葛根素在制备P2X₃介导疼痛/神经系统疾病药物中的应用的制作方法

专利名称：葛根素在制备P2X₃介导疼痛/神经系统疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及镇痛药物用途发明领域，尤其是涉及可用于防治疼痛的葛根素 在制备P2X3介导疼痛/神经系统疾病药物中的应用。
背景技术：
疼痛是大多数疾病具有的共同症状，是人类共有而个体差异4艮大的一种不 愉快的感觉。由于疼痛给人们造成极大痛苦，据2001年第二期《国际疼痛学 会通迅》报道美国106次国会通过一项决议，宣布从2001年元月一日起的 十年为"疼痛控制和研究的十年"(Decade of Pain Control and Research )。由此 说明各国对疼痛研究的重视。根据疼痛时程可将疼痛分为急性痛(生理性痛) 和慢性痛(病理性痛)。其中慢性痛包括炎症痛、神经病理痛、癌症痛，是 临床上常见主诉之一。由于慢性痛机理复杂，其治疗成为临床上的难题。神经 病理痛是指由神经系统损伤或疾病所引起的疼痛综合征，常常表现为自发性的 疼痛，对机械、冷、热等伤害性剌激产生痛觉过敏；对非伤害性剌激产生触诱 发痛、痛觉倒错和烧灼痛等神经病理性痛觉过敏。由于慢性痛持续时间长，对 人身心健康危害较大，其研究成为疼痛领域的热点和重点。烧伤是严重的创伤， 烧伤疼痛也是最严重的急性痛之一，烧伤后伴随炎症反应导致炎症痛。疼痛往 往是烧伤患者的第一反应， 一般在烧伤后最初1小时内，创面出现不同程度的 疼痛或者没有明显的疼痛，此后的疼痛往往受以下因素的影响如烧伤深度、 病程*阶段、治疗措施和患者的个体因素等。烧伤后疼痛是由于烧伤部位皮 肤的伤害性感受器受刺激，并伴随着炎症反应和神经损伤所引起的，因此它的 治疗需要结合伤害性感受处理和神经病理处理。
噪呤类物质三磷酸腺苷(ATP)作为重要的信使物质参与痛觉信息传递。 嘌呤(Purine)受体分为噤呤1和嘌呤2 (Purine 1， Purine 2; Pl， P2 )受体， ATP及其类似物作用于P2受体。P2受体分为配体门控性离子通道型受体(P2X 受体)和G蛋白偶联型受体(P2Y受体)。P2X受体有七种亚型(P2Xw)。英 国"自然"杂志报道ATP作用的P2X3受体(P2X受体的一种亚型)特异性地在 感觉传入的背根神经节神经元克隆表达。疼痛、伤害性剌激使损伤细胞、应激 细胞以及感觉神经末梢本身释放大量ATP， ATP及其作用的P2X受体涉及痛 觉及伤害性信息在初级感觉神经元的传递，其中主要是同聚性P2X3受体参与 初级感觉神经元的痛觉及伤害性信息传递。基因敲除P2X3受体的小鼠减小了 对福尔马林致痛试验的两相反应。P2X3受体介导神经病理痛的痛觉传递。神经 病理痛剌激时，P2X3受体和P2X3mRNA表达增加，感觉神经元P2X3受体介导ATP激活的门控通道电流明显增强。应用P2X3受体反义寡核苷酸及RNA干扰 技术可使炎性痛大鼠模型背根神经节的P2X3受体水平下调，进而明显减轻 P2X3受体激动剂a，P-meATP和福尔马林所致的足底伤害性反应。这些发现为 神经病理痛的发病机理提供了新的依据。申请人实验室以前的研究也显示烧伤 可导致背根感觉神经元P2X3受体表达增加。目前国外已有研究生产P2X3受体 拮抗剂(如R03 )用于临床治疗疼痛的报道。
葛根素是从豆科植物野葛及甘葛船艮中提取的一种黄酮苷，临床上主要用 于心血管疾病和糖尿病的治疗。文献报道[周军，方素萍，齐云,等.葛#^汤对佐剂 性关节炎大鼠关节炎液炎症介质的影响.中国实验方剂学杂志，2001，7(3):29-31.] 以葛根为主药的葛根汤具有抗炎作用。该文献提示从葛根中提取的葛根素可能 具有抗伤害性反应和影响痛觉的作用，但目前尚无葛根素直接具有镇痛作用的 报道，临床上也无葛根素通过镇痛作用机制进行疼痛治疗的报道。

发明内容
本发明的第一个目的在于提供葛根素的第一个新用途，即葛根素在制备治 疗慢性痛(即神经病理痛)的药物中的应用。
本发明的第二个目的在于提供葛根素的第二个新用途，即葛根素在制备治 疗急性痛(即烧伤#^乍痛)的药物中的应用。
本发明的第三个目的在于提供葛根素的第三个新用途，即葛根素作为P2X3 噪B^^桐吉抗剂在制备治疗涉及P2X3受体介导神经系统疾病的病理生理机制防
治药物中的应用。
葛根素可减轻神经病理痛(慢性痛)及烫伤痛大鼠的痛(急性痛)行为反 应。葛根素在治疗急性痛/慢性痛的作用机理为阻断P2X3受体介导的疼痛信 息传递，产生防治疼痛的作用。
为了更好地理解本发明的实质，下面以实验和结果来证明葛根素的用途。 本发明分为葛根素对神经病理痛作用和烧伤痛作用两部分。 一、材料和方法
(一)葛根素对P2X3受体介导神经病理痛作用研究 1.1动物和分组
雄性SD大鼠，220-250g，南昌大学医学院实验动物科学部提供。将大鼠随 机分成5组，每组12只。实验分组I (假手术组)(sham); II(单独葛根素组) (Puerarin); III(坐骨神经'隄性压迫性损伤组X Chronic constriction injury , CCI); IV (坐骨神经慢性压迫性损伤+葛根素组)(CCI + puerarin); V(正常组) (control )。葛根素注射液溶解于生理盐水，浓度为50mg/ml。 I组每天腹腔注 射生理盐水(4ml/kg); II组每天腹腔注射葛根素注射液(4ml/kg); III组(假 手术组)切开皮肤暴露坐骨神经，不结扎神经即缝合皮肤。IV组CCI术后第1 天开始每天腹腔注射葛根素注射液(4ml/kg)。
41.2药物与试剂
葛根素，山东方明药业股份有限公司(生产批号0804171 );硫喷妥钠， 上海新亚药业有限公司(生产批号050101 ); SP试剂盒，原位杂交试剂盒及 DAB试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；P2X3抗体购自美国CHEMICON INTERNATIONAI/^司。三磷酸腺苷(adenosine 5-triphophate， ATP ) ， sigma, DRG细胞外液配制，pH7.4。 a、卩亚曱三磷酸腺苷(a，PmethyleneATP, a,p-meATP ) sigma， DRG细胞外液配制，pH7.4。三硝基三磷酸腺苷(TNP~"ATP )， sigma， DRG细胞外液配制，pH7.4。玻璃孩t电极所充内液(internal solution)成份为 (讓ol.L國l): KC1 140，CaCl2 l，MgCl22，HEPES IO，EGTAII， ATP4。电极电阻 2 ~ 5MQ。灌流用之DRG细胞外液(external solution)成份为(mmol.L-l): NaCl 150， KC1 5， CaCl2 2.5， MgCl21, HEPES 10， D-Glucose 10。 1.3主凌—义器
BME-403 VonFrey细丝(中国医学科学院生物医学工程研究所)；BME410C 型全自动热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)；消毒纱布、手巾、 棉签等，碘酒及75%酒精，手术器械包剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、 有齿镊、神经剥离子等。
膜片钳实验装置及相关配件CEZ-2400型全细胞膜片钳放大器(日本 Nihon-Kohden), SBR--I型二线示波器(汕头超声电子仪器厂)，95-B玻璃孩i电 极拉制仪(华中科技大学同济医学院分子及细胞神经生物学研究室)，分析天 平(上海天平仪器厂)，刺激器(SEN-7203, Nihon-Kohden,日本)，隔离器(SS-202J, Nihon-Kohden，日本)，LMS—2B型二道生理记录仪(成都仪器厂)，玻璃微电 极(GG-17，华西医科大学仪器修造厂)，倒置显微镜(Olympus,日本)，HY—Z 调速多用恒温振荡器(国华电器有限/>司)。 1.4 'ft性神经病理痛模型制作
用硫喷妥钠麻醉大鼠(30mg/kg,腹腔注射)，在无菌条件下于大鼠右大腿 后外侧切开皮肤，钝性分离出坐骨神经，以4-0含铬肠线轻度结扎坐骨神经， 共结扎4道，每个结之间间隔约lmm。结扎过程中可见坐骨神经被结扎处直径 略减小，并伴有右后肢一过性抽动，并注意不要结扎太紧以至于完全阻断神经 外周的血流。大鼠术后单笼饲养，分别于术前(0d)及术后1,3，5，7，9， 11,14d测
量机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期(测定时间恒定于每日io : 00-14 : oo:
室温维持在22士0.5 。C)。
1.5神经病理痛大鼠机械痛敏检测
用BME-403 VonFrey细丝(中国医学科学院生物医学工程研究所)测定 才几械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。置大鼠于透明的 有机玻璃箱(22xl2x22cm3 )中，有机玻璃箱底为lxlcm2的铁丝网。术后大鼠 放置于实验室祠养，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应15min。折力分别为0.13， 0.20, 0.33， 0.60， 1.30, 3.60， 5.00， 7.30, 9.90， 20.1g，折力^20.1g时均记为 20.1g。从最小折力开始，4根试验10次，直至出现缩足反射次数大于5/10，即 50%反应阈值(即引起10次试验中5次反应的值。重复三次，取其平均值)。 每次刺激间隔时间至少大于15s，并待刺激引起的反应(如舔足、甩腿等)完全 消失。
1.6神经病理痛大鼠热痛敏检测
将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自动热痛刺激仪 (中国医学科学院生物医学工程研究所)照射大鼠足底。热辐射刺激4义照射大 鼠足底至出现抬腿回避时间为热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。切断时间为30秒，以防止组织灼伤。 1.7大鼠背根神经节(DRG)P2X3受体的表达
五组实验大鼠于术后第14天腹腔注射疏喷妥钠(30mg/kg)深麻醉，经升主动 脉灌注4°/。多聚曱醛(0. lmol/L PB， pH7. 4)，分离出大鼠L4、 L5段DRG，取出固 定，ii^4 %多聚曱醛/0.lmPBS(含O. 1 % DEPC)中固定2小时，用20 %蔗糖脱水， 在恒冷箱切片机上行冰冻切片，厚度为15拜.放入4%的多聚甲醛中保存。每 只大鼠的DRG切片隔5张取一张二步法免疫组织化学染色测定DRG神经元细 胞P2Xs受体的表达，DAB显色。与此同时对DRG切片进行原位杂交测定P2X3 受体mRNA的表达，杂交前所用液体和器皿都经0.1。/。的DEPC严格处理。冰冻 切片在0.05%的11202室温下作用30分钟，以去除内源性过氧化物酶，胃蛋白酶 消化l-2分钟，37。C预杂交液中孵育2小时，弃去预杂交液，转入杂交液于水 浴中37。C过夜。次日，用梯度枸橼酸盐水(2XSSC,0.5XSSC和0,2XSSC)冲洗 切片各15分钟。入37 。C封闭液30分钟，转入生物素化的地高辛中37 。C孵育30 分钟，0.05。/。的PBS冲洗15分钟，相继在SABC-POD和生物素化的过氧化物酶 中各孵育30分钟，DAB显色。结果用图像分析系统软件(武汉天平影傳4支术有限 公司，HMIAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统)对P2X3阳性神经元进行灰度 分析。
1.8葛根素对CCI大鼠DRG神经元ATP或a，j3-meATP激活电流的影响 1.8.1标本制备
大鼠DRG神经元标本的分离方法概述如下将大鼠击昏、断头后迅速切 开背部皮肤，沿脊柱两侧剪断与^目连的肋骨，取出胸腰段脊柱，由脊柱正中 剖开成两半，置02饱和之DMEM液(Dubecco，s Modified Eagle's medium) 内，pH值7.40，溶液渗透压为340mOsm/kg。由剖开的推管内侧取出L4、 L5神 经节及相连的神经根(腹、背根)和脊神经，在解剖显微镜下用精细角膜剪及 游丝镊仔细剪除相连神经和周围结締组织被膜，将清除干净的DRG尽可能地剪 碎,置培养瓶内并力口入trypsin (typeIII， sigma) 0.5 g/L， collagenase (type IA, sigma) 1.0 g/L在恒温振荡水浴器(35°C， 80次/分)中孵育20~30分钟，完成后力口入适量的Soya beam trypsin inhibitor (type II-s， sigma)以终止酶的消4lM乍 用。将上述酶和机械分离的DRG细胞转移至35mm培^J^内，放在倒置显微镜 的载物台上换液静置30min。然后应用全细胞式膜片钳技术记录葛根素对ATP 或a,P-meATP激活电流的影响。 1.8.2全细胞膜片钳实验操作程序
(1) 仔细检查实验系统各仪器间的连接和初始设置。
(2) 打开电源开关。
(3) 电极安装接好参比电极，充灌玻璃电极，然后将其装于电极夹持器上。 注意电极充灌不要过满；装电极之前将手接触屏蔽罩排出身体上的静电。
(4) 相界电位补偿和电极电阻的测量在"搜索"方式下将微电极入液，调节 相界电位补偿，并根据脉冲电压方波引起的电流响应幅值测量电极电阻。
(5) 细胞封接调节微操纵器使微电极尖端接近细胞表面，并对微电极内施 一负压，形成吉欧封接。
(6) 快电容补偿调节快电容补偿，使输出信号中不含快电容电流成分。
(7) 吸破细胞膜将工作方式切换到"钳压"挡。在电极与细胞之间形成高阻 (1—10GQ)封接后，进一步将膜吸穿。置钳制电压(H.P)于"60mV，膜电流
应用低通波(lkHz，-3dB)。
(8) 慢电容补偿调节慢电容补偿，使输出信号中不舍隄电容电流成分。 串联电阻补偿调节串联电阻补偿至不产生震荡为止。
全细胞膜片钳记录所用的仪器为CEZ-2400型膜片钳放大器 (Nihon-Kohden,日本)。在电极与细胞膜之间形成高阻(1 ~ 10GQ)封接后 进一步将膜吸穿，调节电容和串联电阻补偿。置保持电压(holding potential, HP) 于-60mV，膜电流应用低通滤波(lkHz，-3dB )。实验结果由二道记录仪(LMS-2B， 成都)描记。ATP浓度-效应曲线按照下列公式绘制。I=Imax/[l+(EC50/C)n]式中 C为ATP浓度，I为标准化后的ATP激活电流，Imax为标准化后的ATP激活电流 最大值，ECso或Kd为ATP产生最大效应的半效浓度，n为Hill系数。给药系通 过微操纵器移动快速换药装置的排管进行，每管直径为0.2皿，管口距记录的 细胞约100nm。实验中需进行药物胞内透析时系通过插入玻璃微电极里的微管 注入药物。实验在室温20 30。C范围进^f亍。 1.9实验数据的统计处理
各组数据以x士sem表示。多组间比较用单因素方差分析,继以最小显著差 法(LSD)行两两比较。用SPSSll.O软件包进行数据处理。尸O.05为差异有显著 性。
(二)葛根素对P2X3受体介导烧伤痛作用研究 2.1动物和分组
雄性SD大鼠，220-250g， 60只，南昌大学医学院实-验动物科学部提供，随机分组。I组为足部皮肤假烫组；1I组为葛根素注射+足部皮肤I度或浅II度 烧伤组；m组为生理盐水+足部皮肤I度或浅II度烧伤组；IV组为背部皮肤假 烫组，V组为葛根素注射+背部皮肤I度或浅II度烧伤组；YI组为生理盐水十
背部皮肤i度或浅n度烧伤组。葛根素注射液溶解于生理盐水，浓度为
50mg/ml。 III组和VI组在烫伤前0.5h尾静脉注射4ml/kg生理盐水，每天l次至实验 结束；II组和V组烫伤前0.5h^C静脉注射葛根素注射液4ml/kg，每天一次至实验 结束；I组和IV组(假烫组)分别将足部或背部皮肤浸在37 。C温水中8s。 2.2药物与试剂
葛根素，山东方明药业股份有限^>司(生产批号0804171 );乙醚，天津 市大茂化学试剂厂(生产批号050801 );疏喷妥钠，上海新亚药业有限公司 (生产批号050101 ); SP试剂盒，DAB试剂盒(北京中山生物技术有限公司)； P2X3抗体(CHEMICON INTERNATIONAL,美国)；S100抗体(武汉博士德^> 司)。
2.3主要—义器
BME-403 Von Frey细丝(中国医学科学院生物医学工程研究所)；BME410C 型全自动热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)；膜片钳装置及相 关配件CEZ-2400型全细胞膜片钳放大器(Nihon-Kohden,日本)，SBR—I型 二线示波器(汕头超声电子仪器厂)，95-B玻璃微电极拉制仪(华中科技大学 同济医学院分子及细胞神经生物学研究室)，分析天平(上海天平仪器厂)，刺 激器(SEN-7203， Nihon-Kohden,日本)，隔离器(SS-202J， Nihon-Kohden，日本)， LMS—2B型二道生理记录仪(成都仪器厂)，玻璃微电极(GG-17,华西医科 大学仪器修造厂)，倒置显微镜(Olympus, Japan), HY—Z调速多用恒温振荡 器(国华电器有限公司)等。 2.4烧伤模型制作与确定 2.4.1烧伤才莫型制作 2.4丄1足部浅II度烫伤大鼠模型
用乙醚麻醉大鼠后，将大鼠右后足部浸入70 。C水中5s或8s，烫伤后单笼饲 养，分别于烫伤前(0h)及烫伤后1，24，48,72，96， 120, 144h测量右后足部机械 缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期(室温维持在22i0.5 。C)。 2.4丄2背部浅II度皮肤烧伤大鼠模型
用乙醚麻醉大鼠后，将大鼠背部皮肤剪去毛发后浸入70 。C水中5s或8s,烫伤 面积大约30%，形成背部皮肤浅II度烧伤大鼠模型，燙伤后单笼饲养，创面暴露， 不做任何处理。
2.4.2 I度和浅II度烧伤大鼠的确定
I度烧伤大鼠的皮肤浸入70 。C水中5s后,15分钟左右可以观察到有红斑和 轻微水肿形成，病理切片HE染色证实为I度烧伤。浅II度烧伤大鼠皮肤浸入
870。C水中8s后，15分钟左右可以观察到有红斑和轻微水肿形成，3小时后可以看
到有水疱形成，病理切片HE染色证实为浅II度烧伤。烧伤大鼠在处死之前没
有明显感染发生。
2.5足部烧伤大鼠机械痛敏测定
用BME-403 Von Frey细丝测定枳"喊缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。置大鼠于透明的有机玻璃箱(22 xl2 x22 cm3)t，有机玻璃 箱底为lxlcm2的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有 机玻璃箱中适应15 min。折力分另，J为0.13，0.20，0.33，0.60， 1.30，3.60，5.00， 7.30，9.90,20.1g。从最小折力开始，每根试验10次，直至出现缩足反射次数大约5 /10,即50%反应阈值(即引起10次试验中5次反应的值)。最大折力为20.1g， 大于此值时记为20.1g。每次试验至少间隔15 s,并待刺激引起的反应(如舔足、 甩腿等)完全消失。 2.6足部烧伤大鼠热痛敏测定
将有机玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上,用BME-41 OC型全自动热痛刺激仪 照射大鼠足底。热辐射刺激仪照射大鼠足底至出现抬腿回避时间为热缩足反射 潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。切断时间为25秒，以防止组织灼伤。 2.7背部烧伤大鼠皮肤神经末梢P2X3受体表达实验
烫伤大鼠每天尾静脉注射葛根素或生理盐水5ml/kg,连续3天后，各组大 鼠腹腔注射硫喷妥钠(30mg/kg)深麻醉，剪取大鼠背部烧伤皮肤，大小为 1.5-2cm2，取出固定,石蜡包埋。免疫组化测定时横断切片，片厚4nm。 二步法免 疫组织化学染色，DAB显色。每只大鼠的皮肤隔5张取连续二张切片， 一张切 片做皮肤神经末梢P2X3受体表达测定，另 一张切片做皮肤神经末梢S100表达测 定。结果用图像分析系统软件(武汉天平影像技术有限公司，HMIAS-2000高清晰 彩色医学图文分析系统)分析P2X3阳性神经元灰度。 2.8实验数据的统计处理
各组数据以x ± "w表示。多组间比较用单因素方差分析，继以最小显著差 法(LSD)行两两比较。用SPSSll.O软件包进行数据处理。PO.05为差异有显著 性。
二、结果
(一)葛根素对P2X3受体介导的神经病理痛作用的研究结果
各组大鼠术后均未见肢体运动障碍和自残现象。 l.l行为学研究
1.1.1神经病理痛大鼠热痛敏检测
坐骨神经被结扎4天后神经病理通模型基本形成，III组(坐骨神经慢性压 迫性损伤组；Chronic constriction injury, CCI)和IV组(坐骨神经慢性压迫性 损伤+葛根素组；CCI+ puerarin )的热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)较I组(假手术组，sham)、 II组(单独葛根素组，puerarin)和V组(正常对 照组，control)显著性下降(pO.Ol),而I组(sham)、 II组(puerarin)和V组
(control)之间相比较无显著性差异(pX).05)。 IV组(CCI+puerarin)热缩足反 射潜伏期与I组(sham)、 II组(puerarin)和V组(control)之间相比较仍下降 (p<0.01)，但与III组(CCI)之间比较显^性增加(p<0.01 )。 14d后，IV组(CCI+ puerarin)热缩足反射潜伏期与V组(control)之间相比较无显著性意义 (p>0.05),而III组(CCI)仍较低(p<0.01)。见图1。 1.1.2斗经病理痛大鼠机械痛敏检测
坐骨神经被结扎4d^神经病理通模型基本形成，III组(Chronic constriction injury , CCI)和IV组(CCI+ puerarin)与I组(sham)、 II组(puerarin)和V组
(control)相比，其才几械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT) 显著性下降(pO.Ol)，而I组(sham)、 II组(puerarin)和V组(control)之间相比 较无显著性差异(pX).05)。坐骨神经被结扎7d后，虽IV组(CCI + puerarin)与 V组(control)相比，其机才成缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)仍低(p<0.01),但III组(CCI)比V组(control)的械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)更4氐(p<0.01),而IV组(CCI + puerarin) 与ffl组(CCI)之间比较，枳4成缩足v^射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)显著性增加(pO.Ol)。见图2。 l丄3大鼠背根神经节(DRG)P2X3受体的表达变化
术后14d，用免疫组织化学方法测定大鼠L4、 Ls手术侧背根神经节 (DRG)P2X3受体的表达。每只大鼠背根神经节L4、 Ls段切片中隔5张取一张切 片，用图像分析系统软件分析P2X3阳性神经元的灰度变化。I组(假手术组， sham)、 II组(单独葛根素组，Puerarin)、 III组(坐骨神经慢性压迫性损伤组， CCI)、 IV组(坐骨神经慢性压迫性损伤+葛根素组，CCI +puerarin )、 V组(正 常组，control)的灰度值分别为:112.52±13.59、 115.35±16, 21 、 169.25±23.46、 137.27±17.24、 111.12±12.85。 I组、II组、V组之间P2X3受体表达无显著性差 异(pX).05); m组DRG的P2X3受体的表达较I组、II组、V组明显增加
(p〈0.01); IV组DRG的P2X3受体的表达较I组、II组、V组高(p〈0.05)，但 和m组相比仍较低(p<0.05 )。见图3 。 1.1.4大鼠背根神经+(DRG)P2X3受体mRNA的表达变化
术后14d，采用原位杂交方法测定大鼠U、 Ls段手术侧背根神经节 (DRG)P2X3受体mRNA的表达。每只大鼠L" Ls背根^经节切片中隔5张取一 张切片,用图像分析系统软件分析P2X3阳性神经元的灰度变化。与免疫组织化 学实验结果非常相似，I组(假手术组，sham)、 n组(单独葛根素组，Puerarin)、 m组(坐骨神经慢性压迫性损伤组，CCI)、 IV组(坐骨神经慢性压迫性损伤十 葛根素组，CCI + puerarin)、 V组(正常组，control)的灰度值分别为122.95±15.24、 124.28±14.82、 185.62±26.48、 138.52±31.68、 123.57±9.65。 I组、 II组、IV组、V组之间P2X3受体表达无显著性差异(p>0.05); III组组DRG的 P2X3受体的表达较I组、II组、V组明显增加(pO.Ol ); IV组DRG的P2X3受 体的表达较V组低(p<0.05)。见图4。
1.1.5葛根素对大鼠DRG神经元ATP或a,P-meATP激活电流的影响
实验在各实验组大鼠新鲜分离的L4/L5手术侧即右侧DRG细胞上进行， 分离的细胞呈圓形或椭圆形，实验细胞胞体直径在25-40 jim之间。多数细胞 的胞体一侧可见到巻曲的轴突残根。
实验分为I组(假手术组，sham)、 II组(单独葛根素组，puerarin)、 III 组(坐骨神经慢性压迫性损伤组，CCI)、 IV组(坐骨神经慢性压迫性损伤+葛 根素组，CCI + puerarin )、 V组(正常组，control )。实验共检测I组36个细 胞，1I组37个细胞，ni组39个细胞，IV组40个细胞，V组38个细胞，其中 I组88.9% (32/36)， II组89.2%(33/37)， III组87.2%(34/39), IV组87.5%(35/40), V组86.8% (33/38) DRG神经元对细胞外加ATP ( 1-1000 pmol/L )敏感。ATP-激活电流(IAW)显示快失敏和慢失敏两种形式的内向电流(即尽管激动剂持 续存在且浓度不变，但激活电流上升到达顶峰之后，其幅值随时间呈指数性的 逐步衰减直至一稳定值)。五组DRG神经元lATP的完全恢复时间均约为4-6min, 但CCI组较其它四组DRG神经元对同一浓度的ATP产生的lATP明显增加，且 随着ATP浓度增加ATP-激活电流增加更明显(P0.05)，其它四组之间没有显著 性差异(P>0.05 )。 P2X3受体激动剂a， P-meATP( 10拜ol/L )-激活电流在I 、 II 、 IV、 V组产生极小的内向电流，而在CCI组为一具有明显去敏感的内向电流 (PO.Ol)。各组DRG神经元ATP激活电流效应也表明神经病理痛大鼠DRG神 经元细胞ATP激活电流和I、 II、 V组比明显增强，葛根素用药组和I、 II、 V组相比较虽然有所增加，但无显著性差异(P〉0.05),见图5。 (二)葛根素对P2X3受体介导的烧伤痛作用的研究结果 2丄1浅II度烧伤大鼠的确定
浅1I度烧伤大鼠皮肤浸入70 。C水中8s后，15分钟左右可以X!1察到有红斑和 轻微水肿形成,3小时后可以看到有水疱形成，病理切片HE染色证实为浅II度烧 伤，见图6。烧伤大鼠在处死之前没有明显感染现象。 2.1.2烧伤大鼠皮肤神经末梢P2X3受体表达的变化
应用二步法进行皮肤神经末梢免疫组化，连续切片显示，S-100显色阳性 神经末梢，同时具有P2X3免疫阳性表达。在镜下观察，可以看到皮肤真皮层的 神经末梢主要分布在乳头层靠近表皮层，呈散在分布，或在毛嚢、腺体附近分 布，见图7。用图象分析软件对P2X3免疫阳性皮肤神经末梢灰度值进行分析， 结果表明背部皮肤假烫组、葛根素注射+背部皮肤浅1I度组和生理盐7jC+背部皮 肤浅II度组的灰度值分别为118.76±18.48、 130.42±13.35、 152.63±22.62。生理盐水+背部皮肤浅II度组烧伤后，皮肤神经末梢P2X3表达明显升高，与背部
皮肤假烫组相比较具有显著性差异(p<o.o5),葛根素注射+背部皮肤浅n度组 虽然仍高于背部皮肤假烫组，但显著性低于生理盐水+背部皮肤浅n度组
(p<0.05)。表明葛根素可减少烫伤皮肤神经末梢P2X3的增强表达，见图8。 2丄3足部烧伤大鼠热痛敏测定
将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自动热痛刺激仪 照射大鼠足底。热辐射刺激仪照射大鼠足底至出现抬腿回避时间为热缩足反射 潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。切断时间为30秒，以防止组织灼伤。
烧伤后l、 24、 48、 72hlII(足^浅II。C烫伤组，superficial second degree foot burn)、 IV (足部浅H。C烫伤+葛根素组，superficial second degree foot burn + puerarin )与I (足部假烫组，sham foot burn )、 II (单独葛才艮素组，intraperitoneal injection of puerarin )、 V(正常组，control)之间相比较，III (浅H。C烫伤组)、 IV(浅11。C烫伤+葛根素组)热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL) 显著性下降(pO.Ol)， I (足部假烫组)、II (单独葛根素组)、V(正常组)之间 相比较无显著性差异(pX).05)。烧伤后24h^， IV (足部浅II。C烫伤+葛根素组) 热缩足反射潜伏期与I (足部假烫组)、II (单独葛根素组)、V (正常组)之
间相比较仍下降(p<o.oi)，但与m (足部浅n。c烫伤组)之间比较显著性增加
(p<0.01)。 144h^， IV (足部浅n。c烫伤+葛根素组)热缩足反射潜伏期基本
恢复正常(p>0.05)，而III (足部浅II。C烫伤组)仍较低(p<0.01)。见图9。 2丄4足部烧伤大鼠机械痛敏测定
用BME-403 Von Frey细丝测定才几械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。置大鼠于透明的有机玻璃箱(2^1>22(:1113)中，有机玻璃箱 底为lxlcm2的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有机 玻璃箱中适应15 min。折力分别为0.13， 0.20, 0.33, 0.60， 1.30， 3.60， 5.00, 7.30, 9.卯，20.1g，折力^20.1g时均记为20.1g。从最小折力开始，每根试验10次，直 至出现缩足反射次数大于5/10,即50%反应阈值(即引起10次试验中5次反应 的值。重复三次，取其平均值)。每次刺激间隔时间至少大于15s,并待刺激引 起的反应(如舔足、甩腿等)完全消失。
烧伤后ih始，ni (足部浅n。c烫伤组)、iv (足部浅n。c烫伤+葛根素组) 与i (足部假烫组)、n (单独葛根素组)、v(正常组)之间相比较，in(浅n。c
烫伤组)、IV (浅H。C烫伤+葛根素组)机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)显著性下降(pO.Ol),而I (足部假烫组)、II(单独葛根素组)、 V(正常组)之间相比较无显著性差异(pX).05)。 24h后，IV (足部浅11°(:烫伤+ 葛根素组)与III (足部浅H。C烫伤组)之间比较，机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)显著性增加(pO.Ol)。 72h或96h^IV (足部浅II。C 烫伤+葛根素组)的机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)与i、 n 、 v组之间相比较基本恢复正常(px).05),而m (足部浅n。c烫伤组)
的机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)仍较4氐(p〈0.01)。 见图IO。
2.1.5免疫组化检测大鼠背根神经节(DRG)P2X3表达变化
SD大鼠(体重200士20g)随机分为I (背部假烫组，sham back burn)、 II (单独葛根素组，Puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部淺II。C烫伤组， superficial second degree back burn )、 IV(背部浅II °C烫伤+葛根素组，superficial second degree back bum + puerarin )、 V(正常对照组control )。 IV (背部浅II。C 烫伤+葛根素组)大鼠，烫伤前30min和烫伤后每天腹腔注射葛根素(Puerarin, 100mg/kg)，连续3天。用免疫组织化学方法测定大鼠烫伤部背^bf申经节 (DRG)P2X3受体的表达。
免疫组化结果经Hmias-2000高清晰彩色医学图文分析系统分析，结果显 示i组、ii组、iii组、iv组、v组的平均光密度值分别为127.2±3.6902(n=10)、 124.2±2.4258(n=10)、 158.6±3.1383( n=10 )、 135.9±4.5227( n=10 )、 125.1±1.8824
(n=io)。m(背部浅ii。c烫伤组)明显高于i组、n组、iv组、v组(po.oi)，
I、 II、 V组之间P2X3受体表达无显著性差异(p>0.05); IV(背部浅II。C烫
伤+葛根素组)与i、 ii、 v组之间P2X3受体表i^目比，虽有偏高，但其与ni
(背部浅II°C烫伤组)比较，DRG的P2X3受体的表达量明显下降(pO.Ol )。
见图11。
2.1.6原位杂交检测大鼠背才m申经节(DRG)P2X3的mRNA表达变化
SD大鼠(体重200土20g)随机分为I (背部假烫组，sham back bum)、 II (单 独葛根素组，puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部浅II。C烫伤组， superficial second degree back burn )、 IV(背部浅IPC烫伤+葛根素组，superficial second degree back burn + puerarin) 、 V (正常对照组，control )。 IV (背部浅II 。C 烫伤+葛根素组)，烫伤前30min和烫伤后，大鼠每天腹腔注射葛根素(puerarin 100mg/kg)，连续3天。
原位杂交结果经Hmias-2000高清晰彩色医学图文分析系统测定大鼠烫伤
部背根神经节(DRG)P2X3受体的表达。结果显示，i组、n组、m组、IV组、
V组的平均光密度值分别为:111.4 ±2.0342 (n=10)、 105.4±0.7180 (n=10 )、 129.1±1.1494 (n=10)、 101.7±1.7641 (n=10)、 108.5±3.5567 (n=10 )。 III (背 部浅II。C烫伤组)P2X3mRNA^达明显高于I组、II组、IV组、V组(p0.05), I、 II、 V组之间P2X3 mRNA表达无显著性差异(p>0.05); IV(背部浅II。C 烫伤+葛根素组)与III (背部浅II。C烫伤组)比较，DRG的P2X3 mRNA的表 达量显著性下降(pO.Ol)，与I、 II、 V组之间比较亦较低。见图12。 2丄7蛋白印迹检测大鼠背才m申经节(DRG)P2X3蛋白表达变化
SD大鼠(体重200士20g)随机分为I (背部假烫组，sham back burn)、 II (单独葛根素组，puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部浅II。C烫伤组， superficial second degree back burn )、 IV (背部浅IPC燹伤+葛根素组，superficial second degree back burn + puerarin )、 V (正常对照组，control )。 IV (背部浅II 。C 烫伤+葛根素组)，大鼠烫伤前30min和烫伤后每天腹腔注射葛根素(puerarin, 100mg/kg)，连续3天。
结果通过Alpha Imager 2200图像分析软件读取目的条带在X光胶片上测得 的光密度扫描值，以各组P-actin条带的扫描值标化其相应组P2X3的蛋白表达 量。结果显示，I组、II组、III组、IV组、V组的P2X3的蛋白表达量(经对应 的卩-actin标化后)分别为0.9895±0.0703 ( n=10 )、 0.9744±0.0214 ( n=10 )、
I. 2259±0.0588 (n=10)、 0.9286±0.0177 (n=10 )、 0.9771±0.0203 (n=10 )。 III (背 部浅II。C烫伤组)P2X3蛋白的表达明显高于I组、II组、IV组、V组(pO.Ol )，
i 、 n、 v组之间P2X3蛋白的表达无显著性差异(px).05)，而iv(背部浅n。c
烫伤+葛根素组)与I 、 II、 V组之间相比，DRG的P2X3蛋白的表W目对量更 低，但无显著性差异(p>0.05 )，与m (背部浅H。C烫伤组)比较，DRG的P2X3 蛋白的表&目对量明显下降(p<0.01 )。见图13。 2.1.8 RT-PCR检测大鼠背才M申经节(DRG)P2X3的mRNA表达变化
SD大鼠(体重200士20g)随机分为I (背部假烫组，sham back burn)、 II (单 独葛根素组，puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部浅II。C烫伤组， superficial second degree back burn )、 IV(背部浅IPC烫伤+葛根素组，superficial second degree back burn + puerarin )、 V (正常对照组，control )。 IV (背部浅II 。C 烫伤+葛根素组)，大鼠烫伤前30min和烫伤后每天腹腔注射葛根素(puerarin， 100mg/kg)，连续3天。
引物设计选用p-actin作为内参，引物序列如下
PrimerP2X3 (产物长度为519bp)
S 5 ， - CAACTTCAGGTTTGCCAAA - 3 ，
A 5' - TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3，
Primer卩-actin (产物长度为240bp)
S 5 ， - TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT - 3'
A 5' - CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC - 3'
采用凝胶成像系统读取目的电泳条带的斑点密度(平均光密度)扫描值， 将P2X3条带与其对应的P-actin条带的比值作为P2X3 mRNA表达的相对量。结果 显示，I组、1I组、ni组、IV组、V组P2X3mRNA反i^目对量(经对应的P-actin 标化后)分别为:0.9379±0.0053(n=10)、 0.9513± 0.0049(n=10 )、 1.0391± 0.0097 (n=10)、 0.9133± 0.0033 (n=10)、 0.9517± 0,0085 (n=10)。 III (背部浅II。C 烫伤组)P2X3inRNA的表达明显高于I组、II组、IV组、V组(p<0.01 )， I 、
II、 V组之间P2X3 mRNA的表达无显著性差异(p>0.05),而(背部浅II。C烫
14伤+葛根素组)与I、 II、 V组之间相比，DRG的P2X3 mRNA的表达量更低， 有显著性差异(p<0.05 ),与m (背部浅H。C烫伤组)比较，DRG的P2X3 mRNA 的表达明显下降(pO.Ol)。见图14。
申请人实验室的研究发现葛根素可减轻神经病理痛及烫伤痛大鼠的痛行 为反应。根据葛根素减小神经病理痛和烧伤痛大鼠背才M申经节神经元P2X3受 体的表达、抑制P2X3受体激动剂ATP和a，卩-meATP在正常大鼠背根神经节 神经元的激活电流的研究结果，表明葛根素减轻疼痛的作用机理是阻断P2X3 受体介导的疼痛信息传递，具有防治疼痛的作用。此外，由于P2X嘌呤受体涉 及体内许多生理功能和病理作用，探寻出新的喋呤受体特异性阻断剂，将极大 地推动噪呤信息系统在体内各种生理功能和病理作用的研究工作。


图1为葛根素神经病理痛大鼠热痛敏的影响图； 图2为葛根素神经病理痛大鼠机械痛敏的影响图3为葛根素对神经病理痛大鼠背根神经节P2X3受体免疫反应性的影响 图，其中A:假手术组；B:单独葛根素组；C:坐骨神经慢性压迫性损伤组；D: 坐骨神经慢性压迫性损伤+葛根素组;E:正常组；
图4为葛根素对神经病理痛大鼠背根神经节P2X3受体mRNA表达的影响 图，其中A:假手术组；B:单独葛根素组；C:坐骨神经慢性压迫性损伤组；D: 坐骨神经慢性压迫性损伤+葛根素组;E:正常组；
图5为各组大鼠DRG神经元P2X受体激动剂-激活电流图，其中A:假手 术组；B:单独葛根素组；C:坐骨神经慢性压迫性损伤组；D:坐骨神经慢性压 迫性损伤+葛根素组;E:正常组；
图6为浅II度烧伤皮肤HE染色病理切片x40的示意图7为大鼠皮肤标本连续切片S-100和P2X3免疫组织化学照片，其中A为神 经末梢S-100免疫阳性表达照片；B为神经末梢P2X3免疫阳性表达照片，箭头所 指为免疫阳性神经末梢；
图8为烧伤大鼠皮肤神经末梢P2X3受体免疫组化表达照片，其中A为背部 皮肤假烫组；B为葛根素注射+背部皮肤浅II。C烫伤组；C为生理盐水+背部皮 肤浅n。c烫伤组，箭头所指为免疫组化阳性神经末梢；
图9为葛根素烫伤痛大鼠热痛敏的影响图IO为葛根素烫伤痛大鼠积械痛敏的影响图ll为葛根素对烫伤痛大鼠背才艮神经节P2X3受体免疫反应性的影响图，其 中A:假烫组；B:单独葛根素组；C:浅II。C烫伤组；D:浅II。C烫伤+葛根素组; E:正常组；
图12为葛根素对烫伤痛大鼠背根神经节P2X3受体mRNA表达的影响图，其 中A:假烫组；B:单独葛根素组；C:浅II。C烫伤组；D:浅II。C烫伤+葛根素组;E:正常组；
图13为葛根素对烫伤痛大鼠背根神经节P2X3受体蛋白表达的影响图，其中 实验分组顺序假烫组；正常对照组；浅II。C烫伤+葛根素组；浅II。C烫伤组; 单独葛根素组；
图14为葛根素对烫伤痛大鼠背根神经节P2X3受体mRNA表达的影响图，其 中实验分组顺序正常对照组；浅II。C烫伤+葛根素组；浅II。C烫伤组；单独葛 根素组；假烫组。
具体实施例方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。 实施例1:
用本技术领域公知的方法，制成适用于急性痛/慢性痛治疗的口服、注射或 局部(如局敷)的葛根素制剂。 实施例2:
用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及P2X3受体介导神经系统疾病 治疗的口服、注射或局部(如局敷)的葛根素制剂。
权利要求
1、葛根素在制备治疗慢性痛即神经病理痛的药物中的应用。
2、 葛根素在制备治疗急性痛即烧伤^^乍痛的药物中的应用。
3、 葛根素作为P2X3噪^t^抗剂在制备治疗涉及P2X3受体介导神经系统疾 病防治药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及葛根素在制药领域中的新用途，即葛根素在制备P2X₃介导疼痛/神经系统疾病药物中的应用。实验观察到葛根素可抑制痛觉行为反应，进而应用免疫组化、原位杂交、RT-PCR及蛋白印迹等技术观察到葛根素可抑制神经病理痛模型大鼠背根神经节及烧伤模型大鼠背根神经节、感觉神经末梢P2X₃受体的mRNA和蛋白表达，用全细胞膜片钳技术观察到葛根素可明显减小病理痛模型大鼠背根神经节神经元P2X₃受体激动剂激活电流。实验证实葛根素对急、慢性疼痛具有抑制作用的机理是阻断初级感觉神经元P2X₃受体介导的痛觉信息传递。本发明为防治急、慢性疼痛探明新方法，同时还表明葛根素具有P2X₃受体拮抗剂的作用，这将有助于P2X₃受体所涉及神经系统疾病的药物防治应用。
文档编号A61K31/352GK101627990SQ200910115608
公开日2010年1月20日 申请日期2009年6月29日 优先权日2009年6月29日
发明者晗 刘, 刘双梅, 君 张, 徐昌水, 欣 李, 李桂林, 林加日, 梁尚栋, 云 高 申请人:南昌大学