专利名称：一种超分子水凝胶基因载体材料及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种可用做基因载体的超分子水凝
胶及其制备方法和应用。
背景技术：
基因治疗是目前用于癌症以及先天性免疫系统疾病治疗的一种有效方法。该技 术实施的关键是选择合适的基因载体及基因导入方法，进而使基因能够在细胞中获得安 全、高效、可控且稳定的表达。水凝胶作为一类可用作药物载体的生物医用材料，具有负载 率高、可保护大分子药物免受生物体的降解或清除、以及对药物分子的可持续释放等特性， 近年来已被研究用于基因的负载和控释。例如，Park等以双键修饰的聚乙二醇-聚丙二 醇-聚乙二醇(Pluronic)三嵌段聚合物和透明质酸为原料，通过紫外光聚合将DNA原位包 埋于水凝胶基质中，通过调节光照时间和透明质酸的用量可调控凝胶的强度和DNA的释放 速率(Biomaterials 2005,26:3319-3326)。 Kasper等以聚乙二醇修饰的延胡索酸酯为原 料、N， N'-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过自由基聚合制备得到一类化学凝胶，该类凝 胶通过溶胀作用负载基因，DNA的释放速率可通过聚乙二醇分子量的改变来调节(Journal of Controlled Release2005， 104 :521-539) 。 Shea等则通过光聚合反应，将DNA/PEI (聚 乙烯基亚胺)复合物包埋于由双键修饰的聚乙二醇与透明质酸形成的水凝胶基质中，并通 过改变原料配比调节凝胶强度和DNA的释放速率(Journal of ControlledRelease 2007， 120 :233-241)。然而，这些水凝胶基因载体的形成通常离不开高温、化学交联剂或光引发剂 的使用，不利于保持被包埋基因的生物活性以及材料的生物相容性。因此，如何在温和条件 下构建生物兼容性良好的水凝胶基因载体材料，便成为当前生物医学工程领域亟待解决的 重要课题。 迄今为止，通过聚合物与环糊精的主客体相互作用原位负载基因的超分子水凝胶 及其应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目在于克服现有技术的缺点，提供一种超分子水凝胶基因载体材料的制 备方法；本发明以环糊精为主体、通过主客体组装作用制备可用做基因载体的超分子结构 水凝胶；该凝胶制备条件温和、对温度和浓度要求较低、溶胶_凝胶可逆；凝胶强度可通过 聚合物浓度或者环糊精浓度来调节，操作方便，可作为一类新型的可注射凝胶应用于大分 子药物的负载和释放。 本发明的另一 目的在于提供一种由上述方法制备的超分子水凝胶基因载体材料。
本发明的再一 目的在于提供上述超分子水凝胶基因载体材料在生物医学材料工 程领域的应用。 本发明的目的通过下述技术方案实现一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方 法，包括以下操作步骤
(1)聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸(Pluronic-PLL)多嵌段聚合物的 合成 a、将聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(Pluronic)三嵌段共聚物溶于二氯甲烷与 吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应；反应结束后，反应液用等 体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤；蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二 醇_聚丙二醇_聚乙二醇_对甲苯磺酸酯； b、将聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-对甲苯磺酸酯的氨水溶液置于耐压容器
中，于70 8(TC条件下进行反应，冷却至室温，用等体积的二氯甲烷进行萃取，所得有机相 与等体积的氢氧化钠溶液混合，搅拌，分离，将所得有机层洗至中性，蒸发除去二氯甲烷后 得到氨基修饰物聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基聚合物； c、将NE-苄氧羰基L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)溶解于N，N-二甲基甲酰 胺，形成反应介质；在氮气保护下，将聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基的四氢呋喃溶 液滴加到反应介质中，在38 45t:条件下反应48 72小时，蒸干去除四氢呋喃，再用二氯 甲烷溶解，然后用乙醚沉淀，得到氨基被保护的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚赖 氨酸多嵌段聚合物； d、将聚乙二醇-聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚赖氨酸多嵌段聚合物溶于溴化氢 乙酸溶液中，得到质量百分比浓度为10 20%的溶液，继续搅拌至出现沉淀；静置，将上 层清液倒去；将所得沉淀透析，冷冻干燥，得到聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸 (Pluronic-PLL)多嵌段聚合物； (2)将质量体积比浓度为0. 5 ii g/ ii L的核酸溶液；加入到1. 0mL质量百分比浓度 为8 20% (w/w)的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物溶液中，混 合均匀，室温条件下静置，得到核酸的质量体积比浓度为5 50ii g/mL的聚合物/核酸复 合物溶液； (3)向步骤(2)所得的聚合物/核酸复合物溶液中加入1. 0mL质量百分比浓度为 10 20%的a -环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体 材料。 步骤a所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物的分子量为6000 15000，其中乙二醇单元占乙二醇单元和丙二醇单元总数的57% 85%。
步骤a所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物与对甲基苯磺酰氯的摩 尔比为l : 2;所述二氯甲烷与吡啶的体积比为2 : l，所述二氯甲烷与吡啶的混合溶液中 每100毫升混合溶液含有5 15克聚乙二醇-聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物；所述氯 化氢溶液的摩尔浓度为3mol/L ;所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中 加入3 5克；所述避光反应的时间为24 36小时。 步骤b所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_对甲苯磺酸酯的氨水溶液是将聚乙 二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_对甲苯磺酸酯溶于浓氨水中形成质量百分比浓度为5 20% 的溶液，所述浓氨水的质量百分比浓度为25% ;所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为lmol/L ; 所述反应的时间为16 24小时；所述搅拌为磁力搅拌，转速为600 1200转/分钟，搅拌 的时间为2 4h ;所述洗至中性是用水洗至中性。 步骤c所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基与『-苄氧羰基L-赖氨酸-N-羧酸酐的摩尔比为1 : 20 1 : 40 ;所述N，N-二甲基甲酰胺与四氢呋喃的体积比 为2 : 1 ;所述NE-苄氧羰基L-赖氨酸-N-羧酸酐溶解于N， N-二甲基甲酰胺形成质量体 积比浓度为0. 05 0. lg/ml ;所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基的四氢呋喃溶液 的质量体积比浓度为0. 05 0. lg/ml ;所述沉淀是用3 5倍二氯甲烷体积的乙醚进行沉 淀。 步骤d所述搅拌为磁力搅拌，转速为600 1200转/分钟，搅拌的时间为30 60 分钟；所述静置的时间为20 60分钟；所述透析的时间为3天；步骤(1) (3)所述室温 为5 35°C。 步骤(2)所述核酸为核糖核酸或脱氧核糖核酸；所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙 二醇_聚赖氨酸多嵌段聚合物溶液是将聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物溶解 在水或磷酸盐缓冲溶液中；所述静置的时间为15 30分钟。 步骤(3)所述a -环糊精溶液是将a -环糊精溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中；所 述静置的时间为6 12小时。 —种根据上述方法制备的超分子水凝胶基因载体材料。 上述的超分子水凝胶基因载体材料应用于制备可注射药物载体或可注射基因载 体。 所述聚乙二醇-聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物可选用工业化的Pluronic系
列，常见的Pluronic型号包括F-68 (E076_P029-E076) 、 F-127 (EO^-PC^-EO,)等。 本发明的原理是聚合物Pluronic为一类聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌
段聚合物的商品名，具有良好的生物兼容性，是少数被美国FDA批准可作为药品和食品添
加剂的合成化合物之一。本发明首先利用开环聚合，合成出聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二
醇-聚赖氨酸(Pluronic-PLL)多嵌段共聚物，此聚合物通过聚赖氨酸链段与核酸的静电相
互作用，在溶剂中形成稳定的纳米复合物；然后再通过Pluronic-PLL共聚物与a _环糊精
的主客体组装相互作用，进一步得到了原位包埋基因的超分子结构水凝胶，聚合物在凝胶
体系中起着基因负载和作为凝胶基质的双重作用。水凝胶形成的主要作用力为环糊精组装
之后的结晶作用和聚丙二醇链段的疏水作用力。 本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果 (1)凝胶制备方便快捷，可在室温下成型，条件温和，对浓度及温度要求较低；
(2)凝胶的形成过程不存在化学反应，有效地避免了化学反应及反应副产物对 DNA活性的影响； (3)凝胶的强度和凝胶化时间可通过聚合物浓度、环糊精浓度来调控，随着聚合物 或者环糊精浓度的增加，凝胶的弹性模量增加，凝胶化时间縮短； (4)聚合物在体系中起着DNA载体和凝胶基质的双重作用，可简化凝胶配方，节省 成本； (5)物理凝胶随着生物体中液体介质的不断冲刷溶蚀，会逐渐松散直至完全溶解， 可以达到对DNA的100%的释放率； (6)作为凝胶基质的Pluronic-PLL聚合物与DNA存在静电相互作用，有利于凝胶 对DNA的控释进行调节； (7)超分子凝胶存在温度敏感性，在32C左右(体温以下)实现模量突变，有利于其作为可注射基因载体。 (8)本发明水凝胶成分简单，生物兼容性好，转染效果明显，具备良好的剪切变稀 的特性，应用方便快捷，有望作为可注射的药物载体广泛应用于生物医学工程材料领域。
图l为聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物的核磁氢谱谱图。
图2为超分子凝胶的广角X射线衍射图谱图，其中曲线1为a -环糊精，曲线2为 多嵌段聚合物A，曲线3为超分子水凝胶基因载体材料C
图3为超分子凝胶的模量随温度变化曲线图。 图4为DNA琼脂糖凝胶阻滞实验结果图，其中1为超分子水凝胶基因载体材料B， 2为超分子水凝胶基因载体材料C， 3为超分子水凝胶基因载体材料D， 4为质粒pEGFP。
图5为超分子凝胶对大鼠成纤维细胞的转染效率数据图，其中1为阳性对照组，2 为新配置的聚合物/pEGFP复合物，3为超分子水凝胶基因载体材料C在第12小时的释放 物，4为超分子水凝胶基因载体材料C在第24小时的释放物，5为超分子水凝胶基因载体材 料C在第48小时的释放物。 图6为超分子水凝胶基因载体材料C在第24小时的释放液实施转染后的细胞的 荧光照片图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。 实施例1 a、将干燥好的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物Pluronic F-127溶 于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，然后加入对甲基苯磺酰氯，35t:室温条件下避光反应24 小时；所述的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为 1 : 2，溶剂二氯甲烷与吡啶的体积比为2 : 1，每100毫升混合溶液中含有15克Pluronic F-127 ;反应结束后，反应液用等体积的3mol/L氯化氢溶液萃取，有机层用碳酸氢钠(碳酸 氢钠的加入量以每100毫升有机相中加入3克)洗涤、过滤；蒸发除去二氯甲烷，得到聚乙 二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_对甲苯磺酸酯； b、将上述产物聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-对甲苯磺酸酯的氨水溶液(聚乙 二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_对甲苯磺酸酯溶于浓氨水中形成质量百分比浓度为5%的溶 液，所述浓氨水的质量百分比浓度为25% )置于耐压容器中，于7(TC条件下反应24小时， 冷却至室温25t:，用等体积的二氯甲烷萃取，有机相溶液与等体积lmol/L氢氧化钠溶液磁 力搅拌(转速为600转/分钟)2h，有机层用水洗至中性，蒸干除去二氯甲烷后得到氨基修 饰物聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基； c、将NE-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)溶解于N，N-二甲基甲酰 胺，形成反应介质；在氮气保护下，将溶有聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-NH2的四氢呋喃 溶液滴加到反应介质中，在4(TC条件下反应72小时；所述的聚合物与单体Lys(Z)-NCA的 摩尔比为l : 20， N， N-二甲基甲酰胺与四氢呋喃的体积比为2 : 1，每100毫升溶剂中含
7有10克原料；反应结束后，蒸干去除四氢呋喃，产物用二氯甲烷溶解，然后用3倍二氯甲烷 体积的乙醚沉淀，得到氨基被保护的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚赖氨酸多嵌 段聚合物； 所述NE -苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐按以下步骤制备得到将NE -苄氧羰 基-L-赖氨酸(购自GL生化(上海)有限公司，纯度> 98% )在搅拌条件下加到四氢呋喃 中，在氩气保护下加热至40°C ，得到质量体积比为0. 06g/mL的NE -苄氧羰基_L_赖氨酸分 散液；将固体光气(购自GL生化(上海)有限公司，纯度>99%)溶解于四氢呋喃中配成 质量浓度为6%的溶液后，逐滴加入到NE -苄氧羰基-L-赖氨酸分散液中，所述NE -苄氧羰 基-L-赖氨酸与固体光气的摩尔比为2.5 : 1 ;当反应体系开始透明时，用干燥的氩气将反 应生成的氯化氢气体鼓出，30分钟后反应结束，蒸发除去四氢呋喃，得到无色油状物质；将 所述无色油状物质用四氢呋喃溶解，得到溶液(质量浓度为10% -20% )，然后加入3倍溶 液体积的石油醚进行沉淀，过滤，室温下真空干燥，得到NE -苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸 酐； d、将聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚赖氨酸多嵌段聚合物溶于溴化氢乙 酸溶液中，得到质量百分比浓度为10%的溶液，继续磁力搅拌(转速为600转/分钟)60分 钟出现沉淀现象；静置20分钟后，将上层清液倒去；将所得沉淀透析3天，冷冻干燥，得到 聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸(Pluronic-PLL)多嵌段聚合物。
实施例2 a、将干燥好的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物Pluronic F-68溶 于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，然后加入对甲基苯磺酰氯，15t:室温条件下避光反应36 小时；所述的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为 1 : 2，溶剂二氯甲烷与吡啶的体积比为2 : 1，每100毫升混合溶液中含有5克Pluronic F-68 ;反应结束后，反应液用等体积的3mol/L氯化氢溶液萃取，有机层用碳酸氢钠(碳酸氢 钠的加入量以每100毫升有机相中加入5克)洗涤、过滤；蒸发除去二氯甲烷，得到聚乙二 醇_聚丙二醇_聚乙二醇_对甲苯磺酸酯； b、将上述产物聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-对甲苯磺酸酯的氨水溶液(聚乙 二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_对甲苯磺酸酯溶于浓氨水中形成质量百分比浓度为20 %的溶 液，所述浓氨水的质量百分比浓度为25% )置于耐压容器中，于8(TC条件下反应16小时， 冷却至室温35t:，用等体积的二氯甲烷萃取，有机相溶液与等体积lmol/L氢氧化钠溶液磁 力搅拌(转速为1200转/分钟)4h，有机层用水洗至中性，蒸干除去二氯甲烷后得到氨基修 饰物聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_氨基； c、将NE-苄氧羰基L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)溶解于N，N-二甲基甲酰 胺，形成反应介质；在氮气保护下，将溶有聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-NH2的四氢呋喃 溶液滴加到反应介质中，在45t:条件下反应48小时；所述的聚合物与单体Lys(Z)-NCA的 摩尔比为l : 40， N， N-二甲基甲酰胺与四氢呋喃的体积比为2 : 1，每100毫升溶剂中含 有5克原料；反应结束后，蒸干去除四氢呋喃，产物用二氯甲烷溶解，然后用5倍二氯甲烷体 积的乙醚沉淀，得到氨基被保护的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-Boc-聚赖氨酸多嵌段 聚合物； 所述NE -苄氧羰基L-赖氨酸-N-羧酸酐按以下步骤制备得到将NE -苄氧羰基L-赖氨酸(购自GL生化(上海)有限公司，纯度>98%)在搅拌条件下加到四氢呋喃中， 在氩气保护下加热至40°C ，得到质量体积比为0. 02g/mL的NE -苄氧羰基L_赖氨酸分散液； 将固体光气(购自GL生化(上海)有限公司，纯度>99%)溶解于四氢呋喃中配成质量浓 度为15 %的溶液后，逐滴加入到NE -苄氧羰基L-赖氨酸分散液中，所述NE -苄氧羰基L-赖 氨酸与固体光气的摩尔比为2.5 : 1 ;当反应体系开始透明时，用干燥的氩气将反应生成的 氯化氢气体鼓出，60分钟后反应结束，蒸发除去四氢呋喃，得到无色油状物质；将所述无色 油状物质用四氢呋喃溶解，得到溶液(质量浓度为10% -20% )，然后加入3倍溶液体积的 石油醚进行沉淀，过滤，室温下真空干燥，得到NE -苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐；
d、将聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇-Boc-聚赖氨酸多嵌段聚合物溶于溴化氢乙 酸溶液中，得到质量百分比浓度为20 %的溶液，继续磁力搅拌(转速为600转/分钟)30分 钟出现沉淀现象；静置60分钟后，将上层清液倒去；将所得沉淀透析3天，冷冻干燥，得到 聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸(Pluronic-PLL)多嵌段聚合物A。
实施例3 (1)在室温25t:下，将实施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨 酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为8X (w/w)的水溶液，然后向其中加入浓度为 20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混 合均匀后静置20分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为 15%的a -环糊精水溶液，搅拌混合均匀，室温下静置6小时，得到超分子水凝胶基因载体 材料B。 实施例4 (1)在室温25t:下，将实施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨 酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为12% (w/w)的水溶液，然后向其中加入浓度为 20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混 合均匀后静置20分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为 15%的a -环糊精水溶液，搅拌混合均匀，室温下静置6小时，得到超分子水凝胶基因载体 材料C。 实施例5 (1)在室温25t:下，将实施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨 酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为20X (w/w)的水溶液，然后向其中加入浓度为 20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混 合均匀后静置20分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为 15%的a -环糊精水溶液，搅拌混合均匀，室温下静置6小时，得到超分子水凝胶基因载体 材料D。 实施例6 (1)在室温l(TC下，将实施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨 酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为8X (w/w)的水溶液，然后向其中加入浓度为20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混合均匀后静置15分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为20%的a -环糊精水溶液，搅拌混合均匀，室温下静置12小时，得到超分子水凝胶基因载体材料。 实施例7 (1)在室温35t:下，将实施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为12% (w/w)的水溶液，然后向其中加入浓度为20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混合均匀后静置15分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为10%的a -环糊精水溶液，搅拌混合均匀，室温下静置12小时，得到超分子水凝胶基因载体材料。 实施例8 (1)在室温35t:下，将实施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为12% (w/w)的水溶液，然后向其中加入浓度为100 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混合均匀后静置30分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为15%的a -环糊精水溶液，搅拌混合均匀，室温下静置12小时，得到超分子水凝胶基因载体材料。 实施例9 (1)在室温35t:下，将实施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为12% (w/w)的水溶液，然后向其中加入浓度为10 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混合均匀后静置20分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为15%的a -环糊精水溶液，搅拌混合均匀，室温下静置12小时，得到超分子水凝胶基因载体材料。 实施例10 (1)在室温35t:下，将实施例2得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为12% (w/w)的磷酸盐缓冲溶液，然后向其中加入浓度为20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混合均匀后静置15分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为15%的a -环糊精的磷酸盐缓冲溶液，搅拌混合均匀，室温下静置12小时，得到超分子水凝胶基因载体材料。
实施例11 (1)在室温35t:下，将实施例1得到的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨
10酸多嵌段聚合物配制成lmL质量百分浓度为10% (w/w)的磷酸盐缓冲溶液，然后向其中加入浓度为20 ii L 0. 5 ii g/ ii L的质粒pEGFP溶液(购自Invitrogen公司并用大肠杆菌扩增获得)，混合均匀后静置15分钟，得到聚合物/pEGFP复合物溶液； (2)向步骤(1)所得的聚合物/pEGFP复合物溶液中加入1. OmL质量百分浓度为15%的a -环糊精的磷酸盐缓冲溶液，搅拌混合均匀，室温下静置12小时，得到超分子水凝胶基因载体材料。
实施例12 将实施例2得到的聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_聚赖氨酸多嵌段聚合物(Pluronic-PLL)溶于重水中，进行氢谱核磁表征，结果如图1所示，化学位移出现在4. 22、2. 92、 1. 63和1. 36处的峰对应的是聚赖氨酸上的质子峰；1. 08和3. 62处的质子峰为Pluronic F_68链段上的质子峰。
实施例13 将实施例4得到的超分子水凝胶基因载体材料C进行广角X射线衍射测定，结果如图2所示，曲线1为a _环糊精，曲线2为多嵌段聚合物A，曲线3为超分子水凝胶基因载体材料C。从图2可见，超分子水凝胶基因载体材料C在2e =19.8度处存在明
显的结晶峰，此结晶峰对应于a-环糊精穿到聚合物链上形成的"准多轮烷"的结晶峰(Macromolecules，1990， 23 :2821-2823)。
实施例14 将实施例4得到的超分子水凝胶基因载体材料C进行流变表征，跟踪其模量随温度的变化曲线，并与实施例2得到的多嵌段聚合物A的质量百分浓度为12%的水溶液相对比，结果如图3所示。质量百分浓度为12X的多嵌段聚合物A水溶液在43t:左右才开始出现相转变，而且体系的模量很小，不足以达到凝胶敷料的力学强度。而组装成凝胶之后的超分子水凝胶基因载体材料C的相转变温度约为32t:，而且模量显着提高，有利于其作为可
注射基因载体得到应用。
实施例15 将实例3、4、5所得的超分子水凝胶基因载体材料B、C、D以及质粒pEGFP进行DNA凝胶电泳迁移实验，结果如图4所示。在实验条件的浓度范围内，超分子水凝胶基因载体材料都能与PEGFP形成稳定的复合物，pEGFP不会从电场中迁出(见图4中的1_3);而质粒pEGFP则在电场作用下迁出(见图4中的4)。
实施例16 将实施例4所得的超分子水凝胶基因载体材料C在磷酸盐缓冲溶液PBS环境下进行体外释放实验，其在第12、24和48小时释放出的聚合物/pEGFP复合物的粒径分别为181. 9nm、188. 2nm和177. 2nm。
实施例17 将实施例4所得的超分子水凝胶基因载体材料C在磷酸盐缓冲溶液PBS环境下进行体外释放实验，释放出的聚合物/pEGFP复合物定量后用于对大鼠成纤维细胞(MC3T3)的转染实验，转染效率结果如图5所示，而超分子水凝胶基因载体材料C在第24小时的释放液实施转染后的细胞的荧光照片如图6所示。阳性对照组Lipofectamin-2000/pEGFP表现出较高的转染效率，达到约39% ;而阴性对照裸DNA的转染效率近乎为0% ;超分子水凝胶
11基因载体材料C在第12、24和48小时释放出的聚合物/pEGFP复合物样品的转染效率分别为14%、15%和12%，表现出良好的转染效果。通过与新制备的聚合物/pEGFP复合物胶束的转染效率(18%)比较，可以确定在凝胶的制备、保存以及释放过程中，凝胶以及聚合物对pEGFP的活性起到了良好的保护作用，pEGFP结构的完整性和胶体稳定性得到了较好地保持。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物的合成a、将聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物溶于二氯甲烷与吡啶的混合溶液中，加入对甲基苯磺酰氯，室温条件下避光反应；反应结束后，反应液用等体积的氯化氢溶液进行萃取，有机层用碱进行中和、过滤；蒸发除去二氯甲烷后得到聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-对甲苯磺酸酯；b、将聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-对甲苯磺酸酯的氨水溶液置于耐压容器中，于70～80℃条件下进行反应，冷却至室温，用等体积的二氯甲烷进行萃取，所得有机相与等体积的氢氧化钠溶液混合，搅拌，分离，将所得有机层洗至中性，蒸干除去二氯甲烷后得到氨基修饰物聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基；c、将Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐溶解于N，N-二甲基甲酰胺，形成反应介质；在氮气保护下，将聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基的四氢呋喃溶液滴加到反应介质中，在38～45℃条件下反应48～72小时，蒸干去除四氢呋喃，再用二氯甲烷溶解，然后用乙醚沉淀，得到氨基被保护的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-Boc-聚赖氨酸多嵌段聚合物；d、将聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-Boc-聚赖氨酸多嵌段聚合物溶于溴化氢乙酸溶液中，得到质量百分比浓度为10～20％的溶液，继续搅拌至出现沉淀；静置，将上层清液倒去；将所得沉淀透析，冷冻干燥，得到聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物；(2)将质量体积比浓度为0.5μG/μL的核酸溶液加入到1.0mL质量百分比浓度为8～20％的聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚赖氨酸多嵌段聚合物溶液中，混合均匀，室温条件下静置，得到核酸的质量体积比浓度为5～50μg/mL的聚合物/核酸复合物溶液；(3)向步骤(2)所得的聚合物/核酸序列复合物溶液中加入1.0mL质量百分比浓度为10～20％的α-环糊精溶液，搅拌混合均匀，室温条件下静置，得到超分子水凝胶基因载体材料。
2. 根据权利要求1所述的一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方法，其特征在于 步骤a所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物的分子量为6000 15000，其中 乙二醇单元占乙二醇单元和丙二醇单元总数的57% 85%。
3. 根据权利要求1所述的一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方法，其特征在于 步骤a所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为 1 : 2;所述二氯甲烷与吡啶的体积比为2 : 1，所述二氯甲烷与吡啶的混合溶液中每100毫 升混合溶液含有5 15克聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物；所述氯化氢溶液 的摩尔浓度为3mol/L ;所述碱为碳酸氢钠，所述碱的用量为每100毫升有机相中加入3 5 克；所述避光反应的时间为24 36小时。
4. 根据权利要求1所述的一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方法，其特征在于 步骤b所述聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇_对甲苯磺酸酯的氨水溶液是将聚乙二醇_聚 丙二醇-聚乙二醇-对甲苯磺酸酯溶于浓氨水中形成质量百分比浓度为5 20%的溶液， 所述浓氨水的质量百分比浓度为25% ;所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为lmol/L ;所述反应 的时间为16 24小时；所述搅拌为磁力搅拌，转速为600 1200转/分钟，搅拌的时间为2 4h ;所述洗至中性是用水洗至中性。
5. 根据权利要求1所述的一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方法，其特征在于步骤c所述将NE-苄氧羰基-L-赖氨酸在搅拌条件下加到四氢呋喃中，在氩气保护下加 热至4(TC，得到质量体积比为0. 02 0. 06g/mL的NE-苄氧羰基-L-赖氨酸分散液；将固 体光气溶解于四氢呋喃中配成质量浓度为6% 15%的溶液后，逐滴加入到『-苄氧羰 基-L-赖氨酸分散液中，所述NE-苄氧羰基-L-赖氨酸与固体光气的摩尔比为2.5 : 1; 当反应体系开始透明时，用干燥的氩气将反应生成的氯化氢气体鼓出，30 60分钟后反应 结束，蒸发除去四氢呋喃，得到无色油状物质；将所述无色油状物质用四氢呋喃溶解，得到 溶液，然后加入3倍溶液体积的石油醚进行沉淀，过滤，室温下真空干燥，得到NE -苄氧羰 基-L-赖氨酸-N-羧酸酐；聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基与NE -苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐的摩尔比为i : 20 i : 40 ;所述N，N-二甲基甲酰胺与四氢呋喃的体积比为2 : i ;所述『-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐溶解于N， N- 二甲基甲酰胺形成质量体积比浓度为0. 05 0. lg/ml ;所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-氨基的四氢呋喃溶液的质量体积比浓度为 0. 05 0. lg/ml ;所述沉淀是用3 5倍二氯甲烷体积的乙醚进行沉淀。
6. 根据权利要求1所述的一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方法，其特征在于 步骤d所述搅拌为磁力搅拌，转速为600 1200转/分钟，搅拌的时间为30 60分钟；所 述静置的时间为20 60分钟；所述透析的时间为3天；步骤(1) (3)所述室温为5 35°C。
7. 根据权利要求1所述的一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方法，其特征在于 步骤(2)所述核酸为核糖核酸或脱氧核糖核酸；所述聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚 赖氨酸多嵌段聚合物溶液是将聚乙二醇_聚丙二醇_聚乙二醇三嵌段共聚物溶解在水或磷 酸盐缓冲溶液中；所述静置的时间为15 30分钟。
8. 根据权利要求1所述的一种超分子水凝胶基因载体材料的制备方法，其特征在于 步骤(3)所述a-环糊精溶液是将a-环糊精溶解在水或磷酸盐缓冲溶液中；所述静置的 时间为6 12小时。
9. 一种根据权利要求1 8所述方法制备的超分子水凝胶基因载体材料。
10. 根据权利要求9所述的超分子水凝胶基因载体材料应用于制备可注射药物载体或 可注射基因载体。
全文摘要
本发明公开了一种超分子结构水凝胶基因载体材料及其制备方法和应用。该方法包括以下操作步骤通过对聚赖氨酸修饰聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物端基的修饰，合成出含有阳离子链段的多嵌段聚合物，然后将此聚合物与DNA溶液混合，得到DNA复合物胶束；进一步将此胶束溶液与α-环糊精溶液混合后搅拌，室温下静置，得到水凝胶。该水凝胶可用于制备可注射基因载体。本发明具有操作简单、凝胶强度和凝胶化时间可调、室温成型、不涉及化学交联反应以及有机溶剂的使用、获得的凝胶具备温度敏感性、良好的生物相容性和明显的转染效果等优势，有望在生物医学工程材料领域得到广泛的应用。
文档编号A61K47/34GK101716346SQ200910213939
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者严励, 张宏斌, 张黎明, 李娜, 杨川, 马栋 申请人:中山大学