专利名称：：一种小分子肽在制备促进手术后伤口愈合药物和食品中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是分子量低于10000的肽在制备促进手术后伤口愈合药物和食品中的新用途，特别是涉及海洋胶原肽和大豆肽在促进手术后伤口愈合中的新用途。
背景技术：
：伤口愈合是组织生长、再生的一种特殊生物学过程，所涉及的炎症反应细胞增殖、新生血管和淋巴管形成，以及细胞外基质合成，是一个连续动态过程，不能截然分开，因此，凡是能促进或抑制某一个环节的因素，均可影响伤口愈合的整个过程。伤口愈合过程中的某些环节可受一些营养代谢因素的影响。海洋胶原肽是以海洋鱼皮作主要原料，用酶解法生产的、相对分子质量低于1000的低聚肽(短肽)为主要成分的粉末状产品。彭宏斌，CHKD博硕士学位论文全文数据库2008年博士论文《海洋胶原肽辅助降血糖和免疫营养功能的效果研究》研究表明海洋胶原肽可以改善高血糖和高脂膳食负荷的2型糖尿病大鼠体内过氧化应激标志的表达，具有辅助降血糖功能；海洋胶原肽短期干预可以改善糖尿病患者胰岛素敏感性和改善胰岛素分泌功能，縮短糖尿病患者的血糖调整期，降低夜间低血糖的发生率，改善手术后患者的营养状况，提高手术后患者的免疫能力。《中国组织工程研究与临床康复杂志》2008，12(23):刘桂琴等(海洋胶原肽对2型糖尿病大鼠过氧化应激标志物表达的影响)公开了体外实验证实海洋胶原肽具有抗氧化等生物活性，可能具有一定的抗炎症效应。关于海洋胶原肽的用途，申请号200710157641.8专利文献中公开了海洋胶原肽作为制备降血糖药物、保健食品或食品的用途，申请号200710157643.7专利文献中公开了海洋胶原肽作为制备抗氧化药物、保健食品、食品或化妆品的用途，申请号200610086812.8专利文献中公开了海洋胶原肽在制备免疫调节药物或食品中的用途，以上专利未述及海洋胶原肽在促进手术后伤口愈合的用途。现有技术中均未述及海洋胶原肽关于手术后促进伤口愈合的应用的报导。大豆肽是以大豆、豆粕或大豆蛋白为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，主要成分为肽，且分子量分布在10000Dalton以下的粉末状产品。大豆肽含有的八种必需氨基酸，除蛋氨酸为限制氨基酸以外，甘氨酸、脯氨酸等其它氨基酸均超过或接近世界卫生组织(冊O)的推荐标准，因此具有较高的营养价值。分子量小于1000的肽吸收率高达90%以上。优质大豆肽的分子量分布以小于1000的为主，分子量主要在300700范围内。大豆肽能促进矿物质吸收；大豆肽有降低血压的作用；促进脂肪代谢及降低胆固醇。《食品科技》2007,(7):243国明明等，大豆肽免疫调节作用的研究表明，大豆肽还有免疫功能。《生物加工过程》2008，6(4):69王莉娟，大豆肽体外抗氧化活性研究表明，大豆肽还有抗氧化功能。《中国食物与营养》2000，(4):39陈晓光等，大豆肽的生理功能及应用前景，研究表明大豆肽还有降低血糖作用。关于大豆肽的用途，申请号200510077612.1专利文献中公开了具有解酒护肝功能的产品及制备方法和用途，申请号200610026655.1专利文献中公开了一种促进肥牛肌腱发育的多肽及微生物制剂及制备方法，以上专利均未述及大豆肽用于促进手术后伤口愈合的用途。关于低分子肽类的药物，申请号为200410022266.2专利文献中公开了c-ski基因及其多肽促进损伤愈合又减轻瘢痕；申请号为01109400.l专利文献中公开了基因重组成纤维细胞生长因子一8a多肽具有上调细胞连接蛋白(Connexin43)表达，活化上皮功能，加速伤口愈合，以及促进软骨分化等生物活性；申请号为200610152684.2专利文献中公开了具有促进血管形成、组织再生及伤口愈合作用的多肽组合制剂；申请号200410098483.X专利文献中公开了一组具有促进新血管形成、组织再生及伤口愈合作用的活性小分子多肽胸腺素P16及其药物组合物；申请号200410015853.9专利文献中公开了促进皮肤、结缔组织、骨生长的多肽组合物；申请号01820299.3专利文献中公开了新的一类多肽成纤维细胞生长因子具有促进伤口愈合等作用；申请号200610112159.8专利文献中公开了涉及用于加速伤口愈合的组合物，该组合物中包含有血栓调节蛋白的EGF样区域之氨基酸序列的多肽或其中保守性变异体；申请号00116910.6专利文献中公开了一种新的多肽——上皮形成素9.9和编码这种多肽的多核苷酸用于促进伤口愈合等；申请号99816184.5专利文献中公开了取代的杂环酰基—三肽在伤口愈合和防止血小板凝聚中的用途。综上所述，目前还没有关于分子量在10000以下的天然来源的肽在促进手术后伤口愈合方面的报道。
发明内容海洋胶原肽以深海鱼的鱼皮为主要原料，分子量分布在lOOOODalton以下淡黄色粉术状小分子肽，其中140-1000分子量范围占70%以上。大豆肽是以大豆、豆粕或大豆蛋白为主要原料，分子量分布在10000Dalton以下的粉末状产品，其中140-1000分子量范围占70%以上。经过实验发现，分子量140-10000的肽能促进手术后伤口愈合，可用于制备促进术后伤口愈合的食品或药品，有很好的应用前景。具体实施例方式分子量小于ioooo的肽促进手术后大鼠伤口愈合的功效研究l.材料与方法1.1海洋胶原肽以深海鱼的鱼皮为主要原料，采用生物酶法生产的分子量分布在10000Dalton以下淡黄色粉末状小分子肽，其中140-1000分子量范围占80%以上。1.2大豆肽是以大豆、豆粕或大豆蛋白为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，分子量分布在10000Dalton以下的粉末状产品，其中140-1000分子量范围占70°/。以上。1.3实验动物健康雄性二级SD大鼠，体重230-250克。1.4实验条件清洁级动物室，温度范围21-23°C，相对湿度50%—60%。1.5实验方法1.5.1动物模型建立方法大鼠经1%戊巴比妥钠麻醉后，剃去背部皮肤，常规皮肤消毒，背部两侧分别切一个2cm长的纵行切口，同时切开肌肉，深达腹腔，然后逐层缝合肌肉和皮肤。整个过程模拟临床手术过程，同时手术当天计为术后5第0天(POD0)，以此类推。1.5.2实验动物分组取216只体重为230-250g的大鼠，随即分为9组，每组24只，包括空白对照组、4个海洋胶原肽组(分别为0.667g/kg.bw、2.Og/kg.bw、6.Og/kg.bw和12g/kg.bw)和4个大豆肽组(分别为0.667g/kg.bw、2.Og/kg.bw、6.Og/kg.bw和12g/kg.bw)，相当于人体推荐剂量的3.3倍、10倍、30倍和60倍)，空白对照组灌胃给予等体积溶剂。手术当天开始，每日灌胃。分别于第3、7、14天处死大鼠，每个时间点各8只动物。1.5.3伤口愈合观察1.5.3.1肉眼观察每日用放大镜观察切口变化情况。各组于术后第3天观察伤口及其周围组织的创伤反应，第7、14天观察伤口的恢复情况。术后创伤反应及伤口恢复情况统一按本实验室自建标准评定。1.5.3.1.1伤口及其周围组织的创伤反应评定①I期反应伤口有轻度肿胀。②n期反应伤口及周围组织轻度水肿，皮下有散在淤血斑。③m期反应切口有少量血痂附着，伤口及周围组织明显水肿。1.5.3.1.2伤口恢复情况评定①优伤口组织无肿胀，皮肤青紫现象消失。②良伤口组织轻度肿胀，皮下淤血斑消失，青紫现象逐渐消退。③差伤口及周围组织肿胀。1.5.3.2切口愈合的组织病理学观察各组大鼠分别于术后第3、7、14天于伤口处距切口边缘约0.5cm取全层皮肤组织。左侧伤口所取组织的一半用4%多聚甲醛固定，保存待做石蜡切片及HE、Masson染色，另一半用于抗拉力检测，右侧伤口皮肤用于羟脯氨酸测定和其他指标的检测。1.5.3.3胶原纤维染色(Masson染色)组织切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染色5IO分钟，盐酸酒精分化，流水蓝化，蒸馏水洗，丽春红酸性品红液中染58分钟，蒸馏水，1%磷钼酸中染13分钟，直接入苯胺蓝液或亮绿液5分钟，水速洗，置6(TC温箱中烘干，二甲苯透明，封固。结果胶原纤维绿色，肌纤维、纤维素红色。1.5.3.4切口的抗张强度检测术后第7、14天，沿切口垂直方向切取以切口为中线，宽为0.5cm长为中线双侧各0.5cm，并包含切口在内的皮肤试件组织，去除皮下脂肪组织，于长方形短边以丝线缝合作为牵引线，将皮条置于带有张力感受器的装置中间，张力感受器另一端连接于多功能生物信号采集系统，采用带有游标卡尺的微调装置手动逐渐拉伸皮条，记录皮条被拉断时的张力。测微尺测量皮肤的厚度，每平方毫米面积的张力即为切口的抗张强度。1.5.3.5羟脯氨酸测定切取大鼠切口周围2-3毫米的皮肤用于测定羟脯氨酸，方法依据南京建成生物工程公司的羟脯氨酸检测试剂盒进行操作。1.5.4统计方法采用SPSS软件进行单因素方差分析。2.结果2.1大鼠术后伤口愈合的肉眼观察结果肉眼观察发现，术后第3天，对照组大鼠伤口多数有血痂附着，伤口及周围组织明显水肿，而海洋胶原肽组大鼠伤口的水肿程度明显减轻(表l)。术后第7和14天，海洋胶原肽组、大豆肽组大鼠伤口愈合明显好于对照组大鼠伤口。海洋胶原肽组、大豆肽组大鼠比对照组大鼠伤口提前l-2天愈合，同时发现6.Og/kg.bw和12g/kg.bw剂量组愈合最佳(表2)。表l各组伤口创伤反应情况比较例(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2各组伤口恢复情况比较例(％)第7天(16只/组)第14天(8只/组)组别-优良差优良差0/kg.bw3(18.75)6(37.5)7(43.75)4(50)3(37.5)1(12.5)0.667g/kg.bw(海洋肽)5(31.25)5(31,25)6(37.5)5(62.5)2(25.0)1(12.5)2.Og/kg.bw(海洋肽)6(37.5)6(37.5)4(25.0)5(62.5)2(25.0)1(12.5)6.Og/kg.bw(海洋肽)8(50.0)4(25.0)4(25.0)6(75,0)2(25,0)012g/kg.bw(海洋肽)8(50.0)5(31.25)3(18,7)7(87.5)1(12.5)00.667g/kg.bw(人豆肽)5(31.25)5(31.25)(31.25)(62.5)2(25.0)1(12.5)2.Og/kg.bw(大豆肽)6(37.5)6(37.5)4(25.0)(62.5)2(25.0)'(12.5)6.Og/kg.bw(大豆肽)8(50.0)4(25.0)4(25.0)(87.5)1(12.5)012g/kg.bw(大豆肽)8(50.0)5(31.25)2(12.5)7(87.5)1(12.5)02.2海洋胶原肽对大鼠术后伤口皮肤愈合的组织学观察结果组织学结果发现，术后第7天组织切片观察对照组伤口表皮囊性增生为主，瘢痕组织较多，炎性细胞浸润明显多于海洋胶原肽组，而成纤维细胞和毛细血管则明显少于海洋胶原肽组、大豆肽组。术后第14天组织切片观察显示，对照组伤口表皮以增生为主，瘢痕组织和炎性细胞还是多于海洋胶原肽组、大豆肽组，而各个海洋胶原肽、大豆肽组组伤口表皮完整，瘢痕组织明显少于对照组，炎性细胞明显减少，其中以6.Og/kg.bw剂量组最佳。2.3Masson染色光镜组织学观察Masson染色将结缔组织和胶原纤维染成绿色，平滑肌染成红色，细胞核染成褐色。术后第3天切口各个组之间的胶原纤维数量没有明显的差异。术后第7天结果发现，海洋胶原肽组、大豆肽组胶原纤维数量明显多于对照组，以6.Og/kg.bw和12g/kg.bw剂量组最佳，。术后第14天同样发现海洋胶原肽组、8大豆肽组胶原纤维数量明显多于对照组。2.4术后不同时间伤口抗张力比较术后第7、14天各组伤口抗张力值见表1。从表3可见，第7天和第14天海洋胶原肽组、大豆肽组与对照组伤口的抗张力强度均有差异，并有统计学意义(P<0.05)。表3术后各组伤口抗张力值(g/mm2,、XDSD)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*表示与对照组比较，尸<^.02.5切口肉芽组织羟脯氨酸结果术后第7天、14天各组伤口羟脯氨酸检测结果见表4。结果发现第7天和第14天海洋胶原肽组、大豆肽组与对照组伤口羟脯氨酸表达均有差异，并有统计学意义(P<0.05)。表4术后各组羟脯氨酸结果("g/mg，XDSD)时间0/kg.bw0.667g/kg.bw2.Og/kg.bw6.Og/kg.bw12g/kg.bw(胶原)术后7.8402.179.21Q3.049.67D2.48*10,43Q3.35*11.03Q3.97*第7日(胶原)术后8.43口2.4510.57口3.81*11.咖3.29*12.89口3.74*13.73口2.43*第14日(大豆)术后7.49口1.879.05口2.659.93口2.18*10.85口3.41*11.52CB.59*第7日(大豆)术后8.66口2.349.89[J2.81*11.39EB.02*13.06口3.24*13.87d2.65*第14曰注*表示与对照组比较，尸<0.053.结论本研究发现，经口给予术后大鼠不同浓度的海洋胶原肽、大豆肽组后，各个浓度的海洋胶原肽、大豆肽组都能够提高术后伤口的抗张力值、胶原纤维、羟脯氨酸的表达水平，表明海洋胶原肽、大豆肽能够促进术后大鼠的伤口愈合程度，同时发现随着浓度的增加，海洋胶原肽、大豆肽促进伤口愈合的效果逐渐增强。本研究得出海洋胶原肽、大豆肽能够促进大鼠伤口愈合的最小剂量是0.667g/kg.bw。二、低聚肽含量测定1.方法提要低分子量的蛋白质水解物(包含肽类及游离氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液；高分子量的蛋白质在三氯乙酸溶液中易沉淀。样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀蛋白质物质，测定出离心清液中的酸溶蛋白质含量，清液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为低聚肽的含量。2.分析步骤2.1酸溶蛋白质含量的测定称取2g(精确至lmg)样品，加入10mL15%三氯乙酸溶液，混合均匀，静置10min。将样品溶液在4000rpm下离心10min后，取全部清液，按GB/T5009.5规定的方法测定清液中的酸溶蛋白质，蛋白质换算系数为6.25。检验结果根据样品的干燥失重，折算为干基。2.2游离氨基酸含量的测定样品前处理称取2030mg样品，精确到0.0001g，用3%磺基水杨酸溶液溶解均匀。将样品溶液转移至50ml容量瓶中，定容。将样品溶液在转速为4000r/min离心机上离心5min得清液，再用0.45um微孔滤膜过滤清液，将滤液转移至50ral容量瓶中，定容后作为仪器检测用样品。其余操作同GB12292水果、蔬菜汁游离氨基酸含量的测定规定的方法。2.3结果的表述10低聚肽的含量^按式(1)计算尸2□f□^(1)式中尸2——样品中低聚肽含量(以干基计)，％;S——样品中酸溶蛋白质含量(以干基计)，％;^——样品中游离氨基酸含量(以干基计)，％。2.4测定结果测定海洋胶原肽粉和大豆肽粉低聚肽含量，结果见表5。表5、肽粉中低聚肽的含量测定结果样品海洋胶原肽大豆肽低聚肽含量85.5%79.7%3.相对分子质量小于1000的肽所占比例(高效凝胶过滤色谱法)3.1方法提要采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220mn条件下检测，使用凝胶色谱测定相对分子质量分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算得到低聚肽的相对分子质量大小及分布范围。3.2试剂乙腈色谱纯；三氟醋酸分析纯；水超纯水或二次蒸馏水。相对分子质量校正曲线所用标准品细胞色素C(cyyochrome，MW12500);抑酞酶(aprotinin,MW6500);杆菌酶(bacitracin,MW1450);乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸(MW451);乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(MW189)3.3仪器和设备高效液相色谱仪配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪；流动相真空抽滤脱气装置；超声波振荡器；分析天平感量O.0001g。3.4色谱条件与系统适应性实验色谱柱TSKgelG2000SWXL300mmX7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和多肽的凝胶柱；流动相乙腈水三氟乙酸，45:55:0.1(体积比)检测波长UV220nm;流速0.5ml/min;柱温30°C;进样体积lOul。为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸)峰计算不低于5000,低聚肽的分配系数(Kd)应在01之间。3.5相对分子质量校正曲线制作分别用流动相配制成O.1%(W/V)的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为O.2-0.5um聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数(lgMW)对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。3.6样品制备称取样品20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2-0.5uni聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。3.7相对分子质量的计算将3.6制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。然后用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品中肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量范围在1000以下的肽的峰面积相对百分比之和。3.8测定结果海洋胶原肽和大豆肽分子量分布范围测定结果见表6，7。表6、海洋胶原肽结果分子量范围开始时间min结束时间min重均分子量峰面积％(入220nm)1000-1000013.96618.99514098.2023500-100018.99520.50967227.1174140-50020.50923.28931761.354270-14023.28924.8021082.2662表7、大豆肽结果分子』t范围开始时间min结束时间min重均分子量峰面积％(A220nm)1000-1000013.96618.995201214.6817500-100018.99520.50967226.8898140--50020.50923.28931753.456170-14023.28924.8021084.3834以上结果表明，海洋胶原肽和大豆肽分子量主要集中在140-1000，占70%以上。权利要求1.一种分子量≤10000的肽在制备促进手术后伤口愈合药物和食品中的应用。2.根据权利要求l所述的肽，其特征在于分子量小于2000。3.根据权利要求1或者2所述的肽，其特征在于140-1000分子量范围的肽含量》70%。4.根据权利要求l-3任意所述的肽，其特征在于它是一种海洋胶原肽。5.根据权利要求l-3任意所述的肽，其特征在于它是一种大豆肽。全文摘要本发明涉及一种分子量小于10000的肽在制备促进手术后伤口愈合药物和食品中的应用，其中在140-1000分子量范围的肽含量不低于70％，它是一种海洋胶原肽和大豆肽。文档编号A61K38/02GK101461934SQ20091011480公开日2009年6月24日申请日期2009年1月4日优先权日2009年1月4日发明者付玉梅,卢建中,吕毅斌,萍喻,尧梅香,群廖,易敏之,勇李,李诒光申请人:江中药业股份有限公司