专利名称：一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及到一种新型肿瘤基因治疗靶向表达技 术，即通过构建一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒，应用该调控盒调控肿瘤治疗基因 的表达，并因此构造肿瘤特异性的基因治疗系统。
背景技术：
随着现代遗传学和基因组学的发展，基因治疗作为一种新的疾病治疗方式已经成 为可能。基因治疗是直接通过基因水平的操作和介入来干预疾病的发生、发展和进程。与 现有的其他治疗方法和策略相比，基因治疗的优势在于可直接利用人们在分子水平对疾病 的病因、发病机理的新发现、新认识及分子生物学领域的新技术，针对性地修复甚至置换致 病基因、或纠正基因表达调控异常。基因治疗将是医学和药学领域的一次革命，是当今生物 医学发展最重要的里程碑之一，同时也必将成为21世纪重要的医药产业。基因治疗的发展 极其迅速，据统计，自1990年美国FDA正式批准第一个基因治疗临床试验开始，截止2009 年3月，世界范围内已有1537个各期基因治疗临床研究方案(httpwiley. co. uk/ genmed/clinical/)，涵盖了遗传病、代谢病、肿瘤、传染病等众多领域，其中III期临床研 究有52个，另外中国SFDA还在世界上首次批准了 2个基因治疗新药上市。但是，总体上 讲，基因治疗技术和产品还处在其发展的初期阶段，面临着诸多问题与挑战，其中最主要表 现为基因导入系统效率较低，缺乏靶向性，以及对导入的治疗基因缺乏有效的调控等，这些 问题的也是制约着发展有效和安全的基因治疗的主要原因。基因治疗关键技术中的首要问 题，是能够选择性(或相对特异性)地将治疗基因输送到特定的靶组织(或靶器官)，使之 进入靶细胞，同时在靶细胞中实现选择性表达。靶向基因治疗是当前基因治疗的最重要研 究方向。肿瘤基因治疗是基因治疗研究中最重要的领域，目前其临床研究方案已达993 个，占全体基因治疗临床方案的64. 6%。与其他药物研究和技术评价的指导原则一样，基因 治疗药物也要求做到安全、有效、质量可控。目前，肿瘤基因治疗研究的重要领域也大多集 中在靶向基因治疗上。总体而言，靶向基因治疗主要包括两个方面一是基因治疗载体转导 的靶向性，即使基因治疗载体特异性地导入肿瘤靶细胞，而不进入正常细胞；一是治疗基因 的靶向性表达，即使治疗的目的基因在肿瘤靶细胞中实现特异性表达而不在正常细胞中表 达。其中，治疗基因的靶向性表达是根本。通常，基因的表达受到转录和翻译水平的双重调控。对于肿瘤治疗基因而言， 其靶向性表达也不外乎这两个方面。目前，肿瘤治疗基因的靶向性表达主要集中在利 用肿瘤特异性和/或组织特异性的基因启动子在转录水平上进行调控，包括甲胎蛋 白 AFP (alpha-fetoprotein)基因启动子之于肝癌；癌胚抗原 CEA (carcinoembryonic antigen)基因启动子之于结肠癌；雌激素反应元件(Estrogen-response element)、 抗上皮粘蛋白MUCl (Mucin 1)等基因启动子之于乳腺癌；PrcAasin、前列腺特异性抗 原PSA(prostate-specific antigen)等基因启动子之于前列腺癌；分泌性白细胞蛋白酶抑制剂SLP I (secretory leukoprotease inhibitor)基因启动子之于肺癌；酪氨酸 激酶Tyr(Tyrosinase)基因启动子之于黑色素瘤；嗜铬素CgA(Chromogranin A)基因 启动子之于胰腺癌⑴roplakinll基因启动子之于膀胱癌；Musashi-Ι、巢蛋白(Nestin) 等基因启动子之于脑癌；间皮素(Mesothelin)基因启动子之于间皮瘤；环氧合酶 2(Cyclooxygenase-2)、缺氧诱导因子HIF(Hypoxia-inducible factor)、0ct_3/4反应元件 (0ct-3/4response elements)、E2F 反应元件(E2F-responsive element)、进展提高基因 PEG-3 (Progression elevated gene-3)、肝素结合细胞因子(Midkine)、存活素 Survivin、 端粒酶逆转录酶TERT(human telomerase reverse transcriptase)、早其月生长反应因子 1 (early growth response l，Egr_l)等基因启动子之于多种肿瘤等。
通常，哺乳动物细胞中一个编码蛋白质的完整的mRNA分子包括三部分5’ UTR、 编码区和3’ UTR，其中高度结构化的5’ UTR和3’ UTR参与基因表达在翻译水平上的调控， 控制mRNA的翻译速率，并维护mRNA的稳定性。近年来，已有报道利用高度结构化的5’端 非翻译区(5’ Untranslated Region，5’ UTR)来调控治疗基因的翻译水平以实现其在肿瘤 细胞中特异性表达。这是由5’ UTR的结构决定的，它包含了若干调控mRNA翻译的元件，包 括(l)m7GpppG帽，是翻译效率的决定性因子，为帽结合复合体(eukaryotic initiation factor 4E，eIF_4E)所识别；(2) 二级结构(又称茎环)，通过阻碍核糖体40S亚单位的结 合或迁移来反向调节翻译；(3)与5’ UTR调控蛋白(5’ -UTR-interacting protein)相作 用的特异元件，通过类似于二级结构的方式抑制翻译；(4)上游ORF(Upstream ORFs, uORF) 和上游AUG (upstream AUGs，uAUG)，通常以提供替代的起始位点方式来下调主ORF的翻译；[5]核糖体内部进入位点(Internalribosome entry sites, IRES)，促进非帽依赖的翻译 起始。通常情况下，5’ UTR会阻止mRNA的翻译。不过，在肿瘤细胞中，5’ UTR对翻译的抑制 作用可为elF-4E所逆转。elF-4E是位于人类第四号染色体上、编码分子量为25KD多肽的 癌基因，它能与mRNA 5’末端的帽状结构(m7GpppN)特异性结合，使mRNA 5’末端非编码区 (5’UTR)的二级结构松动、解旋并形成一段单链的mRNA。单链结构的mRNA使起始密码子得 以扫描，启动mRNA与核糖体结合，促进蛋白质的合成。因此，eIF-4E被认为是翻译的最有 效的限速调节因子。同时，eIF-4E与真核细胞mRNA的转运和降解关系密切。eIF_4E在多 种恶性肿瘤组织中都具有高表达，对细胞的恶性转化、分裂以及获得向外侵蚀、转移的能力 等方面都有着重要的影响。因此，5’UTR可有效限制肿瘤治疗基因的mRNA只在肿瘤细胞中 翻译，而在正常细胞中不翻译。同样地，3’ UTR也包含了若干翻译调控元件(1)调控蛋白识别位点元件。通常 3’UTR的调控需要调控蛋白复合体而不是单个蛋白；(2)反义microRNA，通过靶向3’UTR内 的互补序列来抑制翻译功能；(3) CPE (Cytoplasmic polyadenylation elements, CPE)和六 聚核苷酸AAUAAA，激活mRNA polyA尾巴的延长，同时CPE对翻译抑制也有作用；G) PolyA 尾巴，增加PolyA尾巴的长度可补充额外的polyA结合蛋白(poly (A)-binding protein, PABP)分子，促进翻译。3’ UTR具有调控mRNA翻译、维持mRNA的稳定性和亚细胞定位等多 重作用。在真核生物细胞中，基因的表达受到转录、翻译等多种水平的调控。然而，在目前 的肿瘤治疗基因的靶向表达技术中，更多地是集中在转录靶向表达水平，其调控下的mRNA 稳定性与表达效率还有待提高。因此，只有完整模拟真核基因的表达调控机制，从转录和翻译双重水平上共同调控治疗基因，才有可能在肿瘤靶细胞中实现最高的特异表达。
发明内容
本发明主要目的是设计并构建一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒，应用该调 控盒调控肿瘤治疗基因使之在肿瘤靶细胞中实现特异表达，并因此构造肿瘤特异性的基因 治疗系统。本发明针对肿瘤治疗基因的靶向表达技术，设计并提供一种嵌合的肿瘤特异性基 因表达调控盒，以实现在转录和翻译双重水平上调控肿瘤治疗基因的表达，使之表达局限 于肿瘤靶细胞内，而在其他正常细胞中不表达。本发明提供了一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒，它包含肿瘤特异性基因启 动子、肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区、多克隆位点、基因表达增强子和多聚腺苷酸 信号区；肿瘤特异性基因启动子、肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区、基因表达增强 子和多聚腺苷酸信号区依次连接，多克隆位点位于肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区 和多聚腺苷酸信号区之间，与基因表达增强子相互独立。上述肿瘤特异性基因表达调控盒中，所述的肿瘤特异性基因启动子是端粒酶逆转 录酶基因启动子、存活素基因启动子、环氧合酶2基因启动子、缺氧诱导因子基因启动子、 0ct-3/4反应元件、E2F反应元件、进展提高基因启动子、早期生长反应因子1基因启动子、 肝素结合细胞因子基因启动子、甲胎蛋白基因启动子、癌胚抗原CEA基因启动子、雌激素 反应元件、抗上皮粘蛋白基因启动子、Probasin基因启动子、前列腺特异性抗原基因启动 子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子、酪氨酸激酶基因启动子、嗜铬素基因启动子、 Uroplakin II基因启动子、Musashi-I基因启动子、巢蛋白基因启动子或者间皮素基因启动 子中的任意一种。上述肿瘤特异性基因表达调控盒中，所述的肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译 区可以是碱性成纤维细胞生长因子2的5’端非翻译区、人凋亡抑制蛋白hBcl-XL的5’端 非翻译区、人缺氧诱导因子hHIF-Ι的5’端非翻译区或者人血管内皮生长因子的5’端非翻 译区之一。例如，所述的肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区是碱性成纤维细胞生长因 子2的5’端非翻译区。上述肿瘤特异性基因表达调控盒中，所述的基因表达增强子是乙肝病毒增强子、 SV40增强子、巨细胞病毒增强子、甲胎蛋白增强子或者癌胚抗原增强子中的任意一种或者 几种。上述肿瘤特异性基因表达调控盒中，该肿瘤特异性基因表达调控盒的多聚腺苷酸 信号区之前还有肿瘤特异性翻译调控元件3’端非翻译区。上述肿瘤特异性基因表达调控盒中，所述的肿瘤特异性翻译调控元件3’端非翻译 区可以是表皮生长因子受体的3’端非翻译区、抑癌基因p53的3’端非翻译区或者人VEGF 的3’端非翻译区。例如，所述的肿瘤特异性翻译调控元件3’端非翻译区是表皮生长因子 受体的3’端非翻译区。本发明还提供了上述肿瘤特异性基因表达调控盒的制备方法，即分别制备肿瘤特 异性基因表达调控盒的各个组成部分，然后将其依次连接。构建嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒的具体步骤如下
利用常规的分子生物学与分子克隆技术，建立嵌合的肿瘤特异性基因表达调控 盒，该调控盒是由肿瘤特异性基因启动子、肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区、增强子 (enhancer)和/或3’端非翻译区、以及多聚腺苷酸信号区等组成。上述肿瘤特异性基因启动子包括但不限于端粒酶逆转录酶TERTOmman telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因启动子、存活素(Survivin)基因启动 子、环氧合酶2(CyclooxygenaseD基因启动子、缺氧诱导因子HIF(Hypoxia-inducible factor)基因启动子、早期生长反应因子Egr-I (Early growth response 1)基因启动 子、0ct-3/4 反应元件(0ct-3/4response elements)、E2F 反应元件(E2F_responsive element)、进展提高基因PEG-3 (!Progression elevated gene-3)基因启动子、肝素结合细 胞因子(Midkine)基因启动子、甲胎蛋白AFPfelpha-fetoprotein)基因启动子、癌胚抗 原 CEA(carcinoembryonic antigen)基因启动子、雌激素反应兀件(Estrogen-response element)、抗上皮粘蛋白MUCl (Mucin 1)基因启动子、ftx)basin基因启动子、前列腺特 异性抗原PSA(prostate-specific antigen)基因启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 SLPI (secretory leukoprotease inhibitor)基因启云力子、酷氛酸激BlTyr (Tyrosinase)基 因启动子、嗜铬素CgA(Chromogranin A)基因启动子、Uroplakin II基因启动子、Musashi-I 基因启动子、巢蛋白(Nestin)基因启动子、间皮素(Mesothelin)基因启动子等；上述5’端非翻译区包括但不限于碱性成纤维细胞生长因子2 (basic fibroblast growth factor 2，bFGF_2)的5，端非翻译区、人凋亡抑制蛋白hBcl-XL的5，端非翻译区、 人缺氧诱导因子hHIF-Ι的5，端非翻译区、人血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的5，端非翻译区等；上述增强子包括但不限于乙肝病毒增强子WRE(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element 或 Woodchuck Response Element, WRE)、 SV40 (simian virus 40)增强子、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)增强子、甲胎蛋白增 强子、癌胚抗原增强子等；上述3’端非翻译区包括但不限于表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)的3，端非翻译区、抑癌基因p53的3，端非翻译区、人VEGF的3，端非翻 译区等；上述多聚腺苷酸信号区包括但不限于牛生长素多聚腺苷酸信号区(bovine growth hormone polyadenylation signal，BGHpolyA)、SV40ployA 等。多克隆位点的主要功能是插入外源DNA片段，通常由一系列外切酶组成，可以由 若干常规的外切酶串联而得，例如 Sail, Hindlll，EcoRI，SacI, KpnI, EcoRV，NotI, SphI, NcoI, XhoI, SmaI, PacI, NheI, BamHI，等等。利用本发明的嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒可以构建其调控下的基因表达 报告系统。利用常规的分子生物学与分子克隆技术，构建上述嵌合的肿瘤特异性基因表 达调控盒调控的基因表达报告系统，包括但不限于定性的增强绿色荧光蛋白基因报告 系统EGFP (Enhance Green Fluorescence Protein)和定量的荧光素酶基因报告系统 (Luciferase reporter)。由此，可以进一步构建嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的肿瘤治疗基因及其基因治疗系统。利用常规的分子生物学与分子克隆技术，构建上述嵌合的肿瘤特异性基因表达调 控盒调控的肿瘤治疗基因及其基因治疗系统。本发明的肿瘤特异性基因表达调控盒可以应用于肿瘤的基因治疗，即将肿瘤治疗 基因插入肿瘤特异性基因表达调控盒的多克隆位点，用于制备抗肿瘤基因治疗药剂。所述的肿瘤治疗基因是细菌毒素基因、自杀基因、细胞凋亡诱导基因、抗新生血管 形成基因、放射线增敏基因、肿瘤抑制基因、免疫调节因子基因中的任意一种或几种。上述嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的肿瘤治疗基因，包括但不限于(1)细菌毒素基因，包括但不限于白喉毒素(diphtheria toxin, DT)、绿脓杆菌 夕卜毒素(pseudomonas exotoxin, ΡΕ)、霍舌匕毒素(choleratoxin, CT)、志贺氏毒素(shiga toxin, ST)、百日咳毒素(pertussis toxin, PT)、葡萄球菌肠毒素 B 基因(staphylococcal enterotoxin B, SEB)等基因；(2)杀基因，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase，HSV-TK)、水痘带状泡疹病毒胸苷激酶(Varicella-hster Virus Thymidine Kinase, VZV-TK)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(Ε· coli Cytosine Deaminase, CD)、 大肠杆菌脱氧胞苷激酶(Ε. coli Deoxycytidine Kinase, DCK)、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷 酸核H转移BS (E. coli hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT)及 细胞色素 p450 (Cytochromo P450, CYP)等基因；(3)细胞凋亡诱导基因，包括但不限于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因家族、月旨肪酸合Bl (Fatty acid synthase,Fas)及其配 体(Fas-ligand, Fas_L)、bax、caspase 等基因；(4)抗新生血管形成基因，包括但不限于内皮抑素(Endostatin)、血管生 长抑素(angiostatin)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF ；血管生成素 (angiopoietin-2,Ang-2)-7 (Matrix Metalloproteinases 7,MMP-7)诱导因子-1 (hypoxia induced factor-1，HIF-1)、存活素(Survivin)等基因；(5)放射增敏基因，包括但不限于DNA依赖性蛋白激酶(DNA dependent protein kinase,DNA-PK)、Ku70、Ku80、共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant, ATM)等基因；(6)肿瘤抑制基因，包括但不限于抑癌基因p53、Rb、PTEN(phosphatase and tensin homolog, PTEN)、APC(adenomatous polyposis coli)、BRCAl 禾口 2(breast cancer 1, -2, early onset)等基因；(7)免疫调节因子，包括但不限于细胞白介素-2、-12和-Mdnterleukin 2，-12，-24，IL-2, IL-12，IL-24)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF) > zF Λ : _ α ， 一 β ， 一 γ (Interferon alpha, -beta, -gama, IFN-α，一β，一 γ)、月中瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)及 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)等 基因；(8)上述基因的融合基因；
(9)病毒复制关键因基因，包括但不限于腺病毒早期基因E1A、单纯疱疹病毒极 早期基因ICP4和ICP27等基因。本发明的肿瘤特异性基因表达调控盒可以用于制备抗肿瘤基因治疗的质粒系统、 重组病毒系统或者溶瘤病毒系统。上述嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的肿瘤基因治疗系统，包括但不限 于(1)质粒系统，包括但不限于包含上述嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒的 真核基因表达空载质粒、报告基因质粒和治疗基因质粒，上述质粒和/或与脂质体、聚 乙二胺(Polyethylenimine, PEI)、聚乳酸(poly-lactic acid, PLA)、聚乳酸-甘醇酸 (poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、壳聚糖(Chitosan)等纳米微粒组成肿瘤基因治 疗系统；(2)重组病毒系统，包括但不限于包含上述嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒 调控报告基因、肿瘤治疗基因及其空载的各种复制缺陷型的重组腺病毒、重组单纯疱疹病毒、重组痘病毒等；(3)溶瘤病毒系统，包括但不限于包含上述嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒 调控报告基因、肿瘤治疗基因及其空载的各种选择复制型的溶瘤腺病毒、溶瘤单纯疱疹病 毒、溶瘤痘病毒等。本发明属于生物医药技术领域，具体提供一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控 盒。应用该调控盒调控肿瘤治疗基因的表达，并因此构造肿瘤特异性的基因治疗系统。本 发明通过有效调控肿瘤治疗基因的表达使之局限于肿瘤细胞内，显著提高了治疗基因表达 的特异性，进而有效提高肿瘤基因治疗的安全性，降低其对正常组织和细胞的损害。以治疗 基因sHSVl-tk为例，嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的对肿瘤细胞靶向性杀伤能 力比正常细胞提高50至800倍。利用该嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒构建成的重组 腺病毒系统，对肿瘤细胞靶向性杀伤能力要提高300至1800倍。可有效提高荷瘤小鼠生存 时间2-5月，并且荷瘤小鼠治愈率可达50-80%。
图1嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒及其调控的报告基因、治疗基因示意 图。分别是骨架质粒pBA-MCS ；空载表达质粒phTUW-MCS和phTUWR-MCS ；报告基因质粒 phTUff-EGFP 和 phTUWR-EGFP ；肿瘤基因治疗质粒 phTUW-sHSVl-tk 和 phTUWR-sHSVl-tk。
具体实施例方式实施例1分离和克隆肿瘤特异性基因表达调控盒调控元件A. hTERT基因启动子
端粒酶是一种RNA依赖的DNA多聚酶，端粒酶的激活是细胞获得永生化和恶性变 的重要机制。研究显示，端粒酶在85%以上的肿瘤细胞中呈现阳性表达，而在几乎所有的成 人体细胞中呈现阴性。人端粒酶逆转录酶基因hTERT编码的端粒酶催化亚单位，是端粒酶 活性的决定性因素。hTERT自身的活性主要在转录水平进行调节，hTERT基因启动子的转录活性在这一过程中扮演重要角色。由于hTERT启动子只在肿瘤细胞中具有转录活性，因此 hTERT是实现治疗基因在肿瘤细胞中靶向性表达的理想转录调控元件。本发明实施例应用 常规PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增人端粒酶逆转录酶hTERT基因启动子片段(SEQ No. 1)，然后插入到TA克隆载体pCR2. 1 (Invitrogen)中，经测序确证该序列。B. bFGF-25，UTR近年来，利用高度结构化的5’ UTR来调控治疗基因的翻译水平以实现其在肿瘤细 胞中特异性表达已多有报道。在通常情况下，5’UTR会阻止mRNA的翻译。但在肿瘤细胞中 因高表达eIF-4E可逆转5’ UTR对翻译的抑制作用。本发明实施例采用常规的RT-PCR技 术，以大鼠细胞总RNA为模板，扩增大鼠bFGF-2的5’ UTR(SEQ No. 2)，然后插入到TA克隆 载体pCR2. 1 (Invitrogen)中，经测序确证该序列。C. WRE通常肿瘤特异性的基因启动子其转录活性相对较弱，需要借助增强子来进一步提 高其转录能力。本发明实施例应用常规PCR技术，以乙型肝炎病毒基因组DNA为模板，扩增 乙肝病毒增强子WRE (SEQ No. 3)，然后插入到TA克隆载体pCR2. 1 (Invitrogen)中，经测序 确证该序列。D. EGFR 3' UTR在真核生物细胞中，3’UTR具有调控mRNA翻译、维持mRNA的稳定性和亚细胞定位 等多重作用。本发明实施例应用常规RT-PCR技术，以人类细胞总RNA为模板，扩增人表皮生 长因子受体EGFR的3，UTR(SEQ No. 4)，然后插入到TA克隆载体pCR2. 1 (Invitrogen)中， 经测序确证该序列。E. BGHpolyA在真核生物细胞中，其mRNA的转录终止需要借助多聚腺苷酸信号。本发明实施例 应用常规PCR技术，以质粒pCDNA3. 1(+) (Invitrogen)为模板，扩增牛生长素的多聚腺苷酸 信号区BGHpolyA (SEQ No. 5)，然后插入到TA克隆载体pCR2. 1 (Invitrogen)中，经测序确证 该序列。实施例2构建嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒上述分离和克隆的各种肿瘤特异性基因表达调控盒调控元件，需循一定顺序摆列 组合，构建成嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒。本发明实施例应用分子克隆技术基本原 理，设计并化学合成多克隆位点MCS (Multiple Cloning Sites,MCS) (SEQ No. 6)，经PacI和 XhoI双酶切后，插入到经同样双酶切的pORF-MCS (Invivogen)中构成骨架质粒pBA_MCS (图 1A)。把实施例1中的经测序确证的hTERT基因启动子序列用EeoRI和HindIII双酶切、 bFGF-25’ UTR用HindIII和BamHI双酶切、WRE用HindIII和SalI双酶切并补平末端、 EGFR 3，UTR用BglII酶切、BGHpolyA用BglII和XhoI双酶切，依次插入到上述骨架质粒 pBA-MCS,分别构建成包含不同的嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒的表达质粒phTUW-MCS 禾口 phTUWR-MCS (图 IB) ο实施例3建立嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的报告基因上述构建的表达质粒phTUW-MCS和phTUWR-MCS中包含的嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒能否发挥作用，需进一步应用报告基因在细胞系中进行分析和验证。本发明实 施例应用NcoI和^CbaI双酶切从质粒PFUGW(Addgene)切出增强绿色荧光蛋白基因EGFP， 分别插入到经同样酶切的表达质粒PhTUW-MCS和phTUWR-MCS中，构建成定性基因报告质粒 PhTUff-EGFP和phTUWR-EGFP(图1C)。应用上述报告基因进一步转染各种肿瘤细胞株系， 确证其肿瘤特异性的双重调控基因表达效果。与正常细胞(如正常肝细胞L-02)相比较， 该嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的报告基因EGFP在肿瘤细胞(如肝细胞癌细胞 QGY-7703和SMMC-7721以及肝细胞转移癌细胞MHCC97-H等)中表达的特异性要提高100 至2000倍。实施例4建立嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的肿瘤治疗基因质粒系统上述构建的表达质粒phTUW-MCS和phTUWR-MCS中包含的嵌合的肿瘤特异性基因 表达调控盒能否有效调控肿瘤治疗基因的特异性表达，可进一步用体外细胞杀伤实验进行 分析和验证。本发明实施例应用NcoI和NheI双酶切从质粒pMOD-HSVltkanvivogen)切 出可溶性的sHSVl-tk基因，分别插入到经NcoI和XbaI双酶切的表达质粒phTUW-MCS和 phTUWR-MCS中，构建成肿瘤基因治疗裸质粒phTUW-sHSVl-tk和phTUWR-sHSVl-tk (图ID)。 应用上述治疗基因裸质粒进一步转染各种肿瘤细胞株系，用常规的MTT法确证其在肿瘤细 胞中的特异性表达与靶向性杀伤效果。与正常细胞(如正常肝细胞L-02)相比较，该嵌合 的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的治疗基因sHSVl-tk对肿瘤细胞(如肝细胞癌细胞 QGY-7703和SMMC-7721以及肝细胞转移癌细胞MHCC97-H等)靶向性杀伤能力要提高50至 800 倍。实施例5建立嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的肿瘤治疗基因重组腺病毒系统上述嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒调控的肿瘤基因治疗裸质粒的肿瘤靶向 治疗效果可在重组病毒体系和溶瘤病毒体系中得到进一步增强和提高。本发明实施例应 用 AdEasy 腺病毒载体系统(AdEasy Adenoviral Vector System, Stratagene)构建重 组腺病毒系统，首先应用I^acI和BioI双酶切从肿瘤基因治疗裸质粒phTUW-sHSVl-tk和 phTUWR-sHSVl-tk中切出完整的双重靶向调控的治疗基因表达盒，然后插入到穿梭载体 pShuttle中，再与腺病毒基因组骨架质粒pAdEasy-Ι在E. coli BJ5183中进行同源重组，得 到重组质粒pAd-hTUW/sHSVl-tk和pAd-hTUWR/sHSVl_tk，该重组质粒经进一步转染293细 胞得到重组腺病毒Ad-hTUW/sHSVl-tk和Ad-hTUWR/sHSVl-tk。应用上述重组腺病毒进一步 体外感染各种肿瘤细胞株系，用常规的MTT法确证其在肿瘤细胞中的特异性表达与靶向性 杀伤效果。与正常细胞(如正常肝细胞L-02)相比较，该嵌合的肿瘤特异性基因表达调控 盒调控的治疗基因sHSVl-tk对肿瘤细胞(如肝细胞癌细胞QGY-7703和SMMC-7721以及肝 细胞转移癌细胞MHCC97-H等)靶向性杀伤能力要提高300至1800倍。上述重组腺病毒进 一步治疗各种荷瘤小鼠模型(如上述肝细胞癌移植瘤模型)，可有效提高荷瘤小鼠生存时 间2-5月，并且荷瘤小鼠治愈率可达50-80%。序列表<210>1<211>1087100075]<212>DNA0076]<213>Artificial0077]<400>10078]cagaattcctgggaagtcctcagctgtcct0079]ggaccagtggCCgtgtggCttctactgctg0080]tccgaggcttggagccaggtgcctggaccc0081]atgtgaccagatgttggcctcatctgccag0082]ttgtggctggtgtgaggcgcCCggtgCgCg0083]ccctttctcgacgggaccgcCCCggtgggt0084]gtggggacccctcgccgcctgagaacctgc0085]cccaagtcgcggggaagtgttgcagggagg0086]ggagcaatgcgtcctcgggttcgtccccag0087]acgtccggcattcgtggtgcccggagcccg0088]tgggtctccggatcaggccagcggccaaag0089]ccacatcatggcccctccctcgggttaccc0090]ctggggccctCgCtggCgtCcctgcaccct0091]cgcggcccagacccccgggtccgcccggag0092]ccagtggattcgcgggcacagacgcccagg0093]ggacccgggcacccgtcctgccccttcacc0094]gccccgtcccgacccctcccgggtccccgg0095]ccccttcctttccgcggccccgccctctcc0096]gcttatc0097]<210>20098]<211>5750099]<212>DNA0100]<213>Artificial0101]<400>20102]gataagcttgcaccccattcctggcctctg0103]gctctaggggactggagatttccaaaacct0104]tactgctttgggtggaaggctggtcgttgt0105]ttaaactttaggagctgcgtcacggcagtc0106]attctttttgcaacttggaggcgccgggcg0107]gcgcggggccggggtgcaggcggggacgcg0108]acaggggctcggtctctcggcttcaggcgg0109]gggacgcgaaccgggaggctggcagcccgc0110]ggtcggggccggggagccccgagagctgcc0111]atggctgccggcagcatcacttcgcttgga0112]<210>30113]<211>621gcggttgtgccggggccccaggtctggagg60ggctggaagtcgggcctcctagctctgcag120cgaggttgccctccaccctgtgcgggcggg180acagagtgccggggcccagggtcaaggccg240gccagcaggagcgcctggctccatttccca300gattaacagatttggggtggtttgctcatg360aaagagaaatgacgggcctgtgtcaaggag420cactccgggaggtcccgcgtgcccgtccag480ccgcgtctacgcgcctccgtcctccccttc540acgccccgcgtccggacctggaggcagccc600ggtcgccgcacgcacctgttcccagggcct660cacagcctaggccgattcgacctctctccg720gggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaag780cagctgcgctgtcggggccaggccgggctc840accgcgcttcccacgtggcggagggactgg900ttccagctccgcctcctccgcgcggacccc960cccagccccctccgggccctcccagcccct1020tcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcaa10801087tctcccgcaccctatcccttcacagcctgt60gacccgatccctccccagttcagttccttc120gttaaaaggcaggaagggagaaagttgcat180tcctggagaaagctccgccgaacgggacag240tggggaggaggcggcgcgcggggcgggggc300gggtgacgcgggcccgggccgctgtagcac360agtccggctgcactaggctgggagcgcggc420gggcgagccgCgCtggggggccgaggccgg480gcagcggggtCCCggggCCgcggaggggcc540tcctt5750114]<212>DNA0115]<213>Artificial0116]〈400>30117]caaagcttatcgataatcaacctctggatt0118]ttaactatgttgctccttttacgctatgtg0119]ctattgcttcccgtatggctttcattttct0120]tttatgaggagttgtggcccgttgtcaggc0121]acgcaacccccactggttggggcattgcca0122]ctttccccctccctattgccacggcggaac0123]caggggctcggctgttgggcactgacaatt0124]ttccttggctgctcgcctgtgttgccacct0125]tcccttcggccctcaatccagcggaccttc0126]ctcttccgcgtcttcgccttcgccctcaga0127]cgcatcgataccgtcgacctC0128]<210>40129]<211>16770130]<212>DNA0131]<213>Artificial0132]<400>40133]gaagatctagtatgagccctaaaaatccag0134]caggtcctccatcccaacagccatgcccgc0135]caacgtttacaccgactagccaggaagtac0136]attcctttgtcttcaaactgtgaagcattt0137]ctttgagcagaaatttatctttcaaagagg0138]aggatttttattgattggggatcttggagt0139]atgggctcttccaacaaggaagaagcttgc0140]ggcccaactgtgagcaaggagcacaagcca0141]ggttctgcttcaaggcttccactgcaaaac0142]cagcaggccggatcggtactgtatcaagtc0143]tcccttcctgggcaaagaagaaacggaggg0144]aaaaatgtccccacggtacttactccccac0145]ttagactgacttgtttgtcttccattccat0146]ttgctgtcatgaaatcagcaagagaggatg0147]cacattggattcatcagcatttggaccaat0148]ggatagcaccgcttttgttctcgcaaaaac0149]gcatcaggtcctttggggcatagatcagaa0150]cctttagccatcaccccaaccccccaaaat0151]ctccttttacttcacttcaaaagcttttta0152]ctgcccccaaaccccctccttacgctttgtacaaaatttgtgaaagattgactggtattc60gatacgctgctttaatgcctttgtatcatg120cctccttgtataaatcctggttgctgtctc180aacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctg240ccacctgtcagctcctttccgggactttcg300tcatcgccgcctgccttgcccgctgctgga360CCgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcct420ggattctgcgcgggacgtccttctgctacg480cttcccgcggcctgctgccggctctgcggc540cgagtcggatctccctttgggccgcctccc600621actctttcgatacccaggaccaagccacag60attagctcttagacccacagactggttttg120ttccacctcgggcacattttgggaagttgc180acagaaacgcatccagcaagaatattgtcc240tatatttgaaagtatatgtg300ttttcattgtcgctattgatttttacttca360tggtagcacttgctaccctgagttcatcca420caagtcttccagaggatgcttgattccagt480actaaagatccaagaaggccttcatggccc540atggcaggtacagtaggataagccactctg600gatggaattcttccttagacttacttttgt660tgatggaccagtggtttccagtcatgagcg720tgttttgaaactcagtatgctgcccctgtc780acacatcaaataataactcggattccagcc840agcccacagctgagaatgtggaatacctaa900gtatctcctaatttgaggctcagatgaaat960gactacaaaa atgaagctgctctgaaatct1020tagtttgtgttacttatgga agatagtttt1080ctcaaagagt atatgttccctccaggtcag1140C 3. C 3. C 3.3.3.3.3.gtgtctctgccttgagtcat12000153]ctattcaagcacttacagctctggccacaa cagggcattttacaggtgcg aatgacagta12600154]gcattatgagtagtgtggaa ttcaggtagt aaatatgaaa ctagggtttg aaattgataa13200155]tgctttcacaacatttgcag atgttttaga aggaaaaaag ttccttccta aaataatttc13800156]tctacaattggaagattgga agattcagct agttaggagcccaccttttttcctaatctg14400157]tgtgtgccctgtaacctgactggttaacag cagtcctttg taaacagtgttttaaactct15000158]cctagtcaatatccaccccatccaatttatcaaggaagaa atggttcaga aaatattttc15600159]agcctacagttatgttcagtC￡lC￡lC￡lC￡lC￡ltacaaaatgttccttttgcttttaaagtaa16200160]tttttgactcccagatcagtcagagcccct acagcattgttaagaaagta gatctac16770161]<210>50162]<211>2540163]<212>DNA0164]<213>Artificial0165]<400>50166]gatagatcttagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct600167]ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtct1200168]gagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattg1800169]ggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaag2400170]aaccagctcgagat2540171]<210>60172]<211>780173]<212>DNA0174]<213>Artificial0175]<400>60176]ccttaattaagaattcgatatcaagcttgacggatccccatgggtcgactctagaattta600177]aatagatctctcgagcag781权利要求
1.一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒，其特征在于，它包含肿瘤特异性基因启动 子、肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区、多克隆位点、基因表达增强子和多聚腺苷酸信 号区；肿瘤特异性基因启动子、肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区、基因表达增强子 和多聚腺苷酸信号区依次连接，多克隆位点位于肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区和 多聚腺苷酸信号区之间，与基因表达增强子相互独立。
2.根据权利要求1所述的肿瘤特异性基因表达调控盒，其特征在于，所述的肿瘤特异 性基因启动子是端粒酶逆转录酶基因启动子、存活素基因启动子、环氧合酶2基因启动子、 缺氧诱导因子基因启动子、0ct-3/4反应元件、E2F反应元件、进展提高基因启动子、早期生 长反应因子1基因启动子、肝素结合细胞因子基因启动子、甲胎蛋白基因启动子、癌胚抗原 CEA基因启动子、雌激素反应元件、抗上皮粘蛋白基因启动子、I^robasin基因启动子、前列 腺特异性抗原基因启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子、酪氨酸激酶基因启动 子、嗜铬素基因启动子、tooplakin II基因启动子、Musashi-I基因启动子、巢蛋白基因启动 子或者间皮素基因启动子中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的肿瘤特异性基因表达调控盒，其特征在于，所述的肿瘤特异 性翻译调控元件5’端非翻译区是碱性成纤维细胞生长因子2的5’端非翻译区、人凋亡抑 制蛋白hBcl-XL的5’端非翻译区、人缺氧诱导因子hHIF-Ι的5’端非翻译区或者人血管内 皮生长因子的5’端非翻译区之一。
4.根据权利要求1所述的肿瘤特异性基因表达调控盒，其特征在于，所述的基因表达 增强子是乙肝病毒增强子、SV40增强子、巨细胞病毒增强子、甲胎蛋白增强子或者癌胚抗原 增强子中的任意一种或者几种。
5.根据权利要求1所述的肿瘤特异性基因表达调控盒，其特征在于，该肿瘤特异性基 因表达调控盒的多聚腺苷酸信号区之前还有肿瘤特异性翻译调控元件3’端非翻译区。
6.根据权利要求5所述的肿瘤特异性基因表达调控盒，其特征在于，所述的肿瘤特异 性翻译调控元件3’端非翻译区是表皮生长因子受体的3’端非翻译区、抑癌基因p53的3’ 端非翻译区或者人VEGF的3’端非翻译区。
7.权利要求1-6中任意一种肿瘤特异性基因表达调控盒的制备方法，其特征在于，分 别制备肿瘤特异性基因表达调控盒的各个组成部分，然后将其依次连接。
8.权利要求1-6中任意一种肿瘤特异性基因表达调控盒的应用，其特征在于，将肿瘤 治疗基因插入肿瘤特异性基因表达调控盒的多克隆位点，用于制备抗肿瘤基因治疗药剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤治疗基因是细菌毒素基因、自 杀基因、细胞凋亡诱导基因、抗新生血管形成基因、放射线增敏基因、肿瘤抑制基因、免疫调 节因子基因中的任意一种或几种。
10.权利要求1-6中任意一种肿瘤特异性基因表达调控盒的应用，其特征在于，将所述 的肿瘤特异性基因表达调控盒用于制备抗肿瘤基因治疗的质粒系统、重组病毒系统或者溶 瘤病毒系统。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体提供一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒。它包含肿瘤特异性基因启动子、肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区、多克隆位点、基因表达增强子和多聚腺苷酸信号区；肿瘤特异性基因启动子、肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区、基因表达增强子和多聚腺苷酸信号区依次连接，多克隆位点位于肿瘤特异性翻译调控元件5’端非翻译区和多聚腺苷酸信号区之间，与基因表达增强子相互独立。本发明通过有效调控肿瘤治疗基因的表达使之局限于肿瘤细胞内，显著提高了治疗基因表达的特异性，进而有效提高肿瘤基因治疗的安全性，降低其对正常组织和细胞的损害。
文档编号A61P35/00GK102051358SQ20091019857
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月10日 优先权日2009年11月10日
发明者方煜翔, 田聆, 薛京伦, 陈金中 申请人:复旦大学