专利名称：：无荧光化合物丹皮酚的荧光扫描定量测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种无荧光化合物丹皮酚的荧光扫描定量测定方法
背景技术：
：丹皮酚为中药牡丹皮中的主要活性成分，具有抗心律失常，抗动脉粥样硬化，抗高血压及抗菌、抗变态反应和增强免疫的药理作用。牡丹皮为一种常用中药材，配伍在多种成方制剂中，仅《中国药典》2005年版一部收载的成方制剂中含牡丹皮的品种就有35种。目前对丹皮酚的含量测定方法主要有紫外薄层扫描法和高效液相法，高效液相法使用频率最高。紫外薄层扫描法是依据丹皮酚在紫外区274nm处的吸收，采用双波长扫描法，测量对照品与供试品色谱斑点的吸收峰面积，在线性范围内，以外标两点法，进行定量测定。薄层扫描法的灵敏度较差，要求对照品与供试品溶液浓度相对都较高，对含量低微的样品是难以进行准确定量测定的。高效液相法与薄层扫描法相比，灵敏度要高的多，但与其他有荧光的化合物相比，其要求供试品溶液的进样浓度还是相对较高，尤其对杂质峰干扰严重，丹皮酚含量低微的样品，高效液相法有时也难以达到要求。本发明就是针对上述丹皮酚在定量测定中存在的不足，提供一种简便、快捷、低成本、高灵敏度的荧光扫描定量测定方法。
发明内容无荧光化合物丹皮酚，通过薄层展开，将展开的斑点与增荧光剂三氯化铝反应，斑点呈现出很强的亮蓝色荧光，该荧光强度积分值与点样量，在一定范围内呈良好的线性关系，而用于丹皮酚的定量测定。该发明方法有效提高了丹皮酚的检测灵敏度，可达高效液相法的约3倍，紫外薄层扫描法的25倍。点样量只需0.04iig即可准确定量，扩大了丹皮酚的定量范围，使样品中的微量丹皮酚有了检测手段，有效排除了非荧光物质的干扰。通过方法学考察，点样量在0.0402-0.1809iig范围内与荧光强度积分值呈良好的线性关系，回归方程Y=27.89X+982.79，r=0.9997。采用加样回收实验，结果表明9次回收率的平均值为101.80X，RSD为1.58%(见表1)。精密度、稳定性、重复性与专属性实验均符合规定。适用于样品中微量丹皮酚样品的测定。本发明解决其技术问题所采用的技术方案为1.对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含1020iig的溶液，即得。2.供试品溶液的制备取样品粉末或蜜丸碎粒适量(约相当牡丹皮药材0.050.2g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇1025ml，密塞，摇匀，称定重量，如为蜜丸浸泡10小时以上，用玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，超声处理(功率300W，频率50KHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足或挥散至原重量，减失的重量，滤过。精密量取续滤液12ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。3.薄层色谱扫描条件荧光法单波长线性扫描；激发波长292±lnm，1号滤光片，线性化参数SX=3;线性回归二点法计算含量。4.测定方法精密吸取供试品溶液231、对照品溶液3ill与61，分别交叉点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷_乙酸乙酯_丙酮_甲酸(412:13:0.51.5:0.10.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液进行增荧光反应，置紫外光灯(365nm)下定位，采用激发波长A=292nm，进行荧光扫描，用外标二点法计算含量。样品和牡丹皮药材的测定结果见表2。本发明的原理如下丹皮酚与增荧光剂三氯化铝反应后，即产生很强的亮蓝色荧光，该荧光强度积分值与丹皮酚的点样量在一定范围内，呈现良好的线性关系，而用于定量测定。本发明的创新点及有益效果如下(1)通过丹皮酚与增荧光剂三氯化铝反应，能使无荧光化合物丹皮酚呈现出很强的亮蓝色荧光，利用该荧光的高灵敏性，可进行样品中微量丹皮酚的定性检查和定量测定(见图16)。对低微成分的质量监督，具有重要意义。(2)通过丹皮酚无荧光到有荧光的质变，有效提高了丹皮酚的检测灵敏度，点样量只需O.04iig即可准确定量，扩大了丹皮酚的定量范围，使样品中的微量丹皮酚有了检测手段，有效排除了非荧光物质的干扰。(3)本测定方法与中国药典2005年版牡丹皮项下的高效液相法相比，检测灵敏度为药典法的3倍，简便、快捷、检测成本低、灵敏度高，弥补了高效液相法对某些样品难以达到测定要求的欠缺之处。(4)本测定方法与济宁医学院学报2004.27(2)刊载的"薄层扫描法测定牡丹皮中丹皮酚含量"与湖北中医杂志2005.27(7)刊载的"薄层扫描法测定知柏地黄丸中丹皮酚含量"方法相比，本发明的检测灵敏度是报道方法的25倍，也就是说杂质干扰降低到报道方法的1/25，使一些因丹皮酚含量低微，杂质干扰严重的样品能得以准确定量测定。(5)本发明方法的问世，不但解决了丹皮酚的高灵敏度测定问题，还为同行提供了无荧光化合物的定量测定新途径，具表帅与示范作用。图1为丹皮酚对照品与清胃黄连丸的TLC图(254nm下检视)图2为丹皮酚对照品与清胃黄连丸的TLC图(365nm下检视)图3为增荧光后丹皮酚对照品与清胃黄连丸的TLC图(365nm下检视)其中图13为同一块薄层板，不同条件下的检视图，其中1.3.5.7.9.11为样品，2.4.6.8.IO为丹皮酚对照品。图4为丹皮酚对照品与养阴请肺丸的TLC图(254nm下检视)图5为丹皮酚对照品与养阴请肺丸的TLC图(365nm下检视)图6为增荧光后丹皮酚对照品与养阴请肺丸的TLC图(365nm下检视)其中图46为同一块薄层板，不同条件下的检视图，其中1.3.5.7.9.11为样品，2.4.6.8.IO为丹皮酚对照品。从照片可以看到丹皮酚对照品与两种样品，在未增荧光之前，不论是254nm，还是365nm下检视，样品与相应位置的丹皮酚对照品都无任何信息斑点，无法检出，但增荧光后，样品和对照品都出现了非常清晰的亮兰色荧光斑点，信息增强，可用于微量定性鉴别和定本发明具体实施方式如下1.对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含1020iig的溶液，即得。2.供试品溶液的制备取样品粉末或蜜丸碎粒适量(约相当牡丹皮药材0.050.2g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇1025ml，密塞，摇匀，称定重量，如为蜜丸浸泡10小时以上，用玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，超声处理(功率300W，频率50KHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足或挥散至原重量，减失的重量，滤过。精密量取续滤液12ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。3.薄层色谱扫描条件荧光法单波长线性扫描；激发波长292士lnm，l号滤光片，线性化参数SX=3;线性回归二点法计算含量。4.测定方法精密吸取供试品溶液23ii1、对照品溶液3iU与6ii1，分别交叉点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷_乙酸乙酯_丙酮_甲酸(412:13:0.51.5:O.l0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液进行增荧光反应，置紫外光灯(365nm)下定位，采用激发波长入=292nm，进行荧光扫描，用外标二点法计算含量。样品和牡丹皮药材的测定结果见表2。表1丹皮酚含量回收率试验结果(n=9)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2样品与牡丹皮药材含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求一种无荧光化合物丹皮酚的荧光扫描定量测定方法，其特征在于(1)对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10～20μg的溶液，即得；(2)供试品溶液的制备，取样品粉末或蜜丸碎粒适量，相当牡丹皮药材0.05～0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10～25ml，密塞，摇匀，称定重量，如为蜜丸浸泡10小时以上，用玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，超声处理，功率300W，频率50KHz，30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足或挥散至原重量，减失的重量，滤过；精密量取续滤液1～2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；(3)薄层色谱扫描条件荧光法单波长线性扫描，激发波长292±1nm，1号滤光片，线性化参数SX＝3，线性回归二点法计算含量；(4)测定方法精密吸取供试品溶液2～3μl、对照品溶液3μl与6μl，分别交叉点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(4～12∶1～3∶0.5～1.5∶0.1～0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液进行增荧光反应，置紫外光灯(365nm)下定位，采用激发波长λ＝292nm，进行荧光扫描，用外标二点法计算含量。全文摘要本发明涉及一种无荧光化合物丹皮酚的荧光扫描定量测定方法。其特征在于通过将展开的丹皮酚斑点，与增荧光剂三氯化铝反应后，使其产生亮蓝色荧光，该荧光强度积分值与点样量，在一定范围内呈良好的线性关系，而用于丹皮酚的定量测定。该发明方法有效提高了丹皮酚的检测灵敏度，可达高效液相法的约3倍，紫外薄层扫描法的25倍。点样量只需0.04μg即可准确定量测定，扩大了丹皮酚的定量范围，使样品中的微量丹皮酚有了检测手段，有效排除了非荧光物质的干扰。文档编号A61P9/00GK101721492SQ20091017542公开日2010年6月9日申请日期2009年11月16日优先权日2009年11月16日发明者李向军,李晓燕,许红辉,韩桂茹申请人:李向军