8这种单克 隆抗体。实验证明，TRA-8能诱导许多表达DR5受体的肿瘤细胞的凋亡，而对正常组织细胞 无毒性，并且用Western-blot法分析，TRA-8不会与其他的死亡受体发生交叉反应。
由于死亡受体DR5在细胞分布及作用机制的独特性，已为人们在研究肿瘤细胞凋 亡的方向上提供了良好的前景，随着对死亡受体DR5及其配体的深入研究，人们发现在抗 癌治疗上也存在着某些问题，如TRAIL对肝癌的耐药性，及它对肝细胞的毒性等，目前已成 为人们着力探讨的课题。而TRA-8也正处于研制当中，但是对DR5受体的新配体的不断探 索，加深了人们对DR5受体在肿瘤细胞凋亡的发生、发展及治疗方面的认识，并为全新的肿 瘤治疗方案提供了广阔的理论依据。
发明内容
本发明的目的是提供抗人死亡受体5的单链抗体(aDR5-scFv)基因。
本发明的另一目的是提供所述抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法。
本发明的另一 目的是提供所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因在制备抗肿瘤 药物中应用。 所述抗人死亡受体5的单链抗体基因，是由连接肽连接抗体的轻链(VJ和重链 (VH)基因建立，所述抗人死亡受体5的单链抗体基因由726个碱基组成，
其核苷酸序列为
13tgCElggtcCElgctgCElgc朋tctcctgagctggtg朋gcct49ggggetteagtgatetectgc朋ggettctggctat3CCttc97agetactatateC3Ctgggtg朋gCElg￡lggcctgg￡iCElgggccttgag145tggattgg￡itatatttatcct3gag￡ltggtElgtact朋ttac朋tgag193朋gttc朋gggc朋ggccctgactgCElg￡lCtectecage241gcctacEltgCElgetcageagectgtctg￡lgg￡lCtctgCElgtctat289ttctgtgCEl￡igggccetctatgatggtC3CtacgtgggggetEltgg￡lC337tactggggtc朋gg￡iggtggctctgggggtggtageggt385gg￡iggcgggElgtggggccatttecCElggetgttgtgactCElgg朋tct433gCEletc3CCteacctggtg朋gtcetcacttgtcgctea481Elgtactggggetgtt3CCElgt朋ctatgcctgggtcg朋529CC3g￡ltcatttattcactggtetaateggtggt3CCCg￡l577getCC3ggtgttcctgcc3gaateteaggctecctgattg￡lC朋g625getgccetc3CCateggggetCElgactgagg￡ltgaggCElatetat673ttctgtgttetatggtacage朋ccattgggtgttcggtgg￡i3CC721aaactg其氨基酸序列为1METGlyGinValGinLeuGinGinSerGlyProGluLeuValLysPro17GlyAlaSerValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr33SerTyrTyrlieHisTrpValLysGinArgProGlyGinGlyLeuGlu49TrplieGlyTyrlieTyrProArgAspGlySerThrAsnTyrAsnGlu65LysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspThrSerSerSerThr81AlaTyrMETGinLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyr97PheCysAlaArgAlaLeuTyrAspGlyHisTyrValGlyAlaMETAsp113TyrTrpGlyGinGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly129GlyGlyGlySerGlyAlalieSerGinAlaValValThrGinGluSer145AlaLeuThrThrSerProGlyGluThrValThrLeuThrCysArgSer161SerThrGlyAlaValThrThrSerAsnTyrAlaAsnTrpValGinGlu177LysProAspHisLeuPheThrGlyLeulieGlyGlyThrAsnAsnArg193AlaProGlyValProAlaArglieSerGlySerLeulieGlyAspLys209AlaAlaLeuThrlieThrGlyAlaGinThrGluAspGluAlalieTyr225PheCysValLeuTrpTyrSerAsnHisTrpValPheGlyGlyGlyThr241LysLeu(女:终止密码子:)所述抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法包括以下步骤1)--个制备抗人DR5的单克隆抗体的步骤；2)--个克隆抗体可变区基因的步骤;3)--个对获得的基因片段进行测序分析的步骤；4)—-个用连接肽(Linker)连接抗体轻链、重链可变区基因的步骤；
5) —个构建表达载体的步骤；
6) —个制备重组抗体的步骤。 所述制备抗人DR5的单克隆抗体的步骤是用人DR5蛋白免疫8周龄的Balb/c小 鼠，经脾细胞和骨髓瘤细胞融合获得稳定分泌抗人DR5单克隆抗体(aDR5 mAb)的杂交瘤细 胞株。 所述克隆抗体可变区基因的步骤是从杂交瘤细胞株中提取mRNA，用Novagen公 司抗体通用引物试剂盒提供的引物，通过RT-PCR法克隆出该单克隆抗体轻、重链可变区基 因。 所述对获得的基因片段进行测序分析的步骤是将获得的基因片段分别克隆到商 业化的T载体(pMD19-T simple vector, TaKaRa)，进行序列分析，经同源对比分析，证实该 基因片段为抗体可变区基因。 所述用连接肽(Linker)连接抗体轻链、重链可变区基因的步骤是设计引物，以15 个氨基酸的柔性连接肽将抗体轻、重链可变区基因连接起来，构建成scFv基因。
所述构建表达载体的步骤是将scFv基因克隆到商业化的pET-22b (+)载体上，转 化Rosetta-gami大肠杆菌宿主，获得转化菌株为工程菌株Rosetta-gami-aDR5-scFv。
所述制备重组抗体的步骤是用LB液体培养基培养工程菌株，经IPTG诱导表达 12h，表达效率达30X以上。经过破菌、过镍柱纯化等步骤纯化后，获得该发明的分子量为 30kD的重组单链抗体。 所述抗人死亡受体5的单链抗体基因可在制备抗肿瘤药物中应用。 所述单链抗体具有两个抗原结合臂，可同时与T细胞及靶细胞结合，并激活细胞
毒性T细胞杀伤病变细胞。单链抗体分子量只相当于完整抗体的1/6，在临床应用上比完整
抗体优越，免疫原性弱，对实体瘤渗透能力强，可用基因工程手段发酵生产。与传统的单克
隆抗体药物相比，可进行大规模细菌发酵生产，价格低，易于普及应用，是一种极具应用潜
力的抗体形式。 本发明提供的抗DR5单链抗体(aDR5-scFv)是有实际应用价值的单链抗体 (single-chainFv，scFv) 。 aDR5-scFv是由一条连接肽将aDR5mAb轻链(VL)和重链(VH)基 因连在一起所形成的单一肽链，通过正确折叠，两个可变区由非共价键形成具有抗原结合 功能的片段，aDR5-scFv分子量小，易穿入固体组织及肿瘤内部，且保留亲本抗体结合抗原 的特性和功能，因而是一种具有潜在应用价值的免疫治疗制剂。
图1为抗人DR5单链抗体(aDR5-scFv)基因工程菌表达分析图。在图1中，l，未 诱导大肠杆菌总蛋白；2，IPTG诱导lh表达蛋白；3，IPTG诱导3h表达蛋白；4，IPTG诱导6h 表达蛋白；5， IPTG诱导12h表达蛋白；6，纯化后的scFv;7，蛋白分子量标准。经蛋白扫描 分析，IPTG诱导l 12h scFv的表达量分别占菌体总蛋白的24X，28X，33X，35X，完全 满足工程菌表达蛋白的要求。
具体实施例方式
1.抗人DR5杂交瘤细胞株的制备人DR5蛋白lOOii L(约45ii g)与等量弗氏完全佐剂进行乳化，充分混合至油 包水状。于8周龄雌性Balb/c小鼠背部皮下多点注射。每隔2周以相同剂量的DR5加等 量弗氏不完全佐剂加强免疫2次。15天后，腹腔注射人DR5(50iig)与弗氏不完全佐剂混合 物。末次加强免疫4天后经眼球取血，间接ELISA法测定小鼠血清中抗sDR5抗体的效价， 挑选抗血清效价高的小鼠经尾静脉注射重组人DR5蛋白100 ii L加强免疫，3天后进行细胞 融合。 加强免疫3天后，取抗血清效价高的已免疫Balb/c小鼠，眼球取血(取血清留作 阳性对照)后，脱颈处死小鼠，75%酒精浸泡消毒皮肤，无菌取脾，挤压出脾细胞，加入20mL GKN溶液于平皿中，10mL吸管吹散脾细胞团块，将细胞悬液移至50mL离心管，制备免疫脾细 胞。取骨髓瘤细胞Sp2/0于另一离心管，1500r/min离心5min弃上清后，分别加入GKN溶液 20mL，计数，同时1500r/min离心5min。根据计数结果，调整脾细胞骨髓瘤细胞=6 : 1， 且脾细胞浓度为3 X 106/mL。混合两种细胞后，1500r/min离心5min弃上清，弹散管底细胞， 离心管置于37t:水浴中，lmin内缓慢加入50% PEG溶液lmL(边加边轻轻搅动)，静置40s， lmin内加入lmLGKN溶液(边加边轻轻搅动)，随后以同法再在2min内加入5mLGKN， 2min 内加入10mL GKN溶液。将上述细胞悬液800r/min离心7min，弃上清，轻轻弹散管底细胞， 加入所需20% HAT培养液，混匀后加入已铺滋养细胞的96孔板中，置于37°C C02培养箱中 培养。 融合后第二天补加HAT培养液。融合一周后换液一次，补加含HAT的RPMI 1640 完全培养液。HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液培养两周，接下来改用一般培 养液。于杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时(约第10天)检测特异性抗体的产生。以sDR5 蛋白包被酶标板，间接ELISA法筛选阳性克隆。 经ELISA检测筛选到阳性杂交瘤的当日即采用有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞 进行克隆化。在克隆化前一天，先以正常小鼠脾制备饲养细胞，铺96孔板，制备方法同融合 实验。将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，取少许细胞悬液至 另一无菌试管中，取该试管中的细胞进行准确计数。取300个细胞悬浮于6mL培养液中(约 5个细胞/0. lmL)，接种96孔培养板，0. lmL/孔，共32孔，余下2. 8mL，再加入3. 2mL培养液， 共6mL (约2. 5个细胞/0. lmL)接种96孔培养板，0. lmL/孔，共32孔，最后剩余2. 8mL，再 加入3. 2mL培养液，共6mL (约1. 25个细胞/0. lmL)，接种32孔培养板0. lmL/孔。将培养 板置于含5% C02的37t:培养箱中培养，5天左右在显微镜下观察到细胞克隆。培养7 10 天后，ELISA检测筛选阳性克隆，再次克隆化。克隆化检测两次100%阳性后，挑取效价高的 阳性单克隆杂交瘤细胞转入24孔细胞培养板进行扩大培养，同时须冻存几支单克隆细胞 备用。 2.抗体可变区基因、和VH的克隆 筛选出一株分泌可诱导肿瘤细胞凋亡的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以含10%胎 牛血清的RPMI 1640培养至对数生长期，1000rpm，离心5min收集5X 106个细胞，然后按照 AmershamBiosciences公司的"RNA分离纯化试剂盒"提取杂交瘤细胞的总RNA并分离纯化 mRNA，使用Novagen公司抗体通用引物试剂盒提供的引物，进行逆转录和PCR。
逆转录条件为7(TC保温10min后迅速在冰上急冷5min，42t:保温lh，7(TC保温 15min后冰上冷却，得到的cDNA直接用于PCR扩增。PCR条件为94。C保温lmin，58t:保温
850s， 72t:保温2min，共30个循环，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析后回收目的片段，并
与pMD-T Simple Vector相连接，测序鉴定。 3.抗体基因VH、、的连接肽和scFv基因构建 根据序列测定获得的VH与、基因序列的氨基端及羧基端序列，设计构建scFv的 引物，并通过引物带入连接肽序列
VH正义链引物为 5' -AAAACCATGGGACAGGTCCAGCTGCAGCAATCTGGACCTGAG-3'
(CCATGG为Ncol酶切位点)
VH反义链引物为5 ' - GCT4CC4CCaXTCC4G4rCCGCCACCTCC
TCCTTGACCCCAGTAGTCCATAGCC-3'
、正义链引物为 5 爿rCTGG^(7G( CF(Frc;G7^(7CGGTGGAGGCGGGAGT
GGGGCCATTTCCCAGGCTGT-3'
、反义链引物为 5' -AAAACTCGAGCAGTTTGGTTCCTCCACCGAACACCCAATGG-3'
(CTCGAG为Xho I酶切位点) 其中，VH反义链引物和VL正义链引物中黑体部分为连接肽，经PCR反应扩增，斜 体黑体部分为互补序列，为构建scFv而设计。 PCR反应条件为94。C 5min;然后94。C lmin，60。C 50s，72。C 2min，30个循环； 最后72t: 10min。将延伸后的PCR产物电泳回收后，overlap PCR进一步构建scFv基因。 在PCR管中加入上述PCR产物、Taq酶和缓冲液，在不加入引物的情况下进行10个循环 94°C 2min，58°C lmin，72°C lmin。在此过程中，VH反义链引物和、正义链引物的互补序 列进行互补配对，延伸后形成完整的VH-连接肽-VL。最后加入VH正义链引物和VL反义链 引物进行以下反应94。C 5min ;94。C lmin，60。C 50s，72。C lmin， 30个循环；72。C 10min， 最终获得scFv基因序列。
4.构建scFv基因的重组表达载体 限制性内切酶Ncol和Xhol分别消化表达载体pET-22b (+)与aDR5-scFv基因序 列，纯化回收后按摩尔浓度1 : 10比例混合表达载体和scFv基因，用T4DNA连接酶连接载 体和scFv基因，获得重组表达载体pET-22b (+) -aDR5-scFv。
5.表达aDR5-scFv重组蛋白 将重组表达载体pET-22b (+) -aDR5-scFv转化DH5 a感受态大肠杆菌，氨节青霉素 LB液体培养基培养筛选，双酶切鉴定并进行测序鉴定。阳性克隆扩大培养，提取表达载体质 粒转化Rosetta-gami感受态大肠杆菌，37。C培养，当培养至0D6。。约为0. 6时，加入IPTG使 其终浓度为0. 6mM，诱导12h。 8000rpm 4。C离心20min收集菌体，以15%的SDS-PAGE分析 aDR5-scFv重组蛋白表达情况。
序列表 抗人死亡受体5的单链抗体(aDR5-scFv)基因的核苷酸序列为 1 atg gga cag gtc cag ctg cag caa tct gga cct gag ctg gtg aag cct
49ggggetteagtg朋gatetectgc朋ggettctggctat3CCttc97agetactatateC3Ctgggtg朋gCElg￡lggcctCElgggccttgag145tggattgg￡itatatttatcct3gag￡ltggtElgtact朋ttac朋tgag193朋gttc朋gggc朋ggccctgactgCElg￡lCtectecage241gcctacEltgCElgetcageagectgtctg￡lgg￡lCtctgCElgtctat289ttctgtgCEl￡igggccetctatgatggtC3CtacgtgggggetEltgg￡lC337tactggggtc朋gg￡iggtggctctgggggtggtageggt385gg￡iggcgggElgtggggccatttecCElggetgttgtgactCElgg朋tct433gCEletc3CCteacctggtg朋gtcetcacttgtcgctea481Elgtactggggetgtt3CCElgt朋ctatgcctgggtcg朋529CC3g￡ltcatttattcactggtetaateggtggt3CCCg￡l577getCC3ggtgttcctgcc3gaateteaggctecctgattg￡lC朋g625getgccetc3CCateggggetCElgactgagg￡ltgaggCElatetat673ttctgtgttetatggtacage朋ccattgggtgttcggtgg￡i3CC721aaactg抗人死亡受体5的单链抗体(aDR5-scFv)基因的氨基酸序列为1METGlyGinValGinLeuGinGinSerGlyProGluLeuValLysPro17GlyAlaSerValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr33SerTyrTyrlieHisTrpValLysGinArgProGlyGinGlyLeuGlu49TrplieGlyTyrlieTyrProArgAspGlySerThrAsnTyrAsnGlu65LysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspThrSerSerSerThr81AlaTyrMETGinLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyr97PheCysAlaArgAlaLeuTyrAspGlyHisTyrValGlyAlaMETAsp113TyrTrpGlyGinGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly129GlyGlyGlySerGlyAlalieSerGinAlaValValThrGinGluSer145AlaLeuThrThrSerProGlyGluThrValThrLeuThrCysArgSer161SerThrGlyAlaValThrThrSerAsnTyrAlaAsnTrpValGinGlu177LysProAspHisLeuPheThrGlyLeulieGlyGlyThrAsnAsnArg193AlaProGlyValProAlaArglieSerGlySerLeulieGlyAspLys209AlaAlaLeuThrlieThrGlyAlaGinThrGluAspGluAlalieTyr225PheCysValLeuTrpTyrSerAsnHisTrpValPheGlyGlyGlyThr241LysLeu* 。(女:终止密码子)
权利要求
抗人死亡受体5的单链抗体基因，其特征在于由连接肽连接抗体的轻链和重链基因建立，由726个碱基组成其核苷酸序列为1atg gga cag gtc cag ctg cag caa tct gga cct gag ctg gtg aag cct49 ggg gct tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggc tat acc ttc aca97 agc tac tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggc ctt gag145 tgg att gga tat att tat cct aga gat ggt agt act aat tac aat gag193 aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aca tcc tcc agc aca241 gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat289 ttc tgt gca agg gcc ctc tat gat ggt cac tac gtg ggg gct atg gac337 tac tgg ggt caa gga gga ggt ggc gga tct gga ggg ggt ggt agc ggt385 gga ggc ggg agt ggg gcc att tcc cag gct gtt gtg act cag gaa tct433 gca ctc acc aca tca cct ggt gaa aca gtc aca ctc act tgt cgc tca481 agt act ggg gct gtt aca acc agt aac tat gcc aac tgg gtc caa gaa529 aaa cca gat cat tta ttc act ggt cta ata ggt ggt acc aac aac cga577 gct cca ggt gtt cct gcc aga atc tca ggc tcc ctg att gga gac aag625 gct gcc ctc acc atc aca ggg gct cag act gag gat gag gca ata tat673 ttc tgt gtt cta tgg tac agc aac cat tgg gtg ttc ggt gga gga acc721 aaa ctg；其氨基酸序列为1 MET Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro17Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr33Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu49Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu65Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr81Ala Tyr MET Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr97Phe Cys Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Gly His Tyr Val Gly Ala MET Asp113 Tyr Trp Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly129Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser145Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser161Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu177Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg193Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Ile Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys209Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr225Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr241Lys Leu＊。
2.如权利要求1所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法，其特征在于包括 以下步骤1) 一个制备抗人DR5的单克隆抗体的步骤；2) —个克隆抗体可变区基因的步骤；3) —个对获得的基因片段进行测序分析的步骤；4) 一个用连接肽(Linker)连接抗体轻链、重链可变区基因的步骤；5) —个构建表达载体的步骤；6) —个制备重组抗体的步骤。
3. 如权利要求2所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法，其特征在于所述 制备抗人DR5的单克隆抗体的步骤是用人DR5蛋白免疫8周龄的Balb/c小鼠，经脾细胞和 骨髓瘤细胞融合获得稳定分泌抗人DR5单克隆抗体(aDR5mAb)的杂交瘤细胞株。
4. 如权利要求2所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法，其特征在于所述 克隆抗体可变区基因的步骤是从杂交瘤细胞株中提取mRNA，用Novagen公司抗体通用引物 试剂盒提供的引物，通过RT-PCR法克隆出该单克隆抗体轻、重链可变区基因。
5. 如权利要求2所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法，其特征在于所述 对获得的基因片段进行测序分析的步骤是将获得的基因片段分别克隆到商业化的T载体 (pMD19-T simple vector, TaKaRa)，进行序列分析，经同源对比分析，证实该基因片段为抗 体可变区基因。
6. 如权利要求2所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法，其特征在于所述 用连接肽(Linker)连接抗体轻链、重链可变区基因的步骤是设计引物，以15个氨基酸的柔 性连接肽将抗体轻、重链可变区基因连接起来，构建成scFv基因。
7. 如权利要求2所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法，其特征在 于所述构建表达载体的步骤是将scFv基因克隆到商业化的pET-22b(+)载体上，转化 Rosetta-gami大肠杆菌宿主，获得转化菌株为工程菌株Rosetta-gami-aDR5-scFv。
8. 如权利要求2所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因的制备方法，其特征在于所述 制备重组抗体的步骤是用LB液体培养基培养工程菌株，经IPTG诱导表达12h，表达效率达 30%以上。经过破菌、过镍柱纯化等步骤纯化后，获得该发明的分子量为3. 0kD的重组单链 抗体。
9. 如权利要求1所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因在制备抗肿瘤药物中应用。
全文摘要
抗人死亡受体5的单链抗体基因，涉及一种基因。提供抗人死亡受体5的单链抗体(aDR5-scFv)基因及制备方法与应用。所述抗人死亡受体5的单链抗体基因，是由连接肽连接抗体的轻链(VL)和重链(VH)基因建立，所述抗人死亡受体5的单链抗体基因由726个碱基组成。一个制备抗人DR5的单克隆抗体的步骤；一个克隆抗体可变区基因的步骤；一个对获得的基因片段进行测序分析的步骤；一个用连接肽(Linker)连接抗体轻链、重链可变区基因的步骤；一个构建表达载体的步骤；一个制备重组抗体的步骤。所述的抗人死亡受体5的单链抗体基因在制备抗肿瘤药物中应用。
文档编号A61K39/395GK101717775SQ200910112798
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者庄国洪, 张佳锴 申请人:厦门大学