专利名称：斑蝥素在制备抑制肿瘤血管新生与血管新生相关疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及斑蝥素的新用途，具体涉及斑蝥素在制备抑制肿瘤血管新生与血管新
生相关疾病药物中的应用。
背景技术：
血管新生(Angiogenesis)是指在原有血管的基础上芽生出新的毛细血管的过 程，包括五个阶段①血管内皮细胞的增殖；②降解血管基底膜；③内皮细胞的迁移； 内 皮细胞形成微血管；⑤基底膜的重塑，血管成熟。 血管新生在生理和病例条件下都有发生，生理性血管新生主要发生在胚胎发育和 女性生理周期，对于正常的发育非常关键。而许多疾病的发生都离不开病理性血管新生的 参与，例如肿瘤、心血管疾病、糖尿病、视网膜黄斑病变、风湿性关节炎、早产儿视网膜病变、 牛皮癣等。目前已经了解到，血管新生性疾病表现为血管新生过度和缺陷，这类疾病包括肿 瘤、糖尿病视网膜病变、牛皮癣、眼内血管新生病、类风湿关节炎、十二指肠溃疡、月经不调、 不孕症等。 上述疾病中，肿瘤一直对人类健康造成极大的威胁，哈佛大学医生JudahFolkman 提出肿瘤的生长会诱导新生血管来给肿瘤组织提供养分和氧气，带走代谢废物，肿瘤还可 以通过新生血管达到转移的目的。因此，可以通过抑制血管新生来抑制肿瘤的生长和转移， 抑制血管新生是抑制肿瘤生长和转移的有效途径，为肿瘤的治疗提供一种新方法。有效控 制血管新生已成为人们对有关疾病治疗的新政策。 目前靶向肿瘤血管新生已被全球科学界列为继放疗、化疗、手术治疗后的第四种 肿瘤治疗方法。与传统的对正常细胞损伤极大的化疗放疗相比，抗血管新生疗法靶定于肿 瘤灶的微血管内皮细胞而不是肿瘤本身，同时血管新生抑制剂通常毒副作用小，作用明确， 因此，抗血管新生疗法具有疗效明显，毒副作用小等诸多优点。 中草药是我们国家的宝贵财富，从中发现新的抑制血管新生的单体并研究其机制 具有重要意义。斑蝥是鞘翅目(Coleop tera)芫菁科(Meloidae)斑芫菁属(Mylabris)的 药用昆虫，具有消肿破瘀、解毒、消炎、抗癌、通经、杀虫等功效。其中，斑蝥素(Cantharidin) 是斑蝥的有效成分，分子式是Q。H^04，分子量是196. 20，分子结构式如式(1)如示，该化合 物为萜类物质，斜方形鳞状晶体。曾有报道称斑蝥素具有抗肿瘤、升高白细胞等功效，但是 目前尚未有报道指出斑蝥素可以抑制血管新生，或通过抑制血管新生来抑制肿瘤，也没有 关于斑蝥素作为抑制血管新生药物的报道。本发明首次提出斑蝥素在制备抑制肿瘤血管新 生以及血管新生相关疾病的药物中的用途。-二、J
式(1)
发明内容
本发明人把多种中草药单体作为筛选对象，利用化学生物学、生物信息学、文献查
阅等方法，通过预测并初步实验筛选，从多种化合物单体中检测到斑蝥素这一种中草药单 体具有显著抑制血管新生并抑制肿瘤的作用。本发明的斑蝥素在结构、来源、背景上完全 不同于其他中草药单体，本发明人在检测系统的每一单项实验都相应改进或调整了实验条 件，包括因不同研究对象的溶解度、作用强弱、稳定性等不同性质而不同的实验条件，经过 多次反复实验探索，本发明首次提出斑蝥素在制备抑制肿瘤血管新生以及血管新生相关疾 病的药物中的用途。 本发明提供式(1)的斑蝥素(Cantharidin)在制备抑制肿瘤血管新生以及血管新 生相关疾病的治疗和/或预防药物中的应用。本发明中所用的斑蝥素购于Sigma-Aldrich 公司。 本发明斑蝥素的技术方案是，式(1)的斑蝥素(Cantharidin)在制备抑制肿瘤血 管新生以及血管新生相关疾病的治疗和/或预防药物中的应用，尤其是在制备肿瘤血管新 生、眼科疾病、类风湿性关节炎、血管瘤、银屑病、十二指肠溃疡等血管新生性疾病中的应 用。其中，所述抑制血管新生药物可抑制肿瘤血管新生，可抑制病变组织血管新生。其中， 所述肿瘤血管新生包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症的血管新生，K即osi's肉瘤病变组 织血管新生，Paget' s疾病血管新生，血管瘤，血管瘤病变组织血管新生，实体瘤病变组织血 管新生，多发性血管瘤，血管母细胞瘤，良性血管增生疾病。所述病变组织血管新生包括关 节炎病变组织血管新生，血管新生性眼病，银屑病病变组织血管新生。 本发明还提供含有有效量的式(I)斑蝥素以及药学可接受成分的组合物在制备 抑制血管新生药物中的应用。根据本发明可以将治疗有效量的斑蝥素和药学上允许的任 意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与斑蝥素没有拮抗作用的其他抗血管新生药 物。可以在本发明的抑制血管新生的药物中可以加入一种或多种药学上可以接受的载体。
其制剂可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于末齐U、散剂、片齐U、丸齐iJ、滴齐iJ、颗粒齐iJ、
悬浮剂、溶液剂、胶囊剂、糖衣剂、口服液、注射剂、脂质体、舌下含片等。 经研究表明，本发明提供的斑蝥素在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、体外
划痕迁移实验、Boyden小室迁移实验、微管形成实验以及小鼠角膜血管新生等均有明显的
抑制作用，可以明显抑制内皮细胞的增殖，明显抑制人脐静脉内皮细胞的迁移，明显抑制内
皮细胞有阻力的迁移，明显抑制内皮细胞微管的形成，明显抑制由血管内皮细胞生长因子
4诱导的新生血管形成。并且，本发明提供的斑蝥素还可显著抑制肿瘤生长。
以下各附图中，均以p < 0. 05表示有显著差异，其中，*表示p < 0. 05 ;**表示
0. 001 < p < 0. 01 ;***表示p < 0. 001。
图1 :斑蝥素抑制血管内皮细胞的增殖。
图2 :斑蝥素抑制血管内皮细胞的体外划痕迁移；其中A.对照；B. 10微摩尔/升
斑蝥素，右图为统计图。 图3 :斑蝥素抑制血管内皮细胞修饰的Boyden小室迁移，箭头所指为迁移到小室
膜下的细胞，其中A.对照；B. IO微摩尔/升斑蝥素，右图为统计图。
图4 :斑蝥素抑制血管内皮细胞的成管，其中A.对照；B. 10微摩尔/升斑蝥素，右
图为统计图。
图5 :斑蝥素抑制角膜新生血管新生，黑色箭头所指为植入颗粒，白色箭头所指为 新生血管，其中A.对照；B.斑蝥素，柱状图为血管长度、钟点数与血管面积的统计图。
图6 :斑蝥素抑制肿瘤生长，治疗过程中肿瘤体积与小鼠体重的统计图。
具体实施例方式
实验例1 :斑蝥素抑制人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein EndothelialCells， HUVEC)增殖 原理在活细胞中，线粒体中的NADra脱氢酶将MTS四唑盐化合物转变成一种溶 于细胞培养液的有色物质。因此，活细胞数越多，就可以更多地转变四唑盐成为这种有色物 质，所以其颜色深浅与活细胞数目在一定范围内，通过测定该物质在490nm处的光吸收值 可以间接反应活细胞的数量。通过该方法可评价药物对细胞增殖能力的影响。
方法在96孔板中接入HUVEC细胞悬液，5000个/孔，设置对照组和加样组，对照 组不加斑蝥素，加样组分别加入含有不同浓度斑蝥素的培养基培养，作用48小时后，加入 20微升CellTiter 96 Aqueous细胞增殖检测试剂，孵育1_3小时，用酶标仪在490纳米处 检测每孔的光吸收值。 结果与评价与对照组相比，加入斑蝥素的实验组，内皮细胞的增殖能力受到抑
制，说明斑蝥素可以抑制内皮细胞的增殖，结果见图1。 实施例2 :斑蝥素抑制人脐静脉内皮细胞体外划痕迁移实验 目的和原理细胞迁移实验又叫体外划痕实验。本实验通在培养基中长满的单层
细胞上制造划痕，观察划痕边缘细胞朝划痕部位迁移的情况，统计在药物作用下，划痕处新
迁入的内皮细胞的数量是否有变化，来评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。
方法将细胞接入6孔板中，待细胞长至90%以上的密度时，用微量移液器的1
毫升吸头在每孔的中间划十字线。用磷酸缓冲液(PBS)洗净划下的细胞，加入含不同药物
浓度及8纳克/毫升VEGF165的培养基，于5% C02培养箱中37t:培养12 16小时，直至
VEGF165组划线两侧的细胞迁移至划线区域中央。 结果与评价在显微镜下观察并拍照，结果见图2(其中A为对照组；B为含斑蝥素 组，剂量为10微摩尔/升)。与对照组相比，加入斑蝥素后，人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的
5迁移受到抑制，说明斑蝥素可以抑制人脐静脉内皮细胞的迁移。 实施例3 :斑蝥素抑制人脐静脉内皮细胞修饰的Boyden小室迁移实验 目的和原理内皮细胞修饰的Boyben小室最初是Boyden发明的，用于研究白细
胞的趋化性，这种研究基于小室被微孔分离成上下两个部分，本实验室采用的是Millopore
公司购买的小室。修饰的Boyden小室是一类可插入细胞培养板的培养皿，底层有孔径为8
微米的多聚碳酸盐滤膜，在生长因子的诱导下细胞可以透过膜的一侧粘附于含有高浓度生
长因子的另一侧。此实验可以检测药物对内皮细胞有阻力迁移能力的影响。 方法用0. 1%的明胶将24孔板和放入其中的小室包被，于5% C02培养箱中37°C
孵育30分钟，弃去明胶，用PBS洗三遍。小室外24孔板中加入含有10%血清和VEGF165的
内皮细胞培养基。小室中接入细胞，之后再加入50 P L不同浓度的药物，细胞在37°C 5% C02
培养箱中孵育四小时。 结果与评价四小时后，将小室内外的细胞培养液吸去，用棉棒拭去上层细胞，将 小室浸泡在4%多聚甲醛中固定20分钟，用PBS洗三遍吸干，然后用苏木精染色20分钟，再 用PBS将背景多余染料洗去，室温晾干。OLYMPUS显微镜下拍照计数统计数据。结果见图 3(其中A为对照组；B为含斑蝥素组，10微摩尔/升)，与对照组比，给予斑蝥素后，人脐静 脉内皮细胞穿过Boyden小室的能力受到抑制，说明斑蝥素可以抑制内皮细胞有阻力的迁 移的能力。 实施例4 :斑蝥素抑制人脐静脉内皮细胞成管实验 目的和原理Matrigel (基质胶)是从小鼠肉瘤EHS中抽提得到的可容性基底膜 抽提物。在室温下，此Matrigel可聚合成一种具有生物活性的基质材料，作用与哺乳动物 细胞基底膜类似，对于细胞的粘附和分化有效应作用。内皮细胞可以在Matrigel上融和成 微管，可以利用内皮细胞的这种成管特性来研究药物对内皮细胞成管的影响。
方法将Matrigel均匀铺到24孔板中，37°〇，5% C02培养箱中放置30分钟待其 凝固。每孔加入相同体积的细胞和含有不同浓度斑蝥素的培养基各500微升，混匀。于 37°C 5%培养箱中培养16-18h在显微镜下观察微管形成情况，计算微管形成数量进行统计 学分析。 结果与评价内皮细胞在Matrigel中生长8_12小时后，细胞在Matrigel中延伸 生长，由原来的单个细胞巻成管状相互连接，形成三维网状结构。结果见图4(其中A :对照 组；B :给予10微摩尔斑蝥素)，与对照组相比，内皮细胞的成管过程受到影响，三维网络结 构形成受阻，说明斑蝥素可以抑制内皮细胞微管形成。
实施例5 :斑蝥素抑制小鼠角膜新生血管形成 目的与原理小鼠角膜是一个无血管区域，在小鼠角膜上做一个小袋，植入含有血 管内皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒，可以诱导存在于角巩缘处的血管向缓释颗粒的 小袋生长。加药组通过在缓释颗粒上加上VEGF和O. l微克的斑蝥素，观察这些诱导的血管 面积是否有改变。 方法将C57/BL6小鼠麻醉，固定，在角膜上开一小口 ，对照组植入含有血管内皮 细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒，加药组植入含有VEGF和药物的缓释颗粒。术后复苏，饲 养一周后，显微镜下观察拍照。 结果与评价结果见图5示，与对照组相比，加药组新生血管明显受到抑制，说明
6斑蝥素可以抑制由血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的新生血管形成。
实施例6 :斑蝥素抑制肿瘤生长 目的和原理在小鼠身上荷瘤，通过对肿瘤的不同处理，观察处理组和对照组肿瘤 体积的变化，并且观察小鼠体重是否有明显变化。 方法将一定数量的肿瘤细胞注射到小鼠皮下，等实体肿瘤长到一定体积的时候， 分别对对照组和处理组注射不同浓度的斑蝥素，同时每天测量其体重和肿瘤体积，36天后 将肿瘤剥离。 结果与评价结果见图6所示，36天后，将经过斑蝥素处理的加药组和对照组的小 鼠肿瘤剥离，加药组肿瘤体积明显小于对照组。
权利要求
式(1)的斑蝥素在制备抑制血管新生的治疗和/或预防药物中的应用。式(1)F2009101994598C0000011.tif
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管新生药物可抑制肿瘤血管 新生。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管新生药物可抑制病变组织 血管新生。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤血管新生包括白血病、淋巴瘤、 骨髓瘤血液癌症的血管新生，K即osi' s肉瘤病变组织血管新生，Paget' s疾病血管新生，血 管瘤，血管瘤病变组织血管新生，实体瘤病变组织血管新生，多发性血管瘤，血管母细胞瘤， 良性血管增生疾病。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病变组织血管新生包括关节炎病变 组织血管新生，血管新生性眼病，银屑病病变组织血管新生。
6. 根据权利要求l所述的应用，其特征在于，含有有效量的式(I)斑蝥素以及药学可接 受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了斑蝥素在制备抑制肿瘤血管新生与血管新生相关疾病药物中的应用。本发明还提供了含有有效量的式(I)斑蝥素以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
文档编号A61P35/02GK101703498SQ200910199459
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者刘明耀, 卢彬彬, 吴媛媛, 宋雅娟, 张晓丽, 易正芳, 李成海, 杨正峰 申请人:华东师范大学