靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法、其产品及含有该产品的注射剂的制作方法

专利名称：靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法、其产品及含有该产品的注射剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种耙向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，具 体涉及氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物的制备方法；本发明 还涉及由这种方法制得的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物以及以该 产品为活性成分的注射剂。
背景技术：
氯化两面针碱(l，英文名nitidine chloride),结构如下述l式所示， 为苯并菲啶类生物碱，黄色或淡黄绿色针状结晶。1980年，黄志勋等(化 学学报，1980， 38 (6): 535.)从芸香科花椒属植物两面针(Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC)根的干燥粉末中分离得到氯化两面针碱以及其它5 种生物碱，并通过动物实验发现氯化两面针碱能够延长艾氏腹水癌小鼠的 生命，对小鼠艾氏腹水癌的抑制率达到279%，对小鼠肝癌腹水也有效。氯 化两面针碱具有广谱的抗肿瘤活性，对Lewis肺癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺 癌和慢性细胞型白血病等均有治疗效果。<formula>formula see original document page 5</formula>
我们对氯化两面针碱的抗肿瘤活性进行了初步的研究，发现其抗癌活
性很强，对口腔上皮癌KB细胞(时珍国医国药，2007， 9: 2104)、乳腺癌 MDA-MB-231、肝癌bel-7402、鼻咽癌ECV2和7111 (华西药学杂志，2007， 22(5):514)、舌癌Tca8113和肺癌spc-a-l(中国药理学通报，2007， 23(2): 279)等均有明显的抑制率，其IG。为0. 28 2. 7 u g/mL，且对耐药株KBV200 (中国药理学与毒理学杂志，2007， 21(6): 512)也有较强的杀伤作用，能 够引起肿瘤细胞凋亡，在抗肿瘤治疗方面具有非常广泛的开发利用价值和 应用前景。但是，氯化两面针碱存在水溶性差(0.2 mg/mL)和毒副作用 较强的缺点，这就极大地限制了氯化两面针碱在抗肿瘤治疗药物方面的研 究、开发和应用。碳纳米管(carbon nanotubes， CNT)是一类具有完美石墨结构的管 形碳材料，包括单壁碳纳米管(single-walled CNT， SWNT)和多壁碳纳 米管(multi-walled CNT， MWNT)，均具有优异的导电性、电磁特性和力 学性能，在储氢和光电转换功能材料等方面的应用得到了极大的发展；并 且由于碳纳米管在细胞和生物体内具有很低的细胞毒性和很好的生物兼 容性(Nature, 2008， 3: 216)，这使得它在生物和医学领域获得了广泛 的应用研究，例如在生物传感器、药物载体、体内成像和分子诊断以及DNA 调整等方面的应用。其中，单壁碳纳米管(S丽T)的外径范围为O. 5 3. 0 mn，长度范围为1.0 15.0 " m，经过氧化或超声剪裁后，可以获得更短 的单壁碳纳米管。经修饰后的单壁碳纳米管可以增加药物在水溶液中的溶 解度，而且可以实现该药物对肿瘤组织的被动靶向给药，降低毒副作用。 目前有关抗癌药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物及其制备 方法，尚未有公开的成果和技术报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中抗肿瘤药物氯化两面针 碱存在的水溶性差和毒副作用较大的不足，提供一种溶解度大、毒副作用 小的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法及其产品，以及含有 该产品的注射剂。
本发明靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，将氯化两面 针碱进行预处理得到羧酸修饰的氯化两面针碱，然后用双亲性聚合物对裁 剪至20 500 nm长的单壁碳纳米管的外壁进行非共价功能化修饰；再将 羧酸修饰的氯化两面针碱与功能化修饰后的单壁碳纳米管通过酯化和酰 胺化反应进行偶联，即得到靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管 的水溶性复合物。
优选的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法为包括以下
步骤，其中步骤(1)和步骤(2)可以不分前后
(1)氯化两面针碱的预处理
① 在惰性气体保护下，将氯化两面针碱加入到浓的氢卤酸中，使氯化
两面针碱的浓度为1. OX 10" 1. 0 mol/L,边搅拌边升温到50 200 。C反 应l 72h，反应结束后，以氨水调节混合溶液的pH值为碱性，用二氯甲 烷溶剂对反应混合物反复萃取三次，将水相溶剂蒸干，剩余物用甲醇或乙 醇溶解，加盐酸调节pH值为2 3，放置，析晶，即得到C-8和/或C-9 位置的甲氧基被羟基取代的氯化两面针碱晶体；
② 将上述得到的羟基取代的氯化两面针碱与二元羧酸或羟基羧酸化 合物按1:1 1:20的摩尔比溶解在极性溶剂中，反应0.5 48h后，蒸干 溶剂，所得固体以去离子水溶解，过滤，所得沉淀溶解于丙酮中，然后缓 慢加入去离子水，放置，析晶，即得到C-8和/或C-9位置被二元羧酸或 羟基羧酸酯化的氯化两面针碱晶体；
6(2)单壁碳纳米管的功能化修饰
① 将单壁碳纳米管的长度裁剪至20 500 nm备用，优选裁剪至50 200 nm;
② 将两亲表面活性剂与二元羧酸或羟基羧酸按1:1 1:20的摩尔比 溶解在除水除氧的有机溶剂中，反应2 72h后，蒸干溶剂，所得固体溶 解于去离子水中，以超滤膜透析6 96 h，固体以真空冷冻干燥法制成粉 末，得到干燥的羧酸修饰的两亲表面活性剂；
③ 在惰性气体保护下，在冰浴或冰盐浴中，将上述获得的羧酸修饰 的两亲表面活性剂和活化剂按1: 1 10:1的摩尔比溶解于除水除氧的有机 溶剂中，充分搅拌0.5 6 h;然后加入催化剂和聚乙二醇修饰剂，继续 搅拌反应6 72 h;反应结束后，将有机溶剂蒸干，加入去离子水进行充 分溶解，接着以孔径为0.22 um的微孔滤膜过滤除去催化剂，以超滤膜 透析6 72 h除去过量的聚乙二醇修饰剂，得到聚乙二醇修饰剂进一步修 饰的两亲表面活性剂溶液；所述加入的催化剂与羧酸修饰的两亲表面活性 剂的摩尔比为1:10 1:1，所述加入的聚乙二醇修饰剂与羧酸修饰的两亲 表面活性剂的摩尔比为1:10 10:1;
将经过剪裁的单壁碳纳米管与步骤③中所得到的聚乙二醇修饰剂 进一步修饰的两亲表面活性剂溶液加入到适量除水除氧的有机溶剂中，使 单壁碳纳米管的浓度为0. 01 20. 0 mg/mL,聚乙二醇修饰剂进一步修饰的 两亲表面活性剂的浓度为O. 1 10.0 mmol/mL;超声振荡30 1000 min， 频率为40 100kHz，然后将混合溶液在10000Xg 30000Xg的离心力下 离心1 24 h，接着以超滤膜透析6 72 h来除去过量的聚乙二醇修饰剂 进一步修饰的两亲表面活性剂，干燥，即得到非共价功能化修饰的水溶性 单壁碳纳米管；
(3)在惰性气体保护下，将步骤(1)得到的经羧酸修饰的氯化两面 针碱，与非共价功能化修饰的水溶性单壁碳纳米管，溶解在适量除水除氧 后的有机溶剂中，使经羧酸修饰的氯化两面针碱的浓度为0. 1 50.0 mmol/L，非共价功能化修饰的水溶性单壁碳纳米管的浓度为10 1000 mg/L;然后加入活化剂和催化剂，充分搅拌反应0.5 48h后，向混合反 应液中加入pH为7.2 7.4的1XPBS磷酸盐缓冲溶液，以3 10 kDa 的超滤膜透析1 48 h除去未参与反应的羧酸修饰的氯化两面针碱，收集 产物，干燥，即得到靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶 性复合物；所述加入的活化剂与经羧酸修饰的氯化两面针碱的摩尔比为 1:1 5:1，所述加入的催化剂与经羧酸修饰的氯化两面针碱的摩尔比为 1:1 5:1。
上述制备方法中，
所述的惰性保护气体为氮气、氦气、氖气或氩气； 所述的浓氢卤酸为选自浓盐酸、浓氢溴酸和浓氢碘酸中的任意一种；所述的二元羧酸为选自草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚 二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、顺丁烯二酸、邻苯二甲酸以及对苯二酸 中的任意一种；
所述的羟基羧酸为选自酒石酸、柠檬酸以及苹果酸中的任意一种； 所述的极性溶剂为选自酰胺类、氯仿、吡啶、吡咯、二甲基亚砜(DMSO) 中的任意一种；
所述的除水除氧的有机溶剂为选自烷烃、卤代垸、苯、垸基苯、卤代 苯、腈类、酰胺类、酯类、二甲基亚砜、吡啶、吡咯、二硫化碳、四氢呋 喃、四氢化萘、十氢化萘以及六氢吡啶中的任意一种；
所述活化剂为选自N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、 N，N'-二异丙基 碳二酰亚胺(DIC)和1_(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐 (EDC)中的任意一种；
所述的催化剂为选自4-羟基苯并三唑(H0Bt)、 4-二甲氨基吡啶 (DMAP)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N， N， N， ， N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU) 以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的任意一种。
其中，步骤(1)的第①步中，以氨水调节混合溶液的pH值为碱性， 优选调节该混合溶液的pH值为9 10。
其中，步骤(2)的第①步中，所述的单壁碳纳米管可以是由化学气 相沉积法(CVD)、催化热解、电弧放电、模板法或高压一氧化碳歧化法 (HiPco)制备得到的、外径尺寸为0.5 3.0nm，长度尺寸为1. 0 15. 0 lim的单壁碳纳米管；
单壁碳纳米管的剪裁方法可以是超声波振荡、强氧化剂处理中的单独 一种或者两种方法联合使用；其中，超声波剪裁方法具体可为将单壁碳 纳米管进行超声波振荡10 2000 min，频率为40 100 kHz，抽滤， 以去离子水反复洗涤至中性，干燥，以得到所需长度的单壁碳纳米管；强 氧化剂剪裁方法具体可为将单壁碳纳米管与强氧化剂溶液混合，在20 200 t温度下反应10 1000 min;抽滤，以去离子水反复洗涤至中性， 干燥，以得到所需长度的单壁碳纳米管；
所述强氧化剂处理时使用的强氧化剂可以是浓硝酸、1:10 10:1摩 尔比的硝酸和硫酸的混合溶液、1:10 10:1摩尔比的过氧化氢和硫酸的 混合溶液、1:10 10:1摩尔比的高锰酸钾和硫酸的混合溶液或者是 1:10 10:1摩尔比的高锰酸钾和硝酸的混合溶液。
其中，步骤(2)的第②步中，所述的两亲表面活性剂是指一端为疏 水基，另一端为胺基或羟基的表面活性剂；具体可以是选自生物素聚乙二 醇胺基(Biotin-PEG-,2，分子量为2 5 kDa)、 Fmoc-NH-聚乙二醇胺基 (FM0C-NH-PEG-NH2 ，分子量为5 kDa ) 、 Fmoc-NH-聚乙二醇羟基 (FM0C-NH-PEG-0H，分子量为5 kDa)、 二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙 二醇胺基(DSPE-PEG-NH2，分子量为3 10 kDa)以及二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG，分子量为3 10 kDa)中的任意一种；
所述的羧酸修饰的两亲表面活性剂是指二元羧酸或羟基羧酸的羧基 与两亲表面活性剂的端羟基或端胺基发生发生酯化或者酰胺化反应生成
白勺聚合物。
其中，步骤(2)的第③步中，所述的聚乙二醇修饰剂为选自分子量 为5 40 kDa的多臂聚乙二醇胺基、分子量为5 40 kDa的多臂聚乙二醇 羟基、分子量为2 10 kDa的a，"-双端胺基聚乙二醇(NH2-PEG_NH2) 以及分子量为2 7 kDa的a-羟基-"-胺基聚乙二醇(HO-PEG-NH2)中的 任意一种。
本发明还包括由上述制备方法制备得到的水溶性抗肿瘤药氯化两面 针碱复合物。
本发明还提供一种靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物注射液，它含
有
(a) 0. 1 10 g/L的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管 的水溶性复合物；
(b) 药学上可接受的溶剂或辅料。 其中溶剂为注射用水，辅料为聚醚F-68。
耙向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物注射液的制备方法为先取适量 聚醚F-68配制质量百分比为0. 1 10%的聚醚F-68水溶液，再称取适量 靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物溶于聚醚 F-68水溶液中，使其浓度为O. 1 10 g/L，定量灌封，即得成品注射液。
本发明还提供一种耙向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物粉针剂，它是 由耙向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物和水溶 性药用辅料制备而成，其中耙向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管 的水溶性复合物的质量百分比含量为0. 1 10%。
其中，所述水溶性药用辅料为磷酯、聚醚F-68、支架剂和胆固醇； 或者是磷酯、聚醚F-68、支架剂和单硬酸甘油酯。辅料中，所述磷脂可 为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂；所述支架剂为选自葡萄糖、乳糖、氨基乙酸、 山梨糖和山梨醇中任意一种。
当粉针剂由靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性 复合物(以下简称水溶性复合物)与磷酯、聚醚F-68、支架剂和胆固醇为 组分制备时，其各组分的质量百分比含量如下水溶性复合物0.1 10%; 磷脂5. 0 60%;聚醚F-68 0. 5 腦;支架剂5. 0 40%;胆固醇1. 0
它采用薄膜-超声分散法制备，具体制备方法如下
按上述质量百分比分别称取水溶性复合物、磷酯、聚醚F-68、和胆固 醇溶于适量有机溶剂中(以刚好溶解为宜)，以旋转蒸发仪在20 80。C下 减压回收溶剂，在瓶壁上形成类脂薄膜；然后加入适量pH为6. 5的水溶 液将类脂膜洗脱并分散至水溶液中，所得的脂质体溶液以细胞破碎仪设定超声时间和功率进行处理，再以0.22 um微孔滤膜进行过滤，最后向溶 液中加入上述质量百分比的支架剂，在_60 一5(TC和0. 1 0. 5 MPa下 真空冷冻干燥，所得的产品定量装瓶，即得成品粉针剂。
当粉针剂由水溶性复合物与磷酯、聚醚F-68、支架剂和单硬酸甘油酯 为组分制备时，其各组分的质量百分含量如下水溶性复合物0.1 10%; 磷脂5. 0 60%;聚醚F-68 0. 5 10%;支架剂5. 0 40%;单硬酸甘油酯 5.0 60%。它采用高压均质法制备，具体制备方法如下
按上述质量百分比分别称取水溶性复合物、磷脂、聚醚F-68和单硬 酸甘油脂溶于适量有机溶剂中(以刚好溶解为宜)，以旋转蒸发仪在20 80。C下减压回收溶剂，在瓶壁上形成类脂薄膜；然后加入适量pH为6.5 的水溶液轻摇，将类脂膜洗脱并分散至水溶液中，将所得的固体纳米粒溶 液注入高压均质机中，设定压力和循环次数进行处理，再以0. 22 p m微孔 滤膜进行过滤，最后向溶液中加入上述质量百分比的支架剂，在_60 一 5(TC和0. 1 0.5 MPa下真空冷冻干燥，所得的产品定量装瓶，即得成品 粉针剂。
上述薄膜-超声分散法和高压均质法中，所述的有机溶剂为选自乙酸 乙酯、乙醚、乙醇、甲醇和氯仿中的任意一种。
由本发明提供的方法制得的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳 纳米管的水溶性复合物在水生理环境下表现出良好的溶解性(其溶解度可 达5.0mg/mL，是普通氯化两面针碱的25倍)、稳定性和生物兼容性，在 抗肿瘤药物治疗方面拥有十分突出的优点
1、 对单壁碳纳米管进行功能化修饰所使用的聚合物均为低毒和生物 兼容的，在增加该复合物的亲水性的同时，减少血浆蛋白与该复合物相互 作用的几率，降低被单核吞噬细胞系统(MPS)吞噬的可能性，延长氯化 两面针碱复合药物的血液循环半衰期；
2、 控制单壁碳纳米管的长度尺寸，以实现该药物复合物对肿瘤组织 的被动靶向性，改善氯化两面针碱在体内的分布，提高药效的同时降低氯 化两面针碱的毒副作用；
3、 氯化两面针碱与单壁碳纳米管偶联的酯键在体内组织中被羧酸酯酶 水解后，释放出氯化两面针碱；
4、 由于氯化两面针碱与单壁碳纳米管复合物的体积较大，因而可以减 缓该复合药物被肾、肝等网状内皮吞噬系统(RES)器官滤出的速度，延 长其血液循环半衰期；
5、 单壁碳纳米管具有很低的细胞毒性和很好的生物兼容性，释放药物 后逐渐被人体代谢排出。
本发明所提供的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水 溶性复合物具备高溶解性、低毒性等特点，可作为氯化两面针碱的替代品 应用于临床，为氯化两面针碱的临床试用提供了新的水溶性复合物。
10


图1为实验例中各分组给药10天后，处死小白鼠后剥离的瘤体的形貌 图片。
其中A为空白对照组；B为普通氯化两面针碱组；C为本发明提供的 复合物注射液实验组；D为阳性对照组。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。在以下各实施例中所涉及的 百分数均为质量百分数，即为单个组分占全部组分之和的质量百分数。 实施例1
一靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备。
(1) 氯化两面针碱的预处理
在氮气保护下，准确称取氯化两面针碱加入到适量的浓氢碘酸中，使
氯化两面针碱的浓度为0.001 mol/L，边搅拌边升温到50 °C;反应6 h 后冷却至室温，以氨水调节混合溶液的pH约为10，利用二氯甲烷反复萃 取混合溶液三次，将水相的溶剂蒸干，剩余物用甲醇溶解，加盐酸调节pH 为2.5，放置后析出针状晶体，即为C-8和/或C-9位置的甲氧基被羟基取 代的氯化两面针碱晶体。
准确称取上述针状晶体和丙二酸(摩尔比为1:1)加入到150 mL的三 口烧瓶中，再加入50 mL的吡啶，在室温下搅拌反应20 h后，在真空条 件下蒸干吡啶。所得的固体以20 mL去离子水溶解，搅拌20min后过滤， 将沉淀溶解在丙酮中，然后缓慢加入去离子水，对析出的晶体进行干燥， 即得到C-8和/或C-9位置被丙二酸酯化的氯化两面针碱。
(2) 单壁碳纳米管的功能化修饰
首先将单壁碳纳米管进行超声波振荡300 min，频率为100 kHz。抽 滤，干燥后即得到20 200 nm的单壁碳纳米管。
准确称取生物素聚乙二醇胺基(Biotin-PEG-NH2,分子量为5 kDa) 和丙二酸(摩尔比为1:1)加入到150 mL的三口烧瓶中，再加入50 mL 氯仿，在室温下搅拌反应24h;反应结束后，蒸干氯仿，所得固体溶解在 去离子水中，以3 kDa的MWCO超滤膜透析36 h后，将所得的固体进行冷 冻干燥即得丙二酸修饰的Biotin-PEG-NH2。
准确称取丙二酸修饰的Biotin-PEG-NH2和活化剂N， N' -二环己基碳 二亚胺(摩尔比为1:1)溶于50 mL的氯仿中，搅拌2 h;再加入与丙二 酸修饰的Biotin-PEG-丽2的摩尔比均为1:1的催化剂4-羟基苯并三唑和 六-臂聚乙二醇胺基(6-Arm-PEG_NH2， 10 kDa)在冰盐浴条件下搅拌反应 6h，在室温下继续搅拌反应36h;然后将溶剂蒸干，加入去离子水进行 充分溶解，接着以孔径为0.22 um的微孔滤膜过滤除去活化剂N，N' -二环己基碳二亚胺和催化剂4-羟基苯并三唑，以15 kDa的MWC0超滤膜透析 20 h除去过量的6-Arm-PEG-NH2，即得到六-臂聚乙二醇胺修饰的生物素聚 乙二醇胺基(Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-NH2))。
将Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-NH2)和剪裁好的单壁碳纳米管加入到氯 仿中，使得Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-顺2)的浓度为0.5隱ol/mL，单壁碳 纳米管的浓度为0. 5 mg/mL,超声振荡120 min，频率为100 kHz,然后将 混合溶液在26000Xg离心力条件下进行离心8 h，接着以100 kDa的丽CO 超滤膜透析24 h除去未反应的Biotin_PEG-6-Arm-(PEG-NH2)，干燥后即 可获得Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-NH2)修饰的水溶性单壁碳纳米管。
(3)将丙二酸修饰的氯化两面针碱与Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-顺2)修
饰的单壁碳纳米管复合
在氮气保护下，称取丙二酸修饰的氯化两面针碱和
Biot in-PEG-6-Arm- (PEG-NH2)修饰的单壁碳纳米管加入到250 mL三口烧瓶 中，加入适量除水除氧后的二甲基亚砜进行溶解，使丙二酸修饰的氯化两 面针碱衍生物的浓度为0. 5 mmol/L， Biotin-PEG-6-Arm-(PEG-NH2)修饰的 单壁碳纳米管的浓度为100mg/L;然后加入与丙二酸修饰的氯化两面针碱 的摩尔比均为1:1的活化剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐 酸盐和催化剂N-羟基琥珀酰亚胺，充分搅拌反应12h后，向混合反应液 中加入pH为7. 2的1 XPBS磷酸盐缓冲溶液，以3 kDa的丽C0膜透析20 h除去没有参与反应的丙二酸修饰的氯化两面针碱，收集产物，干燥，即 得到靶向性抗肿瘤药靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水 溶性复合物。
二靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物注射液的制备。
取0. 5 g聚醚F-68溶于500 mL的注射用水中，得到质量百分比为0. 1% 的聚醚F-68水溶液，备用；准确称取0.5 g本实施例制得的耙向性抗肿 瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物于500 mL的容量瓶中， 以配好的聚醚F-68水溶液定容配制成500 mL注射液，定量灌封为2 mL/ 支的注射液，每支含靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶 性复合物2 mg。
实施例2
一靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备。
重复实施例1靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不同 的是，以二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇胺基(DSPE-PEG-NH2， 10 kDa)替代生物素聚乙二醇胺基(Biotin-PEG-NH2，分子量为5 kDa)，以 4-臂聚乙二醇胺基(4-Arm-PEG-NH2 ， 5 kDa)替代六-臂聚乙二醇胺基 (6-Arm-PEG-NH2， 10 kDa)。
二靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物注射液的制备。
取16. 3 g聚醚F-68溶于800 mL的注射用水中，得到质量百分比为
122%的聚醚F-68水溶液，备用；准确称取2.0 g本实施例制得的靶向性抗
肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物于500 mL的容量瓶 中，以配好的聚醚F-68水溶液定容配制成500 mL注射液，定量灌封为2 mL/ 支的注射液，每支含靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶 性复合物8 mg。
三溶解度的测定。
将一定量本实施例制备得到的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁 碳纳米管的水溶性复合物溶于5 mL去离子水中，100 kHz频率下超声振荡 到不再溶解，过滤，将所得复合物溶液以紫外可见分光光度计进行测试， 可以得到该复合物中氯化两面针碱与单壁碳纳米管的重量比约为1:1，其 中氯化两面针碱的溶解度为5. 0 mg/mL，是普通氯化两面针碱(0. 2 mg/mL) 的25倍。
实施例3
一靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备。
重复实施例1中靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不 同的是，以己二酸替代丙二酸。
二靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物粉针剂的制备。
取本实施例制得的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的 水溶性复合物(0.1%)、蛋黄卵磷脂(50%)、胆固醇(20%)和聚醚F-68 (5%)溶于适量乙酸乙酯中，以旋转蒸发仪在40 。C下减压回收溶剂，在 瓶壁上形成有类脂薄膜；然后加入适量pH为6. 5的水溶液，将类脂膜洗 脱并分散至水溶液中，所得的脂质体溶液以细胞破碎仪在400 w功率下超 声30min，以孔径为0.22 Pm的微孔滤膜过滤，最后向溶液中加入葡萄 糖(24.9%)，充分溶解后，在一5(TC和0. lMPa条件下真空冷冻干燥，所 得的产品定量装瓶为含2 mg靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米 管的水溶性复合物(即活性成分，以下同)/瓶规格的粉针剂。
实施例4
一靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备。
重复实施例1中靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不 同的是，以a, co-双端胺基聚乙二醇(H2N-PEG_NH2， 4 kDa)替代六-臂聚 乙二醇胺基(6-Arm-PEG-NH2， 10 kDa),以庚二酸替代丙二酸。
二 靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物粉针剂的制备。
取本实施例制得的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的 水溶性复合物(1%)、单硬酸甘油脂(35%)、大豆卵磷脂(20%)和聚醚F-68 (8%)溶于适量无水乙醇中，以旋转蒸发仪在40 。C下减压回收溶剂，在 瓶壁上形成类脂薄膜。然后加入适量pH为6. 5的水溶液将类脂膜洗脱并
1分散至水溶液中。将所得的溶液注入高压均质机中，在1000 bar压力下 循环10次进行处理，以孔径为0.22 um微孔滤膜过滤，最后向溶液中加 入乳糖(36%)，充分溶解后，在一60'C和0.2MPa下真空冷冻干燥，所得 的产品定量装瓶为含活性成分5 mg/瓶规格的粉针剂。
实施例5
重复实施例1中靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不 同的是，将适量单壁碳纳米管与2:3的浓硝酸和浓硫酸混合酸溶液混合， 在20 'C温度下超声处理1000 min;抽滤，以去离子水反复洗涤至中性， 干燥，以得到所需长度的单壁碳纳米管，以a-羟基-o)-胺基聚乙二醇 (HO-PEG-NH2，分子量为7 kDa)替代六-臂聚乙二醇胺基(6-Arm-PEG-NH2， 10 kDa)，以辛二酸替代丙二酸。
实施例6
一氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物的制备。
(1) 氯化两面针碱的预处理
在氩气保护下，准确称取氯化两面针碱加入到适量的浓氢溴酸中，使 氯化两面针碱的浓度为1. OX 10—4 mol/L边搅拌边升温到180 °C 。反应1 h 后冷却至室温，以氨水调节混合溶液的pH约为9，利用二氯甲烷反复萃取 混合溶液三次，将水相的溶剂蒸干，剩余物用乙醇溶解，加盐酸调节pH 为2，放置后析出针状晶体，即为C-8和/或C-9位置的甲氧基被羟基取代 的氯化两面针碱晶体。
准确称取上述针状晶体和丁二酸(摩尔比为1:20)加入到250 mL的 三口烧瓶中，再加入100 mL二甲基亚砜，在室温下搅拌反应0.5 h后， 在真空条件下蒸干二甲基亚砜。所得的固体以适量去离子水溶解，搅拌20 min后过滤，将沉淀溶解在丙酮中，然后缓慢加入去离子水，对析出的晶 体进行干燥，即得到C-8和/或C-9位置被丁二酸酯化的氯化两面针碱晶 体。
(2) 单壁碳纳米管的功能化修饰
将单壁碳纳米管与浓硝酸混合，在200 。C温度下反应20min;抽滤， 以去离子水反复洗涤至中性，干燥，得到20 200 nm的单壁碳纳米管。
准确称取二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG， 10kDa) 和丁二酸(摩尔比为1:20)加入到250 mL的三口烧瓶中，再加入150 mL 二氯甲垸，在室温下搅拌反应2 h;反应结束后，蒸干二氯甲烷，将所得 的固体溶解在去离子水中，以3 kDa的丽C0超滤膜透析6 h后，将所得 的固体进行冷冻干燥即得丁二酸修饰的DSPE-PEG。
准确称量该化合物和活化剂N,N' -二异丙基碳二酰亚胺(摩尔比为 10:1)溶于150 mL的二氯甲烷中，搅拌0.5 h;再加入催化剂4-二甲氨基吡啶(与丁二酸修饰的DSPE-PEG的摩尔比为1:10)和8-臂聚乙二醇胺 基(8-Arm-PEG-NH2， 20 kDa，与丁二酸修饰的DSPE-PEG的摩尔比为1:10)， 在冰浴条件下搅拌反应6 h，在室温下继续搅拌反应6 h;然后将溶剂蒸 干，加入去离子水进行充分溶解，接着以孔径为0.22 ym的微孔滤膜过 滤除去活化剂N，N' -二异丙基碳二酰亚胺和催化剂4-二甲氨基吡啶，以 20 kDa的丽C0超滤膜透析6 h除去过量的8-Arm-PEG-NH2，即得到8-臂 聚乙二醇胺基修饰的二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 (DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2))。
将DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)和剪裁好的单壁碳纳米管加入到二氯 甲垸中，使得DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)的浓度为0. 1 mmol/mL，单壁碳 纳米管的浓度为0.01 mg/mL，超声振荡30 min，频率为80 kHz,然后将 混合溶液在10000 X g离心力条件下进行离心6 h，接着以100 kDa的丽CO 超滤膜透析6 h除去未反应的DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)，干燥后即可获 得DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)修饰的水溶性单壁碳纳米管。
(3)将丁二酸修饰的氯化两面针碱与DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-朋2)修
饰的单壁碳纳米管复合
在氩气保护下，称取丁 二酸修饰的氯化两面针碱和
DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-NH2)修饰的单壁碳纳米管加入到250 mL三口烧瓶 中，加入适量除水除氧后的二甲基甲酰胺溶剂进行溶解，使丁二酸修饰的 氯化两面针碱衍生物的浓度为0.1 mol/L， DSPE-PEG-8-Arm-(PEG-腿2)修 饰的单壁碳纳米管的浓度为10 mg/L;然后加入与丁二酸修饰的氯化两面 针碱的摩尔比为5:1的活化剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺 盐酸盐和催化剂N-羟基琥珀酰亚胺，充分搅拌反应0.5h后，向混合反应 液中加入pH为7. 4的1XPBS磷酸盐缓冲溶液，以2 kDa的丽CO超滤膜 透析1 h除去没有参与反应的丁二酸修饰的氯化两面针碱，收集产物，干 燥，即得到靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合 物。
二靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物粉针剂的制备。 取本实施例制得的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的 水溶性复合物(10%)、大豆卵磷脂(5.0%)、胆固醇(40%)和聚醚F-68 (10%)溶于适量氯仿中，以旋转蒸发仪在30'C下减压回收溶剂，在瓶壁 上形成类脂薄膜。然后加入适量pH为6. 5的水溶液，将类脂膜洗脱并分 散至水溶液中。所得的脂质体溶液以细胞破碎仪在600 w功率下超声20 min，以孔径为0.22的微孔滤膜过滤，最后向溶液中加入氨基乙酸 (35%)，充分溶解后，在一6(TC和0.3MPa条件下真空冷冻干燥，所得的 产品定量装瓶为含活性成分10 mg/瓶规格的粉针剂。
实施例7一耙向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备。
重复实施例6中靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不
同的是，单壁碳纳米管以摩尔比为3:1的浓硝酸和浓硫酸混合酸来进行氧 化剪裁，以Fmoc-NH-聚乙二醇羟基(FM0C-NH-PEG-0H， 5 kDa)替代二硬 脂酰甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG， 10kDa)，以壬二酸替代丁
二靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物注射液的制备。 取100 g聚醚F-68溶于900 mL的注射用水中，得到质量百分比为10% 的聚醚F-68水溶液，备用；准确称取5.0 g本实施例制得的靶向性抗肿 瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物，取配好的聚醚F-68 水溶液定容配制成500 mL的注射液产品。
实施例8
一靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备。
重复实施例6中靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不
同的是，单壁碳纳米管以摩尔比为1:3的高锰酸钾和浓硝酸混合溶液来进 行氧化剪裁，以癸二酸替代丁二酸。
二靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物粉针剂的制备。 取本实施例制得的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的 水溶性复合物(5.0%)、单硬酸甘油脂(60%)、蛋黄卵磷脂(5.0%)和聚 醚F-68 (0. 5%)溶于适量甲醇中，以旋转蒸发仪在35 。C下减压回收溶剂， 在瓶壁上形成类脂薄膜。然后加入适量pH为6. 5的水溶液将类脂膜洗脱 并分散至水溶液中。将所得的溶液注入高压均质机中，在1500 bar压力 下循环20次进行处理，以孔径为0.22 um微孔滤膜过滤，最后向溶液中 加入山梨糖(29. 5%)，充分溶解后，在一6(TC和0. 1 MPa下真空冷冻干燥， 所得的产品定量装瓶为含活性成分10 mg/瓶规格的粉针剂。
实施例9
重复实施例6中靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不 同的是，单壁碳纳米管以摩尔比为1:3的高锰酸钾和浓硫酸混合溶液来进 行氧化剪裁，以顺丁烯二酸替代丁二酸。
实施例10
重复实施例6中靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不 同的是，单壁碳纳米管以摩尔比为1:3的双氧水和浓硫酸混合溶液来进行 氧化剪裁，以邻苯二甲酸替代丁二酸。
实施例11一 氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物的制备。
(1) 氯化两面针碱的预处理
在氦气保护下，准确称取氯化两面针碱加入到适量的浓氢氯酸中，使
氯化两面针碱的浓度为0.2 mol/L，边搅拌边升温到200 °C。反应72 h 后冷却至室温，以氨水调节混合溶液的PH约为11，利用二氯甲烷反复萃 取混合溶液三次，将水相的溶剂蒸干，剩余物用甲醇溶解，加盐酸调节pH 为3，放置后析出针状晶体。
准确称取上述针状晶体和戊二酸(摩尔比为1:10)加入到250 mL的 三口烧瓶中，再加入100 mL二甲基甲酰胺，在室温下搅拌反应48 h后， 在真空条件下蒸干二甲基甲酰胺。所得的固体以适量去离子水溶解，搅拌 20min后过滤，将沉淀溶解在丙酮中，然后缓慢加入去离子水，对析出的 晶体进行干燥，即得到戊二酸修饰的氯化两面针碱。
(2) 单壁碳纳米管的功能化修饰.-
首先将单壁碳纳米管进行超声波振荡2000 min，频率为60 kHz。抽 滤，干燥后即得到长度为20 500 nm的单壁碳纳米管。
准确称取Fmoc-NH-聚乙二醇胺基(FMOC-NH-PEG-NH2，分子量为5 kDa) 和戊二酸(摩尔比为1:10)加入到250 mL的三口烧瓶中，再加入150 mL 四氢呋喃，在室温下搅拌反应72h;反应结束后，蒸干四氢呋喃，将所得 的固体溶解在去离子水中，以2 kDa的丽CO超滤膜透析96 h后，将所得 的固体进行冷冻干燥即得戊二酸修饰的FMOC-NH-PEG-NH2 。
准确称取该化合物和活化剂N, N' -二环己基碳二亚胺(摩尔比为5:1) 溶于150mL的二氯甲烷中，搅拌2h;再加入催化剂2-(7-偶氮苯并三氮 唑)-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(与戊二酸修饰的FM0C-NH-PEG-腿2 的摩尔比为1: 6)和3-臂聚乙二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa，与戊 二酸修饰的FMOC-NH-PEG-NH的摩尔比为3:1 )，在冰浴条件下搅拌反应5 h， 在室温下继续搅拌反应48 h;然后将溶剂蒸干，加入去离子水进行充分 溶解，接着以孔径为0.22 Pm的微孔滤膜过滤除去活化剂N，N' -二环己 基碳二亚胺和催化剂2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N， N， N，， N，-四甲基脲六氟磷 酸酯，以5 kDa的丽CO超滤膜透析48 h除去过量的3-Arm-PEG-丽2，即 得到3-臂聚乙二醇胺基修饰的Fmoc-NH-聚乙二醇胺 (FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH》)。
将FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)和剪裁好的单壁碳纳米管加入到四 氢呋喃中，使得FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)的浓度为2. Ommol/mL，单 壁碳纳米管的浓度为5.0 mg/mL;超声振荡600 min，频率为60 kHz，然 后将混合溶液在30000Xg离心力条件下进行离心6 h，接着以50 kDa的 MWCO超滤膜透析48 h除去未反应的FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)，干燥 后即可获得FM0O丽-PEG-3-Arm-(PEG-丽2)修饰的水溶性单壁碳纳米管。 (3)将戊二酸修饰的氯化两面针碱与FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)
17修饰的水溶性单壁碳纳米管复合
在氮气保护下，称取戊二酸修饰的氯化两面针碱和
FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2)修饰的单壁碳纳米管加入到250 mL三口烧 瓶中，加入适量除水除氧后的二甲基乙酰胺溶剂进行溶解，使戊二酸修饰 的氯化两面针碱的浓度为10. 0mmol/L，使FMOC-NH-PEG-3-Arm-(PEG-NH2) 修饰的单壁碳纳米管(浓度为300mg/L;然后加入与戊二酸修饰的氯化两 面针碱的摩尔比均为1:4的活化剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二 亚胺盐酸盐和催化剂N-羟基琥珀酰亚胺，充分搅拌反应12h后，向混合 反应液中加入pH为7. 3的1 XPBS磷酸盐缓冲溶液，以1. 5 kDa的MWCO 超滤膜透析48 h除去没有参与反应的氯化两面针碱，收集产物，干燥， 即得到靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物。 二 靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物粉针剂的制备。 取本实施例制得的耙向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的 水溶性复合物(10.0%)、单硬酸甘油脂(35%)、大豆卵磷脂(5%)和聚醚 F-68 (5%)溶于适量乙醚中，以旋转蒸发仪在30 'C下减压回收溶剂，在 瓶壁上形成类脂薄膜。然后加入适量pH为6. 5的水溶液将类脂膜洗脱并 分散至水溶液中。将所得的溶液注入高压均质机中，在1000 bar压力下 循环30次进行处理，以孔径为0. 22 u m微孔滤膜过滤，最后向溶液中加 入山梨醇(45%),充分溶解后，在一6CTC和0. lMPa下真空冷冻干燥，所 得的产品定量装瓶为含活性成分50 mg/瓶规格的粉针剂。
实施例12
一靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备。
重复实施例6的制备方法，不同的是，以a-羟基-co-胺基聚乙二醇 (HO-PEG-NH2，分子量为7 kDa)替代3-臂聚乙二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以对苯二酸替代戊二酸。
二靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物注射液的制备。
取25 g聚醚F-68溶于475 ml的注射用水中，得到质量百分比为5% 的聚醚F-68水溶液，备用；称取1. 25 g本实施例制得的耙向性抗肿瘤药 氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物于250 mL的容量瓶中，以 配好的聚醚F-68水溶液定容配制成250 mL注射液，定量灌封为2 mL/支 的注射液，每支含靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性 复合物10 mg。
实施例13
重复实施例11靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不 同的是，以8-臂聚乙二醇胺基(8-Arm-PEG-NH2， 40 kDa)替代3-臂聚乙 二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以酒石酸替代戊二酸。
18实施例14
重复实施例11靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不
同的是，以4-臂聚乙二醇胺基(4-Arm-PEG-NH2， 20 kDa)替代3-臂聚乙 二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以柠檬酸替代戊二酸。
实施例15
重复实施例11靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不 同的是，以6-臂聚乙二醇胺基(6-Arm-PEG-NH2， 20 kDa)替代3-臂聚乙 二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以苹果酸替代戊二酸。
实施例16
重复实施例11靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，不 同的是，以3-臂聚乙二醇羟基(3-Arm-PEG-服2， 5 kDa)替代3-臂聚乙 二醇胺基(3-Arm-PEG-NH2， 5 kDa)，以草酸替代戊二酸。
实验例氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物注射液对人 肝癌H印G2裸鼠移植瘤的抑制作用的评价 1实验材料与对象
l.l实验肿瘤细胞株为国际通用的肿瘤细胞株肝癌H印G2。 1.2实验对象24只昆明种小白鼠(SPF级)，6~8周龄，体重22士2g。 1. 3实验分组
将24只昆明小鼠随机分成A、 B、 C、 D四个试验组，每组6只，其中，
A组为空白对照组；
B组为普通氯化两面针碱组；
C组为本发明提供的复合物注射液实验组；
D组为阳性对照组。
2具体实验步骤
(1) 建立人肝癌H印G2裸鼠移植瘤模型用2 mL注射器抽吸人肝癌 细胞株H印G2，以无菌生理盐水l: 3稀释，调整细胞浓度为(1-2) X107 个细胞/mL;经台盼蓝染色，镜检细胞存活率》95 %。
(2) 取待接种昆明小鼠，消毒腋下皮肤，于超净台上将肿瘤细胞悬 液以每只0.2 mL接种于小鼠右侧腋窝皮下，30 min内接种完四个分组的 昆明小鼠。接种完成后小鼠于动物房词养，自由摄食饮水。
(3) 接种24 h后开始给药，给药情况如下
A组空白对照组(腹腔注射含0.5。/。聚醚F-68的生理盐水200 u L/
只)；
B组普通氯化两面针碱组(以聚醚F-68助溶，将氯化两面针碱配制成含0. 5%聚醚F-68的生理盐水溶液，腹腔注射该溶液200uL/只，剂量为10 mg/kg);
C组本发明提供的复合物注射液实验组(将本申请实施例2制备的注射液稀释配制为含0. 9%氯化钠的水溶液，腹腔注射200 yL/只，剂量为10 mg/kg);
D组阳性对照组(腹腔注射含0. 5%聚醚F-68的环磷酰胺生理盐水溶液200 uL/只，剂量为20 mg/kg)。以上各组均每日给药一次。
(4)给药10天结束后，次日处死全部动物，剥离瘤块，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重，计算肿瘤生长抑制率。
抑瘤率(%)二 (空白对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/空白对照组平
均瘤重xiooy。
3实验观察及结果
接种第4天可见皮下肿瘤生长，出瘤率100%，移植瘤多呈圆型，实质性，呈局限性膨胀生长，表面凹凸不平，呈多个结节融合状。肿瘤组织为淡红色鱼肉状，瘤块较大的表面可见增粗的血管网分布，部分中心有坏死，实验中各组无一例死亡。
各组实验的抑瘤率如表1所示
表l:
组别剂量(mg/kg)瘤重(g)抑瘤率(％)
A (n=6)1.24±0. 19
B (n=6)100. 6±0. 18*45. 96
C (n=6)100. 5±0. 16*52. 42
D (n二6)200. 5±0. 12*55.64
注1. *各组与生理盐水组比，p<0.05
抑瘤率是否有效的判定根据《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》、《药理实验方法学》中对抗肿瘤药物的体内实验要求，药物的抑瘤率〉30%，即被认为有效。
表l中的实验数据显示给药后复合物注射液实验组对人肝癌H印G2裸小鼠移植瘤有较明显的生长抑制作用，抑瘤率为52.42%，平均瘤重低于生理盐水对照组，与阳性对照药环磷酰胺组的瘤重、抑瘤率相当，优于普通氯化两面针碱对照组。
实验结果表明，靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物注射液较普通氯化两面针碱具有更好的制肿瘤生长效果。
权利要求
1、一种靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，其特征在于将氯化两面针碱进行预处理得到羧酸修饰的氯化两面针碱，然后用双亲性聚合物对裁剪至20～500nm长的单壁碳纳米管的外壁进行非共价功能化修饰；再将羧酸修饰的氯化两面针碱与非共价功能化修饰后的单壁碳纳米管通过酯化和酰胺化反应进行偶联，即得到靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物。
2、 根据权利要求1所述的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制 备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 氯化两面针碱的预处理① 在惰性气体保护下，将氯化两面针碱加入到浓的氢卤酸中，使氯化两面针碱的浓度为1.0X10—4 1.0mol/L，边搅拌边升温到50 200 。C反 应l 72h，反应结束后，以氨水调节混合溶液的pH值为碱性，用二氯甲 垸溶剂对反应混合物反复萃取三次，将水相溶剂蒸干，剩余物用甲醇或乙 醇溶解，加盐酸调节pH值为2 3，放置，析晶，即得到C-8禾n/或C-9 位置的甲氧基被羟基取代的氯化两面针碱晶体；② 将上述得到的羟基取代的氯化两面针碱与二元羧酸或羟基羧酸化 合物按1:1 1:20的摩尔比溶解在极性溶剂中，反应0.5 48h后，蒸干溶剂，所得固体以去离子水溶解，过滤，所得沉淀溶解于丙酮中，然后缓 慢加入去离子水，放置，析晶，即得到C-8和/或C-9位置被二元羧酸或 羟基羧酸酯化的氯化两面针碱晶体；(2) 单壁碳纳米管的功能化修饰① 将单壁碳纳米管的长度裁剪至20 500 nm备用；② 将两亲表面活性剂与二元羧酸或羟基羧酸按1:1 1:20的摩尔比 溶解在除水除氧的有机溶剂中，反应2 72h后，蒸干溶剂，所得固体溶 解于去离子水中，以超滤膜透析6 96 h，固体以冷冻干燥法制成粉末， 得到干燥的羧酸修饰的两亲表面活性剂；③ 在惰性气体保护下，在冰浴或冰盐浴中，将上述获得的羧酸修饰 的两亲表面活性剂和活化剂按1: 1 10:1的摩尔比溶解于除水除氧的有机 溶剂中，充分搅拌0.5 6h;然后加入催化剂和聚乙二醇修饰剂，继续搅 拌反应6 72 h;反应结束后，将有机溶剂蒸干，加入去离子水进行充分 溶解，接着以孔径为0.22 "m的微孔滤膜过滤除去催化剂，以超滤膜透 析6 72 h除去过量的聚乙二醇修饰剂，得到聚乙二醇修饰剂进一步修饰 的两亲表面活性剂溶液；所述加入的催化剂与羧酸修饰的两亲表面活性剂 的摩尔比为1:10 1:1，所述加入的聚乙二醇修饰剂与羧酸修饰的两亲表 面活性剂的摩尔比为1:10 10:1;④将经过剪裁的单壁碳纳米管与步骤(D中所得到的聚乙二醇修饰剂 进一步修饰的两亲表面活性剂溶液加入到适量除水除氧的有机溶剂中，使单壁碳纳米管的浓度为0. 01 20. 0 mg/mL，聚乙二醇修饰剂进一步修饰的 两亲表面活性剂的浓度为0. 1 10.0 ramol/mL;超声振荡30 1000 min， 频率为40 100kHz,然后将混合溶液在10000Xg 30000Xg的离心力下 离心1 24 h，接着以超滤膜透析6 72 h来除去过量的聚乙二醇修饰剂 进一步修饰的两亲表面活性剂，干燥，即得到非共价功能化修饰的水溶性 单壁碳纳米管；(3)在惰性气体保护下，将步骤(1)得到的经羧酸修饰的氯化两面 针碱，与非共价功能化修饰的水溶性单壁碳纳米管，溶解在适量除水除氧 后的有机溶剂中，使羧酸修饰的氯化两面针碱的浓度为0. 1 50.0 mmol/L，非共价功能化修饰的单壁碳纳米管的浓度为10 1000 mg/L;然 后加入活化剂和催化剂，充分搅拌反应0.5 48h后，向混合反应液中加 入pH为7. 2 7. 4的1 XPBS磷酸盐缓冲溶液，以3 10 kDa的超滤膜透 析l 48h除去未参与反应的羧酸修饰的氯化两面针碱，收集产物，干燥， 即得到靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物；所 述加入的活化剂与经羧酸修饰的氯化两面针碱的摩尔比为1: 1 5:1，所述 加入的催化剂与经羧酸修饰的氯化两面针碱的摩尔比为1: 1 5:1 。
3、 根据权利要求2所述的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制 备方法，其特征在于其中，所述的二元羧酸为选自草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚 二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、顺丁烯二酸、邻苯二甲酸以及对苯二酸 中的任意一种；所述的羟基羧酸为选自酒石酸、柠檬酸以及苹果酸中的任意一种； 所述的活化剂为选自N，N'-二环己基碳二亚胺、N，N'-二异丙基碳二酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐中的任意一种；所述的催化剂为选自4-羟基苯并三唑、4-二甲氨基吡啶、2-(7-偶氮 苯并三氮唑)-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸酯以及N-羟基琥珀酰亚胺中 的任意一种。
4、 根据权利要求2所述的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制 备方法，其特征在于步骤(2)的第②步中，所述的两亲表面活性剂是指一端为疏水基，另一端为胺基或羟基的表 面活性剂；所述的羧酸修饰的两亲表面活性剂是指二元羧酸或羟基羧酸的羧基 与两亲表面活性剂的端羟基或端胺基发生酯化或者酰胺化反应生成的聚合物。
5、 根据权利要求2所述的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，其特征在于步骤(2)的第③步中，所述的聚乙二醇修饰剂为选自分子量为5 40 kDa的多臂聚乙二醇胺基、分子量为5 40 kDa的多 臂聚乙二醇羟基、分子量为2 10 kDa的a,"-双端胺基聚乙二醇以及 分子量为2 7 kDa的a-羟基-"-胺基聚乙二醇中的任意一种。
6、 权利要求1 5中任何一项所述的制备方法制备得到的靶向性抗肿 瘤药氯化两面针碱复合物。
7、 一种靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物注射液，其特征在于 它含有(a) 0. 1 10 g/L的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管 的水溶性复合物；(b) 药学上可接受的溶剂或辅料。
8、 根据权利要求7所述的水溶性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物注射 液，其特征在于所述溶剂为注射用水，辅料为聚醚F-68。
9、 一种靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物粉针剂，其特征在于 它是由靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳米管的水溶性复合物和 水溶性药用辅料制备而成，其中靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱与单壁碳纳 米管的水溶性复合物的质量百分比含量为0. 1 10%。
10、 根据权利要求10所述的靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物粉针剂，其特征在于所述水溶性药用辅料为磷酯、聚醚F-68、支架剂和 胆固醇或单硬酸甘油酯。
全文摘要
本发明将公开一种靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法，其产品及含有该产品的注射剂。所述靶向性抗肿瘤药氯化两面针碱复合物的制备方法为将氯化两面针碱进行预处理得到羧酸修饰的氯化两面针碱，然后用双亲性聚合物对裁剪至20～500nm长的单壁碳纳米管的外壁进行非共价功能化修饰；再将羧酸修饰的氯化两面针碱与非共价功能化修饰后的单壁碳纳米管通过酯化和酰胺化反应进行偶联，即得。本发明复合物制备方法简单，所得产品的溶解度可达5.0mg/mL，且抗肿瘤的靶向性强，较好地解决了氯化两面针碱的低溶解性和毒性大的问题，可作为氯化两面针碱的替代品应用于临床，为氯化两面针碱的临床试用提供了新的水溶性复合物。
文档编号A61K31/4738GK101474183SQ20091011385
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者刘华钢, 赖泽锋 申请人:刘华钢;赖泽锋