稳定蛋白质制剂的制作方法

专利名称：：稳定蛋白质制剂的制作方法
技术领域：
：本发明大体上涉及含有CTLA4Ig分子的稳定制剂，包括用于各种给药途径(包括例如静脉内(IV)和皮下(SC))的低压冻干和液体制剂。
背景技术：
：在过去20年中，重组DNA技术使许多蛋白质疗法商业化。蛋白质药物最常规的给药途径为静脉内(IV)给药，这是由于绝大多数其它给药途径的生物利用度低、临床给药时需要更多的监控以及更快速的药物研发。对于需要频繁和长期给药的产品而言，另一种皮下(SC)给药途径更具有吸引力。当与预充式注射器和自动注射器技术联合使用时，SC给药允许家庭给药并提高了给药的顺应性。使用高于lmg/kg或IOOmg/剂量的高剂量治疗时需要研发浓度超过100mg/ml的制剂，这是由于小体积(<1.5ml)才可以通过SC途径给药。对于在更高浓度容易聚集的蛋白质而言，达到这样高浓度的制剂是一种研发挑战。甚至对于可以大体积给药的IV给药途径而言，高剂量给药方案可能需要几十mg/ml的蛋白浓度，而这一浓度会影响一些蛋白质的稳定性。控制蛋白质溶解度的原理比小合成分子的更复杂，因此克服蛋白质的溶解度问题需要不同的策略。在操作上，蛋白质的溶解度可描述为在辅溶质存在下并因此溶液保持澄清(例如，没有蛋白质沉淀、结晶或凝胶)时蛋白质的最大量。蛋白质的溶解度对离子强度、盐形式、PH、温度和某些赋形剂的依赖性可由重力水(bulkwater)表面张力的变化和蛋白质与水和离子的结合与自身结合的对比进行机械学解释，见Arakawa等，Theoryofproteinsolubility(蛋白质溶解度原理)，MethodsofEnzymology,11449-77,1985；ScheinSolubilityasafunctionofproteinstructureandsolventcomponents(溶解度作为蛋白质结构和溶剂组分的函数)，BioTechnology8(4)=308-317,1990JenkinsThreesolutionsoftheproteinsolubilityproblem(蛋白质溶角军度问题的三禾中角军答)，ProteinScience7(2):376_382，1998；及其它。蛋白质与某些赋形剂或盐的结合可通过蛋白质构象的变化或遮盖参与自身结合的某些氨基酸影响溶解度。蛋白质也会优先被某些盐、氨基酸和糖水化(并稳定化形成更紧致的构象)，导致其溶解度变化。聚集需要两分子之间的碰撞，是蛋白质溶液中的主要降解途径。浓度与形成聚集的关系取决于聚集物的大小和结合机制。蛋白质聚集可引起共价(例如二硫键连接)或非共价(可逆或不可逆)结合。由非共价结合引起的不可逆聚集通常经由可改变蛋白质天然构象的由温度、机械或化学过程暴露的疏水区域发生。蛋白质聚集可影响蛋白质活性、药物代谢动力学和安全性，例如由于免疫原性。最小化聚集作用的典型方法为限制蛋白质的移动性以降低碰撞次数。用适当的赋形剂低压冻干可防止聚集提高蛋白质的稳定性，其方式为降低蛋白质的移动性和限制构象的柔性，其另外的益处为由于去除水分使水解反应降至最低。加入适当的赋形剂，包括冻干保护剂，可防止在冻干和终产品的保存过程中发生聚集。有效保护的关键参数为冻干保护剂与蛋白质的摩尔比值。通常要求3001或更高的摩尔比值以提供适当的稳定性，尤其是对于室温保存。然而这些比值也可弓I起不利的粘度增加。低压冻干可设计具有适当稳定性和张力的制剂。虽然SC给药并不一定要求等渗性，但对于降低给药时的疼痛还是有需要的。亲液物的等渗性较难达到，这是由于在重新溶解的过程中蛋白质和赋形剂都被浓缩。如果终蛋白浓度的目标>100mg/ml，5001的赋形剂与蛋白质的摩尔比将得到高渗制剂。如果要得到等渗制剂，那么各种可供选择的较低的赋形剂与蛋白质摩尔比将可能得到较不稳定的制剂。确定可达到的最高蛋白质浓度仍然取决于经验，这是由于蛋白质构象的易变性和其与自身、与表面和特定溶质相互作用的倾向性。可从SC制剂中获益的受试者实例为其病症需要频繁或长期给药的患者，例如患有免疫系统疾病、类风湿性关节炎和与移植物移植相关的免疫紊乱的受试者。可购买的用于治疗类风湿性关节炎的蛋白质产品包括HUMIRA,ENBREL和REMICADE。HUMIRA(Abbott)的包装为一次性、Iml的预充式玻璃注射器作为无菌的、不含防腐剂的溶液用于皮下给药。HUMIRA溶液澄清、无色，pH约为5.2。每一支注射器可释放0.8ml(40mg)的药品。每0.8mlHUMIRA含有40mg阿达木单抗、4.93mg氯化钠、0.69mg二水合磷酸二氢钠、1.22mg二水合磷酸氢二钠、0.24mg柠檬酸钠、1.04mg一水合柠檬酸、9.6mg甘露醇、0.8mg聚山梨酯80和注射用水USP。必要时加入氢氧化钠调节pH。ENBREL(Amgen)的包装为一次性、Iml的预充式注射器作为无菌的、不含防腐剂的溶液用于皮下给药。ENBREL溶液澄清、无色，pH为6.3士0.2。每一支ENBREL一次性预充式注射器含有0.98ml的50mg/ml依那西普溶液，其中含10mg/ml蔗糖、5.Smg/ml氯化钠、5.3mg/mlL-精氨酸盐酸盐、2.6mg/ml一水合磷酸二氢钠和0.9mg/ml无水磷酸氢二钠。如果将管形瓶重新溶解并按照建议给药，给药一支50mg/ml的ENBREL预充式注射器相当于2支25rng的ENBREL冻干管形瓶。ENBREL多次使用管形瓶含有无菌、白色、不含防腐剂的冻干粉末。用Iml所提供的抑菌性注射用水(BWFI)，USP(含有0.9%苯甲醇)可都得到多次使用、澄清、无色溶液，PH为7.4士0.3，含有25mg依那西普、40mg甘露醇、IOmg蔗糖和1.2mg氨丁三醇。REMICADE(Centocor)为用于静脉输注的无菌、白色、冻干粉末。在用IOml无菌注射用水USP重新溶解后，所得PH接近7.2。每一支一次性管形瓶含有IOOmg英夫利昔单抗、500mg蔗糖、0.5mg聚山梨酯80、2.2mg—水合磷酸二氢钠和6.Img二水合磷酸二氢钠。不添加防腐剂。可购买的用于治疗与移植物移植相关的免疫紊乱的蛋白质产品包括SIMULECT*ZENAPAX。药品SIMTJLECT(Novartis)为无色冻干物，其包装为6ml无色玻璃管形瓶，含量为IOmg和20mg。每一支ΙΟ-mg管形瓶含有IOmg巴利昔单抗、3.61mg—水合磷酸二氢钠、0.50mg磷酸氢二钠(无水)、0.80mg氯化钠、IOmg蔗糖、40mg甘露醇和20mg甘油，用2.5ml无菌注射用水USP重新溶解。每一支20-mg管形瓶含有20mg巴利昔单抗、7.2Img磷酸二氢钾、0.99mg磷酸氢二钠(无水)、1.6Img氯化钠、20mg蔗糖、80mg甘露醇和40mg甘油，用2.5ml无菌注射用水USP重新溶解。不添加防腐剂。ZENAPAX(RocheLaboratories)，25mg/5ml，为用于进一步稀释和静脉内给药的澄清、无菌、无色浓缩物。每毫升ZENAPAX含有5mg达克珠单抗和3.6mg一水合磷酸二氢钠、Ilmg七水合磷酸氢二钠、4.6mg氯化钠和0.2mg聚山梨酯80并且可含有盐酸或氢氧化钠以调节PH至6.9。不添加防腐剂。CTLA4Ig分子可通过抑制⑶28-B7相互作用干扰T细胞协同刺激。因此，CTLA4Ig分子可用于治疗免疫系统疾病，例如类风湿性关节炎和与移植物移植相关的免疫紊乱。我们需要一种含有CTLA4Ig分子用于治疗免疫系统紊乱的稳定、有效、方便的制剂。发明概述本发明提供了治疗免疫系统紊乱的制剂，其方式为给予受试者CTLA4Ig分子，其可与B7阳性细胞上的B7分子结合并因此抑制内源性B7分子与CTLA4和/或⑶28在T-细胞上的结合。本发明的冻干制剂包含CTLA4Ig分子，其蛋白质与冻干保护剂的重量比至少为12。冻干保护剂优选糖，更优选双糖，最优选蔗糖或麦芽糖。冻干制剂也可含有一种或多种选自缓冲剂、表面活性剂、填充剂和防腐剂中的组分。在某些实施方案中，用于稳定冻干药品的蔗糖或麦芽糖的量为蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比至少为12，优选蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比至少为12至15，更优选蛋白与蔗糖或麦芽糖的重量比约为12。本发明的皮下(SC)制剂在含水载体中含有蛋白浓度至少为100mg/ml的CTLA4Ig分子与稳定化水平的糖，优选至少为125mg/ml的蛋白质浓度与稳定化水平的糖。该糖的优选重量比至少为蛋白质与糖11.1。稳定剂的使用量优选不大于可能引起SC注射器给药时不利或不适当粘度的量。糖优选为二糖，最优选为蔗糖。SC制剂也可含有一种或更多种选自缓冲剂、表面活性剂和防腐剂的组分。在某些实施方案中，用于稳定CTLA4Ig分子SC药品的蔗糖用量为蛋白质与蔗糖的重量比至少为11，优选蛋白质与蔗糖的重量比为13至15，更优选蛋白质与蔗糖的重量比约11.4。本发明的液体制剂在含水载体中包含蛋白质浓度至少为20mg/ml的CTLA4Ig分子与稳定化水平的糖，优选至少25mg/ml与稳定化水平的糖。优选糖的重量比至少为蛋白质与糖11。糖优选双糖，最优选蔗糖。该液体制剂也可含有一种或更多种选自缓冲剂、表面活性剂和防腐剂的组分。在某些实施方案中，用于稳定液体药品的蔗糖用量为蛋白质与蔗糖的重量比至少为11，优选蛋白质与蔗糖的重量比为12至110，更优选蛋白质与蔗糖的重量比约12。在本发明的另一个实施方案中提供了制造品，其包括药品并优选提供其使用说明。本发明进一步提供了给予本发明CTLA4Ig分子制剂治疗免疫系统疾病和耐受诱导作用的方法。附图简介图1显示了CTLA4Ig分子表达盒一部分的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。也显示了由该核酸编码的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。可由该表达盒生产的CTLA4Ig分子包括具有以下残基的氨基酸序列(i)SEQIDNO:2的26-383，(ii)SEQIDNO:2的26-382，(iii)SEQIDNO2的27-383或(iv)SEQIDNO2的26-382，或任选(v)SEQIDNO2的25-382或(vi)SEQIDNO:2的25-383。该表达盒包含以下区(a)抑瘤素M信号序列(SEQIDNO:1的核苷酸11-88；SEQIDNO2的氨基酸1-26)；(b)人CTLA4的胞外结构域(SEQIDNO1的核苷酸89-463；SEQIDNO2的氨基酸27-151)；(c)人IgGl恒定区的被修饰部分(SEQIDNO1的核苷酸464-1159；SEQIDNO2的氨基酸152-383)，包括被修饰的绞链区(SEQIDNO1的核苷酸464-508；SEQIDNO2的氨基酸152-166)，被修饰的人IgGlCH2结构域(SEQIDNO1的核苷酸509-838；SEQIDNO2的氨基酸167-276)和人IgGlCH3结构域(SEQIDNO1的核苷酸839-1159；SEQIDNO2的氨基酸277-383)。图2描述了CTLA4-L104EA29Y-Ig(也称作“L104EA2OTIg”和“LEA29Y”)的核苷酸(SEQIDNO3)和氨基酸(SEQIDNO4)序列，其含有信号肽；突变的CTLA4胞外结构域，起于+1位的甲硫氨酸止于+124位的天冬氨酸或起于-1位的丙氨酸止于+124位的天冬氨酸；和Ig区。SEQIDNO3和4分别描述了L104EA29YIg的核苷酸和氨基酸序列，其含有有信号肽；突变的CTLA4胞外结构域，起于+27位置的甲硫氨酸止于+150位的天冬氨酸或起于+26位的丙氨酸止于+150位的天冬氨酸；和Ig区。L104EA29YIg可具有以下残基的氨基酸序列(i)SEQIDNO4的26-383，(ii)SEQIDNO4的26-382；(iii)SEQIDNO4的27-383或(iv)SEQIDNO4的27-382，或任选(v)SEQIDNO4的25-382，或(vi)SEQIDNO:4的25-383。发明详述如本文中使用“稳定的”制剂或药品为在保存过程中其中的CTLA4Ig分子可基本保持其物理和化学稳定性和完整性的制剂或药品。可在所选温度下经过所选时间段后测定CTLA4Ig分子制剂的稳定性。例如，冻干和保存后聚集形成的增加可作为冻干的CTLA4Ig分子制剂不稳定性的指标。除了聚集形成之外，在保存期间原有澄清度、颜色和气味的保持都可用作监控CTLA4Ig分子溶液稳定性的指标。HMW种类为多聚体(例如，四聚体，七聚体等)，其分子量大于CTLA4Ig分子二聚体。通常，一种“稳定的”药品为于2-8°C保存一年其中的聚集增加(通过高分子量种类(％HMW)的增加测定)小于约5%并优选3%的药品。所生产的药品优选含有小于约25%的HMW种类，优选小于约15%HMW种类，更优选小于约10%HMW种类，最优选小于约5%HMW种类。可通过分子排阻色谱(SEC)分离CTLA4Ig分子的单体、二聚体和HMW种类。SEC基于分子大小分离分子。当分子沿着柱子长度迁移时通过差别分子排阻或进入实现分离。因此，随着柱子长度的增加分离度增加。可使用串联了TSKGelG3000SWXL(300mmX7.8mm)禾口TSKGelG3000SWXL(40mmx6.0mm)柱(TosohBioscience,Montgomery,PA)的2695A1lianceHPLC(Waters，Milford，MA)分离CTLA4Ig分子样品。可用含有0.2MKH2PO4和0.9%NaCl，pH6.8的流动相在流速为1.0ml/min时分离10mg/ml(20μ1等分试样)的样品。使用Water’s2487双波长检测器于280nm处检测样品吸光值。使用这一系统，HMW种类的保留时间为7.5min士1.Omin。对每一个峰的峰下面积积分。HMW种类峰面积除以总峰面积可计算得到％HMW种类。“重新溶解”制剂为通过将冻干制剂溶解于含水载体制备的制剂，这样CTLA4Ig分子被溶解至重新溶解的制剂中。该重新溶解的制剂适用于对需要的病人进行静脉内给药(IV)。“等渗”制剂为与人血液具有基本相同的渗透压的制剂。等渗制剂的渗透压通常为250至350m0smOl/KgH20。术语“高渗”用于描述渗透压高于人血液渗透压的制剂。例如可使用蒸汽压或冰冻型渗透压剂测量等渗性。术语“缓冲剂”指当加入至含水溶液中可防止加入酸或碱或溶剂稀释时溶液pH变化的一种或多种组分。除了磷酸盐缓冲液，也可使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液及类似缓冲液，其中钠、钾或铵可作为平衡离子。“酸”为可在含水溶液中产生氢离子的物质。“药学可接受酸”包括无机和有机酸，其在制剂中使用的浓度和方式是无毒性的。“碱”为可在含水溶液中产生羟基离子的物质。“药学可接受的碱”包括无机和有机碱，其在制剂中使用的浓度和方式是无毒性的。“冻干保护剂”为当与相关蛋白质结合时可防止或降低该蛋白质在冻干和之后的储存过程中化学和/或物理不稳定性的分子。“防腐剂”为可降低细菌作用的试剂，可选择性加入本文的制剂中。加入防腐剂可，例如，辅助多剂量制剂的生产。可用的防腐剂实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双铵、苯扎氯铵(十八烷基二甲基苄基氯化铵的混合物，其中的烷基为长链化合物)和氯化苄乙铵。其它类型的防腐剂包括芳族醇，例如苯酚、丁基和苯甲基醇，烷基尼泊金类，例如甲基或丙基尼泊金，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇和间甲酚。“表面活性剂”为含有疏水部分(例如烷基链)和亲水部分(例如羧基和羰酸基团)的表面活性分子。可将表面活性剂加入本发明的制剂中。适用于本发明制剂的表面活性剂包括但不限于聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；山梨坦酯及其衍生物；Triton；十二烷基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基、十四烷基、亚油酰_或硬脂酰_磺基甜菜碱；十二烷基、十四烷基、亚油酰或硬脂酰_肌氨酸；亚油酰_、十四烷基或十六烷基_甜菜碱；月桂酰胺丙基_、椰油酰胺丙基_、亚油酰胺丙基_、肉豆蔻酰胺丙基_、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基_、棕榈酰胺丙基_或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基牛磺酸二钠；和M0NAQUAT系列(MonaIndustries,Inc.，Paterson,N.J.)；聚乙二醇，聚丙醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics,PF68等)。“药物”指用于药物终产品制剂的起始材料。通常CTLA4Ig药物组合物含有浓度为20mg/ml至60mg/ml，pH7至8的蛋白质并且％HMW<5%。“已配制成的总体溶液”指注入容器之前的最终制剂，例如注入管形瓶用于冻干前的已配制成的溶液或注入用于SC注射的注射器之前的已配制成的溶液。“药品”指包装于容器中的最终制剂，其可在使用前被重新溶解，例如冻干药品；使用前被稀释，例如液体药品；或被用作SC溶液药品。术语“CTLA4-Ig”或“CTLA4-Ig分子”或“CTLA4Ig分子”可交换使用，指至少包含具有CTLA4胞外结构域或其部分片段和免疫球蛋白恒定区或其部分片段的多肽的蛋白质分子。该胞外结构域和免疫蛋白恒定区可为野生型，或突变型或修饰型，和哺乳动物型，包括人和小鼠。该多肽可进一步包括附加蛋白结构域。CTLA4-Ig分子也可指该多肽的多聚体形式，例如二聚体、四聚体和七聚体。CTLA4-Ig分子也可与⑶80和/或⑶86结合。术语“B7-1”指CD80；术语“B7-2”指CD86；术语“B7”指B7-1和B7-2(CD80和CD86)两者。术语“B7-1-Ig”“或“B7-lIg”指CDSO-Ig；术语“B7-2_Ig”或“B7_2Ig”指CD86-Ig。在一个实施方案中，“CTLA4Ig”指具有以下残基的氨基酸序列的蛋白质分子(i)SEQIDNO:2的26-383，(ii)SEQIDNO:2的26-382；(iii)SEQIDNO:2的27-383，或(iv)SEQIDNO:2的27-382，或任选(v)SEQIDNO:2的25-382，或(vi)SEQIDNO:2的25-383。在单体形式中，这些蛋白质可在本文中指“SEQIDNO:2单体，”或“具有SEQIDNO:2序列的”单体。这些SEQIDNO:2单体可二聚体化，这些二聚体组合可包括，例如(i)和(i)；(i)和(ii)；⑴和(iii)；⑴和(iv)；(i)和(ν)；(i)和(vi)；(ii)和(ii)；(ii)和(iii)；()和(iv)；(ii)和(ν)；(ii)和(vi)；(iii)和(iii)；(iii)和(iv)；(iii)和(ν)；(iii)和(vi)；(iv)和(iv)；(iv)和(ν)；(iv)和(vi)；(ν)和(ν)；(ν)和(vi)；和，(vi)和(vi)。这些不同的二聚体组合也可以相互组合形成四聚体CTLA4Ig分子。这些单体、二聚体、四聚体和其它多聚体可在本文中指“SEQIDNO:2蛋白质”或“具有SEQIDNO:2序列”的蛋白质。(编码如SEQIDNO2中所示CTLA4Ig的DNA按照布达佩斯条约的规定于1991年5月31日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas，VA20110-2209，ATCC登录号ATCC68629；表达如SEQIDNO:2所示CTLA4Ig的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系于1991年5月31日保藏，ATCC标识号为CRL-10762)。如本文所使用，"Abatac印t”指SEQIDN0:2蛋白。在一个实施方案中，CTLA4-L104EA29Y_Ig(有时称作“LEA29Y”或“L104EA29Y”)为基因工程融合蛋白，与SEQIDNO1所示的CTAL4_Ig分子具有相似的结构。L104EA29Y-Ig具有被修饰的人CTLA4功能性胞外结合结构域和IgGl类人免疫球蛋白的Fc结构域。对CTLA4结构域B7结合区域的两个氨基酸进行修饰以产生L104EA29Y，将104位(L104E)的亮氨酸突变为谷氨酸(在SEQIDNO2的130位)并将29位(A29Y)的丙氨酸突变为酪氨酸(在SEQIDNO2的55位)。SEQIDNOS3和4分别描述了含有信号肽的L104EA29YIg的核苷酸和氨基酸序列；突变的CTLA4胞外结构域，起于+27位的甲硫氨酸，止于+150位的天冬氨酸，或起于+26位的丙氨酸，止于+150位的天冬氨酸；和Ig区。编码L104EA29Y-Ig的DNA按照布达佩斯条约的规定于2000年6月20日保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC登录号为PTA-2104。美国专利7094874(颁发于2006年8月22日)和WO01/923337A2中进一步描述了L104EA29Y_Ig，均以其整体并于本文以作参考。在哺乳细胞中表达L104EA29YIg可产生N-和C-端突变体，因此所产生的蛋白质可具有以下残基的氨基酸序列(i)SEQIDNO4的26-383，(ii)SEQIDNO4的26-382；(iii)SEQIDNO:4的27-383或(iv)SEQIDNO:4的27-382，或任选(ν)SEQIDNO:4的25-382，或(vi)SEQIDNO:4的25-383。如果为单体形式，这些蛋白质在本文中可指“SEQIDNO:4单体”或“具有SEQIDNO:4序列”的单体。这些蛋白质可二聚体化，这些二聚体组合可包括，例如⑴和⑴；⑴和()；⑴和(iii)；⑴和(iv)；⑴和(ν)；⑴和(vi)；()和()；()和(iii)；()和(iv)；(ii)和(ν)；(ii)和(vi)；(iii)和(iii)；(iii)和(iv)；(iii)和(ν)；(iii)和(vi)；(iv)和(iv)；(iv)和(ν)；(iv)和(vi)；(ν)和(ν)；(ν)和(vi)；和，(vi)和(Vi)0这些不同的二聚体组合也可以相互组合形成四聚体L104EA29YIg分子。这些单体、二聚体、四聚体和其它多聚体在本文中可指“SEQIDN0:4蛋白质”或“具有SEQIDNO:4序列”的蛋白质。如本文所使用，“Belatac印t”指SEQIDNO4蛋白。CTLA4-lg单体和多聚体CTLA4-Ig分子包括，例如CTLA4_Ig蛋白单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或其它多聚体形式。CTLA4-Ig分子可包含至少具有一个CTLA4胞外结构域和一个免疫球蛋白恒定区的蛋白质融合。CTLA4-Ig分子可具有野生型或突变型序列，例如CTLA4的胞外域和免疫球蛋白恒定区序列。单独CTLA4-Ig单体或二聚体、四聚体或其它多聚体形式均可被糖基化。在一些实施方案中，本发明提供至少具有一定百分比的二聚体或其它多聚体分子的CTLA4-Ig分子群。例如，本发明提供CTLA4-Ig二聚体大于90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的CTLA4-Ig分子群。在一个实施方案中，本发明提供含有约95%至约99.5%CTLA4-Ig二聚体和约0.5%to至约5%CTLA4_Ig四聚体的CTLA4_Ig分子群。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子群含有约98%的CTLA4-Ig二聚体、约1.5%的CTLA4_Ig四聚体和约0.5%的CTLA4-Ig单体。在一个实施方案中，本发明提供了基本不含CTLA4_Ig单体分子的CTLA4_Ig分子群。基本不含CTLA4-Ig单体分子可指具有少于1%、0.5%或0.1%单体的CTLA4_Ig分子群。W052]在一个实施方案中，本发明提供了基本不含大于二聚体，例如四聚体、六聚体等的CTLA4-Ig多聚体的CTLA4-Ig分子群。基本不含大于二聚体的CTLA4_Ig多聚体可指含有少于6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%大于二聚体的CTLA4_Ig多聚体的CTLA4_Ig分子群。在一个实施方案中，CTLA4_Ig单体分子可具有，例如，以下氨基酸序列(i)SEQIDNO2的26-383，(ii)SEQIDNO2的26-382(iii)SEQIDNO2的27-383，或(iv)SEQIDNO2的27-382或任选(v)SEQIDNO2的25-382或(vi)SEQIDNO2的25-383。当在CHO细胞中表达含有SEQIDNO:1氨基酸序列的表达盒时，所表达的大多数单体形式具有甲硫氨酸(SEQIDNO:2的残基27)N-端氨基酸残基，其与野生型人CTLA4的N-端氨基酸残基一致。但是，由于SEQIDNO1也包括抑瘤素M信号序列(SEQIDNO1的11-88核苷酸)的编码序列，所以从SEQIDNO:1表达的蛋白质包括抑瘤素M信号序列。在蛋白质运出细胞质或分泌出细胞的过程中，该信号序列从所表达的蛋白质上剪切下来。但是该剪切过程可产生N-端突变体，例如氨基酸残基25至26之间的剪切(得到残基26的N-端，如“丙氨酸变异体”)，或氨基酸残基24至25之间(得到残基2的N-端，如“天冬氨酸-丙氨酸变异体”)，与氨基酸残基26至27之间的剪切相反(得到残基27的N-端)。例如，天冬氨酸_丙氨酸变异体可以约1%存在于CTLA4-Ig分子混合物中，丙氨酸变异体可以8-10%存在于CTLA4-Ig分子混合物中。此外，由于不完全加工，从SEQIDNO:1表达的蛋白质可具有C-端变异体。大多数C-端为SEQIDNO:2残基382的甘氨酸。在CTLA4_Ig分子混合物中可存在例如约4-5%具有C-端赖氨酸(SEQIDNO:2的残基383)的单体。CTLA4-Ig单体分子可含有人CTLA4的胞外结构域。在一个实施方案中，该胞外结构域可包含编码SEQIDNO:2的氨基酸27-151的SEQIDNO1的核苷酸89-463的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该胞外结构域可包含人CTLA4的突变序列。在另一个实施方案中，该胞外结构域可包含SEQIDNO:1核苷酸89-463的核苷酸变化，这样就改变了保守氨基酸。在另一个实施方案中，该胞外结构域可包含至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%与5￡0IDNO:1核苷酸89-463相同的核苷酸序列。CTLA4_Ig单体分子可含有人免疫球蛋白的恒定区。该恒定区可为一个恒定区的一部分；该恒定区可具有野生型或突变型序列。该恒定区可源自人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、化1、1841、1842、180或化￡。该恒定区可源自免疫球蛋白的轻链或重链。当该恒定区源自IgG、IgD或IgA分子时，该恒定区含有一个或更多个以下恒定区结构域CL、CHI、铰链区、CH2或CH3。当该恒定区源自IgM或IgE时，该恒定区含有一个或更多个以下恒定区结构域(^、011、012、013或014。在一个实施方案中，该恒定区可包含一个或更多个源自IgG、IgD、IgA、IgM或IgE的结构域。在一个实施方案中，CTLA4_Ig单体分子含有被修饰的人IgGl铰链区(SEQIDNO1的核苷酸464-508；SEQIDNO2的氨基酸152-166)，其中SEQIDNO2的氨基酸残基156、162和165的丝氨酸来自于野生型序列中的半胱氨酸。在一个实施方案中，CTLA4_Ig单体分子含有被修饰的人IgGlCH2区和野生型CH3区(具有SEQIDNO:1核苷酸509-838和SEQIDNO:2氨基酸167-276的被修饰人IgGlCH2结构域；含有SEQIDNO:1核苷酸839-1159和SEQIDNO:2氨基酸277-383的人IgGlCH3结构域)。在一个实施方案中，CTLA4_Ig分子群含有具有以下序列的单体，如2006年8月22日颁发的美国专利7，094，874的图7、8或9中任一个或多个中以及公布号为US20030083246和US20040022787的美国专利申请中所显示的序列，其均以其整体并于本文作为参考。在一个实施方案中，CTLA4_Ig四聚体分子含有两对CTLA4_Ig多肽或两个CTLA4-Ig多肽二聚体，其中各多肽具有以下氨基酸序列之一(i)SEQIDNO2的26-383，(ii)SEQIDNO:2的26-382，(iii)SEQIDNO:2的27-383，或(iv)SEQIDNO:2的27-382，或任选(v)SEQIDNO2的25-382或(vi)SEQIDNO2的25-383。多肽对或二聚体的每一成员与另一成员共价连接，并且两对多肽之间非共价连接并由此形成四聚体。该四聚体分子可与⑶80或⑶86结合。在另一个实施方案中，该四聚体分子可与⑶80或⑶86结合，其亲和力至少比CTLA4-Ig二聚体(其单体具有上述氨基酸序列之一)与⑶80或⑶86的亲和力大2倍。在另一个实施方案中，该四聚体可与⑶80或⑶86结合，其亲和力至少比野生型CTLA4与⑶80或CD86的亲和力大2倍。这一更大的亲和力有助于在治疗免疫紊乱和其它下述疾病中的达到更高的药效。此外，更高或经提高的亲和力可产生更高的药效强度。例如，含有CTLA4-Ig四聚体的医药组合物将具有更高的亲和力并因此比相同量的含有CTLA4-Ig单聚体的医药组合物具有更高的药效强度。在另一个实施方案中，该四聚体分子对T细胞增殖的抑制比CTLA4-Ig二聚体相(其单聚体具有以上氨基酸序列之一)大2倍。在另一个实施方案中，该四聚体分子对T细胞增殖的抑制比野生型CTLA4分子至少大2倍。可使用本
技术领域：
的标准测定法检测T细胞增殖，例如，最常用的检测T细胞增殖的方法之一为通过抗原或TCR的激动性抗体激活T细胞并检测，例如氚(titrated)-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入增殖T细胞的情况，或增殖T细胞释放至培养基中的细胞因子的量。可由此测定CTLA4-Ig分子对T细胞激活或增殖的抑制作用。CTLA4-Ig分子的亲和性为该分子与单链，包括CD80、CD86或CD80Ig或CD86Ig融合蛋白的结合力。可使用例如基于表面等离振子技术的结合相互作用分析(BIA)测定CTLA4-Ig与配体的亲和性。除了检测结合力，它还使结合动力学例如结合和解离速率常数等得以实时测定。将一种由金属薄膜包被的玻片(与表面基质共价结合)组成的传感器芯片用相互作用物之一即CTLA4-Ig或配体之一包被。使含有其它相互作用物的溶液流过该表面。将一连续光束照射表面的另一侧，测量其反射角。当CTLA4-Ig与配体结合时，光束的共振角发生变化(因为其取决于传感器反应侧邻近介质的屈光指数，其与介质中溶解物质的浓度直接相关)。接着由计算机辅助分析。在一个实施方案中，可在BIAcore仪器(BIAcoreAG，Uppsala，Sweden)上通过表面等离子共振(SPR)进行CTLA4-Ig结合试验。CTLA4-Ig可通过伯胺基团共价偶联至BIAcore传感器芯片上的羧甲基葡聚糖基质上，从而将CTLA4-Ig固定至芯片上。或者，可用抗恒定区抗体将CTLA4-Ig通过Ig片段间接固定至传感器表面。然后，将配体加入芯片以检测CTLA4-Ig与配体的结合。可根据vanderMerwe,P.等，J.Exp.Med.(1997)185(3)393-404描述的方法进行亲和力测定。可测定CTLA4_Ig分子的亲和力。亲和力可定义为两个分子或细胞之间在多位点上的总结合力。亲和力(avidity)与亲和性(affinity)不同，后者为一个分子上的某一位点与其配体的结合强度。不受理论的约束，更高的CTLA4-Ig分子亲合力可增强CTLA4-Ig分子对T-细胞增殖和激活的药效强度。可通过两类固相分析测定亲合力，例如a)竞争抑制检测和b)洗脱检测。在两种情况下，配体均与固相载体结合。在竞争性抑制检测中，将固定浓度的CTLA4-Ig分子与不同浓度的配体加入溶液中，测定可抑制50%固相结合的配体数量。所需配体越少，亲合力越强。在洗脱检测中，将配体加入溶液中。在达到平衡态之后，加入不同浓度的离液剂或变性剂(如异硫氰酸盐、尿素或二乙胺)干扰CTLA4-Ig/配体相互作用。然后用ELISA测定CTLA4-Ig抗性洗脱液的量。亲合力越高，用于洗脱某一数量CTLA4-Ig所需的离液剂越多。CTLA4-Ig分子异质混合物的相对亲合力可以表示为亲和力指数(AI)，等于洗脱50%结合CTLA4-Ig分子所需的洗脱剂浓度。可通过测定不同浓度的洗脱剂洗脱的CTLA4-Ig百分比进行精细分析。生产本发明CTLA4-lg分子的方法可在原核细胞中表达CTLA4_Ig分子。各种细菌株可通常代表大多数的原核细胞。细菌可为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性。通常优选革兰氏阴性菌例如大肠杆菌(E.coli)。也可使用其它微生物株。将如上所述的编码CTLA4_Ig分子的序列插入用于表达外原序列的原核细胞载体中，例如大肠杆菌。这些载体可包括通常使用的原核控制序列，其在本文定义为包括用于起始转录的启动子，任选含有操纵子，以及核糖体结合位点序列，包括这些常用的启动子例如内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang，等，(1977)Nature198:1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，等，(1980)NucleicAcidsRes.84057)以及入衍生Pl启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake，等，(1981)Nature292:128)。这样的表达载体也包括复制起点和可筛选标记，例如使其具有抗生素抗性的内酰胺酶和新霉素磷酸转移酶基因，这样载体可在细菌内复制并且可在抗生素(例如氨苄西林或卡那霉素)存在下生长从而筛选携带质粒的细胞。可通过各种标准方法将表达质粒导入原核细胞，包括但不限于CaCl2休克(Cohen，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA692110和Sambrook等.(eds.)，“分子克隆实验室手册”("MolecularCloning:ALaboratoryManual”)，第二版，冷泉港出版社(1989))和电穿孔。与本发明的实践一致，真核细胞也可为适当的宿主细胞。真核细胞的实例包括任何动物细胞，原始的或固定化的，酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和毕赤酵母(Pichiapastoris))和植物细胞。骨髓瘤、COS和CH0细胞为可作为宿主的动物细胞实例。尤其是CH0细胞包括但不限于DG44(Chasin，等，1986Som.Cell.Molec.Genet.12:555_556;Kolkekar1997Biochemistry36:10901-10909)、CH0-K1(ATCCNo.CCL-61)、CH0-K1Tet-On细胞系(Clontech)、标为ECACC85050302的CH0(CAMR,Salisbury,Wiltshire,UK)，CH0克隆13(GEIMG，Genova,IT)、CH0克隆B(GEIMG，Genova,IT)、标为ECACC93061607的CH0-K1/SF(CAMR,Salisbury,Wiltshire,UK)和标为ECACC92052129的RR-CH0K1(CAMR，Salisbury,Wiltshire,UK)。示例性植物细胞包括烟草(全植物、细胞培养物或愈伤组织)、玉米、大豆和水稻细胞。玉米、大豆和水稻细胞也可接受。也可将上述编码CTLA4Ig分子的核酸序列插入用于表达外源序列的真核宿主中。该载体的调控元件依具体的真核宿主而不同。用于表达载体的常用真核控制序列包括与哺乳动物细胞相容的启动子和控制序列，例如CMV启动子(CDM8载体)和鸟类肉瘤病毒(ASV)(jiLN载体)。其它常用启动子包括猿猴病毒40(SV40)(Fiers，等，(1973)Nature273:113)的早期和晚期启动子，或其它病毒启动子，例如衍生自多瘤、腺病毒2和牛乳头状瘤病毒的启动子。也可使用诱导型启动子，例如hMTII(Karin，等，(1982)Nature299:797_802)。在真核细胞中表达CTLA4Ig分子的载体也可携带被称作增强子区的序列。这些对于优化基因表达是非常重要的并且存在于启动子区的上游或下游。用于真核宿主细胞的表达载体实例包括但不限于哺乳动物宿主细胞载体(例如，BPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2(Maniatis)；pIRES(Clontech)；pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFVl(LifeTechnologies)；pVPakc载体、pCMV载体、pSG5载体(Stratagene))、逆转录病毒载体(例如，pFB载体(Stratagene))，pCDNA-3(Invitrogen)或其修饰形式、腺病毒载体；腺伴随病毒载体、杆状病毒载体、酵母载体(例如，PESC载体(Stratagene))。可将编码CTLA4Ig分子的核酸序列整合至真核宿主细胞的基因组中并按照宿主基因组复制的方式复制。或者，携带CTLA4Ig分子的载体可含有允许染色体外复制的复制起点。对于在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达核酸序列，可使用来自酵母质粒的复制起点2y环(Broach,(1983)Meth.Enz.101:307)。或者，可使用来自酵母基因组可启动自主复制的序列(见例如，Stinchcomb等，(1979)Nature28239；Tschemper等，(1980)Gene10157；和Clarke等，(1983)Meth.Enz.101300)。酵母载体的转录控制序列包括用于合成糖酵解酶(Hess等.，(1968)J.Adv.EnzymeReg.7149；Holland等，(1978)Biochemistryl74900)的启动子。本
技术领域：
已知的其它启动子包括CDM8载体(Toyama核Okayama，(1990)FEBS268217~221)中提供的CMV启动子、3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子(Hitzeman等.，(1980)J.Biol.Chem.2552073)和其它糖酵解酶的启动子。其它启动子为诱导型，因为它们受环境刺激和细胞生长培养基的调节。这些诱导型启动子包括热休克蛋白、醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酯酶、与氮分解代谢相关的酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的基因。调控序列可位于编码序列的3’端。这些序列可稳定信使RNA。这些终止子存在于一些由酵母衍生和哺乳动物基因的编码序列之后的3’非翻译区。示例性植物载体和植物细胞包括但不限于农杆菌质粒、花椰菜花叶病毒(CaMV)和番茄金花叶病毒(TGMV)。哺乳细胞的转化方法包括但不限于磷酸钙存在下的转染、显微注射、电穿孔或通过病毒载体转导。将外源DNA导入植物或酵母基因组的方法包括(1)机械方法，例如将DNA显微注射入单核细胞或原生质体，在DNA存在下与玻璃珠一起涡旋细胞或将DNA包被的钨或金微粒射入细胞或原生质体；(2)用聚乙二醇处理或高电压电脉冲(电穿孔)使细胞膜可透过大分子；或(3)使用可与细胞膜融合的脂质体(含有cDNA)。美国专利申请美国公开号20050019859和美国专利申请美国公开号20050084933教导了用动物或哺乳动物细胞培养生产本发明蛋白质，特别是重组糖蛋白产品的方法，这些文献通过引用并入本文。在细胞培养过程的蛋白质生产阶段之后，使用本领域技术人员已知的技术从细胞培养基中回收CTLA4Ig分子。尤其是将CTLA4Ig分子作为分泌型多肽从培养基中回收。首先将培养基离心去除细胞碎片和颗粒。然后从污染性DNA、可溶性蛋白和多肽中纯化所需要的蛋白质，使用以下本
技术领域：
已建立的非限制性纯化操作SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；乙醇沉淀；免疫亲和或离子交换色谱分级分离；反相HPLC；二氧化硅色谱或阴离子交换树脂例如QAE或DEAE色谱；色谱聚焦；使用例如S印hadexG-75柱凝胶过滤；和使用蛋白AS印harose柱去除污染物例如IgG。加入蛋白酶抑制剂，例如苯甲基磺酰氟化物13(PMSF)或者也可使用蛋白酶抑制剂混合物抑制纯化过程中的蛋白水解降解。本领域技术人员将认识到适用于感兴趣蛋白质(例如糖蛋白)的纯化方法需要一些改变以应对在重组细胞培养中表达时蛋白质性质的改变。为糖蛋白的糖基团选用的纯化技术和方法也属于本发明范畴。例如，该技术包括HPLC或使用阳离子-或阴离子-树脂的离子交换色谱法，其中收集碱性或酸性更强的流分，这取决于所选择的糖。使用这些技术也可同时去除污染物。纯化方法可进一步包括将可能存在于哺乳细胞系细胞培养基中的病毒和/或逆转录病毒失活和/或去除的附加步骤。可利用许多清除病毒的步骤，包括但不限于用离液剂处理，离液剂例如尿素或胍、去污剂；附加的超滤/透析步骤；常规分离，例如离子交换或分子排阻色谱；极端PH；加热；蛋白酶；有机溶剂或其任何组合。在保存或进一步处理之前，已纯化的CTLA4Ig分子需要浓缩和交换缓冲液。可使用PallFiltronTFF系统浓缩并将来自之前纯化柱的洗脱液交换成适用于药物的终缓冲液。在一方面，可将已纯化的CTLA4lg分子(已浓缩并经过透析)装入2_LBiotainer瓶、50-L生物加工袋或任何其它适当的容器中。这些容器中的CTLA4Ig分子可于2°C至8°C在冰冻之前保存60天。CTLA4Ig分子于2°C至8°C更长时间的保存可能导致HMW的增加。因此，对于长期保存，可在保存前将CTLA4Ig分子于-70°C冷冻并于约-40°C保存。冷冻温度的可变范围为约-50°C至约-90°C。冷冻时间可以变化，主要取决于含有CTLA4Ig分子的容器的容积和冷冻箱中装载容器的数量。例如，在一个实施方案中，CTLA4Ig分子保存在2-LBiotainer瓶中。在冷冻箱中装载少于4个2-LBiotainer瓶时需要约14-18小时的冷冻时间。装载至少4个2-LBiotainer瓶时需要约18-24小时的冷冻时间。将装有冰冻CTLA4Ig分子的容器保存于_35°C至约_55°C。在_35°C至约_55°C的保存时间可以变化并且可短至18小时。可有控制地将冷冻药物溶解用于配制药品。在2005年12月20日申请的同时待审美国专利申请序列号60/752267和2006年10月5日申请的06/849543和2006年12月19日申请的标题为“细胞系、组合物和生产该组合物的方法”，发明人为KirkLeister的PCT专利申请10734PCT描述了通过动物或哺乳细胞培养生产本发明蛋白质特别是重组糖蛋白产品的方法。本发明的低压冻干制剂本发明的低压冻干制剂包含CTLA4Ig分子，其中蛋白质与冻干保护剂的重量比至少为12。冻干保护剂优选糖，更优选双糖，最优选蔗糖或麦芽糖。低压冻干制剂也可包含一种或多种选自缓冲剂、表面活性剂、填充剂和防腐剂的组分。在药物制剂开发研究中评价各种赋形剂对CTLA4Ig分子的溶液-稳定性和冻干、固相-稳定性的影响。不存在稳定剂时冻干CTLA4Ig分子的不稳定性明显说明了需要在制剂中包含冻干保护剂。起始筛选研究表明药品在糖(例如麦芽糖和蔗糖)和氨基酸(例如精氨酸和赖氨酸)存在下是稳定的。多元醇(例如甘露醇)和多糖(例如右旋糖酐40)不利于其稳定性。优选的冻干保护剂为二糖麦芽糖和乳糖。实施例VI描述了冻干Abatac印t药品在麦芽糖存在下保存于50°C的稳定性研究。14使用稳定性-指示分子排阻色谱(SE-HPLC)测定法监控所有高分子量(HMW)种类的增加。结果表明麦芽糖存在下CTLA4Ig分子冻干固相形式的稳定性增强。用于稳定化低压冻干药品的蔗糖或麦芽糖的量为蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比至少为12，优选蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比为12至15，更优选蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比约为12。如果必要的话，在低压冻干之前加入药学可接受的酸和/或碱设定制剂的pH。优选的药学可接受的酸为盐酸。优选的碱为氢氧化钠。在制剂开发中，作为pH的函数而研究冻干药品的稳定性。实施例VI描述了作为pH函数的冻干Abatac印t药品的稳定性研究。在冻干之前将溶液pH调至6至8。将样品放置于稳态并使用稳定性-指示分子排阻色谱(SE-HPLC)测定法检测各时间点高分子量种类的增加。在建议保存条件2°_8°C下，没有观察到HMW种类形成速度的显著变化。此外；在早期研发过程中得到的溶液状态稳定性数据显示最大稳定性的PH为7至8。低压冻干药品可接受的PH范围为7-8，优选的目标pH为7.5。在另一方面，可加入至少10mM的盐或缓冲液组分，优选10_200mM。这些盐和/或缓冲液为药学可接受的并衍生自已知的酸(无机的和有机的)和“可形成碱”的金属或胺。除了磷酸缓冲液，也可使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液及类似缓冲液，其中钠、钾或铵离子可作为平衡离子。“填充剂”为可增加低压冻干混合物质量并有利于低压冻干结块的物理结构(例如有助于产生可保持开孔结构的基本均一的低压冻干结块)的化合物。示例性填充剂包括甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨醇。本发明的低压冻干制剂可包含这些填充剂。本发明制剂可任选加入防腐剂以降低细菌作用。加入防腐剂，例如，可有助于生产多次使用(多剂量)制剂。本领域技术人员可选择装入管形瓶中的药品量，取决于所需要的剂量和具体治疗的给药方案。例如，每支管形瓶中CTLA4Ig的浓度可在50-300mg/管形瓶的范围内变化，优选100-250mg/管形瓶。典型低压冻干Abatac印t药品的组成如表1所示。表1低压冻干Abatac印t药品(250mg/管形瓶)的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a包括5%过量填充用于补偿管形瓶、针头、注射器损失13这些组分存在于abatac印t药物溶液中典型低压冻干Belatac印t药品的组成如表2所示。表2低压冻干Belatac印t药品(lOOmg/管形瓶)的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3每支管形瓶包含10%过量填充用于补偿重新溶解的溶液在管形瓶、针头、注射器中的残留用含水载体溶解低压冻干药品。本文感兴趣的含水载体为药学可接受的(对于人体给药安全无毒)并在低压冻干之后可用于制备液体制剂的载体。示例性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH经缓冲的溶液(磷酸盐缓冲生理盐水)、无菌生理盐水溶液、林格氏液或葡萄糖溶液。本发明的低压冻干药品优选用无菌注射用水、USP(SWFI)或0.9%氯化钠注射，USP溶解。在溶解过程中，低压冻干粉末快速溶解形成澄清、无色溶液。通常，用10ml无菌注射用水USP(SWFI)或0.9%氯化钠注射液将本发明的低压冻干药品溶解至约25mg/ml。将溶解得到的溶液进一步用0.9%氯化钠注射液USP稀释至l-10mg/ml。被稀释的注射药品是等渗的并适用于静脉输注给药。在早期的临床研发中发现配制的低压冻干药品溶液与常用于制备和肠道外产品给药的一次性硅化处理注射器不相容。具体而言，当配制的药品溶液在这些注射器中保存超过10-15分钟后会形成丝状凝胶颗粒。进一步研究表明这一不相容性是由于药品与硅油(二甲基硅醚)之间发生反应。这些颗粒的形成并不影响药品溶液在使用中的药效。优选使用无硅氧烷注射器配制药品并将从管形瓶中配制的溶液转移至静脉袋中。或者，也可在制剂中加入表面活性剂以降低或防止配制的药品与硅化处理的注射器发生反应，例如加入足够量的表面活性剂。低压冻干制剂的建议保存条件为2_8°C，建议保存期限为至少12个月。低压冻干制剂的制备低压冻干药品生产过程包含将已配制的总体溶液分批低压冻干、无菌过滤、装入管形瓶、在冷冻干燥室冷冻，然后低压冻干、加塞和加盖。实施例III和IV分别描述了生产低压冻干Abatac印t和Belatac印t药品。通常将已配制的总体溶液设定为固定的蛋白质浓度，这样装入管形瓶的体积可保持恒定。在加入冻干保护剂时，将混合仪速度控制在250士50rpm以尽量减少批溶液中的泡沫并确保冻干保护剂在10-20分钟内完全溶解。已配制的总体溶液在低压冻干前可于2。_8°C或室温日光下保存至少32小时。由于CTLA4Ig分子的热敏感性，已配制的总体溶液不进行终灭菌。可使用一系列的0.22-umMilliporeMillipak除菌级滤膜在注入管形瓶低压冻干之前将已配制的总体溶液灭菌。对选供本产品使用的冷冻干燥周期加以优化，以在干燥的第一和第二相中分别达到有效升华和蒸发而不降低产品质量。为了辅助低压冻干粉末的快速溶解并防止配制药品中形成过量泡沫，在低压冻干周期的末期在500士100微米室压下将低压冻干管形瓶加塞。本领域技术人员将意识到需要将容器过量填充以补偿制备和注射中管形瓶、针和注射器的残留。例如，每支Abatac印t药品管形瓶为250mg/ml含有5%过量填充药品以补偿重新配制和抽取时的损失。液体皮下制剂本领域技术人员将认识到对于需要频繁、长期治疗的患者而言IV制剂的不方便。患者需要经常到医院去进行静脉输注以获得药物，输注的时间可能长至1小时。因此，皮下制剂可实现家庭自给药，对于上述患者是很有益的。对于皮下给药，需要高蛋白浓度的剂量。用大于lmg/kg(>lOOmg/剂量)的高剂量治疗需要研发浓度超过100mg/ml的制剂，这是由于小体积(<1.5ml)才可通过SC途径给药。为了防止形成高分子量种类优化高浓度的长期稳定性，进行制剂开发研究以评价各种赋形剂对本发明的液体SC制剂溶液状态稳定性的作用。本发明的SC制剂包含蛋白浓度至少为100mg/ml的CTLA4Ig分子与稳定化水平的糖，优选含水载体中蛋白质浓度至少为125mg/ml与稳定化水平的糖。优选蛋白质与糖的重量比至少为11.1。稳定剂的用量优选不大于可能引起SC注射器给药中不利或不适粘度的量。糖优选双糖，最优选蔗糖。SC制剂也可包含一种或多种选自缓冲剂、表面活性剂和防腐剂的组分。在各种包括糖、多糖、氨基酸、表面活性剂、聚合物、环糊精、蛋白质等的稳定剂存在下评价SC制剂的稳定性曲线。在所有被评价的赋形剂中，糖例如蔗糖、甘露醇和海藻糖具有更好的防止高分子量种类形成的稳定化作用。实施例V和VIII分别描述了蔗糖存在下于不同温度保存不同时间的SCBelatacept和Abatac印t药品的稳定性研究。使用稳定性_指示分子排阻色谱(SE-HPLC)测定法监测高分子量种类的增加。结果显示蔗糖的存在可以增加SC制剂中CTLA4Ig分子的稳定性。更高的蔗糖蛋白质重量比可得到更好的稳定化效果。基于这些研究，选择以可提供最佳稳定性而不会引起SC溶液过高渗透性的比例的蔗糖作为稳定剂。可用于SC药品稳定化的蔗糖量为蛋白质与蔗糖重量比至少为11，优选蛋白质与蔗糖重量比为11.3-11.5，更优选蛋白质与蔗糖重量比约为11.4。如果必要的话，加入药学可接受的酸和/或碱设定制剂的pH。优选的药学可接受酸为盐酸。优选的碱为氢氧化钠。在制剂开发研究中，作为pH的函数研究SC药品的稳定性。实施例V描述了作为pH的函数研究SCBelatacept药品的稳定性。将SC制剂pH调至7-8.2。将样品放置于稳态并使用稳定性-指示分子排阻色谱(SE-HPLC)测定法检测各时间点高分子量种类的增加。在建议保存条件2°_8°C下，没有观察到HMW种类形成速度的显著变化。除聚集外，脱酰胺作用为发酵、收获/细胞净化、纯化、药物/药品保存和样品分析中可能发生的肽和蛋白质的常见产品变体。脱酰胺作用为从形成可水解的琥珀酰亚胺中间体的蛋白质失去NH3。该琥珀酰亚胺中间体可导致母体肽的质量减少17u。之后的水解可导致质量减少18u。由于在含水条件下不稳定，难以纯化琥珀酰亚胺中间体。这样，由于质量增加了lu脱酰胺作用通常是可检测的。天冬酰胺脱酰胺作用可得到天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺作用速率的参数包括PH、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。肽链中与Asn相邻的氨基酸残基可影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn之后存在Gly和Ser可使对脱酰胺作用更加敏感。前期的实验室规模稳定性研究表明脱酰胺作用可超过使用pH7.8的SCabatacept制剂在24个月的肽作图检测方法中的参比水平。2_8°C和25°C，60%湿度下的六个月数据表明PH7.2时的脱酰胺速率较低，pH7.8时的脱酰胺速率较高。实施例IX和XII描述了用于评价SC制剂在pH范围6.3-7.2的脱酰胺作用。SC药物制剂可接受的pH范围为6-8，优选6-7.8，更优选6_7.2。在另一方面，可加入至少10mM的盐或缓冲液组分，优选10_200mM。这些盐和/或缓冲液为药学可接受的并衍生自已知的酸(无机的和有机的)和“可形成碱”的金属或胺。除了磷酸盐缓冲液，也可使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液及类似缓冲液，其中钠、钾或铵离子可作为平衡离子。实施例VIII描述了缓冲液强度对abataceptSC药品的作用。对于pH7.5、浓度为100mg/mL的abatacept药品，与5mM磷酸盐缓冲液相比，10mM磷酸盐缓冲液中的稳定性更好。而且，10mM磷酸盐缓冲液具有更高的缓冲能力，与5mM缓冲液相比可更好地控制制剂pH。本文感兴趣的含水载体为药学可接受的(对于人体给药安全无毒)并可用于制备液体制剂的载体。示例性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH经缓冲的溶液(磷酸盐缓冲生理盐水)、无菌生理盐水溶液、林格氏液或葡萄糖溶液。本发明制剂可任选加入防腐剂以降低细菌作用。加入防腐剂，例如，可有助于生产多剂量制剂。如在低压冻干药品中所讨论，CTLA4Ig分子与标准注射器中的硅氧烷不相容，其与硅氧烷反应生成可见颗粒，因此限制了患者使用无硅氧烷注射器。SC制剂可任选包含表面活性剂以防止硅氧烷存在下生成可见颗粒。实施例V和VIII分别描述了表面活性剂例如聚山梨酯80和帕洛沙姆188对belatacept和abatacept药品溶液稳定性的作用，研究发现表面活性剂对SC制剂中CTLA4Ig分子的稳定性没有影响。评价不同水平的帕洛沙姆188，结果发现4mg/ml-8mg/ml，优选8mg/ml的浓度可有效防止制剂中硅氧烷相关颗粒的形成。125mg/ml(lOOmg/管形瓶)belataceptSC药品的典型组成如表3所示表3125mg/ml(lOOmg/管形瓶)belataceptSC药品的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>6包括40%过量填充用于补偿管形瓶、针头和注射器的损失。125mg/ml(125mg/管形瓶)AbataceptSC药品的典型组成如表4所示表4125mg/ml(125mg/管形瓶)AbataceptSC药品的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>6包括40%过量填充用于管形瓶、针头和注射器的损失。装入注射器中的125mg/mlAbataceptSC药品的典型组成如表5所示表5125mg/ml(125mg/注射器)AbataceptSC药品的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>SC制剂的建议保存条件为2_8°C，建议保存期限为至少12个月。在环境温度下使用Mettler-Toledo密度计测定abataceptSC和匹配安慰剂的密度。用5-mL样品测量三份。abataceptSC制剂的密度为1.lg/cc，安慰剂产品的密度为1.065g/cc。通常SCCTLA4Ig制剂的密度为约1.Og/cc-约1.2g/cc，优选约1.Og/cc-约1.15g/cc，更优选约1.095g/cc-约1.105g/cc。在环境温度下使用Brookfield电流计测定abataceptSC制剂的粘度。在测量中使用9.3cps的参比标准。SC药品的粘度为125mg/mL，abatacept浓度为13士2cps。通常125mg/mLSCCTLA4Ig制剂的粘度约9-约20cps，优选约9-约15cps，更优选12-约15cps。使用蒸汽压方法测定SCabatac印t药品和安慰剂制剂的摩尔渗透压浓度。数据显示浓度为125mg/mLabataceptSC制剂的摩尔渗透压浓度为770士25m0sm/kgH20。通常125mg/mLSCCTLA4Ig制剂的摩尔渗透压浓度为约250-约800m0sm/kgH20，优选约700-约800m0sm/kgH20,更优选约750-约800m0sm/kgH20。SC制剂的制备SC制剂的生产过程通常包含与糖和表面活性剂复合，然后无菌过滤并装入管形瓶或注射器，任选在此之前使用超滤装置对药物进行透析(缓冲液交换)和浓缩。实施例I和II分别描述了SCBelatacept和Abatacept药品的生产。本领域技术人员将意识到需要将容器过量填充以补偿制备和注射中管形瓶、针头和注射器的残留。例如，每支SC液体制剂管形瓶含有40%过量药品以补偿重新配制和抽取时的损失并确保可从管形瓶抽取0.8ml含有100mgBelatacept的溶液。液体制剂在具体情况下，IV制剂可能是优选的给药途径，例如移植手术后的住院病人通过IV途径接受所有的药物。本领域技术人员将认识到低压冻干制剂分别对生产者和医护人员的不利和风险。对于医护人员的不利和风险与重新配制时的污染、起泡和产品损失以及医护人员配制IV制剂所需要的时间相关。此外，去除生产过程中的低压冻干步骤可降低仪器的生产损耗和员工时间。所有这些原因足以促使我们设计IV用途的液体制剂。优选的液体制剂应类似第一次配制成蛋白浓度约25mg/ml之后的低压冻干药品。可在使用时由医护人员用0.9%氯化钠注射液USP将购买的液体制剂进一步稀释至需要的药品浓度l-10mg/ml。被稀释的注射药品是等渗的并适于静脉输注给药。如上述讨论，液体制剂的长期稳定性是蛋白质药品面临的一个问题。为了确定防止高分子量种类形成的溶液长期稳定性，进行制剂开发研究以评价本发明液体制剂的溶液稳定性。本发明的液体制剂在含水载体中包含蛋白浓度至少为20mg/ml的CTLA4Ig分子与稳定化水平的糖，优选至少25mg/ml与稳定化水平的糖。糖的用量优选为蛋白质与糖的重量比至少为11。糖优选双糖，最优选蔗糖。该液体制剂也可包含一种或多种选自缓冲剂、表面活性剂和防腐剂的组分。用于稳定化液体药品的蔗糖量为蛋白质与蔗糖的重量比至少为11，优选蛋白质与蔗糖的重量比12至110，更优选蛋白质与蔗糖的重量比约12。如果必要的话，加入药学可接受的酸和/或碱设定制剂的pH。优选的药学可接受的酸为盐酸。优选的碱为氢氧化钠。在制剂研发中，在目标pH7.5研究液体药品的稳定性。实施例VII描述了在pH7.5研究液体Belatac印t药品的稳定性。将液体制剂pH调至7.5。将样品放置于稳态并使用稳定性-指示分子排阻色谱(SE-HPLC)测定法检测各时间点高分子量种类的增加。在建议保存条件2°_8°C下，没有观察到HMW种类形成速度的显著变化。除聚集外，脱酰胺作用和片段化为发酵、收获/细胞净化、纯化、药物/药品保存和样品分析中可能发生的肽和蛋白质的常见产品变体。前期的实验室规模稳定性研究表明脱酰胺作用会超过肽作图检测方法(上升超过5%T26a或T26b(%T30)最大值)中的参比水平并且片段化将超出使用保存于2。-8°C的belatac印t(20mg/ml于pH7.5)在24个月的SDS-PAGE检测方法(降低至主带最小值的96%以下)中的参比水平。液体制剂数据(见以上SC数据)表明存在于本发明制剂中的脱酰胺作用速率随着制剂pH的降低而降低。液体药品可接受的pH范围为6-8，优选6-7.8，更优选6_7.2。在另一方面，可加入至少约10mM的盐或缓冲液组分，优选10_200mM。这些盐和/或缓冲液为药学可接受的并衍生自已知的酸(无机的和有机的)和“可形成碱”的金属或胺。除了磷酸缓冲液，也可使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液及类似缓冲液，其中钠、钾或铵离子可作为平衡离子。本文感兴趣的含水载体为药学可接受的(对于人体给药安全无毒)并可用于制备液体制剂的载体。示例性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH经缓冲的溶液(磷酸盐缓冲生理盐水)、无菌生理盐水溶液、林格氏液或葡萄糖溶液。本发明制剂可任选加入防腐剂以降低细菌作用。加入防腐剂，例如，可有助于生产多剂量制剂。如在低压冻干药品中所讨论，CTLA4Ig分子与标准注射器中的硅氧烷不相容，其与硅氧烷反应生成可见颗粒，因此限制了患者使用无硅氧烷注射器。液体制剂可任选包含表20面活性剂以防止硅氧烷存在下生成可见颗粒。20mg/ml(250mg/管形瓶)Belatac印t液体药品的典型组成如表6所示表620mg/ml(250mg/管形瓶)Belatac印t液体药品的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>a包括40%过量填充用于补偿管形瓶、针头和注射器的损失。液体制剂的建议保存条件为2_8°C，建议保存期限为至少12个月。液体制剂的制备液体药品生产过程通常包含与糖和任选表面活性剂复合、然后无菌过滤、装入管形瓶、加塞和加盖。通常将已配制的总体溶液设定为固定的蛋白质浓度，这样装入管形瓶的体积可保持恒定。在加入糖和药物时，将混合仪速度控制在250士50rpm以尽量减少批溶液中的泡沫并确保糖在10-20分钟内完全溶解。已配制的总体溶液在填充前可于2°_8°C或室温日光下保存至少24小时。由于CTLA4Ig分子的热敏感性，已配制的总体溶液未进行终灭菌。可使用一系列的0.22-umMilliporeMillipak除菌级滤膜在装入管形瓶之前将已配制的总体溶液灭菌。本领域技术人员将意识到需要将容器过量填充以补偿制备和注射中管形瓶、针头和注射器的残留。例如，每支Belatac印t药品管形瓶为20mg/ml(250mg/管形瓶)，含有4%过量药品以补偿重新配制和抽取时的损失。制造品在本发发明另一个实施方案中提供了制造品，其包含药品并优选提供其使用说明。制造品包含容器。适当的容器包括，例如瓶子、管形瓶、注射器和试管。该容器可由各种材料例如玻璃、塑料或金属形成。该容器盛有低压冻干或液体制剂。容器上或与容器相连的标签可标明重新配制的说明和/或用法。例如，该标签可标明25mg/mlbelatac印t应稀释至上述蛋白浓度。该标签可进一步标明SC制剂可用于或专用于皮下给药。盛有制剂的容器可为多剂量管形瓶，其允许反复给药(例如2-6次)，例如皮下制剂。或者该容器为含有例如皮下制剂的预充式注射器。制造品可进一步包含第二个容器，其含有例如低压冻干制剂的适当载体。制造品可进一步包括从商业和使用者角度需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤膜、针头、注射器和有使用说明的包装插页。对于无表面活性剂的药品优选使用无硅氧烷注射器，例如在配制低压冻干药品和21/或将管形瓶中的溶液转移至静脉袋时，也可与药品管形瓶一起包装。使用方法本发明进一步提供了治疗免疫系统疾病或耐受性诱导的方法，其包括给予有效量的本发明CTLA4Ig分子制剂。在具体实施方案中，免疫系统疾病由⑶28-和/或CTLA4-阳性细胞与CD80/CD86-阳性细胞相互作用介导。在进一步的实施方案中，T细胞相互作用被抑制。免疫系统疾病包括但不限于自身免疫疾病、免疫增生性疾病、移植相关病症。这些方法包括给予受试者本发明的CTLA4Ig分子制剂以调节T细胞与CD80-和/或CD86-阳性细胞的相互作用。移植相关疾病的实例包括移植物抗宿主疾病(GVHD)(例如由骨髓移植或在耐受诱导中引起的疾病)、与移植物移植排斥、长期排斥和组织或细胞自身_或异种移植物(包括实质器官、皮肤、岛(islets)、肌肉、肝细胞、神经元)相关的免疫病症。免疫增生性疾病的实例包括但是不限于牛皮癣、T细胞淋巴瘤、T细胞急性成淋巴细胞白血病、睾丸血管中心T细胞淋巴瘤、良性淋巴脉管炎和自身免疫疾病例如狼疮(如红斑狼疮、狼疮性肾炎)、Hashimoto's甲状腺炎、原发性粘液水肿、Graves'病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、艾迪生病、糖尿病(如胰岛素依赖型糖尿病、I型糖尿病)Goodpasture’s综合症、眼葡萄膜炎、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少、原发性胆汁性肝硬化、慢性肝炎、溃疡性结肠炎、Sjogren’s综合症、风湿性疾病(例如风湿性关节炎)、多发性肌炎、硬皮症和混合性结缔组织病。本发明进一步提供了抑制受试者对实质性器官和/或组织移植排斥的方法，该受试者为移植组织的接受者。通常，在组织移植中，对移植物的排斥是由于其被T细胞识别为外源性物质起始的，然后产生可破坏该移植物的免疫应答。本发明的CTLA4Ig分子制剂通过抑制T淋巴细胞增殖和/或细胞因子的分泌可降低对组织的破坏并且诱导抗原_特异性T细胞无应答性使不需要全身免疫抑制即可长期接受移植物。而且本发明的CTLA4Ig分子制剂可与其它药物联合使用，包括但不限于皮质激素、环孢霉素A、雷怕霉素、麦考酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司(tacrolismus)、巴利昔单抗和/或其它生物制品。本发明也提供了抑制受试者中移植物抗宿主病的方法。该方法包括单独给予或与附加配体(与IL-2、IL-4或干扰素反应)一起给予受试者本发明制剂。例如可将本发明的CTLA4Ig分子SC制剂给予骨髓移植接受者用于抑制供体T细胞的同种异体反应性。或者在移植前使骨髓移植物中的供体T-细胞在活体外对接受者的同种异体抗原产生耐受。本发明CTLA4Ig分子制剂对T细胞应答的抑制也可用于治疗自身免疫病症。许多自身免疫病症是由对自身抗原具有反应性的T细胞的不当活化引起的，其可促进细胞因子和自身抗体的产生，这些均与该疾病的病理相关。给予患有或易患自身免疫疾病的受试者CTLA4Ig分子制剂可防止自身反应性T细胞的活化并可降低或消除疾病症状。这一方法也包含单独或与附加配体(与IL-2、IL-4或Y_干扰素反应)一起给予受试者本发明制剂。本发明制剂最有效的给药方式和剂量方案取决于疾病的严重程度和进程、患者的健康状况和对治疗的响应性以及治疗医师的判断。依据本发明的实践，治疗患者的有效剂量为约0.1-约10mg/受试者公斤体重。而且，有效量也可为约1-约10mg/kg受试者公斤体重。可给予受试者足以阻断内源性B7(例如CD80和/或CD86)分子与它们各自的配体在受试者体内结合的量和时间(例如一段时间或多次)的本发明CTLA4Ig分子制剂。阻断内源性B7/配体的结合可由此抑制B7-阳性细胞(例如CD80-和/或CD86-阳性细胞)与⑶28-和/或CTLA4-阳性细胞的相互作用。CTLA4Ig分子的剂量取决于许多因素，包括但不限于受累组织类型、被治疗疾病的类型、疾病的严重程度、受试者的健康状况和受试者对治疗药剂的反应性。因此，药物剂量可因受试者和给药方式而变化。美国专利申请美国发明者C·E·达尔黑姆,M·M·达利,M·内鲁尔卡,R·B·甘地,S·波尔萨迪亚,V·H·纳林格雷卡申请人:布里斯托尔—迈尔斯斯奎布公司