专利名称：Morphine在制备治疗帕金森病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及Morphine在制备治疗帕金森病的药物中的应用，确切地说涉及 Morphine的医药新用途，属医药技术领域。
背景技术：
吗啡是鸦片中最主要的生物碱，低浓度的吗啡可以保护神经细胞免受缺血再灌注 的损伤。使用吗啡预处理后进行缺血再灌注，神经元存活率得到明显提高。这种保护作 用是通过鸦片受体的激活实现的(Lim， YJ， Zheng， S and Zuo， Z. Morphin印reconditions Purkinje cells against cell death under in vitro simulatedischemiar印erfusion conditions. Anesthesiology 2004 ;100 :562-568)。所以，吗啡对神经元的保护作用可能 对临床医疗有非常积极的作用。然而，吗啡保护神经元免于1 +的作用尚未报道。
MPP+是1-甲基-4-苯基_1，2，3，6-四氢妣啶(l-methyl-4-phenyl-l， 2， 3， 6-tetrahydropyridine， MPTP)经过单胺氧化酶B (MA0-B)催化后生成的具有细胞毒 性的活性代谢产物，它与线粒体复合物-I结合抑制其活性，使细胞线粒体ATP的下 降和膜电位的破坏，最终导致线粒体功能障碍和氧自由基生成增加，细胞凋亡。MPP+ 通常用来做帕金森病的细胞模型，MPP+抑制PC12细胞的生长增殖，诱导细胞凋亡 (Jie Bai， Hajime Nakamura， Shugo Ueda， Yong_Won Kwon， Toru Tanaka， Sadayuki Ban， and Junji YodoiProteasome—dependent Degra_dation of CyclinDl in l_Methyl_4_phenylpyridinium Ion(MPP+)-induced Cell Cycle Arrest. J. Biol. Chem.， 2004 ;279 :38710-38714.)。 硫氧还蛋白(thioredoxin， Trx)是一种普遍存在于原核生物和真核生物中的 小分子蛋白质，它与NAPDH和硫氧还蛋白还原酶共同组成细胞内主要的氧化还原系统。 Trx-1是生物体所必须的基因，如果选择性地敲除小鼠的Trx-l基因，会造成小鼠早期 胚月台至文死(Matsui M. ， Oshima M. ， Oshima H. ， Takaku K. ， Maruyama T. ， Yodoi J. ， and Taketo M. M. Early embryonic lethality caused by targeteddisruption of the mouse thior-edoxin gene. Dev. Biol. 1996， 178 :179-185)。作为细胞内的抗氧化剂，Trx-1能保 护细胞、减轻氧化应激所致的损伤，并且能抑制p38MAPK和凋亡信号调节激酶1活性，增强 细胞的抗凋亡能力(Saito M. ， Nishitoh， H. ， Fujii， M. ， Takeda， K. ， Tobiume， K. ， Sawada， Y. ， Kawabata， M. ， Miyazono， K. ， and Ichijyo， H. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitorof apoptosis signal-regulating kinase(ASK)1. EMBO，1998，17 :2596-2606 ; Hashimoto S. ， Mats咖oto K. ， Gon Y. ， Furuichi S. ， Maruoka S. ， Takeshi ta I.， Hirota K. ， Yodoi J. ， and Horie T.Thioredoxin negatively regulates p38 MAPkinase activation and IL_6 production by tumor necrosis factor—alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999,258 :443-447)。到目前为止，Trx与人类疾病有关的研究很多，Trx具 有保护神经元抑制帕金森病的作用(Thioredoxinsuppresses l-methyl-4-phenylpyri dinium—induced neurotoxicity in rat PC12cells. Bai J， Nakamura H， Hattori I，Lett. 2002Mar 15 ;321(1-2) :81-4.Does thioredoxin-l prevent mitochondria—andendoplasmic reticulum—mediated neurotoxicity of l_methyl_4_phenyl_l，2，3，6—tetrahydropyridine Bai J，Nakamura H，Kwon YW，Tanito M， Ueda S， Tanaka T， Hattori I， Ban S， Momoi T， Kitao Y， Ogawa S， Yodoi J Antioxid RedoxSignal. 20079(5) :603-8)。 迄今为止，现有技术中未见Morphine保护神经元免受MPP+损伤的作用的报道。
发明内容
本发明旨在提供Morphine的医药新用途，则发明一种Morphine在制备治疗帕金 森病的药物中的应用。 本发明的上述目的是用下面的技术方案得以实现的
Morphine在制备治疗帕金森病的药物中的应用。 本发明经四噻唑蓝(MTT)法，发现Morphine能促进大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12 细胞)的生长。Morphine具有促进神经细胞增殖的活性，并且抑制帕金森毒性物MPP+( l-Methyl-4-Phenylpyridinium ion)导致的神经细胞的损伤；蛋白质免疫印迹法表明， Morphine可以诱导PC12细胞中硫氧还蛋白的表达水平。因此，Morphine保护神经细胞免 于MPP+毒性与诱导硫氧还蛋白表达有关。
图1 :四噻唑蓝(MTT)法测定morphine对PC12细胞的存活率的影响； 图2 :四噻唑蓝(MTT)法测定morphine对MPP+剌激的PC12细胞的保护作用； 图3 :Western Blot检测morphine对MPP+剌激的PC12细胞Trx蛋白表达的影响。
具体实施例方式
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本 发明。 实施例1 :把Morphine (Morphine购自沈阳第一制药厂)250mg，溶于1000ml水中 制成0. 25%浓度的水溶液加热溶解，混合均匀后，装入药瓶中密封，消毒制成产品。
实施例2 :把Morphine (Morphine购自沈阳第一制药厂)125mg，溶于1000ml水中 制成0. 125%浓度的水溶液加热溶解，混合均匀后，装入药瓶中密封，消毒制成产品。
实施例3 :把Morphine (Morphine购自沈阳第一制药厂)2500mg，溶于1000ml水中 制成水溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成5mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒制 成产品。 实施例4 :把Morphine (Morphine购自沈阳第一制药厂)1500mg，溶于1000ml水中 制成水溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成3mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒制 成产品。 实施例5 :把Morphine (Morphine购自沈阳第一制药厂)5000mg，溶于1000ml水中 制成水溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成10mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒
4制成产品。 实施例6 :取100克Morphine (Morphine购自沈阳第一制药厂)、560克微晶纤维 素、380克无水乳糖、200克硬脂酸镁、30克氧化硅，按公知的制片技术和装备制成片剂，即 取上述配方中除硬脂酸镁外所有成分混合25-30分钟，再筛入硬脂酸镁，继续混匀，尔后用 12/32英寸(约1. 03cm)标准凹冲压成片。 下面结合附图，用本发明的试验例来证明本发明的药理效果，描述本发明的具 体实验方法，但并不以此来限定本发明，本发明的内容不局限于此。通过下列实验证明 Morphine能促进PC12细胞生长和保护PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤。
下述的试验例所用的试剂、仪器为 细胞用PC12细胞大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，购自中国科学院昆明动物所。
药品及主要试剂 Morphine购自沈阳第一制药厂；MPP+购自美国sigma公司；一抗Anti-mouseTrx， 由日本京都大学淀井溶司教授提供；一抗Anti-mouse P-actin购自santa ;Protein Marker购自Fermentas公司；RPMI Medium 1640购自Invitrogencorporation ;蛋白质 定量试剂盒(BCA法)购自Bio-Rad公司；Chemiluminesentsubstrate购自生物晶美公 司;PVDF膜购自Millipore公司；TRIS Base购自N0V0N公司;Acrylamide购自Solarbio 公司；十二焼基硫酸納购自xiamen sanlandchemicals company limited ;琼月旨糖、考马 斯亮蓝R_250、 Aprotimin、 PMSF禾口 NP_40，均购自Sanland-chem International InC ; TEMED购自HUALVYUAN BIOTECHNOLOGY ;X射线胶片购自中国乐凯胶片集团公司；二抗 affinity purified antibodyperoxidase labled goat anti-mouse lgG(H+L)HSA liquid conjugate禾口 affinitypurified antibody peroxidase labled goat anti_rabbit lgG(H+L)HSA liquidconjugate，购自美国Kirkegaard & laboratories ;四噻唑蓝(MTT)购 自美国Promega公司。
主要实验仪器 BHC-1300II A/B3生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司生产；TS100生物倒置 相差显微镜，日本NIKON公司生产；C02培养箱，美国NBS公司生产；TS-1脱色摇床，金纭 市杰瑞尔电器有限公司生产；电子分析天枰，北京塞多利斯仪器系统有限公司生产；旋涡 混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；BYY-6C双稳定时电泳仪，北京六一仪器 有限公司生产；酶标仪，美国MD公司生产；J-25离心机，美国贝克曼公司生产；XJX-IIX射 线摄影暗匣，上海跃进医用光学器械厂生产；血球计数板，上海市求精生化试剂仪器有限公 司；96孔板细胞培养板，BiousingBiotechnology有限公司生产。
试验例1 : 四噻唑蓝(MTT)法测定PC12细胞的存活率
( — )PC12细胞株的培养PC12细胞用含10X马血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 y g/mL链霉素的 RPMI1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。每2_3天更换培养液一 次，细胞达约70% 80%融合时，传代或用于实验。
(二)PC12细胞的排板用0. 25%的胰酶将贴壁的PC12细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为1 X 10cel 1/孔，在含有10%马血清，5%胎牛血清、 100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的RPMI 1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度的 培养箱中培养。 梯度浓度Morphine剌激 细胞培养过夜，换新鲜RPMI 1640培养液，对照组不加Morphine,实验组分别用10、 20、50、100、200 ii M的浓度Morphine剌激。各组设5个平行实验。 [OO35](四)四噻唑蓝(MTT)实验 取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，继续孵育4小时 后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150 二甲基亚砜，小心混匀，用 酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。 [OO37](五)细胞的存活率计算 存活率％ =加药组A值/对照组A值X 100%
试验例2 : 四噻唑蓝(MTT)法测定Morphine对MPP+剌激的PC12细胞的保护作用
( — )PC12细胞株的培养 PC12细胞用含10X马血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的 RPMI1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。每2_3天更换培养基一 次，细胞达约70% 80%融合时，传代或用于实验。
(二)PC12细胞的排板 用0. 25%的胰酶将贴壁的PC12细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将 细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为1 X lOcel 1/孔，在含有10%马血清，5%胎牛血清、 100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的RPMI 1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下 进行贴壁培养。 (三)Morphine和MPP+剌激 细胞培养过夜，换新鲜RPMI1640培养基，对照组不加Morphine,实验组分别用 100 iiM浓度的Morphine, 0. 3mM浓度的MPP+， 100 ii M的浓度Morphine力口上0. 3慮浓度1^+ 分别剌激剌激。各组设5个平行实验。 [OO47](四)四噻唑蓝(MTT)试验 取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，继续孵育4小时 后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150 二甲基亚砜，小心混匀，用 酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。 [OO49](五)细胞的存活率计算 存活率％ =加药组A值/对照组A值X 100%
试验例3:Western Blot检测Morphine对MPP+剌激的PC12细胞Trx蛋白表达的影响 [OO53] ( — )PC12细胞株的培养 PC12细胞用含10X马血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的 RPMI1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。每2_3天更换培养基一 次，细胞达约70% 80%融合时，传代或用于实验。
6[OO55] (二)PC12细胞的排板 用0. 25%的胰酶将贴壁的PC12细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将 细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为1 X 104cel1/孔，在含有10%胎牛血清、100U/mL青 霉素和100 ii g/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。 (三)Morphine和MPP+剌激 细胞培养过夜，换新鲜RPMI 1640培养基，对照组不加Morphine,实验组分别用实 验组分别用100 iiM Morphine, 0. 3mM MPP+， 100 ii mM Morphine加上0. 3mM MPP+剌激。各
组设三个以上平行实验。
(四)免疫印迹
1.蛋白含量的测定 用BCA试剂盒测定将10 ii 1标准品或待测样本与200 ii 1 WR工作溶液混合，37°C 孵育30min，将反应管温度冷却至室温。测定562nm光密度值，绘制标准曲线，并计算蛋白浓 度。 2.蛋白免疫印迹(Western Blot) 总蛋白加样量为6ii g，与2XSDS凝胶加样缓冲液混合后，95t:热变性5min，用 15X的SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白条带用电转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶4°〇封 闭过夜；取出PVDF膜，用含0. 1% Tween-20的TPBS冲洗后，加入1000倍稀释的一抗室温 孵育75min ;用含0. 1 % Tween-20的TPBS冲洗，加入5000倍稀释的二抗室温孵育75min ; 用含0. 1 % Tween-20的TPBS冲洗，将PVDF膜浸入发光底物溶液中反应lmin， X射线胶片 曝光。 本发明旨在证实低浓度Morphine保护神经细胞免于MPP+的损伤。
不同浓度的吗啡对神经元的作用不一样。低浓度吗啡可以促进神经元增殖，相反， 高浓度吗啡则诱导神经元凋亡。这些都提示我们Morphine的浓度不同所产生的作用亦不 同。MPP+具有抑制PC12细胞的生长增殖并诱导PC12细胞的凋亡的作用。PC12细胞中加 入Morphine,结果表明10-100 y M的Morphine能促进PC12细胞的生长(图1)。而且，用 100 ii M的Morphine预剌激PC12细胞时，明显保护细胞免受由MPP+所致细胞损伤作用(图 2)，并且加入Morphine后能使MPP+所致的Trx的蛋白表达有所回升(图3)。这些结果都 说明，适当浓度的Morphine可用于促进神经细胞增殖，保护神经细胞免于帕金森病毒性物 的损伤。 由于Morphine能促进PC12细胞的生长，保护神经细胞免于帕金森病毒性物的损 伤是首次发现的，因此，以适当浓度Morphine作为促进神经细胞生长和保护神经细胞免于 帕金森病毒性物损伤。 与对照组相比，在低浓度时，Morphine能增加PC12细胞生长繁殖并且诱导Trx蛋 白表达水平。由于Trx具有抗凋亡、保护细胞的作用，因此，Morphine还可以保护PC12细 胞免于帕金森毒性物MPP+损伤。因此，Morphine通过诱导Trx的表达来促进神经细胞的 生长以及保护神经细胞。
权利要求
Morphine在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及Morphine在制备治疗帕金森病的药物中的应用确切地说涉及Morphine的医药新用途，属医药技术领域。本发明经四噻唑蓝(MTT)法，发现Morphine能促进大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞)的生长。Morphine具有促进神经细胞增殖的活性，并且抑制帕金森毒性物MPP+(1-Methyl-4-Phenylpyridiniumion)导致的神经细胞的损伤；蛋白质免疫印迹法表明，Morphine可以诱导PC12细胞中硫氧还蛋白的表达水平。因此，Morphine保护神经细胞免于MPP+毒性与诱导硫氧还蛋白表达有关。
文档编号A61K31/485GK101766621SQ200910218370
公开日2010年7月7日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者白洁, 陈妍 申请人:昆明理工大学