专利名称：预防或治疗猪链球菌病的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗动物细菌感染的药物组合物，尤其涉及一种预防或治疗猪链球菌病的药物组合物，属于动物细菌病的防治领域。
背景技术：
猪链球菌病是由多种不同群的致病性链球菌引起的动物和人类共患的一种多型传染病。因为猪链球菌的血清群众多，给其防制带来了困难，所以在临床上普遍采用药物进行预防和治疗。
但是在药物选择压力下，猪链球菌可以形成生物被膜(biofilm，BF)，抵抗抗菌药物对其作用。生物被膜是细菌在不良生存环境中生长的一种保护性模式，生物被膜中的细菌无论在形态结构、生理生化特性及致病特点等都与浮游生长的细菌显著不同，生物被膜可以保护细菌逃避宿主免疫和抗菌药物的杀伤作用。生物被膜相关感染的治疗过程中，抗生素可迅速地杀灭浮游细菌和生物被膜表层的细菌，而生物被膜深层的细菌则持续存在，能够使浮游细菌致死的抗生素剂量往往对生物被膜内细菌无效，同时应用低于致死剂量的抗生素又易使细菌产生耐药性，使治疗非常棘手，从而导致生物被膜相关感染难以治愈。因此，寻找抑制、消除生物被膜形成的药物和方法具有重要意义。细菌生物被膜相关感染的治疗非常棘手，目前还没有找到能完全控制这种感染的药物和方法。
基于猪链球菌病的危害和防治现状，国内外均在寻找对猪链球菌高效的药物，通过筛选、研发高效的药物，用于免疫失败的猪群治疗。但是由于新的、作用强的畜禽专用抗菌药物进入市场的数量较少，跟不上兽医临床需要。因此，如何合理使用及开发现有的抗菌药物，减少和延缓细菌耐药性的产生，筛选出对猪链球菌有效的同时又能消除猪链球菌的菌膜的复方药物，就显得十分重要。
发明内容
本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种对于猪链球菌敏感且能消除猪链球菌的菌膜从而有效杀灭包被在生物被膜内的猪链球菌的药物组合物。
本发明目的是通过以下技术方案来实现的 一种治疗猪链球菌病的药物组合物，由治疗上有效量的β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素组成； 其中，所述的β-内酰胺类抗生素包括青霉素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林或氨苄西林，优选为阿莫西林(阿莫西林是广谱氨基青霉素，是β-内酰胺类药物的代表药物)； 所述的大环内酯类抗生素包括红霉素、泰乐菌素、麦迪霉素、螺旋菌素、乙酰螺旋菌素或酒霉素等，优选为泰乐菌素(泰乐菌素是畜禽专用的大环内酯类药物)或红霉素，最优选为泰乐菌素。
本发明通过试验发现，将β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素按照1:20的重量比例组成得到的复方药物具有最佳的治疗效果。此外，本发明还发现，当泰乐菌素的浓度为640μg/ml时，其消除猪链球菌被膜形成的作用最强。
传统的观点认为，快效抑菌剂(包括四环素类、氯霉素类、大环内脂类等)能迅速阻断细菌蛋白质的合成，导致细菌生长处于静止状态细菌合成细胞壁的过程停止，而快速杀菌剂(包括β-内酰胺类、先锋霉素族)的作用原理就是影响细菌细胞壁的合成而起杀菌作用的，故两者合用快效抑菌剂可能降低快速杀菌剂的疗效。据此认为这两种抗生素不能联合应用。
抗菌药物要对生物膜中细菌及其组分产生作用，首先必须要能渗透进入生物膜。抗菌药物对生物膜的渗透作用受到很多因素的影响，其中基质和抗菌药物的量对抗菌药物的渗透有较大的影响。药物对生物膜的杀伤主要表现为生物膜内的细菌数目减少或是对细菌的杀伤。本发明建立了猪链球菌的体外BF模型，通过实验发现，大环内酯类抗生素能有效的破坏或清除猪链球菌的菌膜，具有强大杀菌作用的β-内酰胺类抗生素得以进入到菌膜内从而彻底杀灭隐藏于菌膜内的猪链球菌，实验证明，将大环内酯类抗生素和β-内酰胺类抗生素两者连用，不仅没有拮抗作用，反而具有良好的协同增效作用，能有效清除菌膜内的猪链球菌。本发明进一步发现，将泰乐菌素和阿莫西林相配伍时杀灭猪链球菌的协同效应为最好(协同效应高达77.22％)。
本发明药物组合物可以按照常规的药物制剂方法制备成口服制剂(例如散剂)。
本发明药物组合物的用法和参考用量保健用药一次量将本发明药物组合物100g与猪饲料300斤混合均匀后，饲喂猪只；母猪产前用7天、产后用7天，仔猪断奶后用7天，小猪转群后用7天。治疗用药一次量将本发明药物组合物100g与猪饲料200斤混合均匀后，饲喂发病猪1周。
具体实施例方式 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验例1 β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素MIC值的测定 一、试验方法 采用微量肉汤稀释法测定单药的最低抑菌浓度。分别测定了21株猪链球菌和1株质控菌株对β-内酰胺类抗生素(青霉素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林)和大环内酯类抗生素(红霉素、泰乐菌素)的MIC值。
具体试验方法如下 1、将猪链球菌分离株及标准株的冻存菌株接种至脑心浸液琼脂平板(其配方组成如下3号胨10g、麦芽糖20g、乳糖1g、酵母浸粉10g、氯化钠5g、叠氮化钠0.4g、甘油磷酸钠10g、琼脂15g、氯化三苯基四氮唑0.1g、溴甲酚紫0.015g、PH7.2)，37℃孵育过夜。取菌落制成0.5麦氏管盐水悬液，然后稀释为约5×106CFU/ml； 2、取冻存的抗菌药贮存液溶化后，以脑心浸液培养基分别进行系列二倍稀释，依次加入无菌96孔微孔板每排1-11孔中，每孔100μl，药物浓度从512μg/ml至0.5μg/ml，最后一孔(第12孔)未加抗生素作为对照； 3、每孔加入菌悬液0.01ml，使菌终浓度约为5×105CFU/ml，混匀后盖好，于37℃孵育24h； 4、以肉眼观察，药物最低浓度孔无细菌生长者(细菌生长完全抑制)，即为受试菌的MIC。读取菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。
二、试验结果 101株猪链球菌对红霉素、泰乐菌素，青霉素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林的耐药率分别为58.12％、35.12％、45.171％、22.18％、54.29％、67.14％和78.24％。
试验例2 红霉素、泰乐菌素联合β-内酰胺类抗生素对猪链球菌的联合抑菌效果试验 1、试验方法 1.1初测MIC 将实验室中保存的101株猪链球菌分别用液体培养基(其配方组成如下3号胨10g、麦芽糖20g、乳糖1g、酵母浸粉10g、氯化钠5g、叠氮化钠0.4g、甘油磷酸钠10g、氯化三苯基四氮唑0.1g、溴甲酚紫0.015g、pH7.2)做1:1000稀释。在第一孔加入108μl菌液，其余各孔均加60μl菌液。然后在第一孔加入12μl红霉素原液，混匀后吸取60μl加入第二孔，同法依次稀释至第十一孔弃去60μl，第十二孔为阳性对照。用同样方法稀释阿莫西林；37℃培养18h；按相同的方法对泰乐菌素，青霉素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林的MIC进行测定。以无细菌生长的最低药物浓度为红霉素、泰乐菌素，青霉素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林的MIC。
1.2棋盘法测定红霉素、泰乐菌素联合β-内酰胺类抗生素的药物敏感性测定 根据测定的MIC值，分别以红霉素、泰乐菌素，青霉素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨苄西林的4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍MIC浓度分别进行联合。用无菌蒸馏水把β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素储备液稀释至4MIC。在微孔板上设横竖各5排孔为一方阵，第一方阵内第一列加入用液体培养基稀释1000倍(1.5×104cfu/ml)的复苏菌液108μl，其余各列均加60μl。然后在第一列加入稀释的4MIC大环内酯类抗生素12μl，用排枪混匀后吸取60μl加入第二列，同法依次稀释至第5列弃去60μl，使大环内酯类抗生素的浓度为4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍MIC。用同样方法稀释β-内酰胺类抗生素。然后将β-内酰胺类抗生素的竖排加到大环内酯类抗生素的横排中进行联合。用2的方法测相应大环内酯类抗生素和相应β-内酰胺类抗生素的MIC为对照，37℃培养16-24h。
1.3判断标准 以部分抑菌浓度指数(FIC)的计算结果判定联合药敏试验的结果。
FIC指数＝联合用药时β-内酰胺类抗生素的MIC/β-内酰胺类抗生素单剂的MIC+联合用药时大环内酯类抗生素的MIC/大环内酯类抗生素单剂的MIC； 判断标准FIC指数≦0.5为协同作用；0.5-1为累加作用；1-2为无关作用；大于2为拮抗作用。
2、试验结果 各种抗生素组合的联合抑菌效果见表1。红霉素组和泰乐菌素组均以协同和相加作用为主，在红霉素组中为86.53％，在泰乐菌素组中为90.49％，但泰乐菌素组的协同效应为60％，高于红霉素组15.84％。7种抗生素的10个组合对101株被测菌的FIC范围分别为红霉素+青霉素(0.125～1.063)、红霉素+阿莫西林(0.314～1.031)、红霉素+苯唑西林(0.125～1.016)、红霉素+氯唑西林(0.125～1.125)、红霉素+氨苄西林(0.1875～1.75)，泰乐菌素+青霉素(0.1875～1.063)、泰乐菌素+阿莫西林(0.125～1.063)、泰乐菌素+苯唑西林(0.1875～1.1625)、泰乐菌素+氯唑西林(0.125～1.625)、泰乐菌素+氨苄西林(0.125～1.75)。在红霉素组中，协同现象发生率最高的组合为红霉素+阿莫西林，为55.4％。在泰乐菌素组，协同现象发生率最高的组合为泰乐菌素+阿莫西林，为77.22％。
表1 红霉素或泰乐菌素联合5种β-内酰胺类药物对101株猪链球菌的体外联合效应(株)
联合后红霉素的MIC50和MIC90分别降为≤2mg/L和4mg/L，泰乐菌素的MIC50和MIC90分别降为≤4mg/L和≤8mg/L。测试的5种β-内酰胺类抗生素联合后的MIC50和MIC90也分别比单用药时降低了1～2个对倍稀释度。值得一提的是，泰乐菌素与阿莫西林联用后MIC50和MIC90均比单用时降低了3个对倍稀释度。
试验例3 泰乐菌素对阿莫西林透过猪链球菌菌膜的影响 1.体外猪链球菌生物菌膜(BF)模型建立 1.1建立规范标准的生物被膜模型是进行生物被膜药物作用研究的关键，本试验通过96孔板，用含有0.5％葡萄糖、2％蛋白胨、0.3％ K2HPO4、0.2％KH2PO4、0.01％人纤维蛋白原、0.01％MgSO4.7H2O、0.002％MnSO4.6H2O及0.5％NaCl的肉汤培养基成功的制备了猪链球菌生物菌膜。具体试验方法如下 培养18小时的2型猪链球菌用含有0.5％葡萄糖、2％蛋白胨、0.3％K2HPO4、0.2％KH2PO4、0.01％人纤维蛋白原、0.01％MgSO4.7H2O、0.002％MnSO4.6H2O及0.5％Na Cl的肉汤培养基稀释至吸光度值为0.2(OD655)，将稀释后的猪链球菌加到96孔板，每孔加100μl。37℃孵育18小时后，将悬浮的细菌及培养基除去，用银染法染色。银染法具体步骤如下用灭菌生理盐水多次充分漂洗，去掉浮游菌；在2.5％戊二醛PBS溶液中固定1小时；蒸溜水清洗1分钟；饱和CaCl2溶液结合15分钟；蒸溜水清洗1分钟；5％Ag NO3溶液反应15分钟；1％对苯二酚溶液显色2分钟；蒸溜水漂洗1分钟；5％NaS2O3溶液固定2分钟；蒸溜水漂洗1分钟。银染后行普通光学显微镜观察，并以空白硅胶膜银染后普通光学显微镜观察结果作阴性对照。
1.2试验结果(BF银染结果)菌膜经银染后，肉眼可见膜表面呈灰黑色着色，色泽均匀、致密，表明有猪链球菌菌膜形成。
2、测定菌膜中药物含量 2.1试验方法 将上述形成菌膜的96孔板中，分别加入已预热至37°C的以下3组药物第1组药物32μg/ml阿莫西林；第2组药物640μg/ml泰乐菌素；第3组药物32μg/ml阿莫西林+640μg/ml泰乐菌素；每组加入12个孔中，放入培养箱中培养，培养4小时后，取出。将药液全部倾去，超声脱膜，用500μl灭菌生理盐水稀释成悬浊液，分别测定阿莫西林及泰乐菌素的含量。
阿莫西林含量测定方法如下仪器用Agilent1200带二极管阵列检测器色谱柱ODS-3C18柱250×4.6(ID)，粒径5um或相当者。用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，以0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液-乙腈(97.5:2.5)为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数按阿莫西林计算不低于2000。
泰乐菌素的含量测定应用Agilent1200带二极管阵列检测器。色谱柱为XDBC18柱150×4.6(ID)，粒径5um或相当者。流动相0.05mol/L(pH＝2.8)高氯酸钠乙腈＝6535。流速1.0mL/min。
2.2试验结果 第1组BF阿莫西林含量为0.988±2.45μg/ml；第2组BF泰乐菌素含量为600.88±10.32μg/ml。第3组BF泰乐菌素含量为55.88±9.46μg/ml，阿莫西林含量为28.42±12.60μg/ml。
3.MTT比色法测定BF中活菌数 3.1 试验方法 3.1.1 标准曲线 新鲜培养的受试菌通过比浊仪用MH肉汤调至以下浓度1.5×108、3.0×107、6.0×106、1.2×106、2.4×105、4.8×104CFU/ml。在无菌96孔板中精确加入各浓度的细菌稀释液190μl及20μl MTT试剂，混匀后于37℃培养2h后加入裂解液90μl，待其充分裂解后，于酶标仪上测定595nm处取吸收度，以细菌浓度(C)和吸收度(A)进行直线回归，求得标准曲线。
3.1.2 BF中活菌数测定 将上述形成菌膜的96孔板中，分别加入已预热至37°C的以下3组药物第1组药物32μg/ml阿莫西林；第2组药物640μg/ml泰乐菌素；第3组药物32μg/ml阿莫西林+640μg/ml泰乐菌素；第4组为对照组(不加入任何抗生素)；每组加入12个孔中。放入培养箱中培养。培养4小时后，取出。倾去药液。超声脱膜所得菌悬液按标准曲线向上方法操作，计算菌液浓度。
3.2 试验结果 BF中活菌数法的测定MTT比色法测得4组BF中猪链球菌浓度。4组BF中猪链球菌浓度分别如下第1组药物3.21×107CFU/ml；第2组药物1.25×103CFU/ml；第3组药物46.2CFU/ml；第4组(对照组)6.68×107CFU/ml。
从试验结果可见，相比于对照组，第2组和第3组能显著降低BF中猪链球菌浓度，尤其将阿莫西林和泰乐菌素联合使用时，能有效清除BF中的猪链球菌，说明将大环内酯类抗生素和β-内酰胺类抗生素二者连用具有良好的协同增效作用，能有效清除菌膜内的猪链球菌。
权利要求
1、一种预防或治疗猪链球菌病的药物组合物，由治疗上有效量的β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素组成。
2、按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的β-内酰胺类抗生素包括青霉素、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林或氨苄西林；所述的大环内酯类抗生素包括红霉素、泰乐菌素、麦迪霉素、螺旋菌素、乙酰螺旋菌素或酒霉素。
3、按照权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的β-内酰胺类抗生素是阿莫西林。
4、按照权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的大环内酯类抗生素是红霉素或泰乐菌素。
5、按照权利要求4所述的药物组合物，其特征在于所述的大环内酯类抗生素是泰乐菌素。
6、按照权利要求1-5任何一项所述的药物组合物，其特征在于所述的β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素按照1∶20的重量比例组成。
7、按照权利要求1-5任何一项所述的药物组合物，其特征在于按照常规药物制剂方法制备成口服制剂或注射剂。
8、权利要求1-5任何一项所述的药物组合物在制备治疗猪链球菌病药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种预防或治疗猪链球菌病的药物组合物，属于动物疾病的防治领域。该药物组合物由治疗上有效量的β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素联合组成。其中，所述的β-内酰胺类抗生素优选为阿莫西林，所述的大环内酯类抗生素优选为红霉素或泰乐菌素。本发明建立猪链球菌的体外BF模型，实验发现，将大环内酯类抗生素和β-内酰胺类抗生素两者连用后具有良好的协同增效作用，能有效清除菌膜内的猪链球菌。本发明进一步发现，将泰乐菌素和阿莫西林相配伍时，二者杀灭生物被膜内猪链球菌的协同效应为最好(协同效应高达77.22％)。
文档编号A61K31/429GK101502653SQ20091011815
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者李艳华, 闫清波, 刚 徐, 洋 刘, 敏 王, 李晓云, 阳 崔, 赵志慧, 栋 边 申请人:李艳华