专利名称：一种预防和治疗老年痴呆症的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域。更具体而言，本发明涉及能够预防和治疗老年痴呆症
的组合物、药盒或保健盒，它们包含吡咯并喹啉醌(PQQ)以及乙酰胆碱酯酶等作为主要活 性成分。本组合物的各成分分别通过不同的机制发挥作用，各成分间有显著的相互协同促 进作用，具有改善记忆、认知能力的效果。
背景技术：
目前，老年性痴呆患病率约占60岁人口的10 %左右，其中阿尔茨海默病 (Alzheimer Disease, AD)约占5%左右。而且，随着年龄每增加5岁，AD的患病率将增加 两倍，在80-85岁的病人中有20%的老年人患有老年性痴呆。 据统计，美国2000年的阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)例数为450万例。 如果治疗方法不能取得进展，则美国在2050年时，有症状的AD病例数预期将上升至1320 万例。 目前我国已有1.29亿人口超过60岁，老年人占总人口的比例已达到10. 15%，人 口老龄化的日益严重，从而使我国提前成为老年型人口的国家。因此，老年性痴呆将日渐成 为一个严重的社会问题，将极大地阻碍社会的发展。 并且，老年性痴呆已经成为继心脏病、肿瘤和脑卒中之后的第四位死因，给患者家 庭、社会造成了很大的负担及压力。 所谓的"老年性痴呆"是指老年期出现的已获得的智能在本质上出现持续的损害， 智能缺失和社会适应能力降低，是一种隐袭发病、逐渐发病、以智能障碍为主的慢性进行性 疾病。其临床表现主要为在智能方面出现抽象思维能力丧失、推理判断与计划不足、注意 力缺失；在人格方面出现兴趣与始动性丧失、情绪迟钝或难以抑制、社会行为不端、不拘小 节；在记忆方面出现遗忘，不能学习，时间、地形、视觉与空间定向力差；在言语与认知功能 方面出现说话不流利，综合能力缺失等。 目前，老年性痴呆的病因尚不明了。近年来，国外大量研究的重点集中在遗传学、 免疫学、病毒感染、神经递质和神经内分泌等方面，研究结果表明许多因素与该病发病机制 和病因有关。 总的说来，在复杂的AD病因学研究中，增龄性改变及遗传因素二者比较明确。大 量神经纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT)及老年斑(senile plaques, SP)的存在 是其重要病理特征。 而在疾病发生发展的过程中，包括氧化和脂质过氧化、谷氨酸能兴奋性毒性反应、 病毒感染、炎症等在内的多种因素最终可导致脑海马和皮层部位的大量胆碱能神经元丢 失，对学习和记忆功能受影响，从而导致痴呆。 对于老年性痴呆的治疗，目前尚无肯定的十分有效或治愈的方法。治疗AD的药物 主要分为二类 第一类增加脑内胆碱能神经系统功能，主要为胆碱酯酶抑制剂和M-胆碱受体激动剂。前者主要包括安理申、他克林等，这类药物有助于改善轻度到中度病人的临床症状， 但是，当神经元丢失到一定程度之后，这种药物的维持也是有限的。 第二类作用于神经传递系统的细胞保护剂，以延缓脑神经元变性过程，从理论上 讲，阻断P-淀粉样蛋白形成，抑制e-淀粉样蛋白的神经毒性和保护或修复神经元，达到 防治AD的目的。包括抗氧化剂，非甾体抗炎药、激素替代疗法、神经营养因子、抗神经细胞 凋亡剂及促神经细胞代谢药，钙通道阻滞剂、纠正钙稳态失调药物，抗淀粉样肽形成药，代 谢增强剂，细胞膜调节剂，脑活素，谷氨酸盐受体拮抗剂等药物。其中，抗氧化剂主要通过减 少AD患者脑内自由基的形成，减少氧化应激发挥保护作用。 本领域迫切需要开发出可安全、有效地预防和治疗老年性痴呆(尤其是AD)的药 物。
发明内容
本发明的目的之一正是提供一种可安全、有效地预防和治疗老年性痴呆(尤其是 AD)的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种组合物，其包含 (a)吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯； (b)乙酰胆碱酯酶抑制剂；以及 (c)药学上或生理学上可接受的载体， 其中，组分(a)和组分(b)的摩尔比为i : ioo ioo : i。 在本发明一个实施方式中，所述组合物是药物组合物或保健组合物。
在一个优选例中，所述组合物是药物组合物。 在另一个优选例中，所述组合物的形式为片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、注射剂、溶液 剂或糖浆剂。 在一个优选例中，所述组合物为口服制剂或注射用制剂。
在本发明另一个实施方式中，所述组合物用于改善记忆和认知能力。 在一个优选例中，所述组合物用于预防或治疗老年性退行性神经疾病，优选用于
预防或治疗老年性痴呆，更优选用于预防或治疗阿尔茨海默病或帕金森病。 在本发明另一个实施方式中，所述组分(b)乙酰胆碱酯酶抑制剂为选自下组中的
一种或多种石杉碱甲、他克林或其盐、多奈哌齐、毒扁豆碱氨基甲酸酯或氢溴化加兰他敏。
在一个优选例中，所述组分(b)为石杉碱甲、他克林、多奈哌齐、毒扁豆碱氨基甲
酸酯或氢溴化加兰他敏，更优选石杉碱甲。
在本发明另一个实施方式中，所述组合物中组分(a)和组分(b)的摩尔比为
i : 50 50 : i。 在一个优选例中，组分(a)和组分(b)的摩尔比为，更优选l : 25 25 : l，更优
选i : i 25 : i。 在另一个优选例中，组分(a)和组分(b)的重量之和占组合物总重量的0. 1 % 99. 9%，更优选1% 99%，再优选10% 90%。 在另一个优选例中，组分(a)和组分(b)的重量比为1 : 50 50 : l，更优选
i : 25 25 : i，更优选i : 20 20 : i，再优选i : 1 20 : i。
在本发明另一个实施方式中，所述组合物中还含有辅酶Q10。 在一个优选例中，组分(a)与辅酶QIO的摩尔比为1 : 50 50 : 1，更优选
i : 25 25 : i，更优选i : 25 i : i。 在另一个优选例中，所述组合物还含有预防或治疗老年性退行性神经疾病的其它 活性物质，优选所述活性物质为M-胆碱受体激动剂、抗氧化剂、非甾体抗炎药、神经营养
因子、抗神经细胞凋亡剂、促神经细胞代谢药、钙通道阻滞剂、抗淀粉样肽形成药、代谢增强 剂、细胞膜调节剂、脑活素、谷氨酸盐受体拮抗剂，更优选谷氨酸盐受体拮抗剂。 在本发明的第二方面中，提供了一种制备组合物的方法，所述方法包括将组分
(a)、 (b)和(c)混合在一起，制得组合物的步骤，其中: (a)吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯； (b)乙酰胆碱酯酶抑制剂； (c)药学上或生理学上可接受的载体， 其中，组分(a)和组分(b)的摩尔比为1 : 100 100 : 1. 在一个优选例中，组分(a)和组分(b)的摩尔比为i : 50 50 : i，优选i : 25 25 : i，更优选1 : 1 n 1。
在本发明的第三方面中，提供了一种药盒或保健盒，其包含 (A)装有有效量吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯的容器；
和 (B)装有有效量乙酰胆碱酯酶抑制剂的容器。 在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌与所述乙酰胆碱酯酶抑制剂的摩尔比为
1 : 100 100 : 1，优选1 : 10 50 : 1，更优选1 : 1 25 : 1。
在另一个优选例中，所述药盒或保健盒用于改善记忆和认知能力。 在另一个优选例中，所述药盒或保健盒用于预防或治疗老年性退行性神经疾病，
优选用于预防或治疗老年性痴呆，更优选用于预防或治疗阿尔茨海默病或帕金森病。 在另一优选例中，在给予吡咯并喹啉醌之前、之后或同时给予有效量的乙酰胆碱
酯酶抑制剂。 在另一优选例中，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂为选自下组中的一种或多种石杉碱 甲、他克林或其盐、多奈哌齐、毒扁豆碱氨基甲酸酯、氢溴化加兰他敏，优选为石杉碱甲、他 克林、氢溴化加兰他敏，更优选石杉碱甲。 在另一优选例中，所述药盒或保健盒还含有辅酶Q10，优选吡咯并喹啉醌与辅酶
Qio的摩尔比为i : ioo 25 : i，更优选i : 25 i : i。 在本发明的第四方面中，提供了一种制备药盒或保健盒的方法，所述方法包括
(I)将有效量的吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯装入第 一容器内； (II)将有效量乙酰胆碱酯酶抑制剂装入第二容器内；禾口 (III)将第一容器和第二容器置于同一外包装中，形成药盒或保健盒。 在本发明的第五方面中，提供了吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐
或酯和乙酰胆碱酯酶抑制剂在用于制备改善记忆和认知能力的组合物、药盒或保健盒中的用途。
在一个优选例中，所述组合物、药盒或保健盒用于预防或治疗老年性退行性神经 疾病，优选用于预防或治疗老年性痴呆，更优选用于预防或治疗阿尔茨海默病或帕金森病。
在本发明的另一方面中，提供了以下组合物在改善记忆和认知能力中的用途，优 选在预防或治疗老年性退行性神经疾病中的用途，更优选在预防或治疗老年性痴呆中的用 途，更优选在预防或治疗阿尔茨海默病或帕金森病中的用途，上述组合物包含
(a)吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯；
(b)乙酰胆碱酯酶抑制剂；以及
(c)药学上或生理学上可接受的载体， 其中，组分(a)和组分(b)的摩尔比为i : ioo ioo : i。 在一个优选例中，组分(a)和组分(b)的摩尔比为l : 50 50 : l，优选l : 25
25 : i，更优选i : i n i。 在一个优选例中，上述组合物还含有辅酶Q10，优选吡咯并喹啉醌与辅酶Q10的摩
尔比为i : ioo 25 : i，更优选i : 25 i : i。 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1 :通过Morris水迷宫试验，测试PQQ对大鼠认知和记忆能力水平的影响，横座
标中的1-5分别代表组1-组5 ;纵坐标表示各组大鼠的记忆保持水平(％ )。 图2 :通过Morris水迷宫试验，测试ChEI对大鼠认知和记忆能力水平的影响，横
座标中的1-5分别代表组1-组5 ;纵坐标表示各组大鼠的记忆保持水平(％ )。 图3 :通过Morris水迷宫试验，测试PQQ与ChEI的组合或PQQ与ChEI及CoQIO的
组合对大鼠认知和记忆能力水平的影响，横座标中的1-5分别代表组1-组5 ;纵坐标表示
各组大鼠的记忆保持水平(％ )。 图4 :通过Morris水迷宫试验，测试PQQ对AD模型小鼠认知和记忆能力水平的影 响，横座标中的1-5分别代表组1-组5 ;纵坐标表示各组小鼠的记忆保持水平(％ )。
图5 :通过Morris水迷宫试验，测试ChEI对AD模型小鼠认知和记忆能力水平的 影响，横座标中的1-5分别代表组1-组5 ;纵坐标表示各组小鼠的记忆保持水平(％ )。
图6 :通过Morris水迷宫试验，测试PQQ与ChEI的组合或PQQ与ChEI及CoQIO的 组合对AD模型小鼠认知和记忆能力水平的影响，横座标中的l-5分别代表组l-组5 ;纵坐 标表示各组小鼠的记忆保持水平(％ )。
具体实施例方式
本发明人经过长期而深入的研究发现妣咯并喹啉醌与乙酰胆碱酯酶抑制剂的组
合或联合使用，对于改善记忆和认知能力具有协同作用，延缓老年痴呆模型小鼠发病时间，
因此可用于预防和治疗老年性退行性神经疾病(尤其是老年性痴呆症)。 并且，发明人还进一步发现在组合或联合使用吡咯并喹啉醌和乙酰胆碱酯酶抑
制剂的基础上，加入辅酶Q10可进一步显著提高改善记忆和认知能力的效果，因此可将这
三种活性物质组合使用或联用以预防和治疗老年性退行性神经疾病(尤其是老年性痴呆症)。 在此基础上，发明人完成了本发明。
相关定义 本文中，术语"含有"表示各种成分可一起应用于本发明的组合物中。因此，术语"主要由...组成"和"由...组成"包含在术语"含有"中。 本文中，术语"有效量"指按本发明的方式使用时足以获得需要的效果而无过度不良副反应(如毒性、剌激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的"有效量"因各种因素而异，如所需给予的对象的年龄、病况等。 本文中，术语"PQQ"指妣咯并喹啉醌或其盐或酯，代表性的盐包括(但并不限于)钠盐、钾盐、锌盐等。本文中，术语"PQQ活性物质"或"妣咯并喹啉醌活性物质"可互换使用，都包括吡咯并喹啉醌、PQQ的保健品学、生理学或药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、异构体或其它衍生物形式、或它们的混合物。术语"PQQ衍生物"是指含有吡咯并喹啉醌作
为主要结构或通过吡咯并喹啉醌的代谢获得的产物，只要其还具有吡咯并喹啉醌在本发明中的功效。卩比卩各鹏麵(PQQ)白膽,P雄肯p匕 吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)呈红褐色粉末状，是一种水溶性
化合物，其存在于我们的日常饮食中，并广泛分布于人体各组织器官，并在母乳中存在。PQQ
的分子式如下
COOH 1979年，PQQ被确认为是氧化还原反应的 一 种辅酶。2003年，Nature杂志(Nature. 2003年4月24 ;422(6934) :832)报道PQQ具有维生素活性，认为其可能是一种新型的B族维生素。 研究证实，PQQ是一种对人体健康非常有利的物质。已通过动物实验观察到PQQ的多种功能纯化的PQQ作为一种抗氧化剂能够保护肝脏免受CC14或酒精损伤。纯化的PQQ减少鸡胚发育过程中糖皮质激素诱导的白内障形成，可能是通过恢复谷胱甘肽水平从而降低对皮质激素的反应性来发挥作用。PQQ直接氧化受体的NMDA氧化还原位点，保护细胞免受NMDA毒性影响，从而防止脑部缺血缺氧，避免动物模型发生严重的休克。同时，PQQ还可以保护心脏防止心肌缺血及心肌梗死。 对神经系统而言，PQQ具备抗氧化能力和神经保护作用，主要体现在以下几个方面 1.抗氧化作用 PQQ能有效调节氧化还原反应。它能抑制1)脂质的过氧化；2)蛋白的羰基化；3)氧化应激对线粒体内呼吸链的失活(Stites TE等，J Nutr. 2000Apr ;130(4) :719-27)
2.神经保护作用
1)改善线粒体的机能；2)抑制NMDA受体介导的神经毒性作用；3)神经元的保护作用；4)上调神经生长因子；及5)抑制纤维样蛋白的形成(Scanlon JM， EurJPharmacol. 1997 May 12 ;326(1) :67-74 ;Urakami T等，Biofactors. 1995-1996，5(3):139-46 ;Liu S等，Microsurgery. 2005 ;25(4) :329-37) 然而，在本发明之前，本领域从未对PQQ活性物质与其它改善记忆和认知能力、预防或治疗老年性退行性神经疾病(尤其是阿尔茨海默病)的组合使用或联合使用做出研允。 ZJ先月日碱鹏翻齐ll 如本文所用，术语"乙酰胆碱酯酶抑制剂"是指对乙酰胆碱酯酶的乙酰胆碱降解活性具有抑制作用的物质，其通过抑制神经键内部乙酰胆碱的降解起到改善记忆、缓解老年痴呆的作用。 本发明中的"乙酰胆碱酯酶抑制剂"包括抑制乙酰胆碱酯酶活性的任何物质，包括但不限于他克林(Tacrine)、多奈哌齐(Don印ezil)、利斯的明(Rivastigmine)、高兰它明(Galantamine)、石杉碱甲(Huperzine A)、香豆素衍生物(例如Anseoulin等)、植物或微生物来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如当归根的甲醇提取物、淡紫灰链霉菌中分离的cyclophostin等)。关于乙酰胆碱酯酶抑制剂的种类和用途，可参见例如邹磊等的综述(食品禾斗学，2005， Vol. 26增刊，ppl05-108)。 乙酰胆碱酯酶抑制剂虽然是目前用于治疗老年痴呆症的主要药物，但其只能缓解AD的征状，而不能完全保护神经元不被破坏。因此，本领域仍然迫切需要提高此类药物效果，甚至可治愈AD的药物组合物。
组合物 本发明提供了一种组合物，其包含(a)吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯；(b)乙酰胆碱酯酶抑制剂；以及(c)药学上或生理学上可接受的载体。
该组合物可用于改善记忆和认知能力、延长对象预期寿命、减少脑内13淀粉样蛋白的产生，从而预防或治疗老年性退行性神经疾病，优选用于预防或治疗老年性痴呆，更优选用于预防或治疗阿尔茨海默病、帕金森病。本发明组合物中，活性成分(a)和(b)存在的
摩尔比为i : ioo-ioo : i，优选i : 1-25 : i，从而相互间起到协同作用。 在本发明的一个优选实施方式中，本发明的组合物中还优选含有辅酶Q10。本发明人通过试验证实了辅酶Q10可进一步增强本发明含PQQ和ChEI的组合物在改善记忆和认知能力、延长对象预期寿命、减少脑内P淀粉样蛋白中的效果。组合物中，PQQ与辅酶Q10
的摩尔比为i : 100-25 : i，更优选i : 25-1 : 5。 如本文所用，术语"药学上或生理学上可接受的载体"指用于保健品或药物制剂
的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有或没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。例如，药学上可接受的载体
详细记载于《雷明顿药物科学》(Remington' sPharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co.，N. J. 1991)。 在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解齐IJ、润滑齐IJ、助流齐IJ、泡腾齐IJ、润湿剂或乳化剂、矫味剂、PH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。 本发明的组合物中活性物质(a)和(b)占组合物总重量的0. 001-99. 9wt% ;优选为组合物总重量的l-95wt^，较优选为5-90wt^，更优选10-80wt%。余量为载体以及其它添加剂等物质。 在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型。如本文所用，
术语"单位剂型"是指为了服用或使用方便，将本发明的组合物制备成单次服用或使用所需
的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。 在本发明的另一个优选例中，每天施用1-6剂本发明的组合物，优选施用1-3剂；
在高剂量时优选每天服用1齐U。在本发明的一个优选例中，每天给对象施用0. 001-10mg/kg
体重的本发明组合物，优选0. 01-5mg/kg体重，更优选0. 01-lmg/kg体重。 应理解，所用活性物质的有效剂量可随需预防或治疗的对象的个体情况(例如对
象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。 本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液、溶液剂或糖浆剂)或其它合适的形式。
総gg備^ 本发明还提供了一种药盒或保健盒，其中含有(A)装有有效量吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯的容器；和(B)装有有效量乙酰胆碱酯酶抑制剂的容器。所述药盒或保健盒用于改善记忆和认知能力、延长对象预期寿命、减少脑内P淀粉样蛋白的产生，从而预防或治疗老年性退行性神经疾病，优选用于预防或治疗老年性痴呆。
如本文所用，术语"保健盒"是指装有可对对象提供具有保健作用的活性物质的容器的组合，其可作为保健品提供给需要的对象。 在本发明的实施方式中，在给予吡咯并喹啉醌之前、之后或同时给予有效量的乙
酰胆碱酯酶抑制剂。 施用方式 本发明的组合物、药盒或保健盒可以通过常规途径施用，其中包括(但并不限于)口服、喷涂、鼻腔内、或透皮等途径。优选口服。组合物形式应与施用方式相匹配。本
发明组合物的施用量，按活性物质PQQ重量计，通常为每天约0. 001-5mgPQQ/kg体重，较佳地约0. 01-lPQQ/kg体重，优选0. 01-0. 5mgPQQ/kg体重。 本发明的组合物、药盒或保健盒可直接使用，也可与其它治疗剂或辅剂联合使用。
在本发明的优选实施方式中，在用于预防和治疗老年性痴呆中时，本发明的组合物、药盒
或保健盒还可与有效量(如0. 0005-0. 1克/kg体重/天；优选0. 001-0. 05克/kg体重/
天)的选自下组的物质联合施用M-胆碱受体激动剂、抗氧化剂、非甾体抗炎药、神经营养
因子、抗神经细胞凋亡剂、促神经细胞代谢药、钙通道阻滞剂、抗淀粉样肽形成药、代谢增强
剂、细胞膜调节剂、脑活素、谷氨酸盐受体拮抗剂，更优选谷氨酸盐受体拮抗剂。 当三种或三种以上的物质组合或联合给药时，优选具有优于分别单独给予这些物
质的效果。本发明的优点 本发明的优点包括但不限于
(a)首次发现了 PQQ与乙酰胆碱酯酶抑制剂的联合使用或组合使用对于改善记忆和认知能力、延长对象预期寿命、减少脑内P淀粉样蛋白的产生，从而预防或治疗老年性退行性神经疾病具有协同作用，可用于相关疾病或征状的预防或治疗； (b)PQQ在生物体内存在，是天然的化合物，无毒副作用；而乙酰胆碱酯酶抑制剂
是本领域中已用于老年性痴呆症治疗的现有药物，两者的组合具有高安全性； (c) PQQ的添加还可补充了体内的内源性吡咯并喹啉醌，缓解了体内因吡咯并喹啉
醌的缺乏所引起的症状。 实施例 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
Morris水迷宫试验 Morris水迷宫是1981年由比利时科学家Morris发明的，是用来检测啮齿动物空间学习记忆能力的比较理想的实验系统。实验中的记忆相当于人类的近期记忆，在AD患者中这种近期记忆损害更严重。本实验采用Morris水迷宫了解治疗对大鼠或小鼠动物模型学习记忆能力的影响，实验动物逃避潜伏期縮短说明其学习记忆障碍改善。
设计特制的水迷宫主要由一个圆柱型水池和一个可移动位置的站台组成。水池高70cm，直径80cm，站台直径8cm，水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连接。预先在水池中注入清水，水深15cm，加入碳素墨水使池水变为不透明的黑色，站台表面为黑色，使实验动物不能看到，水面高出站台表面0. 5cm。水温控制在22±0. 5°C ，在水池上标定相同一点作为每次实验动物的入水点。站台置于离入水点较远的象限中间，实验过程保持站台位置不变。每次实验以120s为限，纪录动物从入水点到达站台所需时间以及在这段时间内的游泳路程和速度，以所需时间作为学习和记忆成绩，若设定时间内未找到站台，计算机停止跟踪，记录时间为120s。 每次实验在隔音的房间内进行，水池，光源，鼠笼等实验室各物件的位置保持不变。造模后第3天训练，若动物在120s内找到站台，让其在站台上停留20s，若动物未找到站台，将其放在站台上使其停留20s。于造模第4天，第5天，第7天，第11天进行MORRIS水迷宫学习和测试。 实施例1.吡咯并喹啉醌(PQQ)对大鼠认知和记忆能力水平的影响
试验动物及分组 4周龄的Wistar大鼠(购自中科院动物所)，共60只，平均分为5组，每组12只，雌雄各半。 给药方法和剂量 按照如下的设定剂量，对分组的大鼠口服给药8周(每日2次)
组1 :对照给予生理盐水；
10:0129] 组2 :PQQ 3. 3mg/kg/d(通过PQQ的生理盐水溶液形式给药)；
:0130] 组3 :PQQ 5. 0mg/kg/d (通过PQQ的生理盐水溶液形式给药)；
:0131] 组4 :PQQ 10mg/kg/d(通过PQQ的生理盐水溶液形式给药)；
:0132] 组5 :PQQ 20mg/kg/d(通过PQQ的生理盐水溶液形式给药)。
:0133] 评估方法
:0134] 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，建立痴呆大鼠模型。采用Morris水迷宫试验 重复3次)，检测PQQ对大鼠认知和记忆能力水平的影响。
:0135] 试验结果及讨论
:0136] 各组大鼠的记忆保持百分比数值如图1所示。
:0137] 试验结果显示3. 3mg/kg/d的PQQ仅使得大鼠记忆保持有微弱提高，随着PQQ剂 量的提高，记忆保持百分比逐步提高，20mg/kg/d的PQQ可使得大鼠记忆保持提高到 上。
:0138]
依赖性-
该试验结果表明PQQ可提高大鼠的认知和记忆能力水平，该提高作用具有剂:
x司(取胶囊内容物溶于生理
:0139] 輔你l 2. ZJ先,酉旨,制剂石纏附杖鼠认船口iP雄力餅白條卩向 0140] 试验动物、分组及药物
0141] 4周龄的Wistar大鼠(购自中科院动物所)，共60只，平均分为5组，每组12只， 雌雄各半。
0142] 石杉碱甲石杉碱甲胶囊，购自复旦复华药业有限公 盐水进行实验)。 0143] 给药方法和剂量
按照如下的设定剂量，对分组的大鼠口服给药8周(每日2次) 组1 :对照给予生理盐水；
组2 :ChEI0. lmg/kg/d(以石杉碱甲的生理盐水溶液形式给药)
组3 :ChEI 0. 2mg/kg/d(以石杉碱甲的生理盐水溶液形式给药) 组4 :ChEI 0. 5mg/kg/d(以石杉碱甲的生理盐水溶液形式给药) 组5 :ChEI 1. Omg/kg/d(以石杉碱甲的生理盐水溶液形式给药)
0144] 0145] 0146] 0147] 0148] 0149] 0150] 0151]
评估方法
大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，建立痴呆大鼠模型。采用Morris水迷宫试验 重复次数3次)，检测ChEI对大鼠认知和记忆能力水平的影响。 0152] 试验结果及讨论
0153] 各组大鼠的记忆保持百分比数值如图2所示。
0154] 试验结果显示0. lmg/kg/d的ChEI可使得大鼠记忆保持水平略有提高，随着ChEI 剂量的提高，记忆保持百分比逐步提高，1. Omg/kg/d的ChEI可使得大鼠记忆保持提高到 60%。
0155] 该试验结果表明ChEI可提高大鼠的认知和记忆能力水平，该提高作用具有剂量 农赖性。
0156] 实施例3.吡咯并喹啉醌(PQQ)与乙酰胆碱酯酶抑制剂(ChEI)石杉碱甲的组合或 i亥飽合与辅酶Q10(CoQ10)的飽合对大鼠认知和记忆能力水平的影响
110157] 试验动物及分组
0158] 4周龄的Wistar大鼠(购自中科院动物所)，共60只，平均分为5组，每组12只， 雌雄各半。 0159] 给药方法和剂量
0160] 按照如下的设定剂量，对分组的大鼠口服给药8周(每日2次) 0161] 组l:对照给予生理盐水；
0162] 组2 :PQQ3. 3mg/kg/d(以生理盐水溶液形式给药)； 0163] 组3 :ChEI 0. 2mg/kg/d(以生理盐水溶液形式给药)； 0164] 组4 :PQQ3. 3mg/kg/d+ChEI 0. 2mg/kg/d(以生理盐水溶液形式给药)； 0165] 组5:PQQ 3. 3mg/kg/d+ChEI 0. 2mg/kg/d+CoQ10 100mg/kg/d(以生理盐水溶液 形式给药)。 0166] 评估方法
0167] 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，建立痴呆大鼠模型。采用Morris水迷宫试验 重复次数3次)，检测上述给药对大鼠认知和记忆能力水平的影响。 0168] 试验结果及讨论
0169] 各组大鼠的记忆保持百分比数值如图3所示。
0170] 图3的结果显示采用低剂量的PQQ (3. 3mg/kg/d)与ChEI (0. 2mg/kg/d)的联合给 药即可使得大鼠的记忆保持水平显著提高到60%以上。而在低剂量PQQ与ChEI组合的基 础上，再加入CoQlO更可使得大鼠记忆保持水平达到约80%。
0171] 按照金氏公式计算药物之间的协同作用，发现联合使用PQQ和ChEI较分别单独使 用PQQ或ChEI可显著提高大鼠的记忆保持水平，且两种药物之间具有协同作用 0172] 金式公式判断药物之间的协同效果(参考文献金正均，合并用药中的相加。中国
药理学报1980 ;1 :70-76):
0173] q值二 EA+B/(EA+EB-EAXEB)， q值〉1. 15时，两药有协同作用。
0174] 在本实施例中，E值为与对照组(1)相比，各实验组(2、3、4)记忆保持能力的增 加百分比。
0175]E(PQQ 3.3mg/kg) = (43. 13% -37. 00% ) /37. 00% = 16. 57% 0176]E(chEI 02mg/kg) = (44. 00% -37. 00% )/37. 00%= 18. 92% 0177]E(PQQ+chEI) = (64. 00% -37. 00% ) /37. 00% = 72. 97%
0178] q值二 72. 97% /(16. 57% +18. 92% —16. 57% X 18. 92% ) = 2. 255 > 1. 15
0179] 上述结果表明PQQ与ChEI的联用可显著提高大鼠的认知和记忆能力水平，且两 种活性成分具有协同作用。在该组合中进一步加入CoQlO(主要为抗氧化的作用)，则可进 一步显著提高保持记忆的效果。
0180] 并且，由于PQQ以及ChEI提高大鼠的认知和记忆能力水平的作用具有剂量依赖性 参见实施例1和实施例2的结果)，可合理预期联合使用比本实施例中所用PQQ和ChEI 组合中的浓度更高的PQQ与ChEI可获得更佳的效果。
0181] 实施例4.吡咯并喹啉醌(PQQ)对AD模型小鼠老年痴呆形成时间的影响 0182] 试验动物及分组
0183] APP转基因小鼠模型能够较好地模拟老年痴呆的疾病进程，APP转基因小鼠在3月
12龄时水迷宫实验与对照组(C57BL/6J小鼠)比较有统计学意义(P < 0. 01)，且随着时间的 延长，APP转基因小鼠行为缺陷日渐明显，该现象符合由轻度认知损害向老年痴呆发展的规 律。而在APP转基因小鼠中使用相关药物治疗，显著改善小鼠的记忆能力，有助于延缓疾病 进程。 4月龄APP转基因小鼠(AD模型小鼠，购自中科院上海药物所)共30只，平均分为
5组，每组6只，雌雄各半。 给药方法和剂量
按照如下的设定剂量，对分组的小鼠口服给药8周(每日2次) 组1 :对照给予生理盐水；
组2 :PQQ3. 3mg/kg/d (以PQQ的生理盐水溶液形式给药)； 组3 :PQQ5. Omg/kg/d (以PQQ的生理盐水溶液形式给药)； 组4 :PQQ 10mg/kg/d (以PQQ的生理盐水溶液形式给药)； 组5 :PQQ20mg/kg/d (以PQQ的生理盐水溶液形式给药)。
的影响
评估方法
采用Morris水迷宫试验(重复次数3次)，检测AD模型小鼠认知和记忆能力水平 记忆能力的逐渐丧失是老年痴呆最早也是时间最长的病程，在此过程中患者记忆 能力逐渐降低，如能延缓记忆能力降低，延长记忆保持时间，则对于延缓老年痴呆的发病， 预防和治疗老年痴呆具有良好的效果。
试验结果及讨论 各组小鼠的记忆保持百分比数值如图4所示。 试验结果显示低、中剂量(3. 3、5、10mg/kg/d)的PQQ使得AD模型小鼠记忆保持
水平逐步，而20mg/kg/d的高剂量PQQ可使得大鼠记忆保持提高到接近60% 。 该试验结果表明PQQ可提高老年痴呆模型小鼠的认知和记忆能力水平，并且，该
提高作用具有剂量依赖性。 实施例5.乙酰胆碱酯酶抑制剂(ChEI，石杉碱甲)对AD模型小鼠老年痴呆形成时 间的影响 试验动物及分组 4月龄APP转基因小鼠(AD模型小鼠，购自中科院上海药物所)共30只，平均分为
5组，每组6只，雌雄各半。 给药方法和剂量
按照如下的设定剂量，对分组的小鼠口服给药8周(每日2次) 组1 :对照给予生理盐水；
0. lmg/kg/d(以生理盐水形式给药) 0. 2mg/kg/d(以生理盐水形式给药)
0. 5mg/kg/d(以生理盐水形式给药)
1. Omg/kg/d(以生理盐水形式给药)
组2 :ChEI 组3 :ChEI 组4 :ChEI 组5 :ChEI
评估方法
采用Morris水迷宫试验(重复3次)，检测AD模型小鼠认知和记忆能力水平的影
响。记忆能力的逐渐丧失是老年痴呆最早也是时间最长的病程，在此过程中患者记忆能力逐渐降低，如能延缓记忆能力降低，延长记忆保持时间，则对于延缓老年痴呆的发病，预防 和治疗老年痴呆具有良好的效果。 按照金氏公式计算药物之间的协同作用 E值与对照组(1)相比各实验组(2、3、4)记忆保持能力的增加百分比。
E(PQQ 3.3mg/kg) = (36. 00% -27. 00% ) /27. 00% = 33. 33%
E(chEI 02mg/kg) = (36. 00% -27. 00% )/27. 00%= 33. 33%
E(PQQ+chEI) = (58. 00% —27. 00% )/27. 00%= 114. 81% q值二 114. 81% /(33. 33% +33. 33% —33. 33% X33. 33% ) = 2. 067 > 1. 15(提 示二者为协同作用) 上述结果表明PQQ与ChEI的联用可显著提高AD模型小鼠的认知和记忆能力水 平，且两种活性成分具有协同作用。在该组合中进一步加入CoQlO (抗氧化作用)，则可进一 步显著提高保持记忆的效果，从而延迟老年痴呆的形成时间。
并且，由于PQQ以及ChEI提高AD模型小鼠的认知和记忆能力水平的作用具有剂 量依赖性(参见实施例4和实施例5的结果)，可合理预期联合使用比本实施例中所用PQQ 和ChEI组合中的浓度更高的PQQ与ChEI可获得更佳的效果。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
权利要求
一种组合物，其包含(a)吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯；(b)乙酰胆碱酯酶抑制剂；以及(c)药学上或生理学上可接受的载体，其中，组分(a)和组分(b)的摩尔比为1∶100～100∶1。
2. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物是药物组合物或保健组合物。
3. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于改善记忆和认知能力。
4. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于预防或治疗老年性退行性神经疾病，特别是老年痴呆。
5. 如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述组分(b)乙酰胆碱酯酶抑制剂为选自下组中的一种或多种石杉碱甲、他克林或其盐、多奈哌齐、毒扁豆碱氨基甲酸酯或氢溴化加兰他敏。
6. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还含有辅酶Q10。
7. —种制备组合物的方法，所述方法包括将组分(a)、 (b)和(c)混合在一起，制得组 合物的步骤，其中(a) 吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯；(b) 乙酰胆碱酯酶抑制剂；(C)药学上或生理学上可接受的载体，其中，组分(a)和组分(b)的摩尔比为i : ioo ioo : i.
8. —种药盒或保健盒，其包含(A) 装有有效量吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯的容器；禾口(B) 装有有效量乙酰胆碱酯酶抑制剂的容器。
9. 一种制备药盒或保健盒的方法，所述方法包括(I) 将有效量的吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯装入第一容器内；(II) 将有效量乙酰胆碱酯酶抑制剂装入第二容器内；禾口(III) 将第一容器和第二容器置于同一外包装中，形成药盒或保健盒。
10. 吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐或酯和乙酰胆碱酯酶抑制剂在用 于制备改善记忆和认知能力的组合物、药盒或保健盒中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种预防和治疗老年痴呆症的组合物。具体而言，本发明提供了一种可用于改善记忆和认知能力的组合物，其包含(a)吡咯并喹啉醌、其药学上或生理学上可接受的盐和/或酯；(b)乙酰胆碱酯酶抑制剂；以及(c)药学上或生理学上可接受的载体，其中组分(a)和组分(b)的摩尔比为1∶100～100∶1。本发明还提供了制备本发明组合物的方法、该组合物的用途及含该组合物的试剂盒或药盒及其制备方法。本发明的组合物可用于有效、安全地改善记忆和认知能力，优选用于预防或治疗老年性退行性神经疾病。
文档编号A61K31/122GK101757624SQ200910200639
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者周蕾, 恽小婧, 顾建新 申请人:上海医学生命科学研究中心有限公司