无乳链球菌抗原Ⅰ和Ⅱ的制作方法

专利名称：无乳链球菌抗原Ⅰ和Ⅱ的制作方法
无乳链球菌抗原j和11本申请是2004年05月06日提交的2004800012219. 8号发明专利申请“无乳链球 菌抗原I和II”的分案申请。本发明涉及编码无乳链球菌(Str印tococcus agalactiae)抗原的分离的核酸分 子，所述分子适合用于预防和治疗无乳链球菌引起的细菌感染的药物药剂的制备无乳链球菌是革兰氏阳性细菌，基于其血琼脂上的溶血模式属于B组链球菌 (GBS)。所述生物体是有荚膜的，荚膜是致病重要的元素。荚膜是抗原性的，并形成通过血 清型分类GBS的基础。已经鉴定出九个截然不同的GBS血清型la、lb、II、III、IV、V、VI、 VII和VIII。显示多数无乳链球菌血清型引起严重的疾病，估计两个最普遍的血清型-III 和V型-负责世界上大多数的侵入性疾病。分级和血清型的流行因年龄组和地理范围而不 同。在美国，GBS III型造成多于50%的婴儿疾病，V型造成大约40%的非孕成人疾病，Ia 型造成大约三分之一任何患者群的疾病。无乳链球菌在极端年龄和有潜在疾病的那些人是很重要的人类疾病的原因。B组 链球菌是新生儿全身和局部感染的主要原因。自从二十世纪七十年代，GBS是美国新生儿 的主要病原体。细菌感染能导致威胁生命的疾病，例如败血症、肺炎和脑膜炎。存活者变成 有听力、学习和视力残疾的终身残废。新生儿通常在分娩期或他们有GBS群集(colonized) 的母亲生产时获得所述生物体。另外，GBS也是怀孕妇女以及慢性疾病和年长患者感染的常 见原因，例如遭受糖尿病、恶性肿瘤、免疫缺陷性疾病等等的那些人(Baiter，S等的综述， 革兰氏阳性病原体，Fischetti V. A.等编辑，ASM Press 2000，154-160 页)。10-35%怀孕妇女有GBS群集，但是无症状。然而，因为垂直转播的危险，GBS群集 很重要。50-70%有群集的妇女所生的新生儿-就是5-15%所有的新生儿-在分娩过程中 变成有GBS群集。群集是感染和疾病的先决条件。多数早产儿由于很低的母亲抗体转递和 不成熟的免疫系统，对于侵入性疾病有最高的危险。怀孕时GBS的携带可以是慢性的、间 歇的或暂时的。很难评价携带的持续时间，因为妇女在从后三个月至出生前的检查之中已 经被筛选过一次了。一些研究提示妊娠末三个月中和分娩时的群集状态之间有相关性( 90%)。分离物的血清型指出相同类型的持续最普遍(Balter，S.等的综述，革兰氏阳性病 原体，Fischetti V. A.等编辑，ASM Press 2000，154-160 页)。没有预防性的干预，1至2%所有的新生儿和15%有严重群集的妇女所分娩的新 生儿形成了侵入性疾病(败血症、肺炎和/或脑膜炎)。在美国，GBS感染影响1-5个新生 儿/1000个安全出生儿。美国每年发生大约17，000个病例的GBS疾病，7，500个发生于预 防前的新生儿。GBS是细菌脑膜炎最普遍的原因，造成 40%这个年龄组报告的所有病例。 在美国侵入性GBS疾病的总发病率是0.2-0. 7/100，000。在欧洲稍微低些。侵入性疾病没 有预防干预的死亡率是6%，每16个感染的新生儿死亡，20%的幸存者终生残疾。严重B组链球菌感染的比率在新生儿中要比任何其它年龄组中要高很多。然而， 严重的B组链球菌感染发生在男性和女性的其他年龄组。非孕成人中，严重疾病的比例在 每100，000个人4.1至7. 2个病例的范围。侵入性感染(细菌进入通常不暴露于细菌的体 内部分的感染)平均死亡率对于年龄在18-64岁的成人是8-10%，在65岁及以上的成人是15-25%。死亡率在更年轻的成人和没有其它疾病状态的成人要低些。严重B组链球菌 疾病的比率随着年龄而增加。非孕成人中病例的平均年龄是大约60岁。多数成人B组链 球菌疾病发生在有严重疾病状态的成人中。这些包括糖尿病；肝脏疾病；中风史；癌症史； 或褥疮。在年长者，严重B组链球菌疾病的比率在护理院居住者中和卧床住院病人更为普 遍。非孕成人中通常在新近外伤后或在接受例如手术的某些侵入性医院操作后得B组链球 菌疾病({Farley, Μ. , 2001} ； {Jackson, L.等人，1995} ；www. cdc. gov/groupbstrep/)。预防前新生儿疾病的直接医疗花费是每年两亿九千四百万美金，GBS仍然是相当 大的经济负担。无乳链球菌感染的确诊一般依赖于生物体从子宫颈棉棒取样、血或其它通常无菌 的身体位点的分离。也可利用检测体液中荚膜多糖抗原的测试。青霉素G是已经确定的GBS病例的治疗选择。对于菌血症、肺炎和软组织感染推 荐十天的治疗，而对于脑膜炎推荐2-3周，对于骨髓炎3-4周。自从1994年在北美已经建立了预防，方法是通过在怀孕35-37周阴道和肛门直肠 棉棒采样筛选携带GBS怀孕妇女或者通过在分娩入院时无培养物鉴别危险因子。为预防候 选者的妇女在分娩过程中给予产时抗生素治疗以防止早期发作的新生儿疾病。在美国这个 预防的方法在1993至1999年之间使得GBS疾病的发生率从1. 7降低到0. 4/1000个安全 出生儿。尽管能通过产时预防(青霉素G或氨苄西林)预防多数新生儿GBS疾病，但是目 前可利用的策略不理想，尤其是对于早产婴儿晚期发作(> 7天的年龄)的感染和疾病的 预防。总是有些个体由于一些原因逃脱携带的筛选，例如在32-35周测试阴性但是在分娩 时变阳性的间歇性携带者、未参加、疏忽或者筛选日期(32-35周)前分娩。最后，抗生素的广泛使用通常诱导在一段时间后出现的抗株。已经显示青霉素和 其它的抗生素的大量使用(每3-5个妇女接受高剂量治疗)稳定增加了抗生素抗性临床分 离物的百分比(ref)。另外，基于预防的抗生物的效率对于后期发作疾病不是那么有效，因 为它是针对早期发作的(分娩后48小时内)。另一个关注是并未解决易感成人群的预防。缺乏对对抗GBS携带和疾病的保护性免疫元素足够的了解阻碍了疫苗的发展。没 有很好地理解携带与天然免疫的关系。另外，没有很好地定义允许疾病在携带者发生的免 疫机制。然而，有提示病原体特异性抗体的母体血清水平与新生儿GBS疾病相关。已经很 坚定地确定分娩时母体抗荚膜多糖抗体水平和侵入性新生儿疾病负性相关。{Campbell， J.等人，2000}尽管对于GBS所有的株B组糖抗原很普遍，不幸地，它没有很强的免疫原性并且 抗体也不保护实验模型中致死攻击(challenge)。由多糖制成的GBS荚膜本身是有免疫原 性的并且能够诱导保护抗体。然而，这个保护是类型特异性的。尽管荚膜特异性抗体已经 显示很高的保护性，什么浓度的这些血清型特异性抗体可对抗疾病而有保护作用仍然不清 楚，就在最近，已经清楚调理活性和这些抗体的亲合力是比浓度更关键的保护决定因素。已经理解了表面蛋白质对人类针对无乳链球菌的免疫中的重要性。很明显所有 血清型表达带有与宿主免疫防御相关活性的表面蛋白质。α C蛋白质、β C蛋白质、Rib和 Sip蛋白质在生化和基因上有很好地特征描述，也在动物模型中显示了免疫性和保护性 ({Michel, J.等人，1991} ； {Brodeur, B.等人，2000} ； {Larsson, C.等人，1999} ； {Cheng, Q.等人，2002})。这些蛋白质作为疫苗候选的主要问题似乎是它们在GBS的不同临床分离
7物中的流行变异性。例如Rib蛋白质存在于III血清型GBS中，但是占全世界疾病的重大 部分的V型没有。一些其它的表面蛋白质特征在于是免疫原性的，但是对于鉴别多数GBS 免疫原性蛋白质只作了有限的系统工作。因而，预防或减轻GBS感染的有效治疗仍然是需要的。疫苗不仅能预防GBS的感 染，也更加特异性地预防或减轻宿主组织(尤其是在产道)的群集，因而降低从母体到胚胎 传播的发生。降低急性感染的发生和生物体的携带将导致新生儿中侵入性疾病-肺炎、菌 血症、脑膜炎和败血症的预防。能够显示对造成人类感染的大多数无乳链球菌株交叉保护 作用的疫苗对于预防或减轻所有其它链球菌种类，也就是A、C和G组造成的感染也是有用 的。疫苗能含有全部的各种不同的抗原。抗原的实例是完全杀死的或减毒的生物体、 这些生物体/组织的细组分、蛋白质或者它们最简单的形式肽。抗原也能以糖基化蛋白质 或肽的形式被免疫系统识别，也可以是或含有多糖或脂质。能使用短肽，因为例如细胞毒性 T细胞(CTL)识别连接于主要组织相容性抗原(MHC)的通常8-11个氨基酸长的短肽形式 的抗原。B细胞能识别短到4-5个氨基酸的线性表位以及三维结构(构象表位)。为了获 得持续的抗原特异性免疫反应，佐剂需要激发包括免疫系统所有细胞的免疫级联。起初，佐 剂起作用，但是不限于它们对所谓抗原递呈细胞(APC)的作用的模式。这些细胞通常最先 遇到抗原，之后是加工的或未修饰的抗原呈递给免疫效应细胞。也可以涉及中间细胞类型。 只有有适当特异性的效应细胞在生产免疫反应中被激活。佐剂也可以局部保留抗原和共注 射的其他因子。另外，佐剂可以起其它免疫细胞的化学趋化剂的作用，或者可以在局部和/ 或全身起免疫系统刺激剂的作用。自从二十世纪七十年代末，疫苗开发着重于荚膜多糖，但是仍然没有安全有效的 产品。然而，对于开发和给予婴儿和高危险成人，抗无乳链球菌的疫苗被列为最重要的之 一。目前抗所述感染的疫苗仅仅在开发的研究阶段。成果着重于使用与或者不与蛋白质连 接的荚膜多糖(CPS)作为免疫原{Paoletti，L.等人，2002}。然而，有些争论反对基于多糖 的疫苗的使用。多糖诱导IgG2抗体，IgG2抗体以比IgGl或IgG3抗体更低的效率穿过胚 胎。对于多数易感新生儿，流产儿，这尤其是个问题，因为在32-34周之前胎盘抗体转移很 低。估计 10%的分娩发生在第34个孕周之前。蛋白质偶联疫苗无疑是抗GBS疾病战斗增加的一个伟大的新武器，但是疫苗仅含 有有限数量的GBS血清型，给与足够的生态学压力，非免疫血清型替换的疾病仍然是真正 的威胁，尤其在有非常高的疾病负担的区域。此外用于活性免疫的多糖抗原在人类中不提 供免疫记忆。CPS与非GBS相关免疫原性蛋白质载体结合(例如，破伤风类毒素、霍乱毒素 B亚单位等等)已经显示在诱导疫苗接种者更高的抗体浓度是有利的，但是它不提供在真 正的感染过程中招募记忆B和T细胞以支持最有效宿主反应的病原体特异性B细胞和T细 胞表位。为了能够用符合这些标准的蛋白质补充CPS疫苗，鉴别保守免疫原性GBS特异性 表面蛋白质是必须的。所有这些不足提示需要开发新一代疫苗，所述疫苗由蛋白质或其衍生物组成，其 在体内条件下由所有株表达，在人类有诱导调理和/或中和抗体的能力。基于被动抗体的治疗有很大的潜力。为了预防已经尝试使用人类静脉内免疫球 蛋白(IVIG)的制备物。单克隆抗体生产技术的最新进展提供了产生人类抗体试剂和再引入抗体治疗的方法，而避免与血清治疗相关的毒性。免疫球蛋白是极端多样类型的抗微生 物蛋白质，能用于预防和治疗出现的感染疾病。抗体治疗抵抗各种不同的微生物是有效的 ({Burnie,J.等人，1998}的综述)。抗GBS单克隆抗体能治疗性地给予每一个显现侵入性 疾病的新生儿或者预防性地给予低出生体重的和早产的新生儿。在过去十年，在一些动物模型中描述了一些GBS蛋白质的免疫原性和保护能力， 为了基于种属共有蛋白质的疫苗的开发现在正在对这些进行探究。这样的蛋白质是GBS表 面蛋白质 Sip{Brodeur，B.等人，2000}、rib，α 蛋白质和{Michel, J.等人，1991}。展示在显著造成疾病发生的革兰氏阳性生物体表面上的某些蛋白质或酶参与了 这些病原体引起的疾病过程。通常，这些蛋白质参与了与宿主组织直接的相互作用或隐 藏细菌表面以逃脱宿主防御机制{Navarre，W.等人，1999}。无乳链球菌在这点上并不例 外。一些表面蛋白质具有对GBS治病性很重要的毒力因子的特征((革兰氏阳性病原体 中 Paoletti, L. C 等人的综述，Fischetti V. A 等人编辑，ASM Press2000,137-153 页)； {Paoletti, L.等人，2002})。如果抗这些蛋白质的抗体对人类能提供比多糖更好的保护， 它们能提供新型基于蛋白质的GBS疫苗的来源以连接于或替代更加传统的荚膜多糖疫苗 而使用。一些作为可能疫苗的抗原以及许多额外候选的上面描述的蛋白质的用途主要由基 于鉴别的容易或可获得的机会的挑选产生。以更加全面的方式鉴别无乳链球菌相关抗原是 有需求的。本发明者已经开发了从特异性病原体尤其是从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus^idermidis)鉴别、分离和生产超免疫血清反 应性抗原的方法(W002/059148)。然而，假设生物特性致病功能和遗传背景的不同，无乳链 球菌与葡萄球菌株截然不同。重要地，为了鉴别无乳链球菌的抗原，血清的选择不同于应用 于金黄色葡萄球菌筛选的那个。为了那个目的，收集了人类四个主要类型的抗体来源。首 先，GBS子宫颈和肛门直肠携带测试为阴性的健康怀孕妇女。这个供体组代表了抗体最重 要的来源。除了它们的血清样品外，用子宫颈纱布收集的含有分泌型IgA(SlgA)的人子宫 颈分泌物也用于抗原的鉴别和确认。这个收集物的主要价值是SlgA能被认为是粘膜表面 上的主要免疫效应分子。其次，有GBS群集的健康怀孕妇女，其新生儿仍保持无GBS (尽管 用了抗生素预防)。第三，没有临床疾病的小于45岁的成人。第四，幼稚个体，5到10个月 之间的小孩，在他们已经失去母体抗体之后且由于GBS疾病的缺乏而没有获得GBS特异性 抗体。为了能够挑选相关血清来源，用细菌裂解物和培养上清蛋白质进行了测量抗无乳 链球菌IgG和IgA抗体水平的一系列ELISA和免疫斑点实验。来自高滴度携带者和非携带 者的血清包括在基于基因组的抗原鉴别。这个挑选人类血清的方法基本上与金黄色葡萄球 菌使用的方法非常不同，在这里携带或非携带状态不与抗体水平相关。本发明使用了高通量基因组方法以鉴别在感染和群集过程中有诱导人类抗体能 力的体内表达的病原体特异性蛋白质。两个细菌种属_无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的基因组本身显示了许多重要的 不同。无乳链球菌的基因组含有大约2. 2Mb，而金黄色葡萄球菌有2. 85Mb。它们分别具有 35. 7%和33%的平均GC含量，两个病原体之间大约30%至45%的编码基因不同。另外，对 于增殖两个细菌种类需要不同的生长条件和培养基。两个病原体造成的最重要疾病的列表显示如下。金黄色葡萄球菌主要引起医院的机会性感染脓疱病、毛囊炎、脓肿、疖子、感染 的伤口、心内膜炎、脑膜炎、脓毒性关节炎、肺炎、骨髓炎、皮肤烫伤综合症(SSS)、毒性休克 综合症。无乳链球菌主要引起新生儿感染和老年人的疾病，例如菌血症、败血症、伤口感染、 骨髓炎和脑膜炎。指定为NEM316(ATCC 12403)的无乳链球菌荚膜血清型III的分离物的完全 基因组序列由随机鸟枪测序策略测定(GenBank注册号AL732656 ；见誦.tigr. org/ tigrscripts/CMR2/CMRHomePage. spl) {Glaser, P.等人，2002}。本发明潜在的难题是提供开发例如抗无乳链球菌感染疫苗的药剂的方法。更加特 别地，所述难题提供了能用于生产所述药剂的一套有效、相关和全面的来自无乳链球菌的 核酸分子或超免疫血清反应性抗原。所以，本发明提供了编码高免疫反应血清反应抗原或其片段的分离的核酸分子， 包含如下核酸序列，选自a)与选自Seq ID No 14，90，157-216的核酸分子至少具有70%序列相同性的核 酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子至少15个连续碱基的核酸分子d)在严格杂交条件下退火于a)、b)或C)的核酸分子的核酸分子e)由于遗传密码的简并性，否则将杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子的核 酸分子。根据本发明的优选实施方案，序列相同性是至少80 %，优选地至少95 %，尤其是 100%。此外，本发明提供了编码超免疫血清反应性抗原或其片段的的分离的核酸分子， 包含如下核酸序列，选自a)与选自 Seq ID No 1，3，5-13，15，18-25，27-31，33-36，39-68，70-85，92-100， 103-126，128-145，147，149-156，217，435-448 和 463-474 的核酸分子至少具有 96% 或高于 96%，优选地至少98%，尤其是100%序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子至少15个连续碱基的核酸分子d)在严格杂交条件下退火于a)、b)或C)的核酸分子的核酸分子e)由于遗传密码的简并性，否则将杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子的核 酸分子。根据另一个方面，本发明提供了编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核 酸分子，包含如下核酸序列，选自a)与选自Seq ID No 32，86，91，101，127的核酸分子具有98%或高于98%，尤其 是100%序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)由于遗传密码的简并性，否则将杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子的核 酸分子优选地，核酸分子是DNA或RNA。
根据本发明优选的实施方案，核酸分子从尤其是无乳链球菌基因组DNA的基因组 DNA分离。根据本发明，提供了包含根据本发明的任一核酸分子的载体。在优选实施方案中，载体经改造以适于根据本发明的核酸分子编码的超免疫血清 反应性抗原或其片段的重组表达。 本发明也提供了包含根据本发明的载体的宿主细胞。根据另一方面本发明进一步提供了包含根据本发明的核酸分子编码的氨基酸序 列的超免疫血清反应性抗原。优选的实施方案中，氨基酸序列(多肽)选自Seq ID No 231，307，374-433。另一优选实施方案中氨基酸序列(多肽)选自Seq ID No 218，220，222-230，232， 235-242，244-248，250-253，256-285，287-302，309-317，320-343，345-362，364，366-373， 434,449-462 和 475-486。进一步优选的实施方案中，氨基酸序列(多肽)选自Seq ID No 249,303,308, 318,344ο根据另一方面，本发明提供了选自包含表IA “推定的免疫原性氨基酸”和“鉴别的 免疫原性区域位置”纵栏的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原之片段的肽，尤其是包含 选自如下氨基酸的肽Seq ID No 218 的 4-20，35-44，65-70，73-87，92-98，112-137， 152-161，177-186，193-200，206-213，229-255，282-294，308-313，320-326，349-355， 373-384，388-406，420-425 和 115-199 ；Seq ID No 219 的 5-24，35-41，44-70，73-89， 103-109，127-143，155—161，185—190，192—207，212—219，246—262，304—336，372—382， 384-393，398-407，412-418，438-444，1-75,76-161 和 164-239 ；Seq ID No 220 的 4-10, 16-58,60-71，77-92，100-126，132-146，149-164，166-172，190-209，214-220，223-229， 241-256，297-312，314-319，337-343，351-359，378-387，398-418，421-428，430-437， 440-448,462-471,510-519,525-536,552-559,561-568,573-582,596-602,608-630, 637-649,651-665,681-702,714-732,739-745,757-778,790-805,807-815,821-829, 836-842,846-873,880-903,908-914,916-923,931-940,943-948,956-970,975-986, 996-1015,1031-1040,1051-1069,1072-1095,1114-1119,1130-1148, 1150-1157, 1169-1176，1229-1238 和 802-812 ;Seq ID No 221 的 5-12，14-26，35-47，52-67，72-78， 83-98,121-141,152-159,163-183,186-207,209-257,264-277,282-299,301-309, 312-318，324-339，358-368，372-378，387-397，425-431 和 46-291 ;Seq ID No 222 的 29-38,44-64,70-76,78-87,94-100,102-112,119-134,140-149,163-173, 178-186, 188-194，207-234，247-262，269-290 和 73-92 ；Seq ID No 223 的 10-28，36-63，77-87， 103-119，127-136，141—169，171—183，195—200，207—232，236—246，251—265，268—283， 287-297,314-322,335-343,354-363,384-390,405-411,419-436,443-455,467-473, 480-513,518-529,550-557,565-585,602-608,616-625,632-660,665-677,685-701, 726-736，738-747，752-761，785-796，801-813，838-853，866-871 和 757-774 ；Seq ID No224 的 31-38,61-66,74-81,90-115,123-145，154-167，169-179，182-193，200-206，238-244， 267-272 和 235-251 ;Seq ID No 225 的 19-25，38-54，56-64，66-72，74-92，94-100， 116-129，143-149，156-183，204-232，253-266，269-275，294-307 和 241-313 ；Seq ID No226 的 5-34，50-56，60-65，74-85，89-97，108-119，159-165，181-199，209-225，230-240， 245-251，257-262，274-282，300-305 和 64-75 ；Seq ID No 227 的 5-13，16-21，27-42， 45-52，58-66，74-87，108-114，119-131 和 39-51 ；Seq ID No 228 的 6-23，46-54，59-65， 78-84,100-120,128-133,140-146,159-165,171-183,190-204,224-232,240-248, 250-259，274-280，288-296，306-315 和 267-274 ；Seq ID No 229 的 5-12，15-24，26-36， 42-65,68-80,82-104,111-116,125-144，159-167，184-189，209-218，235-243，254-265， 269-283，287-300，306-316，318-336，338-352，374-392 和 162-174 ；Seq ID No 230 的 30-42，45-54 和 25-37 ;Seq ID No 231 的 10-30，53-59，86-95，116-130，132-147，169-189， 195-201，212-221，247-256，258-265，278-283，291-298，310-316，329-339，341-352， 360-367，388-396，398-411，416-432，443-452，460-466，506-512，515-521，542-548 和 419-431 ；Seq ID No 232 的 4_27，30-53，60-67，70-90，92-151，159-185，189-195， 198-210,215-239 和 173-189 ；Seq ID No 233 的 4-26，41-54，71-78，116-127，140-149，
151-158，161-175，190-196，201-208，220-226，240-252，266-281，298-305，308-318， 321-329，344-353，372-378，384-405，418-426，429-442，457-463，494-505，514-522 和 174-188 ；Seq IDNo 234 的 17—25，27—39，61—67，81—89，99—110，120—131，133—139， 147-161，167-172，179-185，192-198，203-213，226-238，243-258，261-267，284-290， 296-307，311-328，340-352，356-371 和 2 39-256 ；Seq ID No 235 的 8-30，40-49，67-80， 114-123，126-142，152-162，188-194 和 57-70 ；Seq ID No 236 的 4-23，28-34，36-47， 50-61,76-81,89-94,96-104,112-119,126-146，155-181，195-200，208-214，220-229， 244-260,263-276,282-288,292-300,317-323,336-351,353-359,363-375,382-399, 415-432, 444-455,458-471,476-481,484-492,499-517,522-529,535-541,543-568,
572-584，586-600，607-617，626-637，656-675和 282-297 ;Seq ID No 237 的 6-24，30-35， 38-45，63-91，134-140，146-160，167-188，214-220，226-234，244-250，260-270，286-301， 316-329，340-371,429-446，448-459，474-481,485-491，512-526，537-544，550-565，
573-583，596-613，621-630，652-658和 87-97 ；Seq ID No 238 的 8-20，26-48，56-67， 76-86,94-109,115-121，123-129，143-160，178-186，191-198，201-208，221-236，238-244， 260-268 和 237-247 ；Seq ID No 239 的 4-40，42-57，73-87，98-117，126-135，150-156， 166-174，196-217，231-236，248-258，276-284，293-301，307-313，339-347，359-365， 375-387, 395-402,428-440,445-456,485-490,497-505,535-541,547-555,610-625, 648-656,665-671 和 448-528 ;Seq ID No 240 的 10-18，39-45，51-61，80-96，98-106， 110-115，158-172，174-183，191-200，220-237，249-255，274-289，308-324，33卜341， 372-381，384-397，405-414 和 322-338 ;Seq ID No 241 的 30-36，38-56，85-108，134-147， 149-160，163-183，188-201，206-211，219-238，247-254 和 5-13 ;Seq ID No 242 的 11-40， 98-103，110-115，133-145，151-159，172-179，192-201，204-212，222-228，235-245， 258-268,283-296,298-309,322-329,342-351,354-362,372-378,385-393,407-418, 495-516 和 1-148 ；Seq ID No 243 的 5-19，21-36，73-94，112-119，122-137，139-145，
152-167,184-190,198-204,208-224,249-265,267-281,299-304,309-317,326-333, 356-364，368-374，381-389，391-414，419-425，430-435 和 113-140 ；Seq IDNo 244 的 45-54，59-67，78-91和 15-23 ;Seq ID No 245 的 11-22，33-47，52-80，88-112，124-129 和
126-25 ；Seq ID No 246 的 26-41,51-63,80-89,93-115,150-163,187-193,220-237, 240-249,286-294,296-306,316-329,345-353,361-370,407-425,428-437,474-482, 484-494,504-517,533-541,549-558,595-613,616-625,660-668,673-685,711-726, 736-744,749-761,787-802,812-820,825-837,863-878,888-896,901-913,939-954, 964-972,977-989,1003-1008，1016-1022，1028-1034，1041-1053，1059-1074，1101-1122， 420-511 和 581-704 ；Seq ID No 247 的 18-25，27-55，71-83，89-95，102-113，120-146， 150-156,174-185 和 159-175 ；Seq ID No 248 的 24-30，38-56，63-68，87-93，136-142， 153-164，183-199，213-219，226-234，244-261，269-278，283-289，291-297，320-328， 330-336,340-346,348-356,358-366,382-387,401-408,414-419,449-455,468-491, 504-512,531-537,554-560,597-608,621-627,632-643,650-662,667-692,703-716, 724-737，743-758，783-794，800-818，846-856 和 806-884 ;Seq ID No 249 的4-14，21-39， 86-92,99-107,121-131，136-144，147-154，158-166，176-185，193-199，207-222，224-230 和 117-136 ；Seq ID No 250 的 65-76，85-97，103-109，115-121，125-146，163-169， 196-205,212-219,228-237,241-247,254-262,269-288,294-303,305-313,328-367, 395-401，405-412，418-429，437-447，481-488，506-513，519-524，530-541，546-557 和 266-284 ；Seq ID No 251 的 5-14，37-42，49-71，78-92，97-112，127-136，147-154， 156-163，186-198，216-225，233-243，248-253，295-307，323-332，359-366，368-374，
380-398和 194-223 ；Seq ID No 252 的 4-11，33-39，45-72，100-113，119-129，136-144， 169-175，177-185,200-208,210-219,262-276,278-297,320-326，336-344，347-362,
381-394,443-453和 438-454 ；Seq ID No 253 的 4-29，31-52，55-61，95-110，138-158， 162-171，179-187，202-229，239-248，251-256，262-267，269-285，304-310,351-360， 362-368，381-388，415-428，435-440，448-458 和 161-178 ；Seq ID No 254 的 4-17，19-28， 32-43,47-59,89-110,112-126,128-134，140-148，152-161，169-184，191-204，230-235， 255-264，328-338，341-347，401-409，413-419，433-441，449-458，463-468，476-482， 486-492，500-506，529-545 和 305-381 ;Seq ID No 255 的 10-29，38-45，53-61，134-145， 152-160，163-170,202-208,219-229,248-258,266-275,282-288,315-320,328-334, 377-385,392-402,418-424,447-453,460-471,479-487,491-497,500-507,531-537, 581-594,615-623,629-635,644-652,659-666,668-678,710-717,719-728,736-741, 747-760，766-773，784-789，794-800，805-817，855-861，866-887 和 698-715 ;Seq IDNo 256 的 16-26，29-37，44-58，62-68，74-80，88-95，97-120，125-144，165-196 和 58-72 ；Seq ID No 257 的 14-21，23-46，49-60，63-74，78-92，96-103，117-129，134-161，169-211， 217-231，239-248，252-281，292-299，313-343 和 243-257 ;Seq ID No 258 的 11-27，46-52， 67-72，76-84，91-112，116-153，160-175，187-196，202-211，213-220 和 43-76 ；Seq ID No 259 的 5-29，37-56，78-86，108-118，152-161 和 120-130 ;Seq ID No 260 的 8-14，19-41， 52-66，75-82，87-92，106-121，127-133，136-143，158-175，180-187，196-204，221-228， 239-245，259-265，291-306，318-323，328-340，352-358，361-368，375-381，391-399， 411-418,431-442,446-455,484-496,498-510,527-533,541-549,558-565,575-585, 587-594，644-655，661-668，671-677 和 184-196 ；Seq ID No 261 的 4-22，29-38，55-62， 75-81,102-107,110-134,143-150,161-167,172-179,191-215,223-233,241-247,
13251-264，266-272，288-309，340-352，354-366，394-402，414-438 和 198-218 ；Seq ID No 262 的 24-44，49-70，80-91，105-118，128-136，140-154 和 77-92 ;Seq ID No 263 的 5-22，
31-36，41-47，67-74，83-90，105-122，135-143，160-167和 118-129 ；Seq ID No 264 的 4-25,33-73,81-93,96-106,114-120,122-128，130-172，179-208，210-241，251-283， 296-301 和 92-100 ；Seq ID No265 的 14-24，29-38，43-50，52-72，86-97，101-107，110-125， 127-141，145-157，168-175，177-184，186-195，205-226，238-250，255-261，284-290， 293-304,307-314,316-323,325-356,363-371,383-390,405-415,423-432,442-454, 466-485,502-511,519-527,535-556,558-565,569-574,612-634,641-655,672-686, 698-709,715-722,724-732,743-753,760-769,783-792,818-825,830-839,842-849, 884-896，905-918，926-940，957-969，979-1007，1015-1021，1049-1057 和 336-349 ；Seq ID No 266 的 6-16，26-31，33-39，62-73，75-85，87-100，113-123，127-152，157-164，168-181， 191-198，208-214，219-226，233-254，259-266，286-329 和 181-195 ；Seq IDNo 267 的 4-13,
32-39,53-76,99-108,110-116,124-135，137-146，149-157，162-174，182-190，207-231， 242-253, 255-264, 274-283,291-323,334-345,351-360,375-388,418-425,456-474, 486-492，508-517，520-536，547-560，562-577，31-45 和 419-443 ;Seq ID No268 的 15-26， 30-37,42-49,58-90,93-99,128-134,147-154,174-179,190-197,199-205,221-230, 262-274，277-287，300-314，327-333，343-351，359-377，388-396，408-413，416-425， 431-446 和 246-256 ;Seq ID No 269 的 5-26，34-42，47-54，61-67，71-104，107-115， 131-138，144-153，157-189，196-202，204-210，228-245，288-309，316-329，332-341， 379-386,393-399,404-412,414-421,457-468,483-489,500-506,508-517,523-534, 543-557,565-580,587-605,609-617,619-627,631-636,640-646,662-668,675-682, 705-710, 716-723,727-732,750-758,784-789,795-809,869-874,14-138,166-286, 372-503,674-696 和 754-859 ；Seq ID No 270 的 5-17，32-38，40-47，80-89，113-119， 125-137，140-154，157-163，170-177，185-199，213-225，228-236，242-248，277-290， 292-305，323-333，347-353，364-370，385-394，399-406，423-433，441-451，462-474， 477-487 和 116-124 ;Seq ID No 271 的 7-16，18-30，32-49，53-61，63-85，95-101，105-115， 119-134，143-150，159-178，185-202，212-229，236-250，254-265，268-294 和 63-72 ；Seq ID No 272 的 4-12，19-47，73-81，97-103，153-169，188-198，207-213，217-223，236-242， 255-265,270-278,298-305,309-317,335-347,354-363,373-394,419-424,442-465, 486-492,500-507,542-549,551-558,560-572,580-589,607-614,617-623,647-653, 666-676，694-704，706-714，748-754，765-772，786-792，795-806 和 358-370 ;Seq IDNo 273 的 18-28，30-38，40-46，49-55，69-78，82-98，104-134，147-153，180-190，196-202， 218-236，244-261，266-273，275-286，290-295，301-314，378-387，390-395，427-434 和 290-305 ；Seq IDNo 274 的 4-13，20-31，39-51，54-61，69-84，87-105，117-124 和 108-125 ； Seq ID No 275 的 24-34，43-54，56-66，68-79 和 50-69 ;Seq ID No 276 的 5-43，71-77， 102-131，141-148，150-156，159-186，191-207，209-234，255-268，280-286，293-299， 317-323,350-357,363-372,391-397,406-418,428-435,455-465,484-497,499-505, 525-531,575-582,593-607,621-633,638-649,655-673,684-698,711-725,736-741, 743-752,759-769,781-793,813-831,843-853,894-905,908-916,929-946,953-963,970-978，1001-1007，1011-1033，165-178 和 818-974 ；Seq ID No 277 的 16-44,63-86,
98-108,185-191,222-237,261-274,282-294,335-345,349-362,374-384,409-420, 424-430，440-447，453-460，465-473，475-504，522-534，538-551，554-560，567-582， 598-607,611-619,627-640,643-653,655-661,669-680,684-690,701-707,715-731, 744-750,756-763,768-804,829-837,845-853,855-879,884-890,910-928, 77-90,
144-212，279-355，434-536，782-810和 875-902 ;Seq ID No 278 的 4-22，29-41，45-51， 53-66,70-77,86-95,98-104,106-124，129-135，142-151，153-161，169-176，228-251，
284-299,331-337,339-370,380-387,393-398,406-411,423-433,440-452,461-469, 488-498，501-516，523-530，532-559，562-567，570-602，612-628，630-645，649-659， 666-672，677-696，714-723，727-747 和 212-227 ；Seq IDNo 279 的 4-9，17-31，35-41， 56-61,66-75，81-87，90-124，133-138，149-163，173-192，213-219，221-262,265-275， 277-282,292-298,301-307,333-346,353-363,371-378,419-430,435-448,456-469, 551-570，583-599，603-612 和 275-291 ;Seq ID No 280 的 28-34，53-58，72-81，100-128，
145-154，159-168，172-189，217-225，227-249，256-263，299-309，322-330，361-379， 381-388,392-401,404-417,425-436,440-446,451-464,469-487,502-511,543-551, 559-564，595-601，606-612，615-626，633-642，644-650，664-670，674-684，692-701， 715-723,726-734,749-756,763-771,781-787,810-843,860-869,882-889,907-917, 931-936,941-948,951-958,964-971,976-993,1039-1049,1051-1065,1092-1121, 1126-1132,1145-1151,1158-1173,1181-1192,1194-1208,1218-1223,1229-1243, 1249-1254,1265-1279,1287-1297,1303-1320,1334-1341,1343-1358,1372-1382, 1406-1417,1419-1425,1428-1434,1441-1448,1460-1473,1494-1504,1509-1514, 1529-1550，654-669 和 1400-1483 ；Seq IDNo 281 的 10-16，20-25，58-65，97-109，118-132， 134-146,148-155，186-195，226-233，244-262，275-284，295-310，317-322，330-339， 345-351,366-375,392-403,408-415,423-430,435-444,446-457,467-479,486-499, 503-510,525-537,540-585,602-612,614-623,625-634,639-645,650-669,700-707, 717-724，727-739，205-230 和 733-754 ；Seq ID No 282 的 5-22，37-43，72-81，105-113， 128-133，148-160，188-194，204-230，238-245，251-257 和 194-213 ;Seq IDNo 283 的 16-21，35-41，56-72，74-92，103-109 和 62-68 ;Seq IDNo 284 的 4-15，17-82，90-104， 107-159，163-170，188-221，234-245，252-265 和 220-235 ;Seq ID No 285 的 16-22，36-46， 61-75,92-107，113-121，139-145，148-160 和 30-42 ;Seq ID No 286 的 4-12，20-26，43-49， 55-62,66-78,121-127，135-141，146-161，164-170，178-189，196-205，233-238，269-279，
288-318，325-332，381-386，400-407和 328-346 ；Seq ID No 287 的 5-12，31-49，57-63， 69-79,89-97,99-114,116-127,134-142，147-154，160-173，185-193，199-204，211-222， 229-236，243-249，256-274 和 58-68 ;Seq ID No 288 的 10-20，28-34，39-53，68-79，84-90，
99-106和 73-79 ;Seq ID No 289 的 14-37，45-50，61-66，77-82，93-98，109-114，125-130， 141-146，157-162，173-178，189-194，205-210，221-226，237-242，253-258，269-274，
285-290，301-306，316-332，349-359，371-378，385-406，34-307和 312-385 ；Seq ID No 290 的 4-10，17-38，50-85，93-99，109-116，128-185，189-197，199-210，223-256，263-287，
289-312,327-337,371-386,389-394,406-419,424-432,438-450,458-463,475-502,507-513，519-526，535-542，550-567 和 361-376 ；Seq IDNo 291 的 10-39，42-93，100-144， 155-176，178-224，230-244，246-255，273-282，292-301，308-325，332-351，356-361， 368-379，386-393，400-421 和 138-155 ;Seq ID No 292 的 5-11，17-34，40-45，50-55， 72-80,101-123,145-151,164-172,182-187,189-195,208-218, 220-241, 243-252, 255-270,325-331,365-371,391-398,402-418,422-428,430-435,443-452,463-469, 476-484，486-494，503-509，529-553，560-565，570-590，608-614，619-627，654-661， 744-750,772-780,784-790,806-816,836-853,876-885,912-918,926-933,961-975, 980-987，996-1006，1016-1028，1043-1053，1057-1062，994-1003 和 1033-1056 ；Seq ID No 293 的 17-45,64-71,73-81,99-109,186-192,223-238,262-275,283-295,336-346, 350-363,375-385,410-421,425-431,441-448,454-463,468-474,476-512,523-537, 539-552,568-583,599-608,612-620,628-641,644-654,656-662,670-681,685-695, 702-708,716-723,725-735,757-764,769-798,800-806,808-816,826-840,846-854, 856-862，874-881，885-902，907-928，274-350 和 443-513 ;Seq ID No 294 的 4-22，29-41，
45-51,53-61,70-76,85-92,99-104,111-122,134-140,142-154,163-174,224-232, 255-265,273-279,283-297,330-335,337-348,356-367,373-385,391-396,421-431, 442-455,475-485,493-505,526-538,544-561,587-599,605-620,622-651,662-670, 675-681，687-692，697-712，714-735 和 252-262 ；Seq ID No 295 的 4-12，15-35，40-46， 50-59,67-94，110-128，143-169，182-188，207-215，218-228，238-250 和 74-90 ；Seq ID No 296 的 9-18，42-58，78-85，88-95，97-106，115-122，128-134，140-145，154-181，186-202， 204-223，261-267，269-278，284-293，300-336，358-368 和 12-29 ;Seq ID No 297 的 7-34，
46-53，62-72，82-88，100-105，111-117，132-137，144-160，166-180，183-189,209-221， 231-236，246-253，268-282，286-293，323-336，364-372，378-392，422-433 和 388-405 ；Seq ID No 298 的 21-27，34-50，72-77，80-95，164-177，192-198，202-220，226-236，239-247， 270-279，285-292，315-320，327-334，348-355，364-371，388-397，453-476，488-497， 534-545,556-576,582-588,601-607,609-616,642-662,674-681,687-697,709-715, 721-727,741-755 和 621-739 ;Seq ID No 299 的 4-14，16-77，79-109 和 25-99 ;Seq ID No 300 的 4-9，17-23，30-37，44-55，65-72，77-93，102-121，123-132，146-153和 17-29 ；Seq ID No 301 的 4-18，25-41，52-60，83-92，104-112，117-123，149-155，159-167，170-192， 201-210，220-227，245-250 和 124-137 ；Seq ID No 302 的 8-25，50-55，89-95，138-143， 148-153，159-169，173-179，223-238，262-268，288-295，297-308，325-335，403-409， 411-417,432-446,463-475,492-501,524-530,542-548,561-574,576-593,604-609, 612-622,637-654,665-672,678-685,720-725,731-739,762-767,777-783,820-838, 851-865,901-908,913-920,958-970,1000-1006,1009-1015,1020-1026,1043-1052, 1055-1061，1-128，252-341，771-793 和 1043-1058 ；Seq ID No 303 的 16-26,33-46 和 64-76 ；Seq ID No 304 的 4-27，69-77，79-101，117-123，126-142，155-161，171-186， 200-206，213-231，233-244，267-273，313-329，335-344，347-370，374-379，399-408， 422-443,445-453,461-468,476-482,518-534,544-553,556-567,578-595,601-620, 626-636,646-658,666-681,715-721,762-768,778-785,789-803,809-819,22-108, 153-318,391-527 和 638-757 ;Seq ID No 305 的 6-21，32-43，62-92，104-123，135-141，145-152，199-216，218-226，237-247，260-269，274-283，297-303，1-72 和 127-211 ；Seq ID No 306 的 6-26,50-56,83-89,108-114,123-131,172-181,194-200,221-238,241-247, 251-259，263-271，284-292，304-319，321-335，353-358，384-391，408-417，424-430， 442-448,459-466,487-500,514-528,541-556,572-578,595-601,605-613,620-631, 635-648,660-670,673-679,686-693,702-708,716-725,730-735,749-755,770-777, 805-811,831-837,843-851,854-860,863-869,895-901,904-914,922-929,933-938, 947-952,956-963,1000-1005，1008-1014，1021-1030，1097-1103，1120-1130，1132-1140， 1-213，269-592 和 992-1120 ;Seq ID No 307 的 9-16，33-39，47-59，65-79，81-95，103-108， 115-123，138-148，163-171，176-185，191-196，205-211，213-221，224-256，261-276， 294-302，357-363，384-390，95-111 和 161-189 ；Seq ID No 308 的 21-27，35-45，70-76， 92-105,129-143,145-155,161-166,170-191,204-211,214-231,234-246,249-255, 259-275 和 1-18 ；Seq ID No 309 的 21-35，45-53，56-64，69-97 和 1-16 ；SeqID No 310 的 25-33,41-47,61-68,86-101,106-114,116-129，134-142，144-156，163-176，181-190， 228-251,255-261,276-292,295-305,334-357,368-380,395-410,424-429,454-460, 469-482，510-516，518-527，531-546，558-570，579-606，628-636，638-645，651-656， 668-674,691-698,717-734,742-754,765-770,792-797,827-835,847-859,874-881, 903-909,926-933,942-961,964-977,989-1004,1010-1028,1031-1047,1057-1075, 1081-1095,1108-1117,1138-1144,1182-1189,1193-1206,1220-1229,1239-1246, 1257-1267,1271-1279,1284-1301,1312-1320,1329-1335,1341-1347, 1358-1371, 1399-1404,1417-1426,1458-1463,1468-1476,1478-1485,1493-1506,1535-1541, 1559-1574,1583-1590,1595-1601,1603-1611,1622-1628,1634-1644, 1671-1685, 1689-1696,1715-1720,1734-1746,1766-1775,1801-1806,1838-1844,1858-1871, 1910-1917,1948-1955,1960-1974,2000-2015,2019-2036,2041-2063,748-847 禾P 1381-1391 ；Seq IDNo 311 的 5-12，18-24，27-53，56-63，96-113，119-124，131-136， 157-163，203-209，215-223，233-246，264-273，311-316，380-389，393-399，425-433， 445-450,457-462,464-470,475-482,507-513,527-535,542-548,550-565,591-602, 607-613,627-642,644-664,673-712,714-732,739-764,769-782,812-818,826-838, 848-854，860-871，892-906，930-938，940-954，9 5 7 -973，990-998，1002-1021，1024-1033， 1037-1042,1050-1060,1077-1083,1085-1092,1100-1129,1144-1161,1169-1175, 1178-1189,1192-1198,1201-1207,1211-1221,1229-1239,1250-1270,1278-1292, 1294-1300,1314-1335,1344-1352,1360-1374,1394-1405,1407-1414,1416-1424, 1432-1452,1456-1462,1474-1497,1500-1510,1516-1522,1534-1542,1550-1559, 1584-1603，1608-1627，187-273 和 306-441 ；Seq ID No 312 的 70-80，90-97，118-125， 128-140，142-148，154-162，189-202，214-222，224-232，254-260，275-313，317-332， 355-360，392-398，425-432，448-456，464-470，476-482，491-505，521-528，533-546， 560-567，592-597，605-614，618-626，637-644，646-653，660-666，677-691 和 207-227 ；Seq ID No 313 的 5-19，26-34，37-55，57-66，69-83，86-102，115-134，138-143，154-172， 178-195，209-246，251-257，290-302，306-311 和 256-266 ;Seq ID No 314 的 10-20，22-28， 35-57,72-79,87-103,108-128，130-144，158-171，190-198，225-242，274-291，301-315，317-324，374-385 和 353-365 ;Seq ID No 315 的 4-9，17-30，34-54，59-66，73-94，118-130， 135-150,158-171,189-198,219-239,269-275,283-301,89-106 和 176-193 ；Seq ID No 316 的 14-20,22-74,77-86,89-99,104-109,126-135,154-165,181-195,197-212, 216-224,264-275 和 107-118 ；Seq ID No 317 的 4-18，21-38，63-72，101-109，156-162， 165-179，183-192，195-210，212-218，230-239，241-256，278-290，299-311，313-322，
332-341,348-366,386-401,420-426,435-450,455-460,468-479,491-498,510-518, 532-538, 545-552,557-563,567-573,586-595,599-609,620-626,628-636,652-657, 665-681 和 1-198 ;Seq ID No 318 的 4-10，16-38，51-68，73-79，94-115，120-125，132-178， 201-208, 216-223,238-266,269-295,297-304,337-342,347-356,374-401,403-422, 440-447，478-504，510-516，519-530，537-544 和 191-206 ;Seq ID No 319 的 12-40，42-48， 66-71,77-86,95-102,113-120,129-137，141-148，155-174，208-214，218-225，234-240， 256-267,275-283,300-306,313-321,343-350,359-367,370-383,398-405,432-439, 443-461，492-508，516-526，528-535 和 370-478 ；Seq ID No 320 的 6-14，20-37，56-62， 90-95,97-113，118-125，140-145，161-170，183-202，237-244，275-284，286-305，309-316，
333-359，373-401，405-412和 176-187 ；Seq ID No 321 的 33-44，50-55，59-80，86-101， 129-139，147-153，157—163，171—176，189—201，203—224，239—245，257—262，281—287， 290-297，304-320，322-331，334-350，372-390，396-401，71-88 和 353-372 ;Seq ID No 322 的 5-11，15-24，26-33，40-47，75-88，95-103，105-112 和 17-30 ；Seq ID No 323 的 5-11, 16-39，46-54，62-82，100-107，111-124，126-150，154-165，167-183，204-238，245-295， 301-313,316-335 和 8-16 ;Seq ID No 324 的 4-19，34-48，69-74，79-107，115-127， 129-135，143-153，160-169，171-182 和 142-153 ;Seq ID No 325 的 4-30，65-74，82-106， 110-120，124-132，135-140，146-175，179-184，190-196，217-223，228-233，250-267， 275-292，303-315，322-332 和 174-186 ；Seq IDNo 326 的 9-16，29-41，47-57，68-84， 87-109, 113-119, 162-180, 186-193, 195-201, 203-208, 218-230, 234-243, 265-271, 281-292,305-312,323-332,341-347,349-363,368-374,383-390,396-410,434-440, 446-452,455-464,466-473,515-522,529-542,565-570,589-600,602-613,618-623, 637-644，1019-1027，1238-1244，1258-1264，1268-1276，1281-1292，1296-1302 禾口 883-936 ；Seq IDNo 327 的 10-17，23-32，39-44，54-72，75-81，88-111，138-154，160-167， 178-185，201-210，236-252，327-334，336-342，366-376，388-400，410-430，472-482， 493-526，552-558，586-592，598-603，612-621，630-635，641-660 和 384-393 ；Seq ID No 328 的 4-22，24-39，50-59，73-84，100-105，111-117，130-138，155-161，173-178，182-189， 205-215,266-284,308-313,321-328,330-337,346-363,368-374,388-395,397-405, 426-434,453-459,482-492,501-507,509-515,518-523,527-544,559-590,598-612, 614-629，646-659，663-684，686-694，698-721 和 445-461 ;Seq ID No 329 的 14-22，27-33 和 3-17 ；Seq ID No 330 的 29-41，66-73，81-87，90-108，140-146，150-159，165-184， 186-196，216-226，230-238，247-253，261-269 和 126-140 ;Seq ID No 331 的 5-12，16-25， 27-33，36-45，60-68，83-88，103-126 和 86-101 ；Seq ID No 332 的 14-23，36-47，56-66， 84-89,94-105,111-127，140-153，160-174，176-183，189-203，219-225，231-237，250-257 和 194-227 ;Seq ID No 333 的 4-25，54-60，64-71，73-82，89-106，117-124，157-169，183-188，199-210，221-232，236-244，255-264 和 58-98 ;Seq ID No 334 的 13-19，26-36，
41-53,55-71,77-84,86-108,114-135，157-172，177-183，187-194，208-213，218-226， 110-125 和 156-170 ；Seq ID No 335 的 5-24，63-69，77-85，94-112，120-137，140-146， 152-159，166-172，179-187，193-199，206-212，222-228，234-240，244-252，257-264， 270-289，298-309，316-328，337-348，363-375，1-56 和 340-352 ；Seq ID No 336 的 18-39，
42-71，78-120，124-144，152-173，179-189，199-209，213-222，228-258，269-304，329-361， 364-372，374-389，396-441 和 313-327 ;Seq ID No 337 的 19-25，91-98，108-120，156-162， 168-174，191-204，211-216，232-266，272-278，286-308，316-321，327-333，344-355， 358-364，384-391，395-428，464-476，487-495，497-511，544-561，563-573，575-582， 588-594，10-25 和 322-338 ;Seq ID No 338 的 14-26，32-49，51-57，59-72，80-91，102-112， 119-125，147-161，164-173，175-183，188-213，217-222，246-254，260-276，282-303， 308-318,321-328,333-350,352-359,371-378,392-401,407-414,416-443,448-463, 471-484,490-497,501-514,519-527,539-551,557-570,578-590,592-598,600-610, 618-629,633-647,654-667,676-689,702-709,718-726,728-737,741-760,764-780, 786-795,808-826,836-842,845-852,865-874,881-887,931-945,949-957,968-974, 979-986，1003-1009，1023-1029 和 90-103 ;Seq ID No 339 的 11-16，37-56，60-66，69-77， 80-88，93-106，117-139，166-171 和 72-90 ；Seq ID No 340 的 59-84，123-133，145-150， 161-167,178-189 和 115-128 ；Seq ID No 341 的 15-33，39-46，52-64，74-87，108-124， 127-144，150-156，173-179，184-194，201-208，219-236，243-269，272-295，302-309， 343-349, 356-361,370-379,405-411,414-423,430-451,457-464,466-475,477-483, 496-502,507-522,541-548,557-563,571-577,579-585,590-605,626-642,650-662, 671-691,7 0 4 -7 1 0 , 751-7 6 9 , 7 7 5 - 781,7 8 6 - 791,7 9 4 -8 2 9 , 851-8 5 8 , 868 -8 7 8 , 8 8 4 -9 0 4, 913-919,931-939 和 132-142 ；Seq ID No 342 的 33-58，64-71，74-80，83-88，96-120， 122-139，146-157，167-177，207-213，220-225，236-242，264-279，300-305，326-336， 340-347，350-360，97-115 和 199-211 ；Seq ID No343 的 4-26，43-57，70-99，102-117， 121-133，142-148，151-168，170-183，192-220，235-249，258-279 和 30-41 ；Seq ID No 344 的 34-42，48-58，70-94，110-130，154-160，164-172，178-183，195-203，211-222，229-250， 256-261，274-284，286-292，312-323 和 222-233 ；Seq ID No 345 的 4-9，15-36，38-45， 49-74，78-88，100-112，136-191，211-220，226-233，239-246，254-274，287-307，316-322， 342-353，356-366，373-378，384-393，405-431，449-457，459-468，487-511，515-524， 529-541，544-552，562-568，571-576 和 208-280 ；Seq IDNo 346 的 10-27，31-37，39-54， 71-108,124-143 和 2-107 ;Seq IDNo 347 的 16-27，38-57，64-70，90-102，104-113， 116-137,160-166 和 1-80 ；Seq ID No 348 的 13-21，31-36，56-67，127-136，153-171， 173-180，184-200，214-222，225-231，239-263，267-273 和 135-159 ；Seq ID No 349 的 12-27,31-51,68-74,77-87,94-101,108-114,117-123,127-134,138-168,173-196, 201-207，212-217，227-237，247-257，264-280 和 205-223 ;Seq ID No 350 的 17-22，25-54， 70-76，92-100 和 98-110 ;Seq ID No 351 的 7-29，40-50，60-67，87-96，105-111，119-164， 172-199，206-212，220-227，237-259，272-279，282-293，295-309，313-319，321-328， 345-363，376-386 和 159-176 ;Seq ID No 352 的 4-19，24-30，36-43，50-68，71-89，93-106，141-152，154-172，179-197，199-215，229-239，246-252，255-263，281-298，319-325， 329-356, 358-368,374-390,397-409,420-429,432-444,450-456,459-475,483-494, 496-502，520-528，532-556 和 362-377 ；Seq ID No 353 的 18-25，40-62，77-85，91-97， 105-116，123-133，139-184，189-197 和 122-140 ；Seq ID No 354 的 4-49，52-58，62-70， 79-105, 109-133,142-150,163-168,206-214,220-228,233-240,243-254,274-281, 303-311,327-338,357-373,378-396,403-413,420-436,441-453,461-467,475-481, 484-498,506-512,514-521,523-529,562-579,589-595,598-603,615-648,714-722, 728-742，749-758，777-792，795-807 和 643-658 ；Seq IDNo 355 的 8-27，37-48，51-56， 72-79，87-106，120-138，140-147，167-176，187-197，205-216，222-229，234-239，243-249， 277-288,292-315,334-343,347-353,363-391,398-404,430-447,461-467,478-492, 498-507 和 456-470 ；Seq ID No 356 的 5-12，18-24，59-69，80-93，95-109，119-125， 130-137，139-147，158-163，168-176，182-202，206-215，222-239，241-249，267-277， 291-298，311-318，321-327，338-344，348-355，373-386，393-406，411-417，434-443， 446-465，473-484，514-521，532-553，584-594 和 221-237 ；Seq IDNo 357 的 4-14，27-34， 50-58，63-72，79-106，109-114，121-142，146-154，161-167，169-175，178-201，223-238， 249-254，259-264，278-292，294-312，319-330 和 167-191 ；Seq ID No 358 的 7-28，36-42， 50-61,63-80,122-152,161-174,176-191 和 140-190 ；SeqID No 359 的 20-57,59-65, 70-78，86-102，119-133，142-161，163-173，177-188，192-202，204-220，222-236，240-253， 279-319，326-331，337-383，390-399，406-412，420-427，431-438 和 381-395 ；Seq ID No 360 的 13-18，28-34，37-43，50-59，75-81,83-97，105-121，139-147，200-206，209-227， 231-247，260-271，318-327，366-381，388-394，399-406 和 182-201 ；Seq ID No 361 的 6-29,37-43,51-56,70-77,82-102,110-119,127-143,178-190,201-209,216-243, 261-269，281-292，305-313，327-339，341-354，356-373，391-397，423-429，438-445， 450-478和 21-314 ;Seq ID No 362 的 4-12，15-21，32-41，59-76，80-89，96-104和90-103 ； Seq ID No 363 的 9-28，30-41，44-54，69-74，77-82，90-97，104-123，125-135，149-155， 164-173，177-184，217-226，230-235，238-244，258-272，282-297，300-305，309-315， 317-322,327-336,348-362,368-374,380-387,400-411,414-424,451-458,460-466, 483-494, 497-503,506-511,521-528,540-553,569-587,598-606,628-642,661-681, 688-700，718-733，740-749，752-764，769-783，823-834，848-854，862-872，878-884， 886-898，915-920，938-951，954-961，963-972，982-989，996-1003，1010-1016，1021-1032， 1038-1044,1047-1057,1060-1070,1079-1088,1094-1102,1117-1127,1129-1135, 1142-1153,1158-1204,1212-1229,1234-1263,1269-1277,1308-1313,1327-1338, 1344-1376，1400-1415，1436-1443，1448-1458，1497-1504，1511-1522，1544-1566，3-82 和 509-576 ；Seq ID No 364 的 8-36，40-64，71-79，88-94，102-109，118-127，138-148， 151-159，163-174，192-198，200-206，220-233，268-273，290-301，304-309，316-323， 331-349，378-391,414-420,427-437,455-475，494-510，541-547，549-555，616-640，1-60, 55-139，212-308，386-458 和 458-624 ；Seq ID No 365 的 16-31，35-42，70-77，91-101， 120-130，132-140，143-153，185-190，195-202，215-222，228-238，241-251，257-264， 268-277,288-302,312-324,326-333,341-348,364-382,415-429,438-454,458-466,
20491-499,501-521 和 273-281 ;Seq ID No 366 的 8-14，32-57，74-149，155-177，179-212， 221-266，271-296，304-324，329-346，349-359，368-401，413-419，426-454，465-478， 493-510 和 466-490 ；Seq ID No 367 的 22-28，33-51，64-89，96-119，126-132，138-146， 152-159，161-169，172-179，193-198，205-211，221-231，235-254，273-280，297-303， 312-320，328-346，351-373，378-384，391-398，448-454，460-468，470-481，516-558， 574-593,597-602,613-623,626-646,649-656,668-673,675-683,696-708,715-722, 724-739，745-751，759-777，780-804，816-822 和 102-113 ;Seq ID No 368 的 12-28，41-91， 98-107，112-120，125-131，151-193，215-221，240-250，263-280 和 128-138 ；Seq ID No 369 的 16-24，32-38，46-62，68-81，90-105，127-133，144-150，160-166，178-184，186-202， 210-219，232-240，252-258，264-273，293-324，337-344，349-357，360-369，385-398， 410-416,419-427,441-449,458-476,508-515,523-539,544-549,562-569,571-579, 96-109 和 127-139 ;Seq ID No 370 的 19-25，28-34，56-61，85-97，110-116 和 39-53 ;Seq ID No 371 的 4-37，41-50，62-72，91-97，99-109，114-125，136-141，149-158，160-166， 201-215 和 27-225 ;Seq ID No 372 的 15-31，44-51，96-105，122-130，149-157，162-168， 178-183，185-192，198-204，206-213，221-234，239-245，248-255，257-266，289-335， 349-357，415-422，425-441，448-454，462-468 和 463-481 ;Seq ID No 373 的 5-31，39-55， 63-72，76-99，106-155，160-177，179-199，207-217，223-240，245-255，261-267，294-316， 321-343，354-378，382-452，477-488，529-536，555-569，584-591，593-612，620-627， 632-640，647-654，671-680，698-704，723-730，732-750，769-775，781-788，822-852 和 505-525 ；Seq ID No 374 的 3-18 ；Seq ID No 375 的 4-14 和 12-24 ；Seq ID No 376 的 4-11，22-30 和 12-25 ；Seq ID No377 的 5-12 和 4-18 ；Seq ID No 378 的 4-28 和 7-14 ；Seq ID No379 的 6-16 和 8-16 ;Seq ID No 380 的 4-15，18-33 和 24-36 ;Seq ID No 381 的 4-10， 16-21和 20-31 ；Seq ID No 382 的 6-19 ；Seq ID No 383 的 11-18和 3-10 ；Seq ID No 384 的 13-24 和 3-15 ；Seq ID No 385 的 15-27 和 7-16 ；Seq ID No 386 的 11-16 禾口 1-15 ；Seq ID No 387 的 4-16 和 9-21 ;Seq ID No 388 的 4-24，40-48，54-67 和 22-39 ;Seq ID No 389 的 6-30，34-55，62-68，78-106 和 68-74 ;Seq ID No 390 的 3-14 ;Seq ID No 391 的 9-19 和 6-21 ；Seq ID No 392 的 4-17 和 1-9 ；Seq ID No 393 的 5-30 和 1-8 ；SeqID No 394 的 4-16， 23-46，51-56 和 45-55 ;Seq ID No 395 的 7-16 ;Seq ID No 396 的 2-14 ;Seq ID No 397 的 4-36，43-65 和 50-62 ；Seq ID No 398 的 10-30 和 14-21 ；Seq ID No 399 的 9-17 和 1-10 ； Seq ID No 400 的 4-12 和 3-16 ；Seq ID No 401 的 4-15 和 5-23 ；Seq ID No 402 的 10-21 ； Seq ID No 403 的 6-16 ;Seq ID No 404 的 4-29，31-38 和 2-14 ;Seq ID No 405 的 4-35 和 33-42 ；Seq ID No406 的 2-17 ；Seq ID No 407 的 9-18，30-35 和 15-33 ；Seq ID No408 的 4-9 和 6-12 ；Seq ID No 409 的 3-17 ；Seq ID No 410 的 12-21，37-44，52-61，72-80 和 38-48 ；Seq ID No 411 的 4-10，29-44，54-61，69-78 和 13-27 ;Seq ID No 412 的 13-23， 36-53和 2-15 ;Seq ID No 413 的 4-25，28-46，56-72，81-99，120-132，134-142，154-160和 129-141 ；Seq ID No 414 的 4-15，24-33，35-41，64-86 和 21-33 ;Seq ID No 415 的 9-15 和 4-13 ；Seq ID No 416 的 4-11，13-19，34-48 和 15-32 ;Seq ID No 417 的 4-21 和 11-31 ;Seq ID No 418 的 23-57 和 38-50 ;Seq ID No 419 的 4-32 和 3-13 ;Seq ID No 420 的 4-10， 13-25，32-42，56-68，72-84 和 26—38 ；SeqID No 421 的 4-20，31-48，52-58，65-71，80-93，
2199-108，114-123和 37-49 ;Seq ID No 422 的 6-12，14-20和 3-25 ;Seq ID No 423 的 14-25， 27-38 和 5-14 ;Seq ID No 424 的 4-41，57-105，109-118，123-136，144-152 和 86-99 ;Seq ID No 425 的 6-19 ；Seq ID No 426 的 2-19 ；Seq ID No 427 的 14-47 和 1-14 ；Seq ID No 428 的 4-21，29-44 和 2-18 ；Seq ID No 429 的 23-29 和 10-28 ；Seq ID No 430 的 6-16, 22-36 和 11-22 ；Seq ID No 431 的 4-19，30-44 和 18-27 ；Seq ID No 432 的 5-15，37-45， 58-65 和 38-47 ；Seq ID No 433 的 4-15，23-34 和 4-15 ；Seq ID No 434 的 30-36，44-54， 79-85,101-114,138-152,154-164,170-175,179-200,213-220, 223-240, 243-255, 258-264,268-284和10-28 ；包含表IB的“相同区域”纵栏的氨基酸序列的肽，尤其是包含 如下氨基酸的肽Seq ID No 449 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 450 的 326-344，
326-348，338-354，371-392，801-809和877-901；Seq ID No 451 的893-906 ;Seq ID No452 的 51-69 ；Seq ID No 453 的 110-125 ；Seq ID No 454 的 291-305 ；Seq ID No 455 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 456 的 326-344，326-348，338-354，371-392，801-809 和 877-901 ；Seq ID No 457 的 893-906 ；Seq ID No 458 的 51-69 ；Seq ID No 459 的 110-125 ； SeqID No 460 的 291-305 ;Seq ID No 461 的 32-44 ;Seq ID No 462 的 399-410 ；表 2 的“氨 基酸从”到“氨基酸至”纵栏中指定的血清反应性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 218 的 120-143，138-161 和 156-179 ;Seq ID No 219 的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 222 的 74-90 ；Seq ID No 223 的 759-773 ；Seq ID No 224 的 237-260；Seq ID No 225 的 265-284 ；Seq ID No 226 的 65-74 ；Seq ID No 227 的 41-50 ；Seq ID No 229 的 163-174 ； Seq ID No 230 的 26-37 ；Seq ID No 232 的 174-189 ；Seq ID No 234 的 240-256 ；Seq ID No236 的 285-297 ；Seq ID No 238 的 238-247 ；Seq ID No 239 的 491-519 ；Seq ID No 243 的 114-140 ;Seq ID No 250 的 267-284 ;Seq ID No 252 的 439-453 ;Seq ID No 253 的 162-178 ；Seq ID No254 的 347-364 ；Seq ID No 255 的 699-715 ；Seq ID No 256 的 60-71 ； Seq ID No 257 的 244-257 ;Seq ID No 258 的 44-63 和 57-76 ;Seq ID No 260 的 185-196 ； Seq ID No 263 的 119-129 ;SeqID No 266 的 182-195 ;Seq ID No 267 的 32-44和 424-442 ； Seq IDNo 268 的 247-256 ;Seq ID No 269 的 678-694，785-805，55-77 和 72-94 ;Seq ID No 281 的 210-226 ；Seq ID No 289 的 37-59 ；SeqID No 296 的 13-29 ；Seq ID No 348 的 136-159 ；Seq ID No 349 的 205-222 ;Seq ID No 350 的 99-110 ;Seq ID No 351 的 160-176 ；Seq ID No 355 的 457-470 ；Seq ID No 356 的 221-237 ；Seq ID No357 的 167-190 ；Seq ID No 361 的 96-120 ;Seq ID No 364 的 399-417，503-519 和 544-563 ;Seq ID No 371 的 46-68，159-183 和 184-198 ；Seq ID No 372 的 463-481 ；表 4 的“氨基酸从” 到“氨基酸至”纵栏中指定的免疫原性表位；尤其是包含如下氨基酸的肽Seq ID No219的 110-129 和 168-184 ；Seq ID No 277 的 877-901，333-354，326-344 和 801-809 ;Seq ID No 347 的 l-54;Seq ID No 364 的 544-563，31-51，107-119，399-417 和 503-519 ;Seq ID No 218 的 120-198 ;Seq ID No 219 的 20-35 ;Seq ID No 221 的 118-201 ;SeqID No 242 的 48-132 ；Seq ID No 249 的 118-136 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No 254 的 347-364 ；Seq ID No 255 的 699-715 ；Seq ID No 258 的 50-76 ；Seq ID No 269 的 785-819 和 44-128 ；SeqID No 274 的 90-128 ；Seq ID No 289 的 314-384 ；Seq ID No 293 的
327-349；Seq ID No 304 的 242-314，405-478 和 23-100 ;Seq ID No305 的 129-210 ;Seq ID No 307 的 162-188 ；Seq ID No 310 的 750-772 ；Seq ID No 335 的 1-56 ；Seq ID No 337 的322-337 ；SeqID No 339 的 72-90 ；Seq ID No 345 的 374-395 ；Seq ID No 348 的 136-159 ； Seq ID No 358 的 141-164 ；Seq ID No 361 的 96-157 ；Seq ID No 363 的 1-82 ；Seq ID No 364的489-556 ；Seq ID No 371的159-183和49-133 ；包含表5的“推定的免疫原性氨基 酸”和“鉴别的免疫原性区域(aa)的位置”纵栏的氨基酸序列的肽，尤其是包含如下氨基酸 的肽Seq ID No 475 的 4-26，35-41，53-61，73-84，103-108，114-120，140-146，156-162， 192-208，214-219，227-233，239-252，260-268，284-297，1-48 和 113-133 ;Seq ID No 476 的 4-27，38-44，50-56，59-64，72-79，83-89，92-97，108-116，123-148，152-167，183-196， 200-220，232-244，255-261，265-274，282-302，309-317，1-79 和 231-302 ;Seq ID No 477 的 6-28，66-72，85-105，115-121，144-151，160-170，176-185，223-230，252-288，296-310， 319-333，367-374，458-464，471-480，483-488，520-528，530-549，559-564，593-601， 606-616,636-643,655-662,676-682,684-699,719-726,735-750,757-764,777-785, 799-810，812-843，846-853，868-873，880-889，891-899，909-929，934-940，963-969， 998-1004，1007-1014，1016-1022，1030-1046，1-80 和 808-821 ；Seq ID No 478 的 7-24, 35-41,75-81,91-114,122-132，137-144，148-156，183-192，194-200，212-228，233-238， 251-258，275-295，326-332，337-346，1-79 和 305-321 ；Seq ID No 479 的 31-38，42-52， 66-72,86-92,98-104,115-122,127-146，154-164，169-187，198-212，225-237，255-269， 13-92 和 135-142 ；Seq ID No 480 的 4-36，39-49，63-69，71-77，81-88，123-131，133-139， 160-169，174-180，188-194，210-217，273-278，289-300，317-334，336-341，383-401， 425-438，1-68,212-270 和 402-446 ;Seq ID No 481 的 21-29，31-42，49-63，72-79，81-93， 112-132，159-165，188-195，197-232，262-267，279-286，294-301，318-326，348-366， 381-405,409-426,436-465,471-480,484-492,497-505,521-544,554-561,567-577, 581-589,601-609,611-622,636-651,653-667,669-685,700-708,716-722,729-744, 749-766，780-786，789-811，814-864，1-57 和 84-106 ；Seq ID No482 的 6-24，35-48，57-63， 72-78,87-92，113-119，123-137，147-153，173-181,212-233 和 1-124 ；Seq ID No 483 的 13-34,62-69,78-83,86-91,98-104,107-115,146-159,179-188,195-205,209-221, 226-233,239-253,276-282,284-294,297-308,331-354,375-382, 388-399, 421-433, 449-458,464-469,472-491,508-513,525-531,534-550,575-593,601-618,629-635, 654-661，666-680，706-721，723-740，771-805，810-830，845-851 和 1-84 ；Seq ID No484 的 4-32,45-64,73-83,86-92,100-111,125-147,157-163,170-175, 177-188,226-232, 245-252，258-274，320-335，348-359 和 1-71 ;Seq ID No 485 的 13-40，43-71，76-83， 87-101,109-119,125-156,162-175,182-219,226-232,240-262,270-287,306-318, 326-342，344-408，414-444，449-456 和 1-51 ;Seq ID No 486 的 4-16，18-34，45-54， 99-108,134-140,203-212,241-257,266-274,279-291,308-315,330-336,355-370, 374-382，402-410，428-455，466-472，474-480，531-554，560-566，572-580，597-618， 632-660，664-674，676-685，691-705，708-735，750-768，1-87 和 342-480 ；表 6 的“氨基酸 从”到“氨基酸至”的纵栏中指定的血清反应性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽No 475 的 115-132 和 1-26 ；Seq ID No 476 的 33-55 ；Seq ID No 478 的 1-25 ；Seq ID No 479 的 37-61 ；SeqID No 480 的 1-24 ；Seq ID No 481 的 1-23 ；Seq ID No 482 的 46-60 ；Seq ID No 483 的 1-28，23-50 和 45-71 ；Seq ID No 484 的 1-22 和 17—38 ；Seq ID No 485 的 1-22 和17-38 ；Seq ID No 486的1-27，22-47和422-447 ；表7的“氨基酸从”到“氨基酸至”纵栏 中指定的免疫原性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 475的115-132和1_47 ； Seq ID No 476 的 1-55 ；Seq ID No 477 的 22-85 ；Seq I D No478 的 307-320 和 1-44 ；Seq ID No 479 的 15-76 和 40-92 ；SeqID No 480 的 1-59，213-269 和 403-445 ；Seq ID No 481 的 1-56 和 85-105 ；Seq ID No 482 的 37-121 ；Seq ID No 483 的 1-71 ；Seq IDNo 484 的 1-38 ；Seq ID No 485 的 1-38 ；Seq ID No 486 的 1-47。本发明也提供了生产根据本发明的无乳链球菌超免疫血清反应性抗原或其片段 的方法，包括在合适的表达系统中表达根据本发明的一个或多个核酸分子。此外，本发明提供了生产表达根据本发明的无乳链球菌超免疫血清反应性抗原或 其片段的细胞的方法，包括用根据本发明的载体转化或转染合适的宿主细胞。根据本发明提供了尤其是疫苗的药物组合物，其包含如本发明定义的超免疫血清 反应性抗原或其片段或如本发明定义的核酸分子。优选实施方案中，药物组合物进一步包含了免疫刺激物质，优选地选自尤其是聚 阳离子肽的聚阳离子聚合物、免疫刺激脱氧核苷酸(ODN)、含有尤其是KLKL5KLK的至少两 个LysLeuLys基团的肽、尤其是人生长激素的神经活性化合物、明矾(alumn)、弗氏完全或 不完全佐剂或它们的组合。更加优选的实施方案中，免疫刺激物质是聚阳离子聚合物和免疫刺激脱氧核苷酸 或含有至少两个LysLeuLys基团的肽和免疫刺激脱氧核苷酸的组合。还更优选的实施方案中，聚阳离子聚合物是聚阳离子肽，尤其是聚精氨酸。根据本发明，提供了根据本发明的核酸或根据本发明的超免疫血清反应性抗原或 其片段用于药物制备物的生产的用途，尤其是用于抗无乳链球菌感染的疫苗的生产。同此，也提供了至少结合于根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的选择 性部分的抗体或其至少有效部分。优选的实施方案中抗体是单克隆抗体。另一优选的实施方案中抗体的有效部分包含Fab片段。进一步优选的实施方案中抗体是嵌合抗体。还优选的实施方案中抗体是人源化抗体。本发明也提供了产生根据本发明的抗体的杂交瘤细胞系。此外，本发明提供了产生根据本发明的抗体的方法，特征在于如下的步骤 通过给予非人的动物如本发明中定义的超免疫血清反应性抗原或其片段启动 所述动物的免疫反应， 从所述动物移出含抗体的体液，以及 通过进一步纯化步骤处理含所述抗体的体液产生抗体。相应地，本发明也提供了一种产生根据本发明的抗体的方法，特征在于如下的步 骤 通过给予非人的动物如本发明中定义的超免疫血清反应性抗原或其片段启动 所述动物的免疫反应， 从所述动物移出脾或脾细胞， 生产所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞
挑选和克隆特异于所述超免疫血清反应性抗原或其片段的杂交瘤细胞， 通过所述克隆的杂交瘤细胞的培养和可选的进一步纯化步骤产生抗体。根据上面方法提供或生产的抗体可以用于治疗或预防无乳链球菌感染的药剂的 制备。根据另一方面，本发明提供了结合根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段 的拮抗剂。所述能够结合根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的拮抗剂可以通过 包含如下步骤的方法鉴别a)将分离的或固定化的根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段在允许候 选拮抗剂和所述超免疫血清反应性抗原或其片段结合的条件下，在能够提供应答于候选拮 抗剂和所述超免疫血清反应性抗原或其片段结合的可检测信号的组分的存在下，与所述候 选拮抗剂接触；以及b)检测应答于拮抗剂与超免疫血清反应性抗原或其片段结合的信号的存在或不 存在。能够降低或抑制根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段与其相互反应伴 侣的相互反应活性的拮抗剂可以通过包含如下步骤的方法鉴别a)提供了根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其高免疫片段，b)向所述超免疫血清反应性抗原或其片段，提供相互反应伴侣，尤其是根据本发 明的抗体，c)允许所述超免疫血清反应性抗原或其片段与所述相互反应伴侣的相互反应以 形成相互反应复合物，d)提供候选拮抗剂，e)允许候选拮抗剂和相互反应复合物之间发生竞争反应，f)测定候选拮抗剂是否抑制或降低超免疫血清反应性抗原或其片段与相互反应 伴侣的相互反应活性。根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段可用于所述超免疫血清反应性抗 原或其片段的相互反应伴侣的分离和/或纯化和/或鉴别。本发明也提供了体外诊断与根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的表 达相关的疾病的方法，包括测定根据本发明编码所述超免疫血清反应性抗原或其片段的核 酸序列的存在，或根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的存在。本发明也提供了尤其是无乳链球菌感染的细菌感染体外诊断的方法，包括分析根 据本发明编码所述超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸序列的存在或根据本发明的超 免疫血清反应性抗原或其片段的存在。此外，本发明提供了根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的用途其 用以产生结合于所述超免疫血清反应性抗原或其片段的肽，其中所述肽是抗促成素 (anticaline)0本发明也提供了根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的用途，其用以生 产功能性核酸，其中所述功能性核酸选自适体(aptamer)和镜面体(spiegelmers)。根据本发明的核酸分子也可用于功能性核糖核酸的生产，其中所述功能性核糖核
25酸选自核酶、反义核酸和siRNA。本发明有利地提供了使用来自多个人血浆合并物的抗体制备物和来源于无乳链 球菌基因组的表面表达文库，从无乳链球菌鉴别出来的一套有效的、相关的和全面的分离 的核酸分子和它们编码的超免疫血清反应性抗原或其片段。因而，本发明满足了在制备抗 体和鉴别有效对抗无乳链球菌感染的化合物的过程中有用的无乳链球菌抗原、疫苗、诊断 和产品的广泛需要。有效疫苗应当由所有株表达的并能诱导抗无乳链球菌细胞表面组分的高亲和力、 丰富抗体的蛋白质或多肽组成。对于调理作用，抗体应当是IgGl和/或IgG3，对于粘附和毒 素作用的中和，是任何IgG亚型和IgA。化学限定的疫苗必须是明确地比全细胞疫苗优良， 因为与人类组织交叉反应或抑制调理作用的无乳链球菌的组分能被去除，并且诱导保护抗 体和/或保护免疫反应的个体蛋白质能被挑选出来。本发明采用的方法是基于GBS蛋白质或肽与人血清中存在的抗体的相互作用。人 免疫系统产生的并且在人血清中存在的抗无乳链球菌抗体是抗原蛋白质的体内表达和它 们的免疫原性的指征。另外，在用个体选择或产生的血清进行的第二和第三轮筛选中处理 抗原蛋白质，所述抗原蛋白质是使用预选血清的合并物通过细菌表面展示表达文库鉴别 的。因而，本发明提供了作为药物组合物尤其是预防无乳链球菌感染的疫苗的一套有效、相 关、全面的GBS抗原。在鉴别根据本发明的一全套抗原的抗原鉴别程序中，用一些血清合并物或血浆级 分或其它合并的含有抗体的体液(抗体合并物)筛选了至少两个不同的细菌表面表达文 库。抗体合并物来源于已经测试了抗无乳链球菌抗原化合物的血清收集物，例如全部细胞 提取物和培养上清蛋白质。优选地，使用三个截然不同的血清收集物，得自ad 1.健康怀孕 妇女，子宫颈和肛门直肠GBS携带测试阴性，ad 2.健康怀孕妇女，子宫颈和/或肛门直肠 GBS携带测试阳性，其新生儿仍然无GBS (尽管用了抗生物预防)，ad 3.低于45岁没有临 床疾病的成人。为了考虑是超免疫的并因而在本发明采用的筛选方法中是相关的，血清必 须与多个GBS特异性抗原反应。如本发明中使用的表达文库应当允许所有可能抗原的表达，例如源自无乳链球 菌所有分泌的和表面蛋白质。细菌表面展示文库由在细菌宿主膜的两个挑选的外膜蛋白 质(LamB和FhuA)的呈示无乳链球菌一(总)套表达肽序列的细菌宿主的重组文库表示 {Georgiou, G. , 1997} ； {Etz, H.等人，2001}。使用重组表达文库一个优点是鉴别的超免疫 血清反应性抗原可以立即由筛选的和挑选的表达超免疫血清反应性抗原的克隆的编码序 列的表达产生，没有进一步的重组DNA技术或必要的克隆步骤。进一步用一或多个额外轮的筛选，分析通过根据本发明描述的程序鉴别的全套抗 原。所以，使用了被鉴别有免疫原性的个体抗体制备物或产生的抗所选肽的抗体。根据优 选实施方案，用于第二轮筛选的个体抗体制备物来源于显示抗体滴度高于某个最低水平的 怀孕妇女和非孕成人，例如抗体滴度高于80百分数的测试人(患者或健康个体)血清，优 选地高于90百分数，尤其高于95百分数。在第二轮筛选使用这样高滴度的个体抗体制备 物允许超免疫血清反应性抗原和其片段从无乳链球菌的非常有选择性的鉴别。全面筛选过程之后，通过一系列ELISA和Western斑点试验在第二轮筛选中测试 了挑选的抗原蛋白质以评价它们对大量的人血清收集物(最少 150健康和患者血清)的免疫原性，所述抗原蛋白质在原核表达系统中不能表达的情况下表达为重组蛋白质或体外 翻译产物，或者鉴别的抗原性肽(合成产生)。个体抗体制备物(其也可是挑选的血清)允许所有超免疫血清反应性抗原最有希 望的候选物从第一轮的所有有希望的候选物中的选择性鉴别是重要的。所以，优选地至少 10个个体抗体制备物(即来自至少10个已经遭受所选病原体感染的不同个体的抗体制备 物(例如血清))应当用于在第二轮筛选中鉴别这些抗原。当然，也可使用少于10个个体 制备物，然而，步骤的选择性与低数量的个体抗体制备物可能不是最佳的。另一方面，如果 给定的超免疫血清反应性抗原(或其抗原片段)被至少10个个体抗体制备物，优选地至少 30个，尤其是至少50个个体抗体制备物识别，那么超免疫血清反应性抗原的鉴别对正确鉴 别也有足够的选择性。当然也可以与尽可能多的个体制备物(例如与多于100或甚至与多 于1，000个)测试超免疫血清反应。所以，根据本发明的方法之超免疫血清反应抗体制备物的相关部分应当优选地至 少10个，更加优选地至少30个，尤其是至少50个个体抗体制备物。或者(或联合地)超 免疫血清反应性抗原优选地也可用第二轮筛选中使用的至少20%，优选地至少30%，尤其 是至少40%的所有个体抗体制备物进行鉴别。根据本发明的优选实施方案，用于第二轮筛选个体抗体制备物从其制备的血清通 过它们抗无乳链球菌的滴度(例如抗这个病原体的制备物，例如裂解物，细胞壁组分和重 组蛋白质)进行挑选。优选地，当ELISA中全生物体(总裂解物或总细胞)用作抗原时， 挑选有总IgA滴度高于300U尤其是高于500U的和/或IgG滴度高于5，000U尤其是高于 10，000U(U =单位，从在给定稀释度的OD4tl5nm读数计算)的一些血清。人免疫系统产生的抗链球菌、并存在于人血清中的抗体是抗原蛋白质的体内表达 和它们的免疫原性的指征。血清抗体识别的线性表位之识别能基于如4-5个氨基酸短的序 列。当然，它不是一定意味着这些短肽能够体内诱导给定的抗体。为了那个原因，定义的表 位、多肽和蛋白质进一步地在动物(主要是小鼠)中测试它们诱导抗体内挑选蛋白质的抗 体的能力。优选的抗原位于细胞表面或被分泌，并且因而可胞外接近。期望抗细胞壁蛋白质 的抗体起多个作用抑制粘附、干扰营养的获得、抑制免疫逃避和促进噬菌作用{Hornef， Μ.等人，2002}。抗分泌蛋白质抗体对它们作为毒素或毒力组分的功能的中和是有益的。细 菌通过分泌蛋白质相互联系也是已知的。抗这些蛋白质之中和抗体将干扰链球菌类之间或 链球菌内的促进生长的联系(cross talk)。生物信息分析(信号序列、细胞壁定位信号、跨 膜结构域)证明对于评价细胞表面定位或分泌是非常有用的。实验室方法包括有相应表位 的抗体和蛋白质从人血清的分离，以及小鼠中抗细菌表面展示筛选挑选的(多)肽的免疫 血清的产生。这些血清然后作为下面试验中的试剂用于第三轮筛选在不同条件下生长的 无乳链球菌的细胞表面染色(FACS或显微镜)、中和能力的测定(毒素、粘附)以及调理作 用和噬菌作用的促进(体外噬菌试验)。为了所述目的，将细菌大肠杆菌菌落直接注射进小鼠，收集免疫血清并在相关体 外试验中测试功能性调理或中和抗体。或者，可以使用肽或蛋白质作为底物从人或小鼠血 清纯化特异性抗体。针对无乳链球菌的宿主防御主要依赖调理噬菌性杀死机制。通过疫苗接种诱导高亲和力的调理和中和类型的抗体帮助先天免疫系统清除细菌和毒素。这个使得根据本发明 的方法成为GBS抗原蛋白质鉴别的最佳工具。皮肤和粘膜的膜是强大的抗链球菌入侵的屏障。然而，一旦皮肤或粘附的膜被破 坏，第一道非适应性细胞防疫通过补体和噬菌细胞尤其是多形核白细胞(PMN)开始它的合 作作用。这些细胞能被当作清除入侵细菌的基石。因为无乳链球菌是主要的细胞外病原体， 主要的抗链球菌适应性反应来自免疫系统的体液途径，并由三个主要机制介导调理作用 的促进、毒素的中和和粘附的抑制。相信调理作用因为它对有效噬菌作用的要求是尤其重 要的。对于有效的调理作用，为了 PMN通过IgG分子Fc片段或激活的C3b的受体的识别， 微生物表面必须用抗体和补体因子包被。调理作用之后，链球菌被吞噬和杀死。结合于细 菌细胞表面上的特异性抗原的抗体起附着于PMN的配体和促进噬菌作用的作用。期望结合 于粘附素和其它细胞表面蛋白质的非常一样的抗体中和粘附以及阻止群集。本发明提供的 抗原的选择因而非常适于鉴别将导致抗动物模型或人类中抗感染保护的那些抗原。根据此处使用的抗原鉴别方法，本发明惊人地提供了尤其如下描述的一套全面的 无乳链球菌新型核酸和新型超免疫血清反应性抗原和其片段。根据一个方面，本发明尤 其涉及编码超免疫血清反应性抗原的核苷酸序列，所述序列列于序列列表中Seq ID No 1-217,435-448和463-474，以及代表超免疫血清反应性抗原的相应的编码氨基酸序列列 于序列列表中 Seq ID No 218-434，449-462 和 475-486。本发明优选实施方案中，提供了其全长展示了与Seq ID No 14，90，157-216列 出的核苷酸序列70%相同性的核酸分子。最优选的是包含其全长与Seq ID No 14,90, 157-216列出的核酸分子至少80%或至少85%相同性的区域之核酸。在这点上，核酸分子 就其全长与Seq ID No 14，90，157-216列出的核酸分子至少90%、91 %、92%、93%、94%、 95 %或96 %相同是尤其优选的。此外，有至少97 %相同性的那些是优选的，有至少98 % 和至少99%的那些是尤其高度优选的，有至少99%或99. 5%是更加优选的，有100%相同 性是尤其优选的。另外，这点上优选实施方案是编码基本上保留了与Seq ID No 14,90, 157-216列出的所述核酸编码的成熟多肽相同生物功能或活性的超免疫血清反应性抗原或 其片段的核酸。如本领域已知并此处使用的相同性是通过比较序列测定的两个或两个以上多肽 序列或两个或两个以上多核苷酸序列之间的关系。本领域中，相同性也指多肽或聚核苷 酸序列之间序列相关的程度，就如在本情况下可以是这样的序列串(strings)之间的匹配 测定的。能很容易地计算相同性。虽然有许多方法测量两个聚核苷酸或两个多肽序列之 间的相同性，所述术语对于技术人员是众所周知的(例如分子生物学中的序列分析，von Heinje, G.，Academic Press，1987)。设计测定相同性的优选方法以给予测试的序列之间 最大的匹配。在计算机程序中编码测定相同性的方法。测定两个序列之间相同性的优选 计算机程序方法包括但不限于GCG程序包{Devereux，J.等人，1984}、BLASTP, BLASTN和 FASTA {Altschul, S.等人，1990}。根据本发明的另一方面，提供了展现与Seq ID No 1，3，5-13，15，18-25，27-31， 33-36，39-68，70-85，92-100，103-126，128-145，147，149-156，217，435-448 和 463-474 列 出的核酸序列有96%或高于96%，尤其是100%序列相同性的核酸分子。根据本发明的另一方面，提供了与核酸分子具有98 %或高于98 %，尤其是100 %序列相同性的核酸分子，所述核酸分子与Seq ID No 32，86，91，101，127列出的核酸序列相同。根据本发明的核酸分子作为第二备择方案也可是至少基本上互补于上述第一备 择方案的核酸的核酸分子。如此处使用地，互补是指核酸链经由Watson-Crick碱基配对与 第二个核酸链是碱基配对的。如此处使用地基本上互补的是指碱基配对不发生在各个链所 有的碱基而留有一定数量或百分比的未配对或错配的碱基。正确配对碱基的百分比优选地 是至少70%，更加优选地80%，甚至更加优选地90%以及最优选地高于90%的任何百分 比。要注意70%配对碱基的百分比被认为有同源性，具有这个程度配对碱基对的杂交被认 为是严格的。这种严格杂交的杂交条件可以从分子生物学现代试验方案(John Wiley and Sons, Inc. ,1987)获得。更加特别地，杂交条件如下 例如在 5xSSPE，5xDenhardt' s 试剂，0. 1% SDS，100g/mL 剪切的 DNA 中在 68°C 进行的杂交· 0. 2xSSC，0. 1% SDS中在42°C的中等严格清洗· 0. IxSSC, 0. 1% SDS 中在 68°C 的高严格清洗有50% GC含量的基因组DNA具有大约96°C的TM。对于1 %的错配，Tm降低大约 1°C。另外，此处描述的任何进一步的杂交条件原则上也可应用。当然，编码与如本发明鉴别的那些相同的多肽分子之所有核酸序列分子包括任何 公开的给定编码序列，因为遗传密码的简并性可直接应用以清楚地测定编码给定多肽分子 的所有可能的核酸分子，即使这样简并的核酸分子的数量可以很高。这个也可应用于给定 多肽的片段，只要在免疫接种这点上所述片段编码适合用作例如作为主动或被动疫苗的多 肽。根据本发明的核酸分子作为第三备择方案也能是包含了根据上面总结的根据本 发明的核酸分子第一和第二备择方案的核酸分子至少15个碱基的延伸的核酸。优选地，碱 基形成了碱基连续的延伸。然而，所述延伸由许多碱基分开的两个或两个以上的基团组成， 也在本发明的范围内。本核酸优选地由此处公开的序列至少20个，甚至更加优选地至少30个，尤其是至 少50个连续碱基组成。由于用途的计划区域(例如作为(PCR)引物、探针、(例如在(DNA) 芯片上的)捕获分子等等)，很容易地优化合适的长度。优选的核酸分子含有一个或多个表 1和2中列出的推定的免疫原性氨基酸序列的至少连续15个碱基部分，尤其是表2的有高 于10分，优选地高于20分，尤其是有高于25分的序列。尤其优选的是含有本应用的序列方 案中任何序列的DNA序列连续部分的核酸，所述核酸与公开的无乳链球菌株NEM316 (ATCC 12403)基因组({Glaser，P.等人，2002} ；GenBank登陆号AL732656)和/或任何其它公开 的无乳链球菌基因组序列或其部分，尤其是血清型V的2603V/R(A909)株{Tettelin，H.等 人，2002}) ；GenBank登陆号AE009948)，显示了一或多个，优选地多于2个，尤其是多于5个 不相同的核酸残基。尤其优选的不相同的核酸残基是导致不同氨基酸残基的残基。优选地， 核酸序列编码与上面提到的公开的无乳链球菌对应物具有至少1个，优选地至少2个，优选 地至少3个不同氨基酸残基的多肽。这样分离的多肽也是优选的，所述多肽是此处例如序 列列表中提到的蛋白质(或全蛋白质)的片段，具有至少6、7或8个氨基酸残基并由这些
29核酸编码。根据本发明的核酸分子作为第四备择方案也可是在严格杂交条件下退火于根据 上面总结的第一、第二和第三备择方案的本发明任何核酸的核酸分子。严格杂交条件一般 是此处描述的那些。最后，根据本发明的核酸分子作为第五备择方案也可是由于遗传密码的简并性否 则能杂交根据上面总结的第一、第二、第三和第四备择方案的根据本发明任何核酸分子的 任何核酸分子之核酸分子。这种核酸分子指的是优选地根据本发明的核酸编码根据本发明 的超免疫血清反应性抗原或其片段的事实。这种核酸对于根据本发明的核酸分子的检测， 并因而对例如无乳链球菌的各个微生物的诊断以及与这种微生物有关的任何疾病或疾病 状态尤其有用。优选地，杂交将在如上面描述的第四备择方案描述的严格条件下发生或进 行。如此处使用的核酸分子一般指的是任何核酸分子或脱氧核糖核酸分子，可以是非 修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。因而，例如，如此处使用的核酸分子在其它之中指 的是单和双链DNA，单和双链RNA的混合物的DNA，单和双链区域的混合物的RNA，包含可以 是单链、或更加一般地双链、或三链、或单和双链区域混合物的DNA和RNA的杂交分子。另 外，如此处使用的核酸分子指的是包含RNA、或者DNA、或者RNA和DNA的三链区域。这样区 域的链可以来自相同的分子或来自不同分子。这些区域可以包括所有的一个或多个分子， 但更一般地只涉及一些分子的区域。一个三螺旋区域的分子通常是寡核苷酸。如此处使用 地，术语核酸分子包括如上面描述的含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因而，有为了 稳定性或为了其它原因而修饰的骨架的DNA或RNA是此处术语所指的“核酸分子”。另外， 包含例如次黄嘌呤核苷的异常碱基或例如三苯甲基化碱基的修饰碱基的DNA或RNA(只提 及两个例子)是如此处使用的术语的核酸分子。将理解已经对有本领域技术人员已知的很 多有用目的之DNA和RNA进行非常多种的修饰。如此处采用的术语核酸分子包含这样化学、 酶或代谢修饰形式的核酸分子，以及病毒和其中包括简单和复杂细胞的细胞特征的化学形 式的DNA和RNA。术语核酸分子也包含通常指的是寡核苷酸的短核酸分子。“多核苷酸”和 “核酸”或“核酸分子”通常此处交替使用。本发明提供的核酸分子也包括众多的独特的片段，比无乳链球菌编码区域的序列 列表中列出的核酸分子序列更长和更短，能通过标准克隆方法产生。为了是独特的，片段必 须有足够的大小使其能从其它已知的核酸序列中区分出来，最容易通过将任何挑选的无乳 链球菌片段与例如GenBank的计算机数据库中的核苷酸序列比较而测定。另外，能对本发明包含的核酸分子和多肽进行修饰。例如，能进行不影响核酸编码 的多肽的核苷酸替代，因而编码超免疫血清反应性抗原或其片段编码的任何核酸分子也包 含在本发明内。此外，使用例如标准克隆技术的标准技术能将编码本发明提供的超免疫血清反应 性抗原或其片段的任何核酸分子功能性地联接于任何期望的调节序列，不管是无乳链球菌 调节序列或异源性调节序列、异源性先导序列、异源性标记序列或产生融合蛋白的异源性 编码序列。本发明的核酸分子可以是例如mRNA或cRNA的RNA形式，或者包括例如通过克隆 得到的或化学合成技术产生的cDNA和基因组DNA或其组合的DNA形式。DNA可以是三链、双链或单链。单链DNA可以是编码链，也已知为正义链，或者它可以是非编码链，也指的是 反义链。本发明还涉及此处上面描述的核酸分子的变异体，所述变异体编码具有序列列表 中列出的推算的无乳链球菌氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原和其片段的片段、类似物 和衍生物。核酸分子的变异体可以是天然发生的变异体，例如天然发生的等位基因变异体， 或者它可以是不知道是天然发生的变异体。可以通过诱变技术制造核酸分子这样非天然发 生的变异体，包括应用于核酸分子、细胞或生物体的那些。在这点的变异体之中，变异体是不同于前面提到的核酸分子，差别在于有核苷酸 替代、删除或增加的核酸。替代、删除或增加可包括一个或多个核苷酸。可在编码或非编码 区或者这两个区域改变变异体。编码区的改变可产生保守或非保守氨基酸替代、删除或增 加。优选的是编码变异体、类似物、衍生物或片段或者片段的变异体、类似物或衍生物的核 酸分子，所述核酸分子具有如序列列表中列出的无乳链球菌序列，其中以任何的联合形式 少数、5至10个、1至5个、1至3个、2个、1个或没有氨基酸被替代、删除或增加。这些之中 尤其优选的是沉默替代、增加或删除，它们不改变序列列表中列出的无乳链球菌多肽的特 性和活性。在这点也尤其优选的是保守替代。根据本发明的肽和片段也包括修饰的表位，其中优选地根据例如{Tourdot，S.等 人，2000}中公开的法则修饰或替代给定的表位的一个或两个氨基酸，以及编码这样修饰的 表位的核酸序列。很清楚根据本发明的表位涵盖了通过改进、保存或至少不显著阻碍表位的T细胞 激活能力的氨基酸交换而衍生于本表位的表位。所以，本表位也涵盖了不含有源于无乳链 球菌的原始序列但是激发相同或优选地改进的T细胞反应的表位。这些表位指的是“不规 则变化的”；它们需要具有对MHC/HLA分子相似的或优选地对更大的亲和力，并且它们需要 以相似或优选地更强的方式刺激指向原始表位的T细胞受体(TCR)的能力。能通过合理设计获得不规则变化的表位，即考虑如例如{Rammensee，H.等人， 1999}描述的单个残基对结合于MHC/HLA的作用，联合可能与TCR相互作用的残基的系统交 换以及用指向原始表位的T细胞测试得到的序列。这样的设计对于的本领域技术人员是可 能而无需过度的试验。另一个可能性包括用指向原始表位的T细胞对肽库的筛选。优选的方式是合成肽 库的位点扫描。这样的方法已经在例如{Hemmer，B.等人，1999}有详细描述并且此处给予参考。作为本衍生氨基酸序列代表的表位或不规则变化的表位的备择方案，也能采用模 仿这些表位的物质，例如“肽模仿物”或“回复-反_肽”(retro-inverso-p印tides)。改进的表位设计的另一方面，是带有增加其刺激T细胞的能力的物质之制剂或修 饰。这些包括T辅助细胞表位、脂质或脂质体或如W001/78767中描述的优选的修饰。增加表位T细胞刺激能力的另一方法是带有免疫刺激物质的制剂，例如象白细 胞介素-2、-7、-12、-18、I和II型干扰素(IFN)的细胞因子或化学因子，尤其是IFN-γ、 GM-CSF、TNF- α、flt3 配体等。另外如此处讨论地，关于本发明的核酸分子试验，例如如上面讨论的本发明的核 酸分子可以用作RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针以分离编码本发明多肽的全长cDNA和
31基因组克隆，以及分离与本发明核酸分子具有很高的序列相似性的其它基因的cDNA和基 因组克隆。这样的探针一般包含至少15个碱基。优选地，这样的探针将具有至少20个、至 少25个或至少30个碱基，可以具有至少50个碱基。特别优选的探针将具有至少30个碱 基，将具有50个或更少的碱基，例如30、35、40、45或50个碱基。例如，使用已知的DNA序列通过筛选相关文库分离本发明的核酸分子的编码区域 以合成寡核苷酸探针。具有互补于本发明基因序列的序列的标记寡核苷酸然后用于筛选 cDNA、基因组DNA或mRNA文库以测定探针杂交于文库的哪些成员。如此处进一步讨论地，关于核酸分子试验，本发明的核酸分子和多肽可以用作开 发尤其是人类疾病的疾病的治疗和诊断的试剂和物质。作为寡核苷酸的本发明的核酸分子能用于此处描述的方法中，但是优选地是PCR， 以测定此处鉴别的无乳链球菌基因是否全部或部分存在于例如血液的感染组织和/或在 其中转录。已经认识到这样的序列也将在病原体已经达到的感染阶段和感染类型的诊断有 用途。为了这个和其它的目的，可以使用如此处描述的包含至少一个根据本发明的核酸的 阵列。根据本发明的核酸分子可以用于核酸分子和含有这些核酸的生物体或样品的检 测。优选地这样的检测是为了诊断，更加优选地是为了与无乳链球菌的存在或丰度相关的 或相联的疾病的诊断。感染了无乳链球菌的特别是哺乳动物尤其是人的真核细胞(此处也是“个体”)是 可以鉴别的，方法是通过各种技术在DNA水平检测的根据本发明的任何核酸分子的检测。 能够获得为了从其它生物体区分无乳链球菌的优选的候选核酸分子。本发明提供了诊断源自无乳链球菌感染的疾病的方法，包含从个体分离的或来源 于个体的样品测定具有序列列表中列出的核酸分子序列的核酸分子表达水平的增加。能使 用本领域中众所周知的核酸分子定量的方法测量核酸分子的表达，例如PCR、RT-PCR、RNase 保护、Northern斑点、其它的杂交方法和此处描述的阵列。如此处使用的分离的是指“通过人工”从其天然状态分离；即，如果它天然发生，它 将被改变或从其原始环境去除，或两个都有可能。例如，天然存在于活的生物体的天然发生 的核酸分子或肽在其天然状态是不“分离的”，但是从其天然状态的共存物质中分离的相同 的核酸分子或多肽是“分离的”，如此处采用的术语。作为分离的部分或下面的分离，例如为 了诱变形成融合蛋白质以及为了宿主中的增殖或表达，这样的核酸分子能连接于例如DNA 的其它的核酸分子。分离的核酸分子单独或连于例如载体的其它核酸分子能被引入培养的 或全生物体的宿主细胞。引入培养的或全部生物体的宿主细胞，这样的DNA仍然将是分离 的，如此处使用的术语，因为它们将不是它们天然发生的形式或不在它们天然发生的环境 中。相似地，核酸分子和多肽可以发生在组合物中，例如介质制剂、核酸分子或多肽引入例 如细胞内的溶液、化学或酶反应的组合物或溶液，例如，它们不是天然发生的组合物，在此 处采用的那个术语的意义之内，在那里仍然是分离的核酸分子或多肽。根据本发明的核酸可以是化学合成的。或者，核酸能通过本领域的技术人员已知 的方法从无乳链球菌中分离。根据本发明的另一方面，通过使用此处描述的抗原鉴别方法提供了一套全面的新 型超免疫血清反应性抗原和其片段。本发明优选的实施方案中，提供了包含此处描述的任何一个核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原及其片段。本发明的另一优 选实施方案中，提供了包含选自如Seq ID No 231，307，374-433中表示的多肽序列之氨 基酸序列的一套新型超免疫血清反应性抗原及其片段。本发明另一优选的实施方案中， 提供了包含选自 Seq ID No 218，220，222-230，232，235-242，244-248，250-253，256-285， 287-302，309-317，320-343，345-362，364，366-373，434，449-462 和 475-486 中表示的多肽 序列之氨基酸序列的一套新型超免疫血清反应性抗原及其片段。本发明另一优选实施方案 中，提供了包含选自Seq ID No 249，303，308，318，344中表示的多肽序列之氨基酸序列的 一套新型超免疫血清反应性抗原及其片段。如本发明提供的超免疫血清反应性抗原及其片段包括序列列表中列出的任何多 肽，以及如下的多肽具有与序列列表中列出的多肽至少70%相同性，优选地与序列列表 中列出的多肽至少80 %或85 %相同性，更加优选地与序列列表中列出的多肽至少90 %相 似性(更加优选地至少90%相同性)以及仍然更加优选地与序列列表中列出的多肽至 少95%、96%、97%、98%、99%或99. 5%相似性(仍然更加优选地至少95%、96%、97%、 98%、99%或99. 5%相同性)，也包括这样的多肽的部分，所述多肽一般有含有4个氨基酸， 更加优选地至少8个，仍然更加优选地至少30个，仍然更加优选地至少50个氨基酸，例如 4，8，10，20，30，35，40，45或50个氨基酸的这样的多肽部分。本发明还涉及这些超免疫血清反应性抗原及其片段的片段、类似物和衍生物。术 语“片段”、“衍生物”和“类似物”当指的是其氨基酸序列列于序列列表中的抗原时，是指基 本上保留了与这样的超免疫血清反应性抗原及其片段相同的或相似的生物功能或活性的 多肽。超免疫血清反应性抗原及其片段的片段、衍生物或类似物可以是1)其中一个或 多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地保守的氨基酸残基)替代的一种，并 且这样替代的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码编码的一个，或者2)其中一个或多 个氨基酸残基包括取代基团的一种，或者3)其中成熟的超免疫血清反应性抗原及其片段 与例如增加超免疫血清反应性抗原及其片段半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)的另一种 化合物融合的一种，或者4)其中额外的氨基酸融合于成熟的超免疫血清反应性抗原及其 片段的一种，例如先导或分泌序列或用于成熟超免疫血清反应性抗原及其片段的纯化的序 列或前蛋白质序列。这样的片段、衍生物和类似物认为在本领域技术人员此处教义的范围 内。本发明也涉及不同的无乳链球菌分离物的抗原。基于此处公开的核酸和氨基酸 序列可以很容易地分离这样的同源物。至今有9个截然不同的血清型，分型基于血清型特 异性抗血清。对于每一个血清型能相应地测定任何抗原的存在。另外，测定如脓性链球菌 (S. pyogenes) sic基因{Hoe，N.等人，2001}描述的各种血清型中特定抗原的变异性是可能 的。各种血清型对不同GBS感染的作用在不同年龄组和地理区域是不同的。期望最有价值 的保护抗原在各种临床株之中是保守的是一个很重要的方面。在这点序列列表中列出的超免疫血清反应性抗原及其变异体、类似物、衍生物和 片段，以及片段的变异体、类似物和衍生物在本发明尤其优选的实施方案中。额外地，包含 这样的超免疫血清反应性抗原及其变异体、类似物、衍生物和片段以及片段的变异体、类似 物和衍生物的融合多肽也包含在本发明中。使用标准技术能很容易地制造这样的融合多肽
33和蛋白质以及编码它们的核酸分子，包括生产和表达编码融合蛋白质的重组聚核酸的标准 重组技术。由于保守氨基酸替代而与参比不同的那些在优选变异体之中。这样的替代是多肽 中给定氨基酸被另一个同样特性的氨基酸替代的那些。一般视为保守替代是脂肪性氨基酸 Ala, Val, Leu和Ile中互相的取代；羟基残基Ser和Thr的交换，酸性残基Asp和Glu的 交换，酰胺残基Asn和Gln之间的替代，碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香基残基Phe和 Tyr之间的取代。在这点上进一步尤其优选的是具有序列列表中列出的任何多肽之氨基酸序列的 变异体、类似物、衍生物和片段，以及片段的变异体、类似物、衍生物，其中几个、少数、5至 10个、1至5个、1至3个、2个、1个或没有氨基酸残基以任何联合形式被替代、删除或增加。 这些之中尤其优选的是不改变本发明多肽的特性和活性的沉默替代、增加和删除。在这点 上也尤其优选的是保守替代。最高度优选的是具有序列列表中列出的没有替代的氨基酸序 列的多肽。优选地以分离的形式提供本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段，优选地是纯 化为同质的。包含具有序列列表中列出的氨基酸序列的多肽的片段以及序列列表中列出的多 肽的变异体和衍生物的片段也在本发明优选实施方案中。在这点上，片段是具有与前面提到的超免疫血清反应性抗原及其片段的部分但不 是所有氨基酸序列完全相同的氨基酸序列的多肽及其变异体或衍生物、类似物、片段。这样 的片段可以是“游离的”，即不是其它氨基酸或多肽的部分或者与其融合，或者它们也包含 在它们形成的一部分或区域的更大的多肽内。本发明这个方面也优选的是特征在于本发明 多肽的结构或功能属性的片段，即包含本发明多肽的α-螺旋和α-螺旋形成区域、β-折 叠和折叠形成区域、折转和折转形成区域、卷曲和卷曲形成区域、亲水区域、疏水区域、 α两性区域、β两性区域、可曲(flexible)区域、表面形成区域、底物结合区域和高抗原指 示区域的片段以及这样的片段的联合。优选的区域是介导本发明超免疫血清反应性抗原及 其片段的活性的那些。在这点上最高度优选的是具有本发明超免疫血清反应性抗原及其片 段的化学、生物或其它活性的片段，包括有相似活性或改进活性或有降低的非期望活性的 那些。尤其优选的是包含酶受体或结构域的片段，所述酶受体或结构域赋予无乳链球菌存 活或造成人类疾病的能力所必须的功能。进一步优选的多肽片段是包含或含有尤其是人的 动物中抗原或免疫原性决定簇的那些。抗原片段定义为鉴别的抗原的片段，对于其本身它是抗原的或者当提供为半抗原 时可以制成抗原的。所以，本发明实现了显示一个或(对于更长的片段)只有少数氨基酸 交换的抗原或抗原片段，假设在交换时没有严重地破坏有氨基酸交换的这样的片段的抗原 能力，即适于引发接受这个抗原免疫接种的个体的合适免疫反应以及用来自个体血清的个 体抗体制备物鉴别。高免疫反应抗原这样的片段的优选实例选自包含表IA的“推定的免疫原性氨基 酸”栏和“鉴别的免疫原性区域的位置”的氨基酸序列的多肽，尤其是包含如下氨基酸的多 月太Seq ID No 218 的 4-20，35-44，65-70，73-87，92-98，112-137，152-161，177-186， 193-200，206-213，229-255，282-294，308—313，320—326，349—355，373—384，388—406，ID No 219 的 5-24，35-41，44-70，73-89，103-109，127-143， 155-161，185-190，192—207，212—219，246—262，304—336，372—382，384—393，398—407， 412-418,438-444，1-75,76-161 和 164-239 ；Seq ID No 220 的 4-10，16-58，60-71，77-92， 100-126，132-146，149-164，166-172，190-209，214-220，223-229，241-256，297-312， 314-319,337-343,351-359,378-387,398-418,421-428,430-437,440-448,462-471, 510-519,525-536,552-559,561-568,573-582,596-602,608-630,637-649,651-665, 681-702,714-732,739-745,757-778,790-805,807-815,821-829,836-842,846-873, 880-903，908-914，916-923，931-940，943-948，956-970，975-986，996-1015，1031-1040， 1051-1069，1072-1095，1114-1119，1130-1148，1150-1157，1169-1176，1229-1238 和 802-812 ；Seq ID No221 的 5-12，14-26，35-47，52-67，72-78，83-98，121-141，152-159， 163-183，186-207，209-257，264-277，282-299，301-309，312-318，324-339，358-368， 372-378，387-397，425-431 和 46-291 ；Seq ID No 222 的 29-38，44-64，70-76，78-87， 94-100,102-112,119-134,140-149,163-173,178-186,188-194,207-234,247-262, 269-290 和 73-92 ；SeqID No 223 的 10-28，36-63，77-87，103-119，127-136，141-169， 171-183,195-200,207-232,236-246,251-265,268-283,287-297,314-322,335-343, 354-363,384-390,405-411,419-436,443-455,467-473,480-513,518-529,550-557, 565-585,602-608,616-625,632-660,665-677,685-701,726-736,738-747,752-761, 785-796，801-813，838-853，866-871 和 757-774 ;Seq ID No 224 的 31-38，61-66，74-81， 90-115，123-145，154-167，169-179，182-193，200-206，238-244，267-272 和 235-251 ；Seq ID No 225 的 19-25，38-54，56-64，66-72，74-92，94-100，116-129，143-149，156-183， 204-232，253-266，269-275，294-307 和 241-313 ；Seq ID No 226 的 5-34，50-56，60-65， 74-85，89-97，108-119，159-165，181-199，209-225，230-240，245-251，257-262，274-282， 300-305 和 64-75 ;Seq ID No 227 的 5-13，16-21，27-42，45-52，58-66，74-87，108-114， 119-131 和 39-51 ；Seq ID No 228 的 6-23，46-54，59-65，78-84，100-120，128-133， 140-146，159-165，171-183，190-204，224-232，240-248，250-259，274-280，288-296， 306-315 和 267-274 ;Seq ID No 229 的 5-12，15-24，26-36，42-65，68-80，82-104，111-116， 125-144,159-167,184-189,209-218,235-243,254-265,269-283,287-300,306-316, 318-336，338-352，374-392 和 162-174 ;Seq ID No 230 的 30-42，45-54 和 25-37 ;Seq ID No 231 的 10-30，53-59，86-95，116-130，132-147，169-189，195-201，212-221，247-256， 258-265,278-283,291-298,310-316,329-339,341-352,360-367,388-396，398-411， 416-432，443-452，460-466，506-512，515-521，542-548 和 419-431 ;Seq ID No 232 的 4-27，30-53，60-67，70-90，92-151，159-185，189-195，198-210，215-239和 173-189 ；Seq ID No 233 的 4-26，41-54，71-78，116-127，140-149，151-158，161-175，190-196,201-208， 220-226,240-252,266-281,298-305,308-318,321-329,344-353, 372-378, 384-405, 418-426，429-442，457-463，494-505，514-522 和 174-188 ;Seq ID No 234 的 17-25，27-39， 61-67,81-89,99-110,120-131，133-139，147-161，167-172，179-185，192-198，203-213， 226-238，243-258，261-267，284-290，296-307，311-328，340-352，356-371 和 239-256 ；Seq ID No 235 的 8-30，40-49，67-80，114-123，126-142，152-162，188-194 和 57-70 ;Seq ID No 236 的 4-23，28-34，36-47，50-61，76-81，89-94，96-104，112-119，126-146，155-181，
35195-200，208-214，220-229，244-260，263-276，282-288，292-300，317-323，336-351， 353-359,363-375,382-399,415-432,444-455,458-471,476-481,484-492,499-517, 522-529，535-541，543-568，572-584，586-600，607-617，626-637，656-675 和 282-297 ；Seq ID No 237 的 6-24，30-35，38-45，63-91，134-140，146-160，167-188，214-220，226-234， 244-250,260-270,286-301,316-329,340-371,429-446,448-459,474-481,485-491, 512-526，537444，550-565，573-583，596-613，621-630，652-658 和 87-97 ;Seq ID No 238 的 8-20，26-48，56-67，76-86，94-109，115-121，123-129，143-160，178-186，191-198， 201-208，221-236，238-244，260-268 和 237-247 ；Seq ID No 239 的 4-40，42-57，73-87， 98-117, 126-135, 150-156, 166-174, 196-217, 231-236,248-258, 276-284,293-301,
307-313,339-347, 359-365,375-387,395-402,428-440,445-456,485-490,497-505, 535-541，547-555，610-625，648-656，665-671 和 448-528 ;Seq ID No 240 的 10-18，39-45， 51-61,80-96,98-106,110-115,158-172，174-183，191-200，220-237，249-255，274-289，
308-324，331-341，372-381，384-397，405-414和 322-338 ;Seq ID No 241 的 30-36，38-56， 85-108，134-147，149-160，163-183，188-201，206-211，219-238，247-254 和 5-13 ；Seq ID No242 的 11-40,98-103,110-115，133-145，151-159，172-179，192-201，204-212，222-228， 235-245,258-268,283-296,298-309,322-329,342-351,354-362,372-378,385-393, 407-418,495-516 和 1-148 ；Seq ID No 243 的 5-19，21-36，73-94，112-119，122-137， 139-145，152-167，184-190，198-204，208-224，249-265，267-281，299-304，309-317， 326-333，356-364，368-374，381-389，391-414，419-425，430-435 和 113-140 ；Seq ID No 244 的 45-54，59-67，78-91 和 15-23 ；Seq ID No 245 的 11-22，33-47，52-80，88-112， 124-129 和 6-25 ；Seq ID No 246 的 26-41，51-63，80-89，93-115，150-163，187-193， 220-237,240-249,286-294,296-306,316-329,345-353,361-370,407-425,428-437, 474-482,484-494,504-517,533-541,549-558,595-613,616-625,660-668,673-685, 711-726,736-744,749-761,787-802,812-820,825-837,863-878,888-896,901-913, 939-954，964-972，977-989，1003-1008，1016-1022，1028-1034，1041-1053，1059-1074， 1101-1122，420-511 和 581-704 ；Seq ID No247 的 18-25，27-55，71-83，89-95，102-113， 120-146，150-156，174-185 和 159-175 ；Seq ID No 248 的 24-30，38-56，63-68，87-93， 136-142，153-164，183-199，213-219，226-234，244-261，269-278，283-289，291-297， 320-328, 330-336, 340-346,348-356,358-366,382-387,401-408,414-419,449-455, 468-491,504-512,531-537,554-560,597-608,621-627,632-643,650-662,667-692, 703-716，724-737，743-758，783-794，800-818，846-856 和 806-884 ；Seq IDNo 249 的 4-14， 21-39,86-92,99-107,121-131，136-144，147-154，158-166，176-185，193-199，207-222， 224-230 和 117-136 ；Seq IDNo 250 的 65-76，85-97，103-109，115-121，125-146，163-169，
196-205，212-219，228-237，241-247，254-262，269-288，294-303，305-313，328-367， 395-401，405-412，418-429，437-447，481-488，506-513，519-524，530-541，546-557 和 266-284 ；Seq ID No 251 的 5-14，37-42，49-71，78-92，97-112，127-136，147-154， 156-163，186-198，216-225，233-243，248-253，295-307，323-332，359-366，368-374， 380-398 和 194-223 ；Seq ID No 252 的 4-11，33-39，45-72，100-113，119-129，136-144， 169-175，177-185，200-208，210-219，262-276，278-297，320-326，336-344，347-362，381-394,443-453 和 438-454 ；Seq ID No 253 的 4-29，31-52，55-61，95-110，138-158， 162-171,179-187,202-229,239-248,251-256,262-267,269-285,304-310,351-360, 362-368，381-388，415-428，435-440，448-458 和 161-178 ;Seq ID No 254 的 4-17，19-28， 32-43,47-59,89-110,112-126,128-134，140-148，152-161，169-184，191-204，230-235， 255-264，328-338，341-347，401-409，413-419，433-441，449-458，463-468，476-482， 486-492，500-506，529-545 和 305-381 ；Seq IDNo 255 的 10-29，38-45，53-61，134-145， 152-160，163-170，202-208，219-229，248-258，266-275，282-288，315-320，328-334， 377-385,392-402,418-424,447-453,460-471,479-487,491-497,500-507,531-537, 581-594,615-623,629-635,644-652,659-666,668-678,710-717,719-728,736-741, 747-760，766-773，784-789，794-800，805-817，855-861，866-887 和 698-715 ；Seq ID No 256 的 16-26，29-37，44-58，62-68，74-80，88-95，97-120，125-144，165-196 和 58-72 ；Seq ID No 257 的 14-21，23-46，49-60，63-74，78-92，96-103，117-129，134-161，169-211， 217-231，239-248，252-281，292-299，313-343 和 243-257 ;Seq ID No 258 的 11-27，46-52， 67-72，76-84，91-112，116-153，160-175，187-196，202-211，213-220 和 43-76 ；Seq ID No 259 的 5-29，37-56，78-86，108-118，152-161 和 120-130 ;Seq ID No 260 的 8-14，19-41， 52-66，75-82，87-92，106-121，127-133，136-143，158-175，180-187，196-204，221-228， 239-245，259-265，291-306，318-323，328-340，352-358，361-368，375-381，391-399， 411-418，431-442，446-455，484-496，498-510，527-533，541-549，558-565，575-585， 587-594，644-655，661-668，671-677 和 184-196 ；Seq ID No 261 的 4-22，29-38，55-62， 75-81,102-107,110-134,143-150,161-167,172-179,191-215,223-233,241-247, 251-264，266-272，288-309，340-352，354-366，394-402，414-438 和 198-218 ；Seq ID No 262 的 24-44，49-70，80-91，105-118，128-136，140-154 和 77-92 ;Seq ID No 263 的 5-22， 31-36，41-47，67-74，83-90，105-122，135-143，160-167 和 118-129 ；Seq ID No 264 的 4-25,33-73,81-93,96-106,114-120,122-128，130-172，179-208，210-241，251-283， 296-301 和 92-100 ;Seq ID No 265 的 14-24，29-38，43-50，52-72，86-97，101-107， 110-125，127-141，145-157，168-175，177-184，186-195，205-226，238-250，255-261， 284-290,293-304,307-314,316-323,325-356,363-371,383-390,405-415,423-432, 442-454,466-485,502-511,519-527,535-556,558-565,569-574,612-634,641-655, 672-686,698-709,715-722,724-732,743-753,760-769,783-792,818-825,830-839, 842-849, 884-896, 905-918,926-940,957-969,979-1007,1015-1021,1049-1057 禾P 336-349 ；Seq ID No 266 的 6-16，26-31，33-39，62-73，75-85，87-100，113-123，127-152， 157-164，168-181，191-198，208-214，219-226，233-254，259-266，286-329 和 181-195 ；Seq ID No 267 的 4-13，32-39，53-76，99-108，110-116，124-135，137-146，149-157，162-174， 182-190，207-231，242-253，255-264，274-283，291-323，334-345，351-360，375-388， 418-425，456-474，486-492，508-517，520-536，547-560，562-577，31-45 和 419-443 ；Seq ID No 268 的 15-26，30-37，42-49，58-90，93-99，128-134，147-154，174-179，190-197， 199-205,221-230,262-274,277-287,300-314,327-333,343-351,359-377, 388-396, 408-413，416-425，431-446 和 246-256 ；Seq ID No 269 的 5-26，34-42，47-54，61-67， 71-104,107-115,131-138,144-153,157-189,196-202,204-210,228-245,288-309,316-329,332-341,379-386,393-399,404-412,414-421,457-468,483-489,500-506, 508-517,523-534,543-557,565-580,587-605,609-617,619-627,631-636,640-646, 662-668,675-682,705-710,716-723,727-732,750-758,784-789,795-809,869-874, 14-138，166-286，372-503，674-696 和 754-859 ；Seq ID No 270 的 5-17，32-38，40-47， 80-89,113-119,125-137,140-154,157-163,170-177,185-199,213-225,228-236, 242-248,277-290,292-305,323-333,347-353,364-370,385-394,399-406,423-433, 441-451，462-474，477-487 和 116-124 ；Seq ID No 271 的 7-16，18-30，32-49，53-61， 63-85,95-101,105-115，119-134，143-150，159-178，185-202，212-229，236-250，254-265， 268-294 和 63-72 ;Seq ID No 272 的 4-12，19-47，73-81，97-103，153-169，188-198， 207-213,217-223,236-242,255-265,270-278,298-305,309-317,335-347,354-363,
373-394，419-424，442-465，486-492，500-507，542-549，551-558，560-572，580-589， 607-614,617-623,647-653,666-676,694-704,706-714,748-754,765-772,786-792, 795-806 和 358-370 ；Seq IDNo 273 的 18-28，30-38，40-46，49-55，69-78，82-98，104-134， 147-153，180-190，196-202，218-236，244-261，266-273，275-286，290-295，301-314， 378-387，390-395，427-434 和 290-305 ；Seq IDNo 274 的 4-13，20-31，39-51，54-61，69-84， 87-105，117-124 和 108-125 ;Seq ID No 275 的 24-34，43-54，56-66，68-79 和 50-69 ;Seq ID No 276 的 5-43,71-77，102-131,141-148，150-156，159-186，191-207,209-234， 255-268, 280-286, 293-299,317-323,350-357,363-372,391-397,406-418,428-435,
455-465,484-497,499-505,525-531,575-582,593-607,621-633,638-649,655-673, 684-698,711-725,736-741,743-752,759-769,781-793,813-831,843-853,894-905, 908-916，929-946，953-963，970-978，1001-1007，1011-1033，165-178 和 818-974 ；Seq ID No 277 的 16-44，63-86，98-108，185-191，222-237，261-274，282-294，335-345，349-362，
374-384，409-420，424-430，440-447，453-460，465-473，475-504，522-534，538-551， 554-560,567-582,598-607,611-619,627-640,643-653,655-661,669-680,684-690, 701-707,715-731,744-750,756-763,768-804,829-837,845-853,855-879,884-890, 910-928，77-90，144-212，279-355，434-536，782-810 和 875-902 ;Seq ID No 278 的 4-22， 29-41，45-51，53-66，70-77，86-95，98-104，106-124，129-135，142-151，153-161，169-176， 228-251，284-299，331-337，339-370，380-387，393-398，406-411，423-433，440-452， 461-469, 488-498,501-516,523-530,532-559,562-567,570-602,612-628,630-645, 649-659，666-672，677-696，714-723，727-747 和 212-227 ；Seq IDNo 279 的 4-9,17-31, 35-41,56-61,66-75，81-87，90-124，133-138，149-163，173-192，213-219，221-262， 265-275,277-282,292-298,301-307,333-346,353-363,371-378,419-430,435-448，
456-469，551-570，583-599，603-612和 275-291 ;Seq ID No 280 的 28-34，53-58，72-81， 100-128，145-154，159-168，172-189，217-225，227-249，256-263，299-309，322-330， 361-379,381-388,392-401,404-417,425-436,440-446,451-464,469-487,502-511, 543-551，559-564，595-601，606-612，615-626，633-642，644-650，664-670，674-684， 692-701，715-723，726-734，749-756，763-771，781-787，810-843，860-869，882-889， 907-917,931-936,941-948,951-958,964-971,976-993,1039-1049,1051-1065, 1092-1121，1126-1132，1145-1151，1158-1173，1181-1192，1194-1208，1218-1223，
381229-1243,1249-1254,1265-1279,1287-1297,1303-1320,1334-1341,1343-1358, 1372-1382,1406-1417,1419-1425,1428-1434,1441-1448,1460-1473,1494-1504, 1509-1514,1529-1550,654-669 和 1400-1483 ；Seq IDNo 281 的 10-16，20-25，58-65， 97-109,118-132,134-146,148-155,186-195,226-233,244-262,275-284,295-310, 317-322,330-339,345-351,366-375,392-403,408-415,423-430,435-444,446-457,
467-479,486-499,503-510,525-537,540-585,602-612,614-623,625-634,639-645, 650-669，700-707，717-724，727-739，205-230 和 733-754 ;Seq ID No 282 的 5-22，37-43， 72-81，105-113，128-133，148-160，188-194，204-230，238-245，251-257 和 194-213 ；Seq IDNo 283 的 16-21，35-41，56-72，74-92，103-109 和 62-68 ;Seq IDNo 284 的 4-15，17-82， 90-104，107-159，163-170，188-221，234-245，252-265 和 220-235 ；Seq ID No 285 的 16-22，36-46，61-75，92-107，113-121，139-145，148-160 和 30-42 ;Seq ID No 286 的 4-12， 20-26，43-49，55-62，66-78，121-127，135-141，146-161，164-170，178-189，196-205， 233-238，269-279，288-318，325-332，381-386，400-407 和 328-346 ；Seq ID No 287 的 5-12，31-49，57-63，69-79，89-97，99-114，116-127，134-142，147-154，160-173，185-193， 199-204，211-222，229-236，243-249，256-274 和 58-68 ;Seq ID No 288 的 10-20，28-34， 39-53，68-79，84-90，99-106 和 73-79 ；Seq ID No 289 的 14-37，45-50，61-66，77-82， 93-98,109-114,125-130,141-146,157-162,173-178,189-194,205-210,221-226, 237-242，253-258，269-274，285-290，301-306，316-332，349-359，371-378，385-406， 34-307 和 312-385 ；Seq ID No 290 的 4-10，17-38，50-85，93-99，109-116，128-185， 189-197，199-210，223-256，263-287，289-312，327-337，371-386，389-394，406-419， 424-432，438-450，458-463，475-502，507-513，519-526，535-542，550-567 和 361-376 ；Seq IDNo 291 的 10-39,42-93，100-144，155-176，178-224，230-244，246-255，273-282， 292-301，308-325，332-351，356-361，368-379，386-393，400-421 和 138-155 ；Seq ID No 292 的 5-11，17-34,40-45，50-55，72-80，101-123，145-151，164-172，182-187，189-195， 208-218，220-241，243-252，255-270，325-331，365-371，391-398,402-418，422-428， 430-435，443-452，463-469，476-484，486-494，503-509，529-553，560-565，570-590， 608-614,619-627,654-661,744-750,772-780,784-790,806-816,836-853,876-885, 912-918,926-933,961-975,980-987,996-1006,1016-1028,1043-1053,1057-1062, 994-1003 和 1033-1056 ;Seq ID No 293 的 17-45，64-71，73-81，99-109，186-192，223-238， 262-275,283-295,336-346,350-363,375-385,410-421,425-431,441-448,454-463,
468-474,476-512,523-537,539-552,568-583,599-608,612-620,628-641,644-654, 656-662，670-681，685-695，702-708，716-723，725-735，757-764，769-798，800-806， 808-816，826-840，846-854，856-862，874-881，885-902，907-928，274-350 和 443-513 ；Seq ID No 294 的4-22，29-41，45-51，53-61，70-76，85-92，99-104，111-122，134-140，142-154， 163-174，224-232，255-265，273-279，283-297，330-335，337-348，356-367，373-385， 391-396,421-431,442-455,475-485,493-505,526-538,544-561,587-599,605-620, 622-651,662-670,675-681,687-692,697-712,714-735 和 252-262 ；Seq ID No 295 的 4-12，15-35,40-46,50-59,67-94,110-128,143-169，182-188，207-215，218-228，238-250 和 74-90 ;Seq ID No 296 的 9—18，42—58，78—85，88—95，97—106，115—122，128—134，140-145，154-181，186-202，204-223，261-267，269-278，284-293，300-336，358-368 和 12-29 ；Seq ID No 297 的 7_34，46-53，62-72，82_88，100-105，111-117，132-137，144-160， 166-180，183-189，209-221，231-236，246-253，268-282，286-293，323-336，364-372， 378-392,422-433 和 388-405 ；Seq ID No 298 的 21-27，34-50，72-77，80-95，164-177， 192-198,202-220,226-236,239-247，270-279，285-292，315-320，327-334，348-355， 364-371,388-397,453-476,488-497,534-545,556-576,582-588,601-607,609-616, 642-662,674-681,687-697,709-715,721-727,741-755 和 621-739 ；Seq ID No 299 的 4-14，16-77,79-109 和 25-99 ;Seq ID No 300 的 4-9，17-23，30-37，44-55，65-72，77-93， 102-121，123-132，146-153 和 17-29 ；Seq ID No 301 的 4—18，25—41，52—60，83—92， 104-112，117-123，149-155，159-167，170-192，201-210，220-227，245-250 和 124-137 ；Seq ID No 302 的 8-25，50-55，89-95，138-143，148-153，159-169，173-179,223-238,262-268, 288-295,297-308,325-335,403-409,411-417,432-446,463-475,492-501,524-530, 542-548,561-574,576-593,604-609,612-622,637-654,665-672,678-685,720-725, 731-739，762-767，777-783，820-838，851-865，901-908，913-920，958-970，1000-1006， 1009-1015，1020-1026，1043-1052，1055-1061，1-128，252-341，771-793 和 1043-1058 ；Seq ID No 303 的 16-26,33-46 和 64-76 ；Seq ID No 304 的 4-27，69-77，79-101，117-123， 126-142，155-161，171-186，200-206，213-231，233-244，267-273，313-329，335-344， 347-370，374-379，399-408，422-443，445-453，461-468，476-482，518-534，544-553， 556-567,578-595,601-620,626-636,646-658,666-681,715-721,762-768,778-785, 789-803，809-819，22-108，153-318,391-527 和 638-757 ;Seq ID No 305 的 6-21，32-43， 62-92, 104-123, 135-141, 145-152,199-216,218-226,237-247,260-269,274-283, 297-303,1-72 和 127-211 ；Seq ID No 306 的 6-26，50-56，83-89，108-114，123-131， 172-181，194-200，221-238，241-247，251-259，263-271，284-292，304-319，321-335， 353-358,384-391,408-417,424-430,442-448,459-466,487-500,514-528,541-556, 572-578,595-601,605-613,620-631,635-648,660-670,673-679,686-693,702-708, 716-725,730-735,749-755,770-777,805-811,831-837,843-851,854-860,863-869, 895-901,904-914,922-929,933-938,947-952,956-963,1000-1005,1008-1014, 1021-1030,1097-1103,1120-1130,1132-1140,1-213, 269-592 和 992-1120 ；Seq ID No 307 的 9-16,33-39,47-59,65-79,81-95,103-108，115-123，138-148，163-171，176-185， 191-196，205-211，213-221，224-256，261-276，294-302，357-363，384-390，95-111 和 161-189 ；Seq ID No 308 的 21-27，35-45，70-76，92-105，129-143，145-155，161-166， 170-191，204-211，214-231，234-246，249-255，259-275 和 1-18 ；Seq ID No 309 的 21-35， 45-53，56-64，69-97 和 1-16 ；SeqID No 310 的 25-33，41-47，61-68，86-101，106-114， 116-129，134-142，144-156，163-176，181-190，228-251，255-261，276-292，295-305， 334-357, 368-380, 395-410,424-429,454-460,469-482,510-516,518-527,531-546, 558-570,579-606,628-636,638-645,651-656,668-674,691-698,717-734,742-754, 765-770,792-797,827-835,847-859,874-881,903-909,926-933,942-961,964-977, 989-1004,1010-1028,1031-1047,1057-1075,1081-1095, 1108-1117, 1138-1144, 1182-1189,1193-1206,1220-1229,1239-1246,1257-1267,1271-1279,1284-1301,1312-1320,1329-1335,1341-1347,1358-1371,1399-1404,1417-1426,1458-1463, 1468-1476,1478-1485,1493-1506,1535-1541,1559-1574,1583-1590,1595-1601, 1603-1611,1622-1628,1634-1644,1671-1685,1689-1696,1715-1720, 1734-1746, 1766-1775,1801-1806,1838-1844,1858-1871,1910-1917,1948-1955,1960-1974, 2000-2015，2019-2036，2041-2063，748-847 和 1381-1391 ；Seq IDNo 311 的 5-12，18-24， 27-53，56-63，96-113，119-124，131-136，157-163，203-209，215-223，233-246，264-273， 311-316,380-389,393-399,425-433,445-450,457-462,464-470,475-482,507-513, 527-535,542-548,550-565,591-602,607-613,627-642,644-664,673-712,714-732, 739-764，769-782，812-818，826-838，848-854，860-871，892-906，930-938，940-954， 957-973,990-998,1002-1021，1024-1033，1037-1042，1050-1060，1077-1083，1085-1092， 1100-1129，1144-1161，1169-1175，1178-1189，1192-1198，1201-1207，1211-1221， 1229-1239,1250-1270,1278-1292,1294-1300,1314-1335,1344-1352,1360-1374, 1394-1405,1407-1414,1416-1424,1432-1452,1456-1462,1474-1497, 1500-1510, 1516-1522，1534-1542，1550-1559，1584-1603，1608-1627，187-273 和 306-441 ；Seq ID No 312 的 70-80，90-97，118-125，128-140，142-148，154-162，189-202，214-222，224-232， 254-260,275-313,317-332,355-360,392-398,425-432,448-456,464-470,476-482, 491-505,521-528,533-546,560-567,592-597,605-614,618-626,637-644,646-653, 660-666，677-691 和 207-227 ;Seq ID No 313 的 5-19，26-34，37-55，57-66，69-83，86-102， 115-134，138-143，154-172，178-195，209-246，251-257，290-302，306-311 和 256-266 ；Seq ID No 314 的 10-20，22-28，35-57，72-79，87-103，108-128，130-144，158-171，190-198， 225-242，274-291，301-315，317-324，374-385 和 353-365 ;Seq ID No 315 的 4-9，17-30， 34-54，59-66，73-94，118-130，135-150，158-171，189-198，219-239，269-275，283-301， 89-106 和 176-193 ；Seq ID No 316 的 14-20，22-74，77-86，89-99，104-109，126-135， 154-165，181-195，197-212，216-224，264-275 和 107-118 ；Seq ID No 317 的 4-18，21-38， 63-72,101-109,156-162,165-179,183-192,195-210,212-218,230-239,241-256, 278-290, 299-311, 313-322,332-341,348-366,386-401,420-426,435-450,455-460, 468-479，491-498，510-518，532-538，545-552，557-563，567-573，586-595，599-609， 620-626，628-636，652-657，665-681 和 1-198 ；Seq ID No 318 的 4-10，16-38，51-68， 73-79，94-115，120-125，132-178，201-208，216-223，238-266，269-295，297-304，337-342， 347-356，374-401，403-422，440-447，478-504，510-516，519-530，537-544 和 191-206 ；Seq ID No 319 的 12-40，42-48，66-71，77-86，95-102，113-120，129-137，141-148，155-174， 208-214,218-225,234-240,256-267,275-283,300-306,313-321,343-350,359-367, 370-383，398-405，432-439，443-461，492-508，516-526，528-535 和 370-478 ;Seq ID No 320 的 6-14,20-37,56-62,90-95,97-113,118-125，140-145，161-170，183-202，237-244， 275-284,286-305,309-316,333-359,373-401,405-412 和 176-187 ；Seq ID No 321 的 33-44,50-55,59-80,86-101,129-139，147-153，157-163，171-176，189-201，203-224， 239-245，257-262，281-287，290-297，304-320，322-331，334-350，372-390，396-401，71-88 和 353-372 ；Seq ID No 322 的 5-11，15-24，26-33，40-47，75-88，95-103，105-112 和 17-30 ；Seq ID No 323 的 5-11，16-39，46-54，62-82，100-107，111-124，126-150，154-165，167-183，204-238，245-295，301-313，316-335和 8-16 ；Seq ID No 324 的 4-19，34-48， 69-74，79-107，115-127，129-135，143-153，160-169，171-182 和 142-153 ;Seq ID No 325 的 4-30，65-74，82-106，110-120，124-132，135-140，146-175，179-184，190-196，217-223， 228-233，250-267，275-292，303-315，322-332 和 174-186 ；Seq IDNo 326 的 9-16，29-41， 47-57,68-84,87-109,113-119,162-180，186-193，195-201，203-208，218-230，234-243， 265-271，28卜292，305-312，323-332，341-347，349-363，368-374，383-390，396-410， 434-440,446-452,455-464,466-473,515-522,529-542,565-570,589-600,602-613, 618-623,637-644,1019-1027，1238-1244，1258-1264，1268-1276，1281-1292，1296-1302 和 883-936 ；Seq IDNo 327 的 10-17，23-32，39-44，54-72，75-81，88-111，138-154，160-167， 178-185，201-210，236-252，327-334，336-342，366-376，388-400，410-430，472-482， 493-526，552-558，586-592，598-603，612-621，630-635，641-660 和 384-393 ；Seq ID No 328 的 4-22，24-39，50-59，73-84，100-105，111-117，130-138，155-161，173-178，182-189， 205-215, 266-284,308-313,321-328,330-337,346-363,368-374,388-395,397-405, 426-434,453-459,482-492,501-507,509-515,518-523,527-544,559-590,598-612, 614-629，646-659，663-684，686-694，698-721 和 445-461 ;Seq ID No 329 的 14-22，27-33 和 3-17 ；Seq ID No 330 的 29-41，66-73，81-87，90-108，140-146，150-159，165-184， 186-196，216-226，230-238，247-253，261-269 和 126-140 ;Seq ID No 331 的 5-12，16-25， 27-33，36-45，60-68，83-88，103-126 和 86-101 ;Seq ID No 332 的 14-23，36-47，56-66， 84-89,94-105，111-127，140-153，160-174，176-183，189-203，219-225，231-237，250-257 和 194-227 ;Seq ID No 333 的 4-25，54-60，64-71，73-82，89-106，117-124，157-169， 183-188，199-210，221-232，236-244，255-264 和 58-98 ;Seq ID No 334 的 13-19，26-36，
41-53,55-71,77-84,86-108,114-135，157-172，177-183，187-194，208-213，218-226， 110-125 和 156-170 ；Seq ID No 335 的 5-24，63-69，77-85，94-112，120-137，140-146， 152-159，166-172，179-187，193-199，206-212，222-228，234-240，244-252，257-264， 270-289，298-309，316-328，337-348，363-375，1-56 和 340-352 ;Seq ID No 336 的 18-39，
42-71，78-120，124-144，152-173，179-189，199-209，213-222，228-258，269-304，329-361， 364-372，374-389，396-441 和 313-327 ;Seq ID No 337 的 19-25，91-98，108-120，156-162，
168-174，191-204，211-216，232-266，272-278，286-308，316-321，327-333，344-355， 358-364，384-391，395-428，464-476，487-495，497-511，544-561，563-573，575-582， 588-594，10-25 和 322-338 ;Seq ID No 338 的 14-26，32-49，51-57，59-72，80-91，102-112， 119-125，147-161，164-173，175-183，188-213，217-222，246-254，260-276，282-303， 308-318, 321-328,333-350,352-359,371-378,392-401,407-414,416-443,448-463, 471-484, 490-497,501-514,519-527,539-551,557-570,578-590, 592-598,600-610, 618-629,633-647,654-667,676-689,702-709,718-726,728-737,741-760,764-780, 786-795, 808-826,836-842,845-852,865-874,881-887,931-945,949-957,968-974, 979-986，1003-1009，1023-1029 和 90-103 ;Seq ID No 339 的 11-16，37-56，60-66，69-77， 80-88，93-106，117-139，166-171 和 72-90 ；Seq ID No 340 的 59-84，123-133，145-150， 161-167,178-189 和 115-128 ；Seq ID No 341 的 15-33，39-46，52-64，74-87，108-124， 127-144，150-156，173-179，184-194，201-208，219-236，243-269，272-295，302-309，343-349,356-361,370-379,405-411,414-423,430-451,457-464,466-475,477-483, 496-502,507-522,541-548,557-563,571-577,579-585,590-605,626-642,650-662, 671-691,704-710,751-769,775-781,786-791,794-829,851-858,868-878,884-904, 913-919,931-939 和 132-142 ；Seq ID No 342 的 33-58，64-71，74-80，83-88，96-120， 122-139，146-157，167-177，207-213，220-225，236-242，264-279，300-305，326-336， 340-347，350-360，97-115 和 199-211 ；Seq ID No343 的 4-26，43-57，70-99，102-117， 121-133，142-148，151-168，170-183，192-220，235-249，258-279 和 30-41 ;Seq ID No 344 的 34-42，48-58，70-94，110-130，154-160，164-172，178-183，195-203，211-222，229-250， 256-261，274-284，286-292，312-323 和 222-233 ；Seq ID No 345 的 4-9，15-36，38-45，
49-74，78-88，100-112，136-191，211-220，226-233，239-246，254-274，287-307，316-322， 342-353，356-366，373-378，384-393，405-431，449-457，459-468，487-511，515-524， 529-541，544-552，562-568，571-576 和 208-280 ；Seq IDNo 346 的 10-27，31-37，39-54，
71-108,124-143禾口 2—107 ;Seq IDNo 347 的 16—27，38—57，64—70，90—102，104—113， 116-137,160-166 和 1-80 ；Seq ID No 348 的 13-21，31-36，56-67，127-136，153-171， 173-180，184-200，214-222，225-231，239-263，267-273 和 135-159 ；Seq ID No 349 的 12-27，31-51，68-74，77-87，94-101，108-114，117-123，127-134，138-168，173-196， 201-207，212-217，227-237，247-257，264-280 和 205-223 ;Seq ID No 350 的 17-22，25-54， 70-76，92-100 和 98-110 ;Seq ID No 351 的 7-29，40-50，60-67，87-96，105-111，119-164， 172-199，206-212，220-227，237-259，272-279，282-293，295-309，313-319，321-328， 345-363，376-386 和 159-176 ;Seq ID No 352 的 4-19，24-30，36-43，50-68，71-89，93-106， 141-152，154-172，179-197，199-215，229-239，246-252，255-263，281-298，319-325， 329-356, 358-368,374-390,397-409,420-429,432-444,450-456,459-475,483-494, 496-502，520-528，532-556 和 362-377 ；Seq ID No 353 的 18-25，40-62，77-85，91-97， 105-116，123-133，139-184，189-197 和 122-140 ；Seq ID No 354 的 4-49，52-58，62-70， 79-105,109-133,142-150,163-168,206-214,220-228,233-240,243-254,274-281, 303-311,327-338,357-373,378-396,403-413,420-436,441-453,461-467,475-481, 484-498, 506-512, 514-521,523-529,562-579,589-595,598-603,615-648,714-722, 728-742，749-758，777-792，795-807 和 643-658 ；Seq IDNo 355 的 8-27，37-48，51-56，
72-79，87-106，120-138，140-147，167-176，187-197，205-216，222-229，234-239，243-249， 277-288,292-315,334-343,347-353,363-391,398-404,430-447,461-467,478-492, 498-507 和 456-470 ;Seq ID No 356 的 5-12，18-24，59-69，80-93，95-109，119-125， 130-137，139-147，158-163，168-176，182-202，206-215，222-239，241-249，267-277， 291-298,311-318,321-327,338-344,348-355,373-386,393-406,411-417,434-443, 446-465，473-484，514-521，532-553，584-594 和 221-237 ；Seq IDNo 357 的 4-14，27-34，
50-58，63-72，79-106，109-114，121-142，146-154，161-167，169-175，178-201，223-238， 249-254，259-264，278-292，294-312，319-330 和 167-191 ；Seq ID No 358 的 7-28，36-42， 50-61,63-80，122-152，161-174，176-191 和 140-190 ；SeqID No 359 的 20-57，59-65， 70-78,86-102,119-133，142-161，163-173，177-188，192-202，204-220，222-236，240-253， 279-319，326-331，337-383，390-399，406-412，420-427，431-438 和 381-395 ；Seq ID No360 的 13-18，28-34，37-43，50-59，75-81，83-97，105-121，139-147，200-206，209-227， 231-247，260-271，318-327，366-381，388-394，399-406 和 182-201 ；Seq ID No 361 的 6-29,37-43,51-56,70-77,82-102,110-119,127-143,178-190,201-209,216-243, 261-269，281-292，305-313，327-339，341-354，356-373，391-397，423-429，438-445， 450-478 和 21-314 ;Seq ID No 362 的 4-12，15-21，32-41，59-76，80-89，96-104 和 90-103 ； Seq ID No 363 的 9-28，30-41，44-54，69-74，77-82，90-97，104-123，125-135，149-155， 164-173，177-184，217-226，230-235，238-244，258-272，282-297，300-305，309-315， 317-322，327-336，348-362，368-374，380-387，400-411，414-424，451-458，460-466， 483-494,497-503,506-511,521-528,540-553,569-587,598-606,628-642,661-681, 688-700，718-733，740-749，752-764，769-783，823-834，848-854，862-872，878-884， 886-898，915-920，938-951，954-961，963-972，982-989，996-1003，1010-1016，1021-1032， 1038-1044,1047-1057,1060-1070,1079-1088,1094-1102,1117-1127,1129-1135, 1142-1153,1158-1204,1212-1229,1234-1263,1269-1277,1308-1313, 1327-1338, 1344-1376，1400-1415，1436-1443，1448-1458，1497-1504，1511-1522，1544-1566，3-82 和 509-576 ；Seq ID No 364 的 8-36，40-64，71-79，88-94，102-109，118-127，138-148，
151-159，163-174，192-198，200-206，220-233，268-273，290-301，304-309，316-323， 331-349，378-391，414-420，427-437，455-475，494-510，541-547，549-555，616-640，1-60, 55-139，212-308，386-458 和 458-624 ；Seq ID No 365 的 16-31，35-42，70-77，91-101， 120-130，132-140，143-153，185-190，195-202，215-222，228-238，241-251，257-264， 268-277,288-302,312-324,326-333,341-348,364-382,415-429,438-454,458-466, 491-499,501-521 和 273-281 ;Seq ID No 366 的 8-14，32-57，74-149，155-177，179-212， 221-266,271-296,304-324,329-346,349-359,368-401,413-419,426-454,465-478, 493-510 和 466-490 ;Seq ID No 367 的 22-28，33-51，64-89，96-119，126-132，138-146，
152-159，161-169，172-179，193-198，205-211，221-231，235-254，273-280，297-303， 312-320，328-346，351-373，378-384，391-398，448-454，460-468，470-481，516-558， 574-593,597-602,613-623,626-646,649-656,668-673,675-683,696-708,715-722, 724-739，745-751，759-777，780-804，816-822 和 102-113 ;Seq ID No 368 的 12-28，41-91， 98-107，112-120，125-131，151-193,215-221，240-250，263-280 和 128-138 ；Seq ID No 369 的 16-24，32-38，46-62，68-81，90-105，127-133，144-150，160-166，178-184，186-202， 210-219,232-240,252-258,264-273,293-324,337-344,349-357,360-369,385-398, 410-416,419-427,441-449,458-476,508-515,523-539,544-549,562-569,571-579, 96-109 和 127-139 ;Seq ID No 370 的 19-25，28-34，56-61，85-97，110-116 和 39-53 ;Seq ID No 371 的 4-37，41-50，62-72，91-97，99-109，114-125，136-141，149-158，160-166， 201-215 和 27-225 ;Seq ID No 372 的 15-31，44-51，96-105，122-130，149-157，162-168， 178-183,185-192,198-204,206-213,221-234,239-245,248-255,257-266,289-335, 349-357，415-422，425-441，448-454，462-468 和 463-481 ;Seq ID No 373 的 5-31，39-55， 63-72，76-99，106-155，160-177，179-199，207-217，223-240，245-255，261-267，294-316， 321-343,354-378,382-452,477-488,529-536,555-569,584-591,593-612,620-627, 632-640，647-654，671-680，698-704，723-730，732-750，769-775，781-788，822-852 和
44505-525 ；Seq ID No 374 的 3-18 ;Seq ID No 375 的 4-14 和 12-24 ;Seq ID No 376 的 4-11，22-30 和 12-25 ;Seq ID No377 的 5-12 和 4-18 ;Seq ID No 378 的 4-28 和 7-14 ;Seq ID No379 的 6-16 和 8-16 ;Seq ID No 380 的 4-15，18-33 和 24-36 ;Seq ID No 381 的 4-10， 16-21 和 20-31 ；Seq ID No 382 的 6-19 ；Seq ID No 383 的 11-18 和 3-10 ；Seq ID No 384 的 13-24 和 3-15 ；Seq ID No 385 的 15-27 和 7-16 ；Seq ID No 386 的 11-16 禾口 1-15 ；Seq ID No 387 的 4-16 和 9-21 ；Seq ID No 388 的 4-24，40-48，54-67 和 22-39 ;Seq ID No 389 的 6-30，34-55，62-68，78-106 和 68-74 ;Seq ID No 390 的 3-14 ;Seq ID No 391 的 9-19 和 6-21 ；Seq ID No 392 的 4-17 和 1-9 ；Seq ID No 393 的 5-30 和 1-8 ；SeqID No 394 的 4-16， 23-46，51-56 和 45-55 ;Seq ID No 395 的 7_16;Seq ID No 396 的 2-14 ;Seq ID No 397 的 4-36，43-65 和 50-62 ；Seq ID No 398 的 10-30 和 14-21 ；Seq ID No 399 的 9-17 和 1-10 ； Seq ID No 400 的 4-12 和 3-16 ；Seq ID No 401 的 4-15 和 5-23 ；Seq ID No 402 的 10-21 ； Seq ID No 403 的 6-16 ;Seq ID No 404 的 4-29，31-38 和 2-14 ;Seq ID No 405 的 4-35 和 33-42 ；Seq ID No406 的 2-17 ；Seq ID No 407 的 9-18，30-35 和 15-33 ；Seq ID No408 的 4-9 和 6-12 ；Seq ID No 409 的 3-17 ；Seq ID No 410 的 12-21，37-44，52-61，72-80 和 38-48 ；Seq ID No 411 的 4-10，29-44，54-61，69-78 和 13-27 ;Seq ID No 412 的 13-23， 36-53和 2-15 ;Seq ID No 413 的 4-25，28-46，56-72，81-99，120-132，134-142，154-160和 129-141 ；Seq ID No 414 的 4-15，24-33，35-41，64-86 和 21-33 ;Seq ID No 415 的 9-15 禾口 4-13 ；Seq ID No 416 的 4-11，13-19，34-48 和 15-32 ;Seq ID No 417 的 4-21 和 11-31 ;Seq ID No 418 的 23-57 和 38-50 ；Seq ID No 419 的 4-32 和 3-13 ；Seq ID No 420 的 4-10， 13-25，32-42，56-68，72-84 和 26-38 ；SeqID No 421 的 4-20，31-48，52-58，65-71，80-93， 99-108，114-123和 37-49 ;Seq ID No 422 的 6-12，14-20和 3-25 ;Seq ID No 423 的 14-25， 27-38 和 5-14 ;Seq ID No 424 的 4-41，57-105，109-118，123-136，144-152 和 86-99 ;Seq ID No 425 的 6-19 ；Seq ID No 426 的 2-19 ；Seq ID No 427 的 14-47 和 1-14 ；Seq ID No 428 的 4-21，29-44 和 2-18 ；Seq ID No 429 的 23-29 和 10-28 ；Seq ID No 430 的 6-16, 22-36 和 11-22 ；Seq ID No 431 的 4-19，30-44 和 18-27 ；Seq ID No 432 的 5-15，37-45， 58-65 和 38-47 ;Seq ID No 433 的 4-15，23-34 和 4-15 ;Seq ID No 434 的 30-36，44-54， 79-85,101-114,138-152,154-164,170-175,179-200,213-220,223-240,243-255, 258-264,268-284和10-28 ；包含表IB的“相同区域”纵栏的氨基酸序列的肽，尤其是包含 如下氨基酸的肽Seq ID No 449 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 450 的 326-344， 326-348，338-354，371-392，801-809和 877-901 ；Seq ID No 451 的 893-906 ;Seq ID No452 的 51-69 ;Seq ID No 453 的 110-125 ;Seq ID No 454 的 291-305 ;Seq ID No 455 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 456 的 326-344，326-348，338-354，371-392，801-809 和 877-901 ；Seq ID No 457 的 893-906 ；Seq ID No 458 的 51-69 ；Seq ID No 459 的 110-125 ； SeqID No 460 的 291-305 ;Seq ID No 461 的 32-44 ;Seq ID No 462 的 399-410 ；表 2 的“氨 基酸从”到“氨基酸至”纵栏中指定的血清反应性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽Sep ID No 218 的 120-143，138-161 和 156-179 ;Seq ID No 219 的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 222 的 74-90 ；Seq ID No 223 的 759-773 ；Seq ID No 224 的 237-260 ；SeqID No 225 的 265-284 ；Seq ID No 226 的 65-74 ；Seq ID No 227 的 41-50 ；Seq ID No 229 的 163-174 ； Seq ID No 230 的 26-37 ；SeqID No 232 的 174-189 ；Seq ID No 234 的 240-256 ；Seq ID No
45236 的 285-297 ;Seq ID No 238 的 238-247 ;Seq ID No 239 的 491-519 ;Seq ID No 243 的 114-140 ；Seq ID No 250 的 267-284 ;Seq ID No252 的 439-453 ;Seq ID No 253 的 162-178 ；Seq ID No 254 的 347-364 ；Seq ID No 255 的 699-715 ；Seq ID No 256 的 60-71 ； SeqID No 257 的 244-257 ；Seq ID No 258 的 44-63 和 57-76 ；Seq IDNo 260 的 185-196 ； Seq ID No 263 的 119-129 ；Seq ID No 266 的 182-195 ；Seq ID No 267 的 32-44 和 424-442 ；Seq ID No 268 的 247-256 ;Seq ID No 269 的 678-694，785-805，55-77 和 72-94 ； Seq ID No 281 的 210-226 ；Seq ID No 289 的 37-59 ；Seq ID No 296 的 13-29 ；Seq ID No 348 的 136-159 ；Seq ID No 349 的 205-222 ；Seq ID No 350 的 99-110 ；Seq ID No 351 的 160-176 ；Seq ID No 355 的 457-470 ；Seq ID No 356 的 221-237 ；Seq ID No 357 的 167-190 ；Seq ID No 361 的 96-120 ；Seq ID No 364 的 399-417，503-519 和 544-563 ；Seq ID No 371 的 46-68，159-183 和 184-198 ；Seq ID No372 的 463-481 ；表 4 的“氨基酸从，，到 “氨基酸至”纵栏中指定的免疫原性表位；尤其是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 219的 110-129 和 168-184 ；Seq ID No 277 的 877-901，333-354，326-344 和 801-809 ;Seq ID No 347 的 l-54;Seq ID No 364 的 544-563，31-51，107-119，399-417 和 503-519 ;Seq ID No 218 的 120-198 ；Seq ID No 219 的 20-35 ；Seq ID No 221 的 118-201 ；Seq ID No 242 的 48-132 ；SeqID No 249 的 118-136 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No 254 的 347-364 ； SeqID No 255 的 699-715 ;Seq ID No 258 的 50-76 ;Seq ID No 269 的 785-819 和 44-128 ； Seq ID No 274 的 90-128 ；Seq ID No 289 的 314-384 ；Seq ID No 293 的 327-349 ；Seq ID No304 的 242-314,405-478 和 23-100 ;Seq ID No 305 的 129-210 ;Seq ID No 307 的 162-188 ；Seq ID No 310 的 750-772 ；Seq ID No335 的 1-56 ；Seq ID No 337 的 322-337 ； Seq ID No 339 的 72-90 ；Seq ID No 345 的 374-395 ；Seq ID No 348 的 136-159 ；Seq ID No358 的 141-164 ；Seq ID No 361 的 96-157 ；Seq ID No 363 的 1-82 ；Seq ID No 364 的 489-556 ；Seq ID No 371的159-183和49-133 ；包含表5的“推定的免疫原性氨基酸”和 “鉴别的免疫原性区域(aa)的位置”纵栏的氨基酸序列的肽，尤其是包含如下氨基酸的肽 Seq ID No475 的4-26，35-41，53-61，73-84，103-108，114-120，140-146，156-162，192-208， 214-219，227-233，239-252，260-268，284-297，1-48 和 113-133 ;Seq ID No 476 的 4-27， 38-44，50-56，59-64，72-79，83-89，92-97，108-116，123-148，152-167，183-196，200-220， 232-244，255-261，265-274，282-302，309-317，1-79 和 231-302 ;Seq ID No 477 的 6-28， 66-72,85-105,115-121，144-151，160-170，176-185，223-230，252-288，296-310，319-333， 367-374，458-464，471-480，483-488，520-528，530-549，559-564，593-601，606-616， 636-643，655-662，676-682，684-699，719-726，735-750，757-764，777-785，799-810， 812-843,846-853,868-873,880-889,891-899,909-929,934-940,963-969,998-1004, 1007-1014，1016-1022，1030-1046，1-80 和 808-821 ;Seq ID No 478 的 7-24，35-41，75-81， 91-114，122-132，137-144，148-156，183-192，194-200，212-228，233-238，251-258， 275-295，326-332，337-346，1-79 和 305-321 ；Seq ID No 479 的 31-38，42-52，66-72， 86-92，98-104，115-122，127-146，154-164，169-187，198-212，225-237，255-269，13-92 和 135-142 ；Seq ID No 480 的 4-36，39-49，63-69，71-77，81-88，123-131，133-139，160-169， 174-180，188-194，210-217，273-278，289-300，317-334，336-341，383-401，425-438，1-68, 212-270 和 402-446 ;Seq ID No 481 的 21-29，31-42，49-63，72-79，81-93，112-132，159-165，188-195，197-232，262-267，279-286，294-301，318-326，348-366，381-405， 409-426,436-465,471-480,484-492,497-505,521-544,554-561,567-577,581-589, 601-609,611-622,636-651,653-667,669-685,700-708,716-722,729-744,749-766, 780-786，789-811，814-864，1-57 和 84-106 ;Seq ID No 482 的 6-24，35-48，57-63，72-78， 87-92，113-119，123-137，147-153，173-181,212-233 和 1-124 ;Seq ID No 483 的 13-34， 62-69，78-83，86-91，98-104，107-115，146-159，179-188，195-205，209-221，226-233， 239-253，276-282，284-294，297-308，331-354，375-382，388-399，421-433，449-458， 464-469,472-491,508-513,525-531,534-550,575-593,601-618,629-635,654-661, 666-680，706-721，723-740，771-805，810-830，845-851 和 1-84 ;Seq ID No 484 的 4-32， 45-64，73-83，86-92，100-111，125-147，157-163，170-175，177-188，226-232，245-252， 258-274，320-335，348-359 和 1-71 ;Seq ID No485 的 13-40，43-71，76-83，87-101， 109-119，125-156，162-175，182-219，226-232，240-262，270-287，306-318，326-342， 344-408，414-444，449-456 和 1-51 ；Seq ID No 486 的 4-16，18-34，45-54，99-108， 134-140,203-212,241-257,266-274,279-291，308-315，330-336，355-370，374-382， 402-410，428-455，466-472，474-480，531-554，560-566，572-580，597-618，632-660， 664-674，676-685，691-705，708-735，750-768，1-87 和 342-480 ；表 6 的“氨基酸从”到“氨 基酸至”的纵栏中指定的血清反应性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽No 475的115-132 和 1-26 ；Seq ID No 476 的 33-55 ；Seq IDNo 478 的 1-25 ；Seq ID No 479 的 37-61 ；Seq ID No 480 的 l_24;Seq ID No 481 的 1-23 ;Seq ID No 482 的 46-60 ;Seq ID No 483 的 1-28， 23-50 和 45-71 ；Seq ID No 484 的 1-22 和 17-38 ；Seq ID No485 的 1-22 和 17-38 ；Seq ID No 486的1-27，22-47和422-447 ；表7的“氨基酸从”到“氨基酸至”纵栏中指定的免疫原 性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 475的115-132和1-47 ;Seq ID No476的 1-55 ；Seq ID No 477 的 22-85 ；Seq ID No 478 的 307-320 和 1-44 ；Seq ID No 479 的 15-76 和 40-92 ；Seq ID No 480 的 1-59，213-269 和 403-445 ；Seq ID No 481 的 1-56 和 85-105 ；Seq ID No482 的 37-121 ；Seq ID No 483 的 1-71 ；Seq ID No 484 的 1-38 ；Seq ID No 485的1-38 ；Seq ID No 486的1_47以及包含所述序列至少6个优选地多于8个尤其 多于10个氨基酸并且优选地不多于70、50、40、20、15或11个氨基酸的片段。所有这些片 段单独地并且每一个独立地形成了本发明优选的挑选的方面。通过一套长度至少10个氨基酸有1个氨基酸重叠的肽分析蛋白质抗原的全部序 列可以鉴别特定抗原的所有线性超免疫血清反应片段。随后，通过使用表达的全长蛋白质 或其结构域多肽的用超免疫血清分析蛋白质抗原可以鉴别非线性表位。假设蛋白质独特的 结构域足够形成不依赖于天然蛋白质的3D结构，各个重组或合成产生的结构域多肽用超 免疫血清的分析将允许在多结构域蛋白质各个结构域内的构象抗原结构域的鉴别。对于结 构域拥有线性以及构象性表位的那些抗原，用相应于线性表位的肽的竞争试验可用于证实 构象性表位的存在。将理解本发明尤其也涉及编码前面提到的片段的核酸分子，杂交编码片段的核酸 分子的核酸分子，特别是在严格条件下杂交的那些，以及用于扩增编码片段的核酸分子的 例如PCR引物的核酸分子。在这些点上，优选的核酸分子是如上面讨论的相应于优选片段 的那些。
本发明也涉及包含本发明的一个或多个核酸分子的载体、用本发明的载体进行基 因工程的宿主细胞以及通过重组技术的超免疫血清反应性抗原及其片段的产生。大量的表达载体能用于表达根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段。一 般，适于维持、繁殖或表达核酸以在宿主中表达多肽的任何载体可以用于在这方面的表达。 与本发明的这个方面一致，载体可以例如是质粒载体、单或双链噬菌体载体、单或双链RNA 或DNA病毒载体。此处公开的起始质粒或者是市售可获得的、公开可获得的，或者通过众所 周知的公开的程序的常规应用能从可获得的质粒构建。在某些方面，载体之中优选的是为 了本发明的核酸分子和超免疫血清反应性抗原或其片段的表达的那些。宿主细胞中的核酸 构建体能以传统方式用于产生重组序列编码的基因产物。或者，本发明的超免疫血清反应 性抗原及其片段能通过传统肽合成器合成产生。成熟的蛋白质能表达于哺乳细胞、酵母、细 菌或其它在合适的启动子控制下的细胞。使用来源于本发明的DNA构建体的RNA，也能采用 无细胞的翻译系统以产生这样的蛋白质。能对宿主细胞进行基因工程化以整合核酸分子和表达本发明的核酸分子。合适宿 主的代表性实例包括例如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌细菌细胞； 例如酵母细胞和曲霉属细胞的真菌细胞；例如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞的昆虫细胞；例如 CHO, COS, Hela, C127，3T3，BHK, 293和Bowes黑素瘤细胞的动物细胞；以及植物细胞。本发明也提供了产生无乳链球菌超免疫血清反应性抗原及其片段的方法，包括从 宿主细胞表达本发明提供的核酸分子编码的超免疫血清反应性抗原或其片段。本发明还提 供了产生表达无乳链球菌超免疫血清反应性抗原或其片段的细胞的方法，包括用根据本发 明的载体转化或转染合适的宿主细胞使得转化的或转染的细胞表达载体中含有的核酸编 码的多肽。可以以例如融合蛋白质的修饰形式表达多肽，并且多肽可以不仅包括分泌信号还 有额外的异源性功能区域。因而，例如，尤其是带电荷氨基酸的额外氨基酸区域可以加到多 肽的N或C末端以改进在纯化过程中或随后的操作和储存过程中在宿主细胞中的稳定性和 持续性。区域也可加到多肽以促进纯化。这样的区域可以在多肽的最后制备之前去除。多 肽基团加到多肽以引起分泌或排泄、以改进稳定性或促进纯化在其它之中是本领域熟悉的 和常规的技术。优选的融合蛋白质包含对于溶解或纯化多肽是有用的来自免疫球蛋白的异 源性区域。例如，EP-A-O 464 533 (加拿大副本2045869)公开了包含免疫球蛋白分子的恒 定区不同部分和另一个蛋白质或其部分的融合蛋白质。在药物发现中，例如，为了鉴别拮抗 剂的高通量筛选试验的目的蛋白质已经与抗体Fc部分融合。见例如{Bennett，D.等人， 1995}和{Johanson, K.等人，1995}。通过众所周知的方法能从重组细胞培养物中重新获得和纯化无乳链球菌超免疫 血清反应性抗原或其片段，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷 酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。通过化学合成以及通过生物工程手段能生产根据本发明的超免疫血清反应性抗 原及其片段。后者包含了用含有根据本发明的核酸的载体转染或转化宿主细胞，以及在本 领域技术人员已知的条件下培养转染或转化的宿主细胞。为了纯化或分离要生产的多肽的 生产方法也可以包含纯化步骤。优选的实施方案中载体是根据本发明的载体。根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段可用于含有这些生物体或其衍生的多肽的样品中一个或多个生物体的检测。优选的这样的检测是为了诊断，更加优选地 为了疾病的诊断，最优选地为了与革兰氏阳性细菌的存在或丰度相关或相联的疾病的诊 断，尤其是选自链球菌、葡萄糖球菌和乳球菌的细菌。更加优选地，微生物选自肺炎链球 菌(Streptococcus pneumoniae)、化月农链球菌(Streptococcus pyogenes)禾口变形链球菌 (Streptococcus mutans)，尤其微生物是化脓链球菌。本发明也涉及诊断试验，例如用于检测细胞和组织中本发明的超免疫血清反应性 抗原及其片段的水平的定量和诊断试验，包括正常和异常水平的测定。所以，例如，根据本 发明，为了检测与正常组织样品相比多肽的过度表达的诊断试验可以用于检测感染的存 在，以及鉴别感染生物体。能用于测定源自宿主的样品中多肽水平的试验技术对于本领域 技术人员是众所周知的。这样的试验方法包括放射免疫试验、竞争结合试验、Western斑点 分析和ELISA试验。这些之中，ELISA常常是优选的。ELISA试验最初包含制备特异于多肽 的抗体，尤其是单克隆抗体。另外，一般地制备了结合于单克隆抗体的报告抗体。报告抗体 附着于检测试剂，例如放射活性的、荧光的或酶试剂，例如辣根过氧化物酶。根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段可用于阵列的目的或与其相连。更 加特别的，至少一个根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段可以固定于支持物上。 所述支持物一般包含各种超免疫血清反应性抗原及其片段，由此可以使用一种或一些根据 本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段和/或不同的超免疫血清反应性抗原及其片段 产生多样性。这样的阵列以及任何阵列的特征性特性一般是独特的多肽固定于所述支持物 或其表面上独特的或预先定义的区域或位置上。因为这个，阵列独特位置或区域上的任何 活性与特异性多肽相关。不同超免疫血清反应性抗原及其片段固定于支持物的数量可以在 从10个那么少到几千个不同超免疫血清反应性抗原及其片段的范围内。优选实施方案中 每cm2超免疫血清反应性抗原及其片段的密度是从每Cm2IO个肽/多肽那么少到每cm2至 少400个不同肽/多肽，更加特别的每cm2至少1000个不同超免疫血清反应性抗原及其片 段。这种阵列的生产对于本领域的技术人员是已知的，例如，在美国专利5，744，309 中有描述。阵列优选地包含具有至少第一个表面的平坦的、多孔或非多孔的固相支持物。如 此出公开的超免疫血清反应性抗原及其片段固定于所述表面。其它之中优选的支持物材料 是玻璃或纤维素。为了此处描述的任何诊断应用使用矩阵也在本发明内。除了根据本发明 的超免疫血清反应性抗原及其片段外，为了如上面描述的阵列的产生也可以使用根据本发 明的核酸。这个也应用于抗体制成的阵列，优选地其它之中如此处描述的单克隆抗体。另一方面本发明涉及指向任何根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段、其 衍生物或片段的抗体。本发明包括例如单克隆和多克隆抗体、嵌合、单链和人源化抗体，以 及Fab片段或Fab表达文库的产物。抗体可以是嵌合的也在本发明之内，即它们的不同部 分源自不同种属或者至少各自的序列取自不同的种属。通过将超免疫血清反应性抗原及其片段直接注射到动物或者通过给予优选非人 类的动物超免疫血清反应性抗原及其片段，能够获得产生的抗相应于本发明的序列的超免 疫血清反应性抗原及其片段的抗体。然后如此得到的抗体将结合超免疫血清反应性抗原及 其片段本身。以这个方式，甚至仅仅编码超免疫血清反应性抗原及其片段的一个片段的序 列能用于产生结合整个天然超免疫血清反应性抗原及其片段的抗体。然后这样的抗体能用于从表达那些超免疫血清反应性抗原及其片段的组织中分离超免疫血清反应性抗原及其 片段。为了单克隆抗体的制备，能够使用本领域已知的提供连续细胞系培养物产生的抗 体的任何技术(如原先{Kohler, G.等人，1975}中描述地)。能使为了单链抗体的产生描述的技术适应于产生抗根据本发明的免疫原性的超 免疫血清反应性抗原及其片段的单链抗体。转基因小鼠或例如其它哺乳动物的其它生物体 可以用于表达抗根据本发明的免疫原性超免疫血清反应性抗原及其片段的人源化抗体。或者，噬菌体展示技术或核糖体展示能用于从筛选拥有各自靶抗原的人类淋巴细 胞的PCR扩增ν-基因文库或从幼稚文库挑选对超免疫血清反应性抗原及其片段有结合 活性的抗体基因{McCafferty, J.等人，1990} ； {Marks, J.等人，1992}。也能通过链改组 (chain shuffling) {Clackson, Τ.等人，1991}改进这些抗体的亲和力。如果存在两个抗原结合结构域，每个结构域可以指向不同的表位-称为“双特异 性”抗体。上面描述的抗体可以应用于分离或鉴别表达超免疫血清反应性抗原及其片段的 克隆或为了用亲和色谱的分离和/或纯化通过将抗体附着于固相支持物而纯化本发明的 超免疫血清反应性抗原及其片段。因而，抗本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的抗体尤其可以应用于抑制和 /或治疗感染，特别是细菌感染，特别是来自无乳链球菌的感染。超免疫血清反应性抗原及其片段包括抗原性、表位或免疫原性等同的衍生物，它 形成了本发明的特定方面。如此处使用的术语“抗原性等同衍生物”包含某些抗体特异性识 别的超免疫血清反应性抗原及其片段或其等同物，所述抗体当针对根据本发明的蛋白质或 超免疫血清反应性抗原及其片段培养时，干扰病原体和哺乳动物宿主之间的相互作用。如 此处使用的术语“免疫原性等同衍生物”包含肽或其等同物，当其用于合适的制剂以在脊柱 动物中培养抗体时，抗体起干扰病原体和哺乳动物宿主之间相互作用的作用。超免疫血清反应性抗原及其片段，例如抗原性或免疫原性等同衍生物或其融合蛋 白能够用作抗原以免疫小鼠或例如大鼠或小鸡的其它动物。融合蛋白质可以给超免疫血清 反应性抗原及其片段提供稳定性。抗原可以例如通过结合连接于例如牛血清白蛋白(BSA) 或匙孔血蓝蛋白(KLH)的免疫原性载体蛋白质。或者，包含蛋白质或超免疫血清反应性抗 原及其片段多个拷贝的抗原肽或抗原性、免疫原性等同的超免疫血清反应性抗原及其片段 可以有足够的抗原性以改进免疫原性而避免载体的使用。优选地，修饰抗体或其衍生物使其在个体有更少的免疫原性。例如，如果个体是 人，抗体最优选地可以是“人源化的”，其中杂交瘤衍生的抗体的互补决定区域被接种到人 单克隆抗体，例如如{Jones, P.等人，1986}或{Tempest, P.等人，1991}中描述地。本发明的多核苷酸在基因免疫中的使用将优选地采用合适的递送方法，例如质粒 DNA直接注射入肌肉，与特异性蛋白质载体复合的DNA的递送，用磷酸钙的DNA共沉淀，DNA 包装在各种形式的脂质体中，粒子轰击{Tang，D.等人，1992}，{Eisenbraun，M.等人，1993} 以及使用克隆的逆转路病毒载体的体内感染{Seeger，C.等人，1984}。另一方面本发明涉及结合于根据本发明的任何超免疫血清反应性抗原及其片段 的肽，以及这样肽的生产方法，由此所述方法特征在于根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的使用，并且基础步骤对于本领域的技术人员是已知的。可以通过使用根据本领域技术的方法产生这样的肽，例如噬菌体展示或核糖体展 示。在噬菌体展示的情况下，基本上产生了噬菌体形式的肽的文库，这种文库与靶分子接 触，在这个情况下是根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段。随后从各自的反应中 去除那些结合于靶分子的肽，优选地是与靶分子的复合物。结合的特性至少在某个程度依 赖于例如盐浓度等等特定实行的实验设置是本领域技术人员已知的。结合于有更高的亲和 力或更大力量的靶分子的那些肽从文库的非结合成员分离之后，并且可选地也在靶分子从 靶分子与肽的复合物去除后，随后可以特征分析各自的肽。特征分析之前，可选地实行扩增 步骤，例如通过增殖编码肽的噬菌体。特征分析优选地包含靶结合肽的测序。基本上，肽不 限制它们的长度，然而优选地在各自的方法中优选地得到具有从大约8至20个氨基酸的长 度的肽。文库的大小可以是大约IO2至1018，优选地IO8至IO15个不同的肽，然而并不限于 这些。特定形式的靶点结合超免疫血清反应性抗原及其片段是所谓的“抗促成素”，在其 它之中它们在德国专利申请DE 197 42 706中有描述。在另一方面本发明涉及与任何的根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段 相互作用的功能性核酸，以及这样功能性核酸的生产方法，由此所述方法特征在于根据本 发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的用途，并且基础步骤对于本领域的技术人员是已 知的。功能性核酸优选地是适体和镜面体。适体是单链或双链的、并且特异性与靶分子相互作用的D-核酸。适体的生产或挑 选在例如欧洲专利EP 0 533 838中有描述。基本上实行了下面的步骤。首先，提供了核酸 的混合物，即潜在的适体，由此每个核酸一般包含一些优选地至少8个随后随机的核苷酸 的片段。这个混合物随后与靶分子接触，由此例如基于与候选混合物对靶点增加的亲和力 或对靶点更大的力量核酸与靶分子结合。随后从剩余的混合物中分离结合核酸。可选地， 使用例如多聚酶链式反应扩增这样得到的核酸。这些步骤可以重复数次，只要最后混合物 具有增加的特异性结合于靶点的核酸的比例，然后可选地从中挑选最终结合核酸。这些特 异性结合的核酸指的是适体。很明显在适体的生产或鉴别方法的任何阶段，为了使用标准 技术测定它的序列可以采集个体核酸混合物的样品。例如通过引入对产生适体的技术领域 技术人员已知的定义的化学基团可以稳定适体在本发明之内。这样的修饰例如可以存在于 氨基基团在核苷酸糖基团2’位置的引入。适体目前用作治疗剂。然而，这样挑选的或产生 的适体可以用于靶点确认和/或用作优选基于小分子药剂的药剂开发的先导物质也在本 发明之内。这个实际上通过竞争试验完成，由此候选药物抑制靶分子和适体之间特异性相 互作用，由此在适体从靶点和适体的复合物取代时，可以假设各自的候选药物允许靶点和 适体之间相互作用的特异性抑制，如果相互作用是特异性的，所述候选药物将至少在原则 上适于阻断靶点并因而降低其在包含这样靶点的各自的系统中的生物利用度或活性。这样 得到的小分子可以进行进一步的衍生化和修饰以优化其物理、化学、生物和/或医学特征， 例如毒性、特异性、生物降解度和生物利用度。镜面体和它们的产生或制造基于一个简单的原则。镜面体的制造在国际专利申请 WO 98/08856中有描述。镜面体是L-核酸，这是指它们由L-核苷酸而不是象适体的D-核 苷酸组成。镜面体特征在于它们在生物系统具有非常高的稳定性并且与适体相比特异性地
51与它们指向的靶分子相互作用这个事实。产生镜面体的方法中，产生了 D-核酸的异源群， 这个群与靶分子的光学对映体接触，在这个情况下例如与根据本发明超免疫血清反应性抗 原及其片段的天然发生的L-对映体的D-对映体接触。随后，分离不与靶分子的光学对映 体相互作用的那些D-核酸。但是分离、可选地鉴别和/或测序与靶分子的光学对映体相互 作用的那些D-核酸，随后基于从D-核酸获得的核酸序列信息合成相应的L-核酸。就与靶 分子的光学对映体相互作用的前面提到的D-核酸的序列而言相同的这些L-核酸将特异性 地与天然发生的靶分子而不是它的光学对映体相互作用。与适体产生的方法相似，重复各 种步骤几次并因而浓集特异性与靶分子的光学对映体相互作用的那些核酸是可能的。在另一方面，本发明涉及与根据本发明的任何核酸分子相互作用的功能性核酸， 以及这样功能性核酸的制造方法，由此所述方法特征在于根据本发明的核酸分子和它们各 自序列的用途并且基础步骤对于本领域技术人员是已知的。功能性核酸优选地是核酶、反 义寡核苷酸和siRNA。核酶是催化活性的核酸，优选地由基本上包含两个基团的RNA组成。第一个基团 显示了催化活性而第二基团负责与靶核酸的特异性相互作用，在这个情况下是编码根据本 发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的核酸。靶核酸和核酶第二基团相互作用时，一般 通过两个杂交链上基本上互补的碱基的延伸杂交和Watson-Crick碱基配对，催化活性基 团可以变成有活性的，就是指它或者分子内或者分子间催化核酸分子，倘若核酶的催化活 性是磷酸二酯酶活性。随后，可以有靶核酸进一步的降解，最后导致了靶核酸以及源自所述 靶核酸的蛋白质的降解。核酶、它们的使用和设计原则对于本领域技术人员是已知的，例如 {Doherty, Ε.等人，2001}和{Lewin，Α.等人，2001}中有描述。用于药剂的制造以及作为诊断试剂的反义寡核苷酸的活性和设计分别基于作用 的相同模式。基本上，反义寡核苷酸基于碱基互补与靶RNA优选地与mRNA杂交，因而激活 RNase H。RNase H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶联的DNA激活。然而除了硫代磷酸酯偶联 的DNA以外，磷酸二酯偶联的DNA很快地被细胞内核酶降解。这些抗性的非天然发生DNA 衍生物在与RNA杂交时不抑制RNase H。换而言之，反义聚核苷酸仅仅作为DNA RNA杂交 复合物是有效的。这种反义寡核苷酸的实例在其它之中的美国专利US 5，849，902和US 5，989，912。换而言之，基于靶分子的核酸序列，在这个情况下靶分子是根据本发明的超免 疫血清反应性抗原及其片段的核酸分子，可以基于碱基互补的原则，从原则上可从其推测 的各自的核酸序列的靶蛋白质或者通过了解尤其是mRNA这样的核酸序列设计合适的反义 寡核苷酸。特别优选的是具有硫代磷酸酯DNA(3至9个碱基)的短的延伸的反义寡核苷酸。 最少3个DNA碱基对于细菌RNase H的激活是必需的，最少5个碱基是哺乳动物RNase H激 活必需的。在这些嵌合寡核苷酸中有形成RNase H底物的中心区域，它与由不形成RNase H 底物的修饰的核苷酸组成的杂交“臂”侧面相接。可以例如通过2’ -氧-甲基或2’ -氟修 饰嵌合寡核苷酸的杂交臂。替代的方法使用了所述臂中的甲基膦酸酯或氨基磷酸酯连接。 本发明的实践中有用的反义寡核苷酸进一步实施方案是P-甲氧基寡核苷酸，部分P-甲氧 基寡脱氧核糖核酸或P-甲氧基寡核苷酸。本发明尤其相关和有用的是如上面提到的两个美国专利更加特别描述的那些反 义寡核苷酸。这些寡核苷酸不含有天然发生的5' —3'-连接的核苷酸。更合适的寡核苷酸具有两个类型的核苷酸激活RNase H的2’-脱氧硫代磷酸酯和不激活RNase H的2’ 修饰的核苷酸。2’-修饰的核苷酸之间的连接是磷酸二酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸二 酯。通过连续的RNase H激活区域完成RNase H的激活，所述激活区域含有3和5个之间 的2’脱氧硫代磷酸酯核苷酸以激活细菌RNase H以及5和10个之间的2’脱氧硫代磷酸 酯核苷酸以激活真核特别是哺乳动物RNase H。通过使5’和3’末端碱基高度核酶抗性以 及可选地通过取代3’末端阻断基团完成对于降解的保护。更加特别地，反义寡核酸包含5’末端和3’末端；从位置11至595' -3'-连接 的核苷酸独立地选自2’修饰的磷酸二酯核苷酸和2’修饰的P-烷氧基磷酸三酯核苷酸；其 中5’末端核苷酸附着于三和十个连续的硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核酸之间的RNase H 激活区域，其中所述核苷酸3’末端选自反转的脱氧核糖核酸、一至三个硫代磷酸酯2’修饰 的核糖核酸的连续延伸、生物素基团和P-烷氧基磷酸三酯核苷酸。也可以使用反义寡核苷酸，其中不是5’末端核苷酸而是上面详述的3’末端核苷 酸附着于RNase H激活区域。5’末端也选自特定的基团，而不是所述寡核苷酸的3’末端。根据本发明的核酸以及超免疫血清反应性抗原及其片段可以用作或用于尤其是 疫苗的药物组合物的制造。优选是疫苗的这样的药物组合物优选地是为了无乳链球菌造成 的、相关的或相联的疾病的预防和治疗。在这个范围内本发明的另一方面涉及诱导尤其是 哺乳动物的个体的免疫反应的方法，包含用本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段或其 片段或变异体接种个体，足够生产抗体以保护所述个体免受感染，特别是链球菌感染并且 最特别的链球菌的感染。仍然本发明的另一方面，涉及诱导个体免疫反应的方法，包含通过基因治疗或其 它，递送核酸功能性编码超免疫血清反应性抗原及其片段或其片段或变异体以体内表达超 免疫血清反应性抗原及其片段或其片段或变异体，目的是为了诱导产生抗体或细胞介导的 T细胞反应的免疫反应以保护所述个体免受疾病，不管那个疾病是否已经在个体内确定，T 细胞可以是产细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞。给予基因的一个方法是通过加速作为 颗粒上的涂层或其它的基因进入期望的细胞内。本发明的另一方面涉及免疫组合物，当被引入能够诱导宿主内免疫反应的宿主内 时，它能诱导这样的宿主内的免疫反应，其中所述组合物包含编码和表达本发明的超免疫 血清反应性抗原及其片段的抗原的重组DNA。可以治疗性或预防性地使用免疫反应，可以采 用抗体免疫或细胞免疫的形式，例如源自CTL或CD4+T细胞的细胞免疫。本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段或其片段可以与本身可能不产生抗体 但是能够稳定第一个蛋白质并产生将具有免疫性和保护特性的融合蛋白质的辅蛋白质 (co-protein)融合。这个融合的重组蛋白质优选地进一步含有抗原性辅蛋白质，例如谷胱 甘肽S转移酶(GST)或半乳糖苷酶，溶解蛋白质并促进其产生和纯化的相对大的辅蛋 白质。另外，辅蛋白质在提供免疫系统全面刺激的意义上起佐剂的作用。辅蛋白质可以附 着于第一个蛋白质的氨基端或羧基端。本发明也提供的是在无乳链球菌感染的动物模型中在这样的基因免疫实验中使 用所述核酸分子或者其特定片段的方法。这样的片段对于鉴别能引发预防性或治疗性免疫 反应的蛋白质表位尤其有用。这个方法能允许随后从成功抵抗或清除感染的动物的必备器 官制备有特别价值的单克隆抗体以开发尤其是人类的哺乳动物中无乳链球菌感染的预防
53试剂或治疗处理。超免疫血清反应性抗原及其片段可以用作宿主免疫接种的抗原以产生抗细菌入 侵的保护的特异性抗体，例如通过阻断细胞对损伤组织的粘附。组织损伤的实例包括例如 病毒感染(尤其是呼吸系统的，例如流感病毒)、机械、化学或热损伤或者通过留置装置的 植入造成的皮肤或结缔组织以及粘膜组织的伤口，或者例如口腔、乳腺、尿道或阴道的粘膜 的伤口。本发明也包括包含免疫原性重组蛋白质和合适载体的疫苗制剂。因为蛋白质可以 在胃内降解，优选地它通过非胃肠道给予，包括例如皮下、肌肉内、静脉、皮内、鼻内或经皮 的给予。适于非胃肠道给予的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，它可以含有赋予制剂 与个体的优选是血液的体液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、细菌抑制剂和溶质；水性和非水性的 无菌悬浮液，它可以包括悬浮剂或增稠剂。制剂可以呈现在单位剂量或多个剂量的容器内， 例如密封的安瓿和药瓶，可以储存于冷冻干燥条件下，只需要使用前立即加入无菌液体载 体。疫苗制剂也可以包括增强制剂免疫原性的佐剂系统，例如水包油系统和本领域已知的 其它系统。剂量将依赖于疫苗的特异性活性并能很容易地通过常规试验测定。根据另一方面，本发明涉及包含如本发明为了无乳链球菌提供的这样的超免疫血 清反应性抗原及其片段的药物组合物。这样的药物组合物可包含一个优选地至少两个或两 个以上的抗无乳链球菌的超免疫血清反应性抗原及其片段。可选的，这样的无乳链球菌超 免疫血清反应性抗原及其片段在联合药物组合物中也可与抗其它病原体的抗原联合。优选 地，所述药物组合物是为了预防或治疗无乳链球菌和/或其它病原体造成的感染的疫苗， 疫苗中包括了抗所述病原体的抗原。根据另一方面，本发明涉及包含编码上面鉴别的对于无乳链球菌的超免疫血清反 应性抗原或其片段的核酸分子的药物组合物。这样的药物组合物可以包含一个或多个编码 抗无乳链球菌的超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸分子。可选地，编码超免疫血清反 应性抗原或其片段的这样的无乳链球菌核酸分子在联合药物组合物中也可以与编码抗其 它病原体的抗原的核酸分子联合。优选地，所述药物组合物是为了预防或治疗无乳链球菌 和/或其它病原体造成的感染的疫苗，疫苗中包括了抗上述病原体的抗原。药物组合物可含有任何适合的辅助物质，例如缓冲物质、稳定剂或另外的活性成 分，尤其是已知与药物组合物和/或疫苗生产有关的成分。根据本发明的超免疫血清反应性抗原、片段或其编码核酸分子的优选的载体和/ 或赋形剂是为了进一步刺激对给定的超免疫血清反应性抗原、其片段或其编码核酸分子的 免疫反应的免疫刺激化合物。优选地根据本发明的药物制备物中的免疫刺激化合物选自尤 其是聚阳离子肽的聚阳离子物质、优选是免疫刺激脱氧核苷酸的免疫刺激核酸分子、明矾、 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、尤其是人生长激素的神经活性化合物或其组合。尤其是疫苗的药物组合物除根据本发明的超免疫血清反应性抗原、其片段和/或 其编码核酸分子外还包含有生物或药物活性的其它化合物也在本发明的范围内。优选地， 疫苗组合物包含至少一个聚阳离子肽。根据本发明使用的聚阳离子化合物可以是显示了根 据TO 97/30721的特征作用的任何聚阳离子化合物。优选的聚阳离子化合物选自碱性多 肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或它们的混合物。这些聚氨基酸应当具有至少4个氨基酸 残基的链长度(W0 97/30721)。尤其优选的是象聚赖氨酸、聚精氨酸和在多于8个尤其是多于20个氨基酸残基的范围内含有多于20%尤其多于50%的碱性氨基酸的多肽的物质或 者它们的联合。其它优选的聚阳离子和它们的药物组合物在WO 97/30721 (例如聚乙烯亚 胺)和W099/38528中有描述。优选地这些多肽含有20和500个之间的氨基酸残基，尤其 是30和200个之间的残基。这些聚阳离子化合物可以化学或重组产生或可以来源于天然的来源。阳离子(多)肽也可以是抗微生物的，有如{GanZ，T.，1999}中综述的特性。这些 (多)肽可以是原核的或动物或植物来源的或者可以化学或重组产生(W0 02/13857)。肽 也可以属于防卫素类(W0 02/13857)。这样的肽的序列例如能在下面网址的抗微生物序列 数据库中找到http://www. bbcm. univ. trieste. it/ tossi/pag2. html这样的宿主防御肽或防御物质也是根据本发明的聚阳离子多聚体的优选形式。一 般地，允许作为优选地由APC(包括树突细胞)介导的适应性免疫系统的终末产物激活(或 下调)的化合物用作聚阳离子多聚体。尤其优选用作本发明的聚阳离子物质是cathelicidin衍生的抗微生物肽或 其衍生物(国际专利申请WO 02/13857，此处引用作为参考)，尤其是源于哺乳动物 catheIicidin的抗微生物肽，优选地来自人、牛或小鼠。源于天然来源的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽、触 角足肽、壳聚糖或甲壳素其它的衍生物)或源于生化或重组产生的这些肽或蛋白质的其它 肽。其它优选的聚阳离子化合物是cathelin或来自cathelin的相关或衍生的物质。例 如，小鼠 cathelin 是具有氨基酸序列 NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE_COOH 的肽。相关的或衍生的cathelin物质含有有至少15-20个氨基酸残基的cathelin序列的 全部或部分。衍生化可以包括天然氨基酸被不在20个标准氨基酸中的氨基酸替代或修饰。 另外，更多的阳离子残基可以引入这样的cathelin分子中。这些cathelin分子优选地与抗 原联合。结果这些cathelin分子作为没有更多的佐剂加入的抗原的佐剂惊人地有效。所 以这样的cathelin分子用作有或没有更多的免疫激活物质的疫苗制剂的有效佐剂是可能 的。根据本发明使用的另一个优选的聚阳离子物质是含有被3至7个疏水氨基酸的连 接子分开的至少2个KLK基团的合成肽(国际专利申请W002/32451，此处引入作为参考)。本发明的药物组合物可进一步包含免疫刺激核酸。免疫刺激核酸是例如含有中性 或人工CpG的核酸，源自非脊柱动物或在某些碱基内容含有非甲基化的胞核嘧啶_鸟嘌呤 二核苷酸(CpG)的短寡核苷酸形式(ODN)(例如WO 96/02555中描述的)的核酸的短延伸。 或者，基于如例如W001/93903中描述的次黄嘌呤核苷和胞啶的核酸或含有脱氧次黄嘌呤 核苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(W0 01/93905和PCT/EP 02/05448中描述的，此处引 用作为参考)可优选地用作本发明的免疫刺激核酸。优选地，根据本发明也可以使用不同免疫刺激核酸的混合物。任何上面提到的聚阳离子化合物与如前面提到的任何免疫刺激核酸联合也在 本发明之内。优选地，这样的联合是根据WO 01/93905, W002/32451, WO 01/54720, WO 01/93903，WO 02/13857 和 PCT/EP 02/05448 和奥地利专利申请 A 1924/2001 中描述的那 些，此处引用作为参考。
另外或可替代地，这样的疫苗组合物除了根据本发明的超免疫血清反应性抗原及 其片段和其编码核酸外还可以包含神经活性化合物。优选地，神经活性化合物是如例如WO 01/24822中描述的人生长因子。也优选地，神经活性化合物联合于如前面提到的任何聚阳 离子化合物和/或免疫刺激核酸。在另一方面，本发明涉及药物组合物。例如这样的药物组合物是此处描述的疫苗。 药物组合物也是包含任何下面的化合物或其联合的药物组合物根据本发明的核酸分子， 根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段，根据本发明的载体，根据本发明的细胞，根 据本发明的抗体，根据本发明的功能性核酸和根据本发明的例如抗促成素的结合肽，如此 处描述的任何激动剂和拮抗剂。与此有关任何这些化合物可联合于非无菌或无菌载体或与 细胞、组织或生物体一起使用的载体而应用，例如适于给予研究对象的药物载体。这样的组 合物包含例如介质添加剂或治疗有效量的本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段以及 药物可接受载体或赋形剂。这样的载体可以包括但不限于生理盐水、缓冲盐、葡萄糖、水、甘 油、乙醇和它们的联合。制剂应当适合给药的模式。药物组合物可以以任何有效的、方便的方式给予，包括例如通过其它之中局部、口 腔、肛门、阴道、静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、鼻内、气管内或皮内途径的给予。在治疗中或作为预防剂，活性试剂可以作为例如无菌水性分散物优选等渗的可注 射组合物给予个体。或者组合物可制成适于局部应用的例如软膏、乳膏、洗液、眼药膏、滴眼液、滴耳 液、漱口水、浸透敷料和缝线和烟雾剂的形式，并且可以含有合适的传统添加剂，包括例如 防腐剂、辅助药物穿透的溶剂以及药膏和乳膏中的软化剂。这样的局部制剂可以含有相容 性传统载体，例如乳膏或软膏基质以及洗剂的乙醇或油醇。这样的载体可以构成大从约 至大约98%的制剂重量；更加通常地它们将构成一共大约80%的制剂重量。除了上面描述的治疗外，本发明的组合物一般可用作伤口治疗剂以阻止细菌粘附 到受伤组织中暴露的基质蛋白质以及为了牙科治疗的预防用途用作抗生物预防的代替或 与抗生物预防结合。疫苗组合物很方便地是可注射的形式。可采用传统佐剂以增强免疫反应。疫苗接 种合适的单位剂量是0. 05-5 μ g抗原/每公斤体重，优选地给予这样的剂量1-3次，间歇 1-3 周。在所示剂量范围，本发明的化合物应当没有观察到妨碍它们给予合适的个体副毒 性作用。进一步的实施方案中，本发明涉及诊断的和药物的包装和试剂盒，包含一个或多 个充填了一个或多个本发明前面提到的成分的容器。成分能以有用的量、剂量、制剂或联合 存在。与这样的容器有关的是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的 形式的通知，反映了人类给予的产品的制造、使用或销售的机构的批准。与本发明相关，如此处公开的例如药物组合物或疫苗的用途相关的任何疾病尤其 是链球菌更加优选地化脓性和肺炎链球菌相连或相联的疾病或疾病状态。与此相关，要注 意无乳链球菌包含了包括此处公开的那些的一些菌株。与根据本发明要预防和/或治疗的 细菌感染相关的、造成的或相联的疾病在人类包括除了其它的细菌性咽炎、中耳炎、肺炎、 菌血症、脑膜炎、腹膜炎、伤口感染和败血症。
仍然进一步的实施方案中，本发明涉及使用任何根据本发明的超免疫血清反应性 抗原及其片段的筛选方法。这样的筛选方法对本领域的技术人员是已知的，能设计所述方 法以筛选激动剂或拮抗剂。优选地筛选了在本情况下抑制或阻止根据本发明的超免疫血清 反应性抗原及其片段与相互作用伴侣结合的拮抗剂。这样的相互作用伴侣可以是天然发生 的相互作用伴侣或非天然发生的相互作用伴侣。本发明也提供了筛选化合物的方法以鉴别增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)本发 明的超免疫血清反应性抗原及其片段或核酸分子的功能的那些化合物，例如其与结合分子 的相互作用。筛选的方法可以包括高通量。例如，为了筛选激动剂或拮抗剂，可以从表达结合于本发明的超免疫血清反应性 抗原及其片段的分子的细胞分别制备根据本发明的核酸分子的相互作用伴侣和核酸，可以 是合成反应混合物、细胞腔室，例如膜、细胞被膜或细胞壁或者任何的它们的制备物。制备 物在有或无可以是激动剂或拮抗剂的候选分子的存在下与标记的超免疫血清反应性抗原 及其片段一起孵育。候选分子与结合分子结合的能力反映在标记配体结合的降低。无偿结 合，即不引起超免疫血清反应性抗原及其片段功能性作用的分子最可能是好的拮抗剂。很 好结合的并引起与超免疫血清反应性抗原及其片段相同的或密切相关的功能性作用的分 子是好的激动剂。可以例如通过在候选分子与细胞或合适的细胞制备物相互作用后测定报告系统 的活性，以及与本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段或引发与超免疫血清反应性抗原 及其片段相同作用的分子的作用比较测量可能的激动剂和拮抗剂的功能性作用。在这点上 有用的报告系统包括但不限于比色标记底物转化为产物，对超免疫血清反应性抗原及其片 段的功能性活性的改变有响应的报告基因，以及本领域已知的结合试验。拮抗剂试验的另一个实例是竞争试验，在竞争抑制试验合适的条件下联合本发明 的超免疫血清反应性抗原及其片段和有膜结合的结合分子、重组结合分子、天然底物或配 体、底物或配体模仿物的可能的拮抗剂。能例如用放射活性或比色化合物标记超免疫血清 反应性抗原及其片段，如此能精确地测定结合于结合分子或转化为产物的超免疫血清反应 性抗原及其片段以评价可能的拮抗剂的有效性。可能的拮抗剂包括结合于本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段并因而抑制 或取消其活性的的小有机分子、肽、多肽和抗体。可能的拮抗剂也可以是小有机分子、肽、多 肽，例如结合于结合分子上相同位点但不引起本发明超免疫血清反应性抗原及其片段的功 能活性的密切相关的蛋白质或抗体。可能的拮抗剂包括小分子，它结合于并占据了超免疫血清反应性抗原及其片段的 结合位点，由此阻止与细胞结合分子的结合，使得正常的生物活性被阻止。小分子的实例包 括但不限于小有机分子、肽或肽样分子。其它可能的拮抗剂包括反义分子(对于这些分子的描述，见{Okano，H.等人， 1991}；寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂；CRC Press，BocaRation，FL(1988))。优选的可能的拮抗剂包括本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的衍生物。如此处使用的根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的活性是其结合于 任何其相互作用伴侣的能力或结合于其或任何相互作用伴侣这样的能力的程度。在特定的方面，本发明提供了本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段、核酸分子或的抑制剂干扰病原体和负责感染后遗症的哺乳动物宿主之间最初的物理相互作用的 用途。尤其是可以在如下方面使用本发明的分子i)阻止无乳链球菌粘附于粘膜表面的和 植入装置上的哺乳动物细胞外基质蛋白质或伤口的细胞外基质蛋白质；ii)阻断哺乳动物 细胞外基质蛋白质和介导组织损伤或入侵的细菌蛋白质之间的细菌性粘附；iii)导致免 疫防御的逃避；iv)阻断除了装置的植入或其它手术技术以外例如通过抑制营养的获得启 动的感染中致病的正常进程。此处提供的每个DNA编码序列可以用于抗菌化合物的发现和开发。编码蛋白质在 表达时能用作抗菌药筛选的靶点。另外，编码编码的蛋白质氨基酸区域或Shine-Delgarno 或各自mRNA的其它翻译促进序列的DNA序列能用于构建反义序列以控制目的编码序列的 表达。可以采用拮抗剂和激动剂以例如抑制源自链球菌尤其是无乳链球菌感染的疾病， 例如败血症。在仍然另一方面，本发明涉及亲和装置，这样的亲和装置包含至少一种支持材料 和附着于支持材料的任何根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段。由于根据本发明 的超免疫血清反应性抗原及其片段对它们的靶细胞或靶分子或它们的相互作用伴侣的特 异性，只要满足结合的条件，超免疫血清反应性抗原及其片段允许它们的相互作用伴侣从 应用于支持材料的任何种类的样品中选择性去除。样品可以是生物或医学样品，包括但不 限于发酵肉汤、细胞碎片、细胞制备物、组织制备物、器官制备物、血液、尿液、淋巴液、液体寸寸。超免疫血清反应性抗原及其片段可以以共价或非共价方式附着于基质。合适的支 持材料对于本领域技术人员是已知的，并选自纤维素、氧化硅、玻璃、铝、顺磁珠、淀粉和右 旋糖苷。本发明进一步通过下面的图示、实例和序列列表举例说明，从中可以取得进一步 的特性、实施方案和优点。要理解只经由例证不经由公开的限制给予本实例。与本发明相关

图1显示了针对无乳链球菌的人抗体来源的特征。图2显示了来自无乳链球菌ATCC 12403的小片段基因组文库LSAg-70的特征。图3显示了使用生物素化人IgG通过MACS对细菌细胞的挑选。图4显示了所用菌株的血清型和采用鉴别抗原之一的基因分布分析的实例。图5显示了通过用大肠杆菌裂解物免疫诱导小鼠中表位特异性抗体的实例。图6显示了通过流式细胞仪用表位特异性抗血清染色细胞表面的实例。图7显示了体外试验中挑选的表位诱导的抗体杀菌活性的测定。表IA显示了用基因组无乳链球菌文库和人血清进行的所有筛选的总结。表IB显 示了通过表IA中列出的蛋白质抗原区域内序列标示鉴别的抗原蛋白质。表2显示了用人血清的表位血清学分析的总结。表3显示了 46个无乳链球菌株中鉴别的抗原的基因分布分析的总结。表4显示了小鼠免疫原性实验的总结。表5显示了用基因组无乳链球菌文库和人血清进行的所有筛选的总结。表6显示了用人血清的表位血清学的总结。
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表7显示了小鼠免疫原性实验的总结。在详述中提到的图示在下面有更详细地描述。图1显示了如免疫试验测量的抗无乳链球菌抗体的人血清和子宫颈分泌物的特 征分析。使用从无乳链球菌血清型III株ATCC 12403制备的总细菌裂解物或培养上清组 分，通过标准ELISA测量总抗无乳链球菌IgG和IgA抗体水平。㈧显示了由总细菌裂解蛋 白质的健康成人血清的代表性实验结果。数据表示为从线性检测范围内的血清稀释度(对 于IgA2.000X，对于IgG 10, 000)在405nm处的吸光度计算来的ELISA单位。大写数字指出 了包括在健康成人非孕血清合并物中的(从52个中)挑选的血清。(B)为了确保对蛋白质 抗原的多重免疫反应性，对通过ELISA挑选的高滴度血清进行免疫斑点分析。显示了使用 从无乳链球菌血清型III ATCC 12403株制备的总细菌裂解物和在5. 000X稀释度的挑选的 病人血清的代表性实验结果。(C)显示了通过免疫斑点分析来自没有群集的怀孕妇女的子 宫颈分泌物的挑选。定量分析子宫颈纱布条提取的抗体的IgA含量。使用总细菌裂解物在 多孔斑点设备中测试了来自每个制备物2yg IgA的免疫反应性。用抗人IgA第二抗体显 像斑点。挑选并合并显示了与GBS蛋白质有反应性(通过箭头指出)的IgA制备物。图2(A)显示了无乳链球菌ATCC 12403小片段基因文库LSAg-70的片段大小的 分布。在测序576个随机挑选的克隆后，修齐序列(464个)以消除载体残基，对有各种基 因组片段大小的克隆数量作图。(B)显示了无乳链球菌ATCC 12403染色体之上的相同的 LSAg-70 —套随机测序的克隆分布图例。长方形指出了与有注解的ORF配对的序列，菱形代 表了与+/+或+/_方向的非编码染色体序列完全配对的克隆。环形决定了有嵌合序列的所 有克隆的位置。碱基对中的数字距离指出了环形基因组上的方向。图底下的数字和百分比 给出了文库内各种克隆集合的划分。图3㈧显示了用生物素化的人IgG的MACS挑选。用15_20 μ g生物素化的 IgG(PSagll-IgG，从人血清中纯化)筛选了 pMAL9. 1中的LSAg-70文库。作为阴性对照，没 有血清加入到筛选的文库细胞。对于每轮挑选显示了第一次、第二次和第三次洗脱之后挑 选的细胞数(分别上、中和下图)。(B)显示了细菌表面展示挑选的特异性克隆(1-26个)的 反应性，通过用MACS的挑选使用的在1 3，000稀释度的人血清IgG合并物(PSagl 1-IgG， 4yg/yl)的免疫斑点分析进行分析。作为负载对照，相同的斑点用指向平台蛋白质LamB 的抗体在高免疫兔血清1 5，000稀释度也进行分析。Μ，分子重量标记物；L，来自表达 LamB而没有外源肽插入的克隆的提取物。图4(A)显示了用于基因分布研究分析的无乳链球菌临床分离物不同血清型的图 示。许多菌株是不可分型的，可以代表额外的血清型。(B)显示了用各自的寡核苷酸和46个 无乳链球菌株的gbs0061基因分布的PCR分析。PCR片段预言的大小是814bp。1_46，无乳 链球菌株，如在A下显示的临床分离物；_，没有加入基因组DNA ；+，无乳链球菌ATCC 12403 的基因组DNA，作为文库构建的模板。图5显示了用有无乳链球菌衍生的表位并表达Lamb或FhuA的大肠杆菌克隆的总 细菌裂解物诱导表位特异性小鼠血清IgG抗体水平的测量。(A)显示了分别用gbs0428、 gbs0628、gbs632表位产生的三套小鼠血清(每组5个小鼠，1_5)代表性肽ELISA实验。在 两个不同的稀释度测试血清黑柱100X ；灰柱1000X。在肽ELISA中使用了相应于各自表 位的生物素标记的合成肽。用没有无乳链球菌衍生的表位的大肠杆菌裂解物诱导的血清指的是FhuA或LamB。(B)显示了使用从为了小鼠注射挑选的个体大肠杆菌克隆制备的裂解 物的典型免疫斑点实验。血清被不携带表位的大肠杆菌裂解物耗尽以去除抗大肠杆菌蛋白 质的抗体。显示了 gbs0918、gbs0428、gbs0628和gbs632表位的实例。阴性对照(-)是有 空的平台蛋白质的大肠杆菌克隆。箭头指出了平台蛋白质LamB和FhuA的位置。图6显示了通过流式细胞仪对无乳链球菌细胞表面上特异性抗体结合的检测。图 6A中培养的抗无乳链球菌血清型III裂解物的免疫前小鼠血清和多克隆血清与无乳链球 菌株血清型III孵育并用流式细胞仪进行分析。对照显示了二抗与无乳链球菌细胞表面的 非特异性结合的水平。图6B中的柱状图指出了与产生的抗只含有“空的”平台蛋白质FhuA 的大肠杆菌裂解物的对照血清相比由于抗gbs0031、抗gbsl925和抗gbs0012抗体的特异性 结合荧光的增加。图7显示了如体内杀死试验中测定的表位特异性抗体的杀菌活性。免疫血清的杀 死活性与合适的对照血清平行进行测量并相对于对照血清进行计算。数据表示为杀死的百 分比，就是作为特异性抗体存在的后果细菌cfu的降低。用无乳链球菌裂解物产生的高免 疫多克隆小鼠血清和来自非免疫小鼠的血清分别作为试验的阳性和阴性对照。测试用㈧ gbs0012, gbs0016, gbs0031, gbs0428, gbsl306 和 gbs2018 表位和用(B) gbs0233, gbs0419, gbs0942, gbs0975, gbsl038, gbsll44和gbs2093表位产生的免疫血清的杀菌活性，相对 于合适的对照来表示数据，对照可以是例如用没有无乳链球菌衍生的表位并表达Lamb或 FhuA的大肠杆菌克隆诱导的血清。无乳链球菌血清型III细胞与小鼠吞噬细胞孵育60分 钟，存活的细菌通过接种于血琼脂之后计数cfu进行定量。表1 细菌表面展示鉴别的免疫原性蛋白质。(A)纵栏 A，无乳链球菌 ATCC 12403 在 fhuA 中的 300bp 文库，NSag8_IgA (826)，B， 在 fhuA 中的 300bp 文库，PSaglO-IgA(768)，C，在 fhuA 中的 300bp 文库，PSaglO-IgG(711)， D,在 fhuA 中的 300bp 文库，PSaglI-IgG (640)，E，在 LamB 中的 70bp 文库，NSag8_IgA (1057)， F，在 LamB 中的 70bp 文库，NSag8_IgG (869)，G，在 LamB 中的 70bp 文库，PSaglO-IgA (904)， H，在LamB中的70bp文库，PSaglO-IgA-吸附的(493)，I，在LamB中的70bp文库， PSaglO-IgG (910)，J，在 LamB 中的 70bp 文库，PSaglI-IgA (631)，K，在 LamB 中的 70bp 文库， PSaglI-IgG (926)，L,在 LamB 中的 70bp 文库，PSagl8_IgA (691)，M,在 LamB 中的 70bp 文库， PSag-sIgA(628)；*，用程序ANTIGENIC (KoIaskar和Tongaonkar，1990)进行长于5个氨基酸的抗原 序列的预报。表IB列出了氨基酸序列标示鉴别的免疫原性蛋白质和细菌表面展示鉴别的 肽。已经由细菌表面展示鉴别的抗原肽拥有列出的来自无乳链球菌的蛋白质中相同的副 本。显示了肽与多个人血清反应(见表2)。所以靶向这些肽的血清能识别多个蛋白质。表2 用人血清的表位的血液学。显示了代表挑选的表位的个体合成肽与人血清的免疫反应性。反应性的程度表示 为+，++或+++，并加和肽与个体血清(13个患者和9个健康成人，总共22个)的个体反应 性。在ELISA单位作为所有反应性的加和的基础上计算每个肽的总分。对于+分数为2-8， ++为9-16以及+++为17-26。校正背景后从OD4tl5nm的读数和血清稀释度计算ELISA单位。 纵栏中分别指出了第一个和最后一个氨基酸残基的氨基酸从和氨基酸至给出了合成肽在 根据ATCC 12403菌株基因组注释的抗原ORF内的位置。肽名称gbs0012. 1存在于注释的ORF :gbs0012o表3 无乳链球菌株的基因分布用特异于编码相关抗原的基因的寡核苷酸通过PCR测试了如图4A中显示的 四十六个无乳链球菌株。为了证实正确的DNA片段的扩增对一个挑选的PCR反应的PCR片 段进行测序。*，源自与无乳链球菌ATCC 12403相比的测序的血清型IA株中氨基酸替代的 数目。#，用于测序的代替菌株，因为基因在血清型IA株中不存在。表4:抗原表位的免疫原性用包含编码融合于无乳链球菌肽的平台蛋白质LamB或FhuA的质粒的大肠杆菌克 隆免疫测试了无乳链球菌抗原的免疫原性。使用相应的大肠杆菌克隆裂解物通过肽ELISA 和/或免疫斑点检测和测量表位特异性抗体的存在。结果表示为+至+++++，对于肽ELISA 计算为基于ELISA单位的各体小鼠血清的反应性的总和(如图5A上指出的)，对于免疫斑 点(IB)计算为合并的(5个个体)小鼠血清与含有平台蛋白质的表位反应性的强度(如图 5B上指出的)。纵栏中分别指出第一个和最后一个氨基酸残基的氨基酸从和氨基酸至给出 了合成肽在根据ATCC 12403的基因注释的抗原ORF内的位置。表5 细菌表面展示鉴别的免疫原性蛋白质。(A)fhuA 中无乳链球菌 ATCC12403 的 300bp 文库，IC8_IgA(826)，B, fhuA 中的 300bp 文库，PlO-IgA(768)，C, fhuA 中的 300bp 文库，PlO-IgG(711)，D, fhuA 中的 300bp 文库，Pll-IgG(640)，E, IamB 中的 70bp 文库，IC8_IgA(1057)，F, IamB 中的 70bp 文库， IC8-IgG (869), G, IamB 中的 70bp 文库，PlO-IgA (904)，H，IamB 中的 70bp 文库，PlO-IgA-吸 附(493)，I，IamB 中的 70bp 文库，PlO-IgG(910)，J, IamB 中的 70bp 文库，PlI-IgA(631)， K, IamB 中的 70bp 文库与 PlI-IgG (926)，*，用程序 ANTIGENIC (Kolaskar 和 Tongaonkar， 1990)进行长于5个氨基酸的抗原序列的预言。表6 用人血清的表位的血清学。显示了代表挑选的表位的个体合成肽与人血清的免疫反应性。反应性的程度表示 为+、++或+++，加和肽与个体血清(13个患者和9个健康成人，共22个)的个体反应性。在 ELISA单位作为每个肽的总分的基础上计算每个肽的总分。对于+分数为2-8，++为9-16， +++为17-30。背景校正后从OD4tl5nm的读数和血清稀释度计算ELISA单位。纵栏中分别指出 第一个和最后一个氨基酸残基的氨基酸从和氨基酸至给出了根据合成肽在ATCC12403的 基因注释的抗原ORF内的位置。肽名称gbs0233. 1存在于注释的ORF :gbs0233。表7 小鼠中抗原表位的免疫原性。用包含编码融合于无乳链球菌肽的平台蛋白质LamB或FhuA的质粒的大肠杆菌克 隆免疫测试了无乳链球菌抗原的免疫原性。通过肽ELISA检测和测量表位特异性抗体的存 在。结果表示为+至+++++，对于肽ELISA计算为基于ELISA单位的各体小鼠血清的反应性 的总和(如图5上指出的)。纵栏中分别指出第一个和最后一个氨基酸残基的氨基酸从和 氨基酸至给出了合成肽在根据ATCC12403的基因注释的抗原ORF内的位置。实施例实施例1 基于抗无乳链球菌抗体的人血清来源的表征和挑选、抗体筛选试剂的 制备试验过程
酶联免疫试验(ELISA)。用包被缓冲液(0. IM碳酸钠pH 9. 2)稀释的5_10 μ g/ml总蛋白质包被ELISA平 板(Maxi sorb，Millipore)。PBS-BSA中制成三个稀释度的血清。根据生产厂商的推荐 (稀释度1，OOOx)使用高特异性马辣根过氧化物酶(HRP)-连接的抗人IgG或抗人IgA 二 抗(Southern Biotech)。通过基于自动ELISA阅读仪(TECAN SUNRISE) OD4tl5nm的读数测量 底物转化为颜色产物，定量抗原抗体复合物。细菌抗原提取物的制备总细菌裂解物细菌在THB (Todd-Hewitt肉汤)中生长过夜，重复冷冻-解冻循环 裂解细菌在干冰/乙醇混合物上孵育直到冻结(1分钟)，然后在37°C解冻(5分钟)重 复3次。这之后是超声和离心收集上清(3，500rpm, 15分钟，4°C )。培养上清液离心去除细菌后，通过混合1份上清和3份无水乙醇，用冰冷的乙醇 沉淀过夜生长的细菌培养物的上清，在_20°C孵育过夜。离心收集沉淀物(2，600g，15分 钟)。干燥的粒状沉淀物为了 ELISA溶于PBS，或为了 SDS-PAGE和免疫斑点溶于尿素和SDS 样品缓冲液。Bradford试验测定样品的蛋白质浓度。免疫斑点从体外生长的无乳链球菌血清型III株制备总细菌裂解物和培养上清样品。使用 BioRad Mini-Protean细胞电泳系统通过SDS-PAGE分离10至25 μ g总蛋白质/泳道，蛋白 质转移到硝酸纤维素膜(ECI^AmershamPharmacia)。在5%的奶中封闭过夜后，加入2，OOOx 稀释的人血清，HRPO标记的抗人IgG用于检测。抗体从子宫颈纱布条的提取用内窥镜检查过程中引入子宫颈管的吸收圆柱纱布条(Polyfiltronics)收集子 宫颈分泌物，其后冷冻保存直到提取。根据Hordnes等人，1998 (样品的提供者)进行提取。 简要地，纱布条与含有蛋白酶抑制剂的PBS混合，震荡，从含有纱布条的试管中排出液体。 测定提取物中总IgA和IgG抗体的浓度。用于基因组筛选的抗体的纯化基于筛选程序中使用的血清或子宫颈分泌物合并物的总抗GBS滴度挑选来自患 者和健康组的五份血清。通过将热灭活血清与全细胞大肠杆菌细胞(DH5ci，用pHIEll 转化，在与细菌表面展示使用的相同的条件下生长)孵育去除抗大肠杆菌蛋白质的抗 体。根据厂商说明书(超连接固定蛋白质G，Pierce)用蛋白质G亲和色谱从合并的贫瘠 (depleted)血清生产IgG高度富集的制备物。也通过亲和色谱使用固定在链亲和素_琼 脂糖(GIBC0 BRL)上的生物素标记的抗人IgA(S0uthern Biotech)纯化IgA抗体。用 SDS-PAGE、Western斑点、ELISA和蛋白质浓度测量检查损耗(d印letion)和纯化的效率。结果人免疫系统产生的并存在于人血清的抗无乳链球菌抗体是抗原蛋白质的体内表 达和它们的免疫原性的指征。这些分子对于如本发明描述的方法中各体抗原的鉴别是必须 的，所述方法基于特异性抗GBS抗体和相应的无乳链球菌肽或蛋白质的相互作用。为了获 得相关抗体所有组分(r印ertoires)，从如下来源收集人血清I.子宫颈和肛门直肠GBS携带测试阴性的健康怀孕妇女II.子宫颈和/或肛门直肠GBS携带测试阴性其新生儿仍然无GBS(虽然用抗生素预防)的健康怀孕妇女III.没有临床疾病< 45岁的成人IV.幼稚个体，5和10个月之间的小孩，在他们已经丧失母体抗体，由于GSB疾病 的缺乏没有获得的GSB特异性抗体另外也从前两个组的供体收集子宫颈分泌物。这些抗体来源的主要价值主要是分 泌IgA组分，它作为粘膜表面上的保护性效应分子而有直接有关。用来自怀孕妇女和未孕成人至少两个不同人群的抗体进行筛选很重要，因为GBS 疾病也影响老人和免疫受损成人。怀孕研究组内，仍有两个不同的患者类别包括在抗原筛 选中，有GBS群集的妇女和无群集的那些妇女。暴露于病原体的个体中诱导的血清和例如粘膜分泌物的其它体液中的抗体对于 抗原鉴别是至关紧要的。暴露于GBS导致了无症状的群集、当前或过去的急性或慢性感 染。无乳链球菌的群集和感染是普遍的，作为来自以前的遭遇的天然免疫的后果抗体是存 在的。很可能高滴度没有群集的个体的血清含有功能性抗体，能消除携带。在相同的时间 只有抗体持续存在才有可能诱导抗GBS组分的某些抗体。为了那个原因，也包括来自有群 集的个体的血清。已经显示群集与荚膜多糖(CPS)-特异性抗体反应相关联。然而，不清楚 是否足够水平的对CPS的抗体能阻止GBS的群集，因为有群集的妇女有高和低水平的抗CPS 抗体，对于没有群集的怀孕妇女这也是真的。然而，有报告指出怀孕期间产生的抗体的效应功能和亲合力可能改变。认识到最 健康的成人受到保护免受入侵GSB疾病并且敏感性比新生儿和老人要低很重要。来自这些 个体的抗体似乎对于相应抗原的鉴别尤其有价值。已知抗GBS抗体水平随着年龄增加。GBS是粘膜病原体，应当诱导IgA反应；为了那个原因进行基于IgA的筛选以及基 于IgG的筛选很重要。一些无乳链球菌株表达高亲和力IgA结合受体的事实也指出宿主反 应中IgA的重要性。最近有报告指出不仅IgG而且IgA血清抗体能被PMN的FcRlII受体识 别并促进调理作用{PhiIlips-Quagllata, J.等人，2000} ； {Shibuya, Α.等人，2000}。IgA 抗体的主要作用是主要在粘膜表面的中和。血清IgA水平反映了二聚型分泌IgA的质量、数 量和特异性。为了那个原因对血清收集物不仅分析抗链球菌IgG，也分析IgA水平。ELISA 试验中高度特异性第二试剂用于检测例如IgG和IgA的来自高亲和力类型的抗体，但不避 免IgM。IgM抗体的产生在初级适应体液反应过程中发生，得到了低亲和力抗体，而IgG和 IgA抗体已经经历了亲和力的成熟，并且在抵抗或预防疾病中价值更高。通过一系列免疫试验对来自怀孕妇女的127个血清样品和97份子宫颈分泌物和 来自健康成人的50份血清进行抗无乳链球菌抗体的特征分析。使用例如总细菌提取物和 从无乳链球菌血清型III ATCC 12403株制备的培养上清蛋白质的两个不同的抗原制备物 通过ELISA完成主要的特征分析。图IA中显示了使用来自健康成人群的血清的典型实验。 在反应是线性的给定的稀释度比较抗体滴度。基于IgG和IgA抗两个复合抗原混合物(包 括血清型特异性III型荚膜)的反应性对血清进行分级，挑选最高的血清进行进一步的免 疫斑点测试。这个分析证实预先挑选的血清抗多个GBS蛋白质的高抗体反应性，尤其与未 挑选的低滴度血清比较时(图1B)。然而，血清的ELISA分级不总是与免疫斑点信号相关， 提示抗荚膜抗体是多量的，控制了抗总细菌提取物的ELISA反应性。因而，包括在抗体合并 物中的血清的最终挑选主要基于免疫斑点试验中的多个免疫原性条带。这个广泛的抗体特
63征分析方法导致了抗GBS超免疫血清的明确的鉴别。测定了 97份子宫颈分泌物的IgA含量，通过免疫斑点测试了相同量(2yg)的抗 GBS反应性。阳性挑选的血清分成有群集和没有群集的IgA合并物并分开地用于细菌表面 展示实验。为了细菌表面展示对抗原的鉴别，挑选并合并来自两个供体组的5份血清。挑 选的血清包括在四个怀孕妇女的合并物(PSAglO-IgG，-IgA, PSAgll-IgG, PSAgl8_IgG和 PSAg-sIgA)和一个(非孕)健康成人的合并物(NSAg8-IgG，-IgA)中。通过亲和色谱从合 并的血清纯化IgG和IgA抗体，并耗尽大肠杆菌反应性抗体以避免细菌表面展示筛选中的
曲旦 冃足°实施例2 无乳链球菌的高度随机的、挑选框架的、小片段的基因组DNA文库的产 生实验过程链球菌基因组DNA为制备。来自冷冻穿刺培养物的无乳链球菌ATCC12403细菌 接种于50ml Todd-Hewitt肉汤培养基并且在通风和37°C摇晃18h而生长。然后收集培养 物，1，600xg离心15分钟，去除上清。用PBS清洗细菌小球3次，小心悬浮于0. 5ml的溶解 酶溶液(100mg/ml)。加入0. Iml的10mg/ml热处理的RNase A和20U的RNase Tl，小心混 合，溶液在37°C孵育lh。0.2ml的20% SDS溶液和0. Iml蛋白酶K(10mg/ml)的加入之后， 试管在55°C孵育过夜。然后加入1/3体积的饱和NaCl，溶液在4°C孵育20分钟。微离心 机中沉淀提取物(13，000印111)，上清转入新的试管。用？110!1/01(13/^^(25 24 1)和用 CHC13/IAA(24 1)萃取溶液。加入0.6x体积的异丙醇在室温下沉淀DNA，用无菌Pasteur 移液管从溶液缠绕DNA并转入含有80%冰冷乙醇的试管中。10-12，OOOxg离心沉淀物重新 获得DNA，然后空气中干燥并溶于ddH20中。小基因组DNA片段的制备。使用杯状管(cup-horn)超声仪(BandelinSonoplus UV 2200超声仪，装有BB5杯状管，在100%动力输出10秒脉冲)将基因组DNA片段机械剪 切成大小范围150和300bp之间的片段或通过温和的DNase I处理(Novagen)剪切成大小 50至70bp之间的片段。观察到当将DNA打碎成150-300bp大小范围的片段时，超声得到了 紧凑很多的片段大小分布。然而，虽然DNA大量暴露于超声波诱导的流体力学剪切力，还是 不能有效率并可重复的获得随后片段大小的降低。所以，使用Novagen的鸟枪(shotgun)剪 切试剂盒通过温和的DNase I处理获得大小50至70bp的片段。制备试剂盒提供的1 20 稀释度的DNase I，在MnCl2存在下在60 μ 1体积中在20°C进行消化5分钟以确保酶的双 链剪切。用2μ1 0.5Μ EDTA中止反应，在2% TAE-琼脂糖凝胶上评价片段化的效率。这个 处理导致了基因组DNA片段化为近50-70bp片段。然后使用T4DNA聚合酶在100 μ M每个 dNTP的存在下平端处理(blunt-ended)片段两次以确保末端的有效净化(flushing)。片 段在连接反应中立即使用或为了随后的使用冷冻于-20°C。载体的描述。在有与卡那霉素抗性基因交换的β-内酰胺酶(bla)基因的 pASK-IBA骨架上{Skerra，Α.，1994}构建载体pMAL4. 31。另外，将bla基因克隆进多个克 隆位点。编码成熟的β-内酰胺酶的序列先于ompA的先导肽序列以允许有效的跨细胞质 膜的分泌。此外，编码成熟的β -内酰胺酶最初12个氨基酸(间隔子序列)的序列跟在 ompA先导肽序列后面以避免紧接在先导肽酶切割位点之后的序列的融合，因为例如这个区域的正性电荷氨基酸群将降低或取消跨细胞质膜的转位{KajaVa，A.等人，2000}。SmaI限 制性位点供给文库的插入。用于挑选片段的重新获得的上游FseI位点和下游NotI位点在 SmaI位点的两侧。以bla基因转录在_1阅读框在NotI位点后得到一个中止密码子15bp 的方式在编码12个氨基酸间隔子序列的序列之后插入三个限制性位点。+Ibp插入重建了 bla ORF以至于得到β -内酰胺酶伴随着氨苄西林抗性的获得。通过将IamB基因克隆进pEHl的多个克隆位点构建载体 pMAL9. IlHashemzadeh-Bonehi，L.等人，1998}。随后，序列在氨基酸154后插入lamB，含有 限制性位点FseLSmaI和NotI。以挑选了框架的DNA片段的转移得到fhuA的连续阅读框 和各自插入的这个方式构建这个插入的阅读框，所述DNA片段通过用来自质粒pMAL4. 31的 FseI和NotI的消化进行剪切。通过将fhuA基因克隆进pEHl的多个克隆位点构建了载体pHIEll。之后，序列在 氨基酸405后插入fhuA，含有限制性位点FseI、XbaI和NotI。以挑选了框架的DNA片段的 转移得到IamB的连续阅读框和各自插入的这个方式选择这个插入的阅读框，所述DNA片段 通过用来自质粒PMAL4. 31的FseI和NotI的消化进行剪切。用于框架挑选的文库的克隆和评价。基因组无乳链球菌DNA片段连接到载体 PMAL4. 31的SmaI位点。将重组DNA电穿孔进DHlOB电穿孔胜任的大肠杆菌细胞(GIBC0 BRL)，转化株接种于补充了卡那霉素(50yg/ml)和氨苄西林(50yg/ml)的LB琼脂平板 上。平板在37°C孵育过夜，为了大规模的DNA提取收集克隆。储存和保留代表性的平板以 收集克隆用于菌落的PCR分析和大规模的测序。简单的菌落PCR试验用于最初测定大致的 片段大小分布以及插入效率。从测序的数据评价精确的片段大小、在插入位点的接合的完 整性以及框架选择的精确性(3n+l规则)。用于细菌表面展示的文库的克隆和评价。从PMAL4.31载体切割基因组DNA片 段，含有有限制性酶FseI和NotI的无乳链球菌文库。然后完整的片段群转移到质粒 PMAL9. 1 (LamB)或pHIEll (FhuA)中，所述质粒已经用FseI和NotI消化。使用识别8bp富 含GC序列的这两个限制性酶，在每个平台载体中维持PMAL4. 31载体中挑选的阅读框。然 后通过电穿孔将质粒文库转化进大肠杆菌DH5 α细胞。细胞接种于补充了 50 μ g/ml卡那 霉素的大的LB琼脂平板上，在可以得到清晰可见的单个菌落的密度在37°C生长过夜。然后 从这些平板的表面刮下细胞，用新鲜LB培养基清洗，分装在-80°C储存用于文库筛选。结果用于框架挑选的文库。在pMAL4. 31载体中产生分别有大约70和300bp大小的 两个文库(LSAg-70和LSAg-300)。对于每一个文库，大约IygW pMAL4. 31质粒DNA和 50ng的片段化的基因组无乳链球菌DNA的连接和其后的转化在框架挑选后得到了 4X105 至2X IO6个克隆。为了评价文库的随机性，测序了大约576个随机选择的克隆。生物信息 分析显示这些克隆中只有很少的克隆多于一次存在。此外，显示大约80%的克隆的大小在 范围25和IOObp之间，有平均大小大约40bp (图2)。几乎所有序列遵循3n+l规则，显示了 所有克隆恰当地选择框架。细菌表面展示文库。大肠杆菌表面上肽的展示要求来自LSAg-70和LSAg-300文 库的插入体从框架挑选载体PMAL4. 31转移到展示质粒pMAL9. 1 (LamB)或pHIEll (FhuA)。 FseI和NotI限制性剪切基因组DNA片段，5ng插入体与0. 1 μ g质粒DNA连接，其后转化进
65DH5a细胞得到了 2-5xl06个克隆。从LB平板刮下克隆并冷冻而没有进一步的扩增。实施例3 使用细菌表面展示的基因组文库和人血清的高度免疫原性肽序列从无 乳链球菌的鉴别试验过程MACS筛选。来自给定文库的大约2. 5 X IO8个细胞在37°C在5ml补充了 50 μ g/ml 卡那霉素的LB培养基中生长2小时。ImM IPTG加入30分钟诱导表达。用新鲜LB培养基 清洗细胞两次，大约2 X IO7个细胞重新悬浮在100 μ ILB培养基中并转移到Eppendorf管 中。10至20 μ g生物素化的从血清纯化的人IgG加入到细胞，悬浮液在4°C轻微震摇 孵育过夜。加入900 μ 1 LB培养基，混合悬浮液，随后在6，OOOrpm 4°C离心10分钟(对于 IgA筛选，使用IOyg纯化的IgA，这些用生物素化的抗人IgG 二抗捕获)。用Iml LB清 洗细胞一次，然后重新悬浮于100 μ ILB培养基。加入10 μ 1偶联于链亲和素的MACS微珠 (Miltenyi Biotech，德国)，继续在4°C孵育20分钟。之后加入900μ1 LB培养基，将MACS 微珠细胞悬浮液上样到已经平衡的固定于磁铁的MS柱(Miltenyi Biotech，德国)。(MS柱 通过用Iml 70% EtOH清洗一次并用2ml LB培养基清洗两次平衡)。然后用3ml LB培养基清洗柱三次。磁铁去除之后，通过用2ml LB培养基清洗洗 脱细胞。用3ml LB培养基清洗柱后，2ml洗脱物第二次上样到相同的柱上，重复清洗和洗脱 步骤。进行第三次上样、清洗和洗脱步骤，得到2ml的终洗脱物。第二和第三轮筛选进行如下。离心收集终洗脱物的细胞，重新悬浮在Iml补充了 50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基。培养物在37°C孵育90分钟，然后在ImM IPTG诱导30分 钟。随后收集细胞，用Iml LB培养基清洗一次，悬浮于10 μ 1 LB培养基。再次加入10至 20 μ g人生物素化的IgG，悬浮液在4°C轻微震摇孵育过夜。所有进一步的步骤与第一轮挑 选完全一样。两轮挑选之后挑选的细胞接种于补充了 50 μ g/ml卡那霉素的LB琼脂平板上， 37 °C孵育过夜。通过测序和Western斑点分析对挑选克隆的评价。挑选的克隆在补充了 50 μ g/ml 卡那霉素的3ml LB培养基中37°C生长过夜以使用标准程序制备质粒DNA。在MWG(德国) 或与TIGR(美国)合作进行测序。对于Western斑点分析，用10% SDS-PAGE分离大约10至20 μ g总细胞蛋白质，转 印到HybondC膜(Amersham Pharmacia Biotech，英格兰)上。使用人血清作为第一抗体 在大约1 3，000至1 5，000的稀释度以及偶联于HRP抗人IgG或IgA抗体作为第二抗 体在1 5，000的稀释度检测LamB或FhuA融合蛋白质。使用ECL检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，英国)进行检测。或者，兔抗FhuA或兔抗LamB多克隆免疫血清用作 第一抗体，联合各自的偶联于HRP的第二抗体以检测融合蛋白质。结果使用生物素化IgG通过磁铁激活的细胞分拣(MACS)对细菌表面展示文库的筛 选。用从健康成人(NSagS-IgG，-IgA)或P10，11，18 (见实施例1 抗体从人血清的制备) 的血清制备的生物素化的人IgG和IgA的合并物筛选pMAL9. 1中的LSag-70和pHIEll中 的Lsag-70文库。如实验过程下描述地进行挑选过程。图3A显示了用LSag-70文库和 PSagl I-IgG的筛选的代表性实例。如从菌落计数可以看到地，在从MACS筛选的第一挑选循环之后，最后重新获得的细胞总数戏剧性地从2 X IO7个细胞降到大约2 X IO4个细胞，但是 没有抗体加入的挑选显示了相似的细胞数的降低(图3A)。所以进行第二和第三轮挑选。 在第三轮的最后，用PSagll-IgG重新获得大约IO4个细胞，然而当没有加入来自人血清的 IgG时，只重新获得了 2X103个细胞，清楚地显示了挑选依赖于无乳链球菌特异性抗体。为 了评价筛选的表现，随机选择26个挑选的克隆，并用筛选性IgG合并物进行免疫斑点分析 (图3B)。这个分析揭示了多于80%挑选的克隆显示了与相关血清中存在的抗体的反应性， 而表达没有无乳链球菌特异性插入物的LamB的对照株与相同的血清不反应。一般，观察到 反应的速率在35%至90%的范围内。菌落PCR分析显示了所有挑选的克隆含有期待大小 范围的插入物。随后大量随机选择的克隆(每轮筛选600至1200个)的测序导致了基因和被用于 筛选的人血清抗体特异性识别的相应的肽或蛋白质序列的鉴别。挑选特异性克隆的频率至 少部分反映了在用于挑选的血清中并且识别这个克隆呈现的表位的特异性抗体的丰度和/ 或亲和力。在这点，很惊人地源自一些ORF的克隆被选择了多于100次，指出它们高度免疫 原的特性。表1和表5总结了所有13个进行的筛选所得到的数据。使用单个克隆的全细 胞提取物通过免疫斑点分析验证了表1和表5中呈现的所有克隆以显示与用于各自筛选中 的人血清合并物的表明的反应性。如从表1和表5能看到地，鉴别的ORF的独特区域鉴别 为免疫原性的，因为蛋白质不同大小片段被平台蛋白质展示在表面。更加值得注意多数细菌表面展示筛选鉴别的基因编码附着于无乳链球菌的表面 的和/或分泌的蛋白质。这个与表面附着的或分泌的蛋白质在无乳链球菌毒力中期望的作 用是一致的。实施例4 高度免疫原性肽序列与个体人血清反应性的评价实验过程肽合成使用Syroll 合成器(Multisyntech，Witten，德国)在 Rink酰胺树脂上(P印Chem， Tubingen，德国)使用标准F-moc化学小规模(4mg树脂；平行共288个)合成肽。序列组 合后，用Fmoc-ε-氨基己酸(作为连接剂)和生物素(Sigma，St. Louis, MO ；象正常的氨基 酸被激活的)延长肽。用93% TFA、5%三乙基硅烷和2%水1小时将肽从树脂上切下来。 真空下干燥肽，从乙腈/水(1 1)冷冻干燥3次。正确质量的存在通过质谱在Reflex酶联免疫实验(ELISA)根据生产厂商的说明书在链亲和素ELISA平板(EXICON)上在10 μ g/ml浓度包被 生物素标记的肽(在N-末端)。根据生产厂商的推荐使用高度特异性马辣根过氧化物酶 (HRP)连接的抗人 IgG 二抗(SouthernBiotech)(稀释度1，OOOx)。在 200X 和 1，000X 两个 血清稀释度测试血清。手工包被之后，通过有内置ELISA阅读仪(GENI0S，TECAN)的Gemini 160ELISA机器人(TECAN)处理和分析肽平板。结果对挑选克隆的生物信息分析之后，设计并合成相应的肽。在有多于26个氨基酸残 基的表位的情况下，制造重叠肽。所有的肽用N-末端生物素标记进行合成并用作链亲和素 包被的ELISA平板上的包被试剂。对基于它们与个体血清的反应性而挑选的肽进行分析，所述肽包括在用于制备为了细菌表面展示的IgG和IgA筛选试剂的血清合并物中。表2和表6中显示了 74个肽的 血清反应性的总结，所述肽代表了 55个用22份用于抗原鉴别的人血清(来自13个病人和 9个健康暴露于高滴度个体)分析的来自基因组筛选的不同的无乳链球菌抗原蛋白质。通 过基于阳性血清数和反应的程度计算的每个肽的分数对肽进行。肽在对弱阳性血清有很高 的反应性到有广泛的反应性的范围内。实施例5 用从无乳链球菌鉴别的高免疫原性蛋白质的基因分布研究实验过程PCR测定的GBS抗原的基因分布理想的疫苗抗原会是存在于所有或绝大部分疫苗指向的靶生物体株的抗原。为了 确立编码鉴别的无乳链球菌抗原的基因是否在无乳链球菌株中普遍存在，在一系列独立的 无乳链球菌分离物上用特异于目的基因的引物进行PCR。获得无乳链球菌的分离物，包括如 图4A中显示的在患者中最频繁存在的血清型。对于所有鉴别的ORF设计了作为引物的寡 核苷酸序列，产生大约1，OOObp的产物，如果可能包括所有鉴别的免疫原性表位。如实施例 2下描述地制备所有无乳链球菌株的基因组DNA。根据生产厂商的说明书(Invitrogen，荷 兰)使用Taq聚合酶(IU)、200nM dNTPs、IOpMol每个寡核苷酸和试剂盒在25 μ 1的反应体 积进中行 PCR。作为标准，进行 30 个循环(lx :5min. 95°C，30x :30sec. 95°C,30sec. 56°C， 30sec. 72°C,lX4min. 72°C )，除非各个条件必须适于个体引物对。结果通过PCR测试了鉴别的编码免疫原性蛋白质的基因在46个不同无乳链球菌株中 它们的存在(图4A)。作为实例，图4B显示了用所有指出的46个菌株的GBS0061的PCR反 应。清楚可见地，基因存在于所有分析的菌株中。对来自IA型菌株的PCR片段进行测序， 显示与无乳链球菌ATCCl2403株比较所有的657bp是相同的，指出两个分离物之间高水平 的保守性。从总共117个分析的基因中，100个以上存在于所有或几乎所有的测试的菌株中， 而只有5个基因在多于10%测试的46个菌株中不存在(表3)。另外，只有少数基因(例 如GBS0016，GBS1087，GBS1528和GBS2018)显示了大小的不同，但是存在于所有或大多数菌 株分离物中。从一个菌株产生的PCR片段的测序和随后的与III型株ATCC 12403的比较 证实了正确DNA片段的扩增，揭示了如表3中指出的序列差异的程度。重要地，很多鉴别的 抗原在所有的菌株中在序列和大小是高度保守的，所以是预防GBS感染的新型疫苗候选。实施例6 得自用来自大肠杆菌表面上展示的无乳链球菌的高度免疫原性蛋白质 /肽免疫小鼠的免疫血清的特征分析实验过程小鼠免疫血清的产生包含编码了融合于无乳链球菌肽的平台蛋白质的质粒的大肠杆菌克隆在37°C在 补充了 50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中生长。过夜的培养物1 10稀释，生长直到0.5 的0D·，与0. 2mM IPTG孵育2小时。沉淀成粒的细菌细胞悬浮在PBS缓冲液中，冰上用超声 打破，产生粗细胞提取物。根据0D_测量，相应于5 X IO7个细胞的分装量静脉注射到NMRI 小鼠，之后是2周后的追加。第二次注射1周后采血浆。肽ELISA测量表位特异性抗体的 水平。
抗原的体外表达通过免疫斑点测试体外生长的无乳链球菌III血清型的抗原的表达。测试不同生 长培养基和培养条件以检测总裂解物和细菌培养上清中抗原的存在。当检测到相应于预言 的分子重量的特异性条带点和电泳迁移率时，认为表达被证实了。细胞表面染色如下进行细胞流式仪分析。细菌在培养条件下生长，得到如免疫斑点分析显示的 抗原的表达。细胞在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中清洗两次，细胞密度调整为100 μ 1 HBSS, 0. 5% BSA中大约IX IO6个CFU。在4°C与稀释50至100倍的小鼠抗血清孵育30至60分 钟之后，通过在过量的HBSS，0. 5% BSA中的离心洗掉未结合的抗体。荧光素(FITC)标记的 第二羊抗小鼠抗体(F(ab’)2片段特异性的)与细胞在4°C孵育30至60分钟。清洗后，细 胞用2%多聚甲醛固定。使用Becton DickinsonFACScan流式细胞仪检测结合的抗体，用计 算机程序CELLQuest进一步分析数据。阴性对照血清包括小鼠免疫前血清和用没有无乳链 球菌基因组插入物的质粒编码基因IamB或fhuA转化的IPTG诱导的大肠杆菌细胞制备的 裂解物所产生的小鼠多克隆血清。杀菌(杀死)试验鼠巨噬细胞(RAW246. 7或P388. Dl)和细菌孵育，通过菌落计数测定60分钟后活 细菌的丢失。简而言之，细菌用Hanks平衡盐溶液(HBSS)清洗两次，细胞密度调整为50 μ 1 HBSS中大约IXlO5个CFU。细菌与小鼠血清(最多可达25% )和豚鼠补体(最多可达5%) 在总体积100 μ 1中4°C孵育60分钟。预调理的细菌与巨噬细胞(鼠细胞系RAW264. 7或 P388.D1 ；每100μ 1 2Χ106个细胞)以1 20的比例混合，旋转震摇器上在500rpm 37°C 孵育。每个样品的分装物用无菌水稀释，室温孵育5分钟以裂解巨噬细胞。然后将系列稀 释物接种到Todd-Hewitt肉汤琼脂平板上。平板在37°C孵育过夜，用Countermat闪光菌落 计数仪(IUL仪器)计数菌落。对照血清包括小鼠免疫前血清和用包含没有无乳链球菌基 因组插入物的基因IamB或fhuA的质粒转化的IPTG诱导的大肠杆菌制备的裂解物所产生 的小鼠多克隆血清。结果小鼠的免疫原性使用如图5A和B中分别举例以及表4和表7中总结的表达埋于LamB或FhuA平 台蛋白质中给定表位的大肠杆菌通过肽ELISA和/或免疫斑点测定特异性抗体的存在。61 个不同表位区域呈现的43个新型GBS抗原在小鼠中显示是有免疫原性的。然后使用无乳 链球菌血清型III株制备的总细菌裂解物和培养上清通过免疫斑点分析阳性血清(数据未 显示)。这个分析作为测定抗原蛋白质是否表达以及如果为了用FACS分析评价多肽的表面 表达在什么生长条件下的第一步。基于文献的数据不期待所有的蛋白质会在体外条件下表 达。无乳链球菌的细胞表面染色。随后过基于流式细胞仪的试验证明一些抗原蛋白质 易接近细胞表面通。GBS细胞与免疫前血清以及产生的抗无乳链球菌裂解物或包含了编码 融合于无乳链球菌肽的平台蛋白质的质粒的大肠杆菌克隆的多克隆小鼠血清孵育，之后用 荧光标记的二抗检测。如图6A中显示地，通过无乳链球菌III血清型细胞群荧光的显著迁 移证明，生产的抗无乳链球菌裂解物的抗血清含有抗表面组分的抗体。对于生产的抗许多
69鉴别的GBS抗原的肽的多克隆血清观察到无乳链球菌III血清型细胞的相似的细胞表面染 色(图6B)。一些实例中，如柱状图中检测到的两个峰指出地一小部分细菌没有染色(图 6B)。这个现象可以是细菌生长过程中基因产物差异表达、不足的抗体水平或其它表面分子 或血浆蛋白质造成的抗体结合部分抑制的结果。重要地，众所周知的保护性GBS抗原Sip/ gbs0031在这个试验中被证明也是阳性的。体外杀菌活性。调理噬菌死亡是抗细胞外细菌例如无乳链球菌的宿主防御的里程 碑。如果特定抗原诱导的抗体能结合激活的补体组分(C3bi)，抗体对细菌抗原的细胞表面 结合是受调理素作用的并诱导噬菌细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)的杀死(杀菌)。图7 中数据呈现了通过用相应抗原在小鼠中产生的抗原特异性抗体测量的杀菌活性。根据这些 数据，一些新型 GBS 抗原，例如 gbs0012, gbs0016, gbs0428, gbsl306 和 gbs2018，诱导功能 性抗体。重要地，众所周知的保护性GBS抗原Sip/gbs0031在完全相同的试验中被证明是 强阳性的。这些实验证实了生物信息的预言，很多蛋白质由于它们的信号肽序列而被运出， 另外显示了它们存在于无乳链球菌III血清型的细胞表面上。它们也证实这些蛋白质可用 于有功能特性的人抗体的识别，使得它们成为开发抗GBS疾病的疫苗很有价值的候选。表IA 细菌表面展示鉴别的免疫原性蛋白质。
表IB 氨基酸序列识别鉴别的免疫原性蛋白质和细菌表面展示鉴别的肽 表2.用人血清的表位血清学表3 无乳链球菌株中的基因分布 表4.小鼠表位的免疫原性 表5 细菌表面展示鉴别的免疫原性蛋白质 表7.小鼠表位的免疫原性 参考文献Altschul, S.，等人(1990). Tournal of Molecular Biology215 403-10.Baiter，S.，等人，革兰氏阳性病原体中，Fischetti V. A.等人编辑，AMS Press 2000，154-160.Bennett, D.，等人(1995). T Mol Recognit 8 :52_8·Brodeur, B.，等人(2000). Infect Immun 68 :5610_8·Burnie, J.，等人(1998). T Antimicrob Chemother 41 :319_22·Campbell, J.，等人(2000). Obstet Gynecol 96 :498_503·Cheng, Q.，等人(2002). Infect Immun 70 :6409_15.Clackson, Τ.，等人(1991). Nature 352 :624_8.Devereux, J.，等人(1984). Nucleic acids research 12 :387_95.Doherty, E.，等人(2001) · Annu Rev Biophys Biomol Struct 30 :457_475.Eisenbraun, M.，等人(1993). DNA Cell Biol 12 :791_7.Etz, H.，等人(2001). T Bacteriol 183 :6924_35·
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1. 一种编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子，其包含选自如下 的核酸序列a)与选自Seq ID No 14，90，157-216的核酸分子具有至少70%序列相同性的核 酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子至少15个连续碱基的核酸分子，d)在严格杂交条件下退火于a)、b)或C)的核酸分子的核酸分子，e)杂交于a)、b)、C)或d)中定义的核酸分子之核酸分子的简并性序列。2.根据项目1的分离的核酸分子，其中序列相同性是至少80%，优选地至少95%， 尤其是100%。3. 一种编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子，包含选自如下的 核酸序列a)与选自 Seq ID No 1，3，5-13，15，18-25，27-31，33-36，39-68，70-85，92-100， 103-126，128-145，147，149-156，217，435-448 和 463-474 的核酸分子具有 96 % 或高于 96%，优选地至少98%，尤其是100%序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子至少15个连续碱基的核酸分子，d)在严格杂交条件下退火于a)、b)或C)的核酸分子的核酸分子，e)杂交于a)、b)、C)或d)中定义的核酸分子之核酸分子的简并性序列。4. 一种编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子，包含选自如下的 核酸序列a)与选自Seq ID No 32，86，91，101，127的核酸分子有98%或高于98%，尤其是 100%序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸的核酸分子，c)杂交于a)、b)、C)或d)中定义的核酸分子之核酸分子的简并性序列。5.根据项目1、2、3或4中任何一个的核酸分子，其中所述核酸是DNA。6.根据项目1、2、3、4或5中任何一个的核酸分子，其中所述核酸是RNA。7.根据项目1至5中任何一个的分离的核酸分子，其中从基因组DNA尤其是无乳 链球菌(S. agalactiae)基因组DNA分离所述核酸分子。8. 一种包含根据项目1至7中任何一个的核酸分子的载体。9.根据项目8的载体，其中所述载体经改造适于根据项目1至7中任何一个的核 酸分子编码的超免疫血清反应性抗原或其片段的重组表达。10. 一种包含根据项目8或9的载体的宿主细胞。11.包含根据项目1、2、5、6或7中任何一个的核酸分子编码的氨基酸序列的超免 疫血清反应性抗原及其片段，优选地所述氨基酸序列选自Seq ID No 231，307，374-433。12.包含根据项目3、5、6或7中任何一个的核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫 血清反应性抗原及其片段，优选地所述氨基酸序列选自Seq ID No 218，220，222-230，232， 235-242，244-248，250-253，256-285，287-302，309-317，320-343，345-362，364，366-373， 434,449-462 和 475-486。
13.包含根据项目4、5、6或7中任何一个的核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫 血清反应性抗原及其片段，优选地所述氨基酸序列选自Seq ID No 249，303，308，318，344。14.超免疫血清反应性抗原的片段，其选自包含表IA “推定的免疫原性氨基酸”和 “鉴别的免疫原性区域的位置”纵栏的氨基酸序列的肽，尤其是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 218 的 4-20，35-44，65-70，73-87，92-98，112-137，152-161，177-186，193-200， 206-213，229-255，282-294，308-313，320-326，349-355，373-384，388-406，420-425 和
115-199；Seq ID No 219 的 5-24，35-41，44-70，73-89，103-109，127-143，155-161， 185-190,192-207,212-219,246-262,304-336,372-382,384-393, 398-407, 412-418, 438-444，1-75,76-161 和 164-239 ;Seq ID No 220 的 4-10，16-58，60-71，77-92，100-126， 132-146，149-164，166-172，190-209，214-220，223-229，241-256，297-312，314-319， 337-343,351-359,378-387,398-418,421-428,430-437,440-448,462-471,510-519, 525-536,552-559,561-568,573-582,596-602,608-630,637-649,651-665,681-702, 714-732,739-745,757-778,790-805,807-815,821-829,836-842,846-873,880-903, 908-914，916-923，931-940，943-948，956-970，975-986，996-1015，1031-1040，1051-1069， 1072-1095，1114-1119，1130-1148，1150-1157，1169-1176，1229-1238 和 802-812 ；Seq ID No221 的 5-12，14-26，35-47，52-67，72-78，83-98，121-141，152-159，163-183，186-207， 209-257,264-277,282-299,301-309,312-318,324-339,358-368,372-378,387-397, 425-431 和 46-291 ;Seq ID No222 的 29-38，44-64，70-76，78-87，94-100，102-112， 119-134，140-149，163-173，178-186，188-194，207-234，247-262，269-290 和 73-92 ；Seq ID No 223 的 10-28，36-63，77-87，103-119，127-136，141-169，171-183，195-200，207-232， 236-246,251-265,268-283,287-297,314-322,335-343,354-363,384-390,405-411, 419-436,443-455,467-473,480-513,518-529,550-557,565-585,602-608,616-625, 632-660,665-677,685-701,726-736,738-747,752-761,785-796,801-813,838-853, 866-871 和 757-774 ；Seq ID No 224 的 31-38，61-66，74-81，90-115，123-145，154-167， 169-179，182-193，200-206，238-244，267-272 和 235-251 ;Seq ID No 225 的 19-25，38-54， 56-64，66-72，74-92，94-100，116-129，143-149，156-183，204-232，253-266，269-275， 294-307 和 241-313 ;Seq ID No 226 的 5-34，50-56，60-65，74-85，89-97，108-119， 159-165，181-199，209-225，230-240，245-251，257-262，274-282，300-305 和 64-75 ；Seq ID No 227 的 5-13，16-21，27-42，45-52，58-66，74-87，108-114，119-131 和 39-51 ;Seq ID No 228 的 6-23，46-54，59-65，78-84，100-120，128-133，140-146，159-165，171-183，190-204， 224-232，240-248，250-259，274-280，288-296，306-315 和 267-274 ；Seq ID No 229 的 5-12，15-24,26-36,42-65,68-80,82-104,111-116,125-144，159-167，184-189，209-218， 235-243，254-265，269-283，287-300，306-316，318-336，338-352，374-392 和 162-174 ；Seq ID No 230 的 30-42,45-54 和 25-37 ;Seq ID No 231 的 10-30，53-59，86-95，116-130， 132-147，169-189，195-201，212-221，247-256，258-265，278-283，291-298，310-316， 329-339,341-352,360-367,388-396,398-411,416-432,443-452,460-466,506-512, 515-521,542-548 和 419-431 ;Seq IDNo 232 的 4-27，30-53，60-67，70-90，92-151， 159-185，189-195，198-210,215-239 和 173-189 ；Seq ID No 233 的 4-26，41-54，71-78，
116-127，140-149，151-158，161-175，190-196，201-208，220-226，240-252，266-281，298-305,308-318,321-329,344-353,372-378,384-405,418-426,429-442,457-463, 494-505,514-522 和 174-188 ；Seq ID No 234 的 17-25，27-39，61-67，81-89，99-110， 120-131，133-139，147-161，167-172，179-185，192-198，203-213，226-238，243-258， 261-267，284-290，296-307，311-328，340-352，356-371 和 239-256 ；Seq ID No 235 的 8-30，40-49，67-80，114-123，126-142，152-162，188-194 和 57-70 ;Seq ID No 236 的 4-23， 28-34，36-47，50-61,76-81，89-94，96-104，112-119，126-146，155-181，195-200，208-214，
220-229,244-260,263-276,282-288,292-300,317-323,336-351,353-359,363-375, 382-399, 415-432,444-455,458-471,476-481,484-492,499-517,522-529,535-541, 543-568，572-584，586-600，607-617，626-637，656-675 和 282-297 ；Seq ID No 237 的 6-24,30-35,38-45,63-91,134-140,146-160,167-188,214-220,226-234,244-250, 260-270,286-301,316-329,340-371,429-446,448-459,474-481,485-491,512-526, 537-544，550-565，573-583，596-613，621-630，652-658 和 87-97 ;Seq ID No238 的 8-20， 26-48，56-67，76-86，94-109，115-121，123-129，143-160，178-186，191-198，201-208，
221-236，238-244，260-268和 237-247 ；Seq ID No 239 的 4-40，42-57，73-87，98-117， 126-135，150-156，166-174，196-217，231-236，248-258，276-284，293-301，307-313， 339-347,359-365,375-387,395-402,428-440,445-456,485-490,497-505,535-541, 547-555，610-625，648-656，665-671 和 448-528 ;Seq ID No 240 的 10-18，39-45，51-61， 80-96,98-106,110-115，158-172，174-183，191-200，220-237，249-255，274-289，308-324， 331-341，372-381，384-397，405-414 和 322-338 ；Seq IDNo 241 的 30-36，38-56，85-108， 134-147，149-160，163-183，188-201，206-211，219-238，247-254 和 5-13 ;Seq ID No 242 的 11-40,98-103，110-115，133-145，151-159，172-179，192-201，204-212，222-228， 235-245,258-268,283-296,298-309,322-329,342-351,354-362,372-378,385-393, 407-418,495-516 和 1-148 ；Seq ID No 243 的 5-19，21-36，73-94，112-119，122-137， 139-145,152-167,184-190,198-204,208-224,249-265,267-281,299-304,309-317, 326-333，356-364，368-374，381-389，391-414，419-425，430-435 和 113-140 ；Seq ID No 244 的 45-54，59-67，78-91 和 15-23 ;Seq ID No 245 的 11-22，33-47，52-80，88-112， 124-129 和 6-25 ;Seq ID No 246 的 26-41，51-63，80-89，93-115，150-163，187-193， 220-237，240-249，286-294，296-306，316-329，345-353，361-370，407-425，428-437， 474-482，484-494，504-517，533-541，549-558，595-613，616-625，660-668，673-685， 711-726,736-744,749-761,787-802,812-820,825-837,863-878,888-896,901-913, 939-954，964-972，977-989，1003-1008，1016-1022，1028-1034，1041-1053，1059-1074， 1101-1122，420-511 和 581-704 ；Seq ID No247 的 18-25，27-55，71-83，89-95，102-113， 120-146，150-156，174-185 和 159-175 ；Seq ID No 248 的 24-30，38-56，63-68，87-93， 136-142，153-164，183—199，213—219，226—234，244—261，269—278，283—289，291—297， 320-328,330-336,340-346,348-356,358-366,382-387,401-408,414-419, 449-455, 468-491,504-512,531-537,554-560,597-608,621-627,632-643,650-662,667-692, 703-716，724-737，743-758，783-794，800-818，846-856 和 806-884 ；Seq IDNo 249 的 4-14， 21-39,86-92,99-107,121-131，136-144，147-154，158-166，176-185，193-199，207-222， 224-230 和 117-136 ;Seq I DNo 250 的 65-76，85-97，103-109，115-121，125-146，163-169，196-205，212-219，228-237，241-247，254-262，269-288，294-303，305-313，328-367， 395-401，405-412，418-429，437-447，481-488，506-513，519-524，530-541，546-557 和 266-284 ；Seq ID No 251 的 5-14，37-42，49-71，78-92，97-112，127-136，147-154，
156-163,186-198，216-225，233-243，248-253，295-307，323-332，359-366，368-374，
380-398和 194-223 ；Seq ID No 252 的 4-11，33-39，45-72，100-113，119-129，136-144， 169-175，177-185，200-208，210-219，262-276，278-297，320-326，336-344，347-362，
381-394,443-453和 438-454 ；Seq ID No 253 的 4-29，31-52，55-61，95-110，138-158， 162-171,179-187,202-229,239-248,251-256,262-267,269-285,304-310,351-360, 362-368，381-388，415-428，435-440，448-458 和 161-178 ;Seq ID No 254 的 4-17，19-28， 32-43,47-59,89-110,112-126,128-134，140-148，152-161，169-184，191-204，230-235， 255-264，328-338，341-347，401-409，413-419，433-441，449-458，463-468，476-482， 486-492，500-506，529-545 和 305-381 ;Seq ID No 255 的 10-29，38-45，53-61，134-145， 152-160，163-170,202-208,219-229,248-258,266-275,282-288,315-320,328-334, 377-385,392-402,418-424,447-453,460-471,479-487,491-497,500-507,531-537, 581-594,615-623,629-635,644-652,659-666,668-678,710-717,719-728,736-741, 747-760，766-773，784-789，794-800，805-817，855-861，866-887 和 698-715 ；Seq ID No 256 的 16-26，29-37，44-58，62-68，74-80，88-95，97-120，125-144，165-196 和 58-72 ；Seq ID No 257 的 14-21，23-46，49-60，63-74，78-92，96-103，117-129，134-161，169-211， 217-231，239-248，252-281，292-299，313-343 和 243-257 ;Seq ID No 258 的 11-27，46-52， 67-72，76-84，91-112，116-153，160-175，187-196，202-211，213-220 和 43-76 ；Seq ID No 259 的 5-29，37-56，78-86，108-118，152-161 和 120-130 ;Seq ID No 260 的 8-14，19-41， 52-66，75-82，87-92，106-121，127-133，136-143，158-175，180-187，196-204，221-228， 239-245，259-265，291-306，318-323，328-340，352-358，361-368，375-381，391-399， 411-418,431-442,446-455,484-496,498-510,527-533,541-549,558-565,575-585, 587-594，644-655，661-668，671-677 和 184-196 ；Seq ID No 261 的 4-22，29-38，55-62， 75-81,102-107,110-134,143-150,161-167,172-179,191-215,223-233,241-247, 251-264，266-272，288-309，340-352，354-366，394-402，414-438 和 198-218 ；Seq ID No 262 的 24-44，49-70，80-91，105-118，128-136，140-154 和 77-92 ；Seq ID No 263 的 5-22, 31-36，41-47，67-74，83-90，105-122，135-143，160-167 和 118-129 ；Seq ID No 264 的 4-25,33-73,81-93,96-106,114-120,122-128，130-172，179-208，210-241，251-283， 296-301 和 92-100 ;Seq ID No 265 的 14-24，29-38，43-50，52-72，86-97，101-107， 110-125，127-141，145-157，168-175，177-184，186-195，205-226，238-250，255-261， 284-290,293-304,307-314,316-323,325-356,363-371,383-390,405-415,423-432, 442-454,466-485,502-511,519-527,535-556,558-565,569-574,612-634,641-655, 672-686, 698-709, 715-722,724-732,743-753,760-769,783-792,818-825,830-839, 842-849,884-896,905-918,926-940,957-969,979-1007,1015-1021,1049-1057 禾P 336-349 ；Seq ID No 266 的 6-16，26-31，33-39，62-73，75-85，87-100，113-123，127-152，
157-164，168-181，191-198，208-214，219-226，233-254，259-266，286-329和 181-195 ；Seq ID No 267 的 4-13，32-39，53-76，99-108，110-116，124-135，137-146，149-157，162-174，
110182-190，207-231，242-253，255-264，274-283，291-323，334-345，351-360，375-388，
418-425，456-474，486-492，508-517，520-536，547-560，562-577，31-45和 419-443 ；Seq ID No 268 的 15-26，30-37，42-49，58-90，93-99，128-134，147-154，174-179，190-197， 199-205,221-230,262-274,277-287,300-314,327-333,343-351,359-377, 388-396, 408-413，416-425，431-446 和 246-256 ；Seq ID No 269 的 5-26，34-42，47-54，61-67， 71-104,107-115,131-138,144-153,157-189,196-202,204-210,228-245,288-309, 316-329,332-341,379-386,393-399,404-412,414-421,457-468,483-489,500-506, 508-517,523-534,543-557,565-580,587-605,609-617,619-627,631-636,640-646, 662-668,675-682,705-710,716-723,727-732,750-758,784-789,795-809,869-874, 14-138，166-286，372-503，674-696 和 754-859 ；Seq ID No 270 的 5-17，32-38，40-47， 80-89,113-119,125-137,140-154,157-163,170-177,185-199,213-225,228-236, 242-248，277-290，292-305，323-333，347-353，364-370，385-394，399-406，423-433， 441-451，462-474，477-487 和 116-124 ；Seq IDNo 271 的 7-16，18-30，32-49，53-61，63-85， 95-101,105-115,119-134,143-150,159-178,185-202,212-229,236-250,254-265, 268-294 和 63-72 ；Seq ID No 272 的 4-12，19-47，73-81，97-103，153-169，188-198， 207-213，217-223，236-242，255-265，270-278，298-305，309-317，335-347，354-363， 373-394,419-424,442-465,486-492,500-507,542-549,551-558,560-572,580-589, 607-614,617-623,647-653,666-676,694-704,706-714,748-754,765-772,786-792, 795-806 和 358-370 ;Seq ID No 273 的 18-28，30-38，40-46，49-55，69-78，82-98，104-134， 147-153，180-190，196-202，218-236，244-261，266-273，275-286，290-295，301-314， 378-387，390-395，427-434 和 290-305 ；Seq ID No 274 的 4-13，20-31，39-51，54-61， 69-84,87-105，117-124 和 108-125 ；Seq ID No 275 的 24-34，43-54，56-66，68-79 和 50-69 ；Seq ID No 276 的 5-43，71-77，102-131，141-148，150-156，159-186，191-207， 209-234，255-268，280-286，293-299，317-323，350-357，363-372，391-397，406-418， 428-435,455-465,484-497,499-505,525-531,575-582,593-607,621-633,638-649, 655-673,684-698,711-725,736-741,743-752,759-769,781-793, 813-831, 843-853, 894-905,908-916,929-946,953-963,970-978, 1001-1007, 1011-1033, 165-178 禾口 818-974 ；Seq ID No 277 的 16-44，63-86，98-108，185-191，222-2 3 7，261-274，282-294， 335-345,349-362,374-384,409-420,424-430,440-447,453-460,465-473,475-504, 522-534,538-551,554-560,567-582,598-607,611-619,627-640,643-653,655-661, 669-680, 684-690, 701-707,715-731,744-750,756-763,768-804,829-837,845-853, 855-879，884-890，910-928，77-90，144-212，279-355，434-536，782-810 和 875-902 ；Seq ID No 278 的 4-22，29-41，45-51，53-66，70-77，86-95，98-104，106-124，129-135，142-151， 153-161，169-176，228-251，284-299，331-337，339-370，380-387，393-398，406-411， 423-433, 440-452, 461-469,488-498,501-516,523-530,532-559,562-567,570-602, 612-628，630-645，649-659，666-672，677-696，714-723，727-747 和 212-227 ;Seq IDNo 279 的 4-9，17-31,35-41,56-61,66-75,81-87,90-124,133-138，149-163，173-192， 213-219，221-262，265-275，277-282，292-298，301-307，333-346，353-363，371-378，
419-430，435-448，456-469，551-570，583-599，603-612和 275-291 ；Seq ID No 280 的
11128-34，53-58，72-81，100-128，145-154，159-168，172-189，217-225，227-249，256-263， 299-309,322-330,361-379,381-388,392-401,404-417,425-436,440-446,451-464, 469-487,502-511,543-551,559-564,595-601,606-612,615-626,633-642,644-650, 664-670，674-684，692-701，715-723，726-734，749-756，763-771，781-787，810-843， 860-869，882-889，907-917，931-936，941-948，951-958，964-971，976-993，1039-1049， 1051-1065,1092-1121,1126-1132,1145-1151,1158-1173,1181-1192,1194-1208, 1218-1223,1229-1243,1249-1254,1265-1279,1287-1297, 1303-1320, 1334-1341, 1343-1358,1372-1382,1406-1417,1419-1425,1428-1434,1441-1448,1460-1473, 1494-1504，1509-1514，1529-1550，654-669 和 1400-1483 ;Seq ID No 281 的 10-16，20-25， 58-65，97-109，118-132，134-146，148-155，186-195，226-233，244-262，275-284，295-310， 317-322,330-339,345-351,366-375,392-403,408-415,423-430,435-444,446-457, 467-479,486-499,503-510,525-537,540-585,602-612,614-623,625-634,639-645, 650-669，700-707，717-724，727-739，205-230 和 733-754 ；Seq IDNo 282 的 5-22，37-43， 72-81，105-113，128-133，148-160，188-194，204-230，238-245，251-257 和 194-213 ；Seq ID No 283 的 16-21，35-41，56-72，74-92，103-109 和 62-68 ;Seq ID No 284 的 4-15，17-82， 90-104，107-159，163-170，188-221，234-245，252-265 和 220-235 ;Seq ID No 285 的 16-22，36-46，61-75，92-107，113-121，139-145，148-160 和 30-42 ;Seq ID No 286 的 4-12， 20-26，43-49，55-62，66-78，121-127，135-141，146-161，164-170，178-189，196-205， 233-238，269-279，288-318，325-332，381-386，400-407 和 328-346 ；Seq ID No 287 的 5-12，31-49，57-63，69-79，89-97，99-114，116-127，134-142，147-154，160-173，185-193， 199-204，211-222，229-236，243-249，256-274 和 58-68 ;Seq ID No 288 的 10-20，28-34， 39-53，68-79，84-90，99-106 和 73-79 ；Seq ID No289 的 14-37，45-50，61-66，77-82，93-98， 109-114，125-130，141-146，157-162，173-178，189-194，205-210，221-226，237-242， 253-258，269-274，285-290，301-306，316-332，349-359，371-378，385-406，34-307 和 312-385 ；Seq ID No 290 的 4-10，17-38，50-85，93-99，109-116，128-185，189-197， 199-210,223-256,263-287,289-312,327-337,371-386,389-394,406-419,424-432, 438-450，458-463，475-502，507-513，519-526，535-542，550-567 和 361-376 ；Seq ID No 291 的 10-39,42-93，100-144，155-176，178-224，230-244，246-255，273-282，292-301， 308-325，332-351，356-361，368-379，386-393，400-421 和 138-155 ；Seq ID No 292 的 5-11，17-34，40-45，50-55，72-80，101-123，145-151，164-172，182-187，189-195，208-218， 220-241，243-252，255-270，325-331，365-371，391-398，402-418，422-428，430-435， 443-452，463-469，476-484，486-494，503-509，529-553，560-565，570-590，608-614， 619-627,654-661,744-750,772-780,784-790,806-816,836-853,876-885,912-918, 926-933,961-975,980-987,996-1006,1016-1028，1043-1053，1057-1062，994-1003 和 1033-1056 ；Seq ID No 293 的 17-45，64-71，73-81，99-109，186-192，223-238，262-275， 283-295,336-346,350-363,375-385,410-421,425-431,441-448,454-463,468-474, 476-512,523-537,539-552,568-583,599-608,612-620,628-641,644-654,656-662, 670-681，685-695，702-708，716-723，725-735，757-764，769-798，800-806，808-816， 826-840，846-854，856-862，874-881，885-902，907-928，274-350 和 443-513 ;Seq IDNo294 的 4-22,29-41,45-51,53-61,70-76,85-92,99-104,111-122，134-140，142-154， 163-174，224-232，255—265，273—279，283—297，330—335，337—348，356—367，373—385， 391-396,421-431,442-455,475-485,493-505,526-538,544-561,587-599,605-620, 622-651,662-670,675-681,687-692,697-712,714-735 和 252-262 ；Seq ID No 295 的 4-12，15-35，40-46，50-59，67-94，110-128，143-169，182-188，207-215，218-228，238-250 和 74-90 ；Seq ID No296 的9-18，42-58，78-85，88-95，97-106，115-122，128-134，140-145， 154-181，186-202，204-223，261-267，269-278，284-293，300-336，358-368 和 12-29 ；Seq ID No 297 的 7-34，46-53，62-72，82-88，100-105，111-117，132-137，144-160，166-180， 183-189,209-221,231-236,246-253,268-282,286-293,323-336,364-372,378-392， 422-433 和 388-405 ；Seq ID No 298 的 21-27，34-50，72-77，80-95，164-177，192-198， 202-220，226-236，239-247，270-279，285-292，315-320，327-334，348-355，364-371， 388-397，453-476，488-497，534-545，556-576，582-588，601-607，609-616，642-662， 674-681，687-697，709-715，721-727，741-755 和 621-739 ;Seq ID No 299 的 4-14，16-77， 79-109 和 25-99 ；Seq ID No 300 的 4-9，17-23，30-37，44-55，65-72，77-93，102-121， 123-132,146-153 禾Π 17-29 ；Seq ID No 301 的 4—18，25—41，52—60，83—92，104—112， 117-123，149-155，159-167，170-192，201-210，220-227，245-250 和 124-137 ；Seq ID No 302 的 8-25,50-55,89-95,138-143，148-153，159-169，173-179，223-238，262-268， 288-295，297-308，325-335，403-409，411-417，432-446，463-475，492-501，524-530， 542-548,561-574,576-593,604-609,612-622,637-654,665-672,678-685,720-725, 731-739，762-767，777-783，820-838，851-865，901-908，913-920，958-970，1000-1006， 1009-1015，1020-1026，1043-1052，1055-1061，1-128，252-341，771-793 和 1043-1058 ；Seq ID No 303 的 16-26,33-46 和 64-76 ；Seq ID No 304 的 4-27，69-77，79-101，117-123， 126-142，155-161，171-186，200-206，213-231,233-244，267-273，313-329，335-344， 347-370,374-379,399-408,422-443,445-453,461-468,476-482,518-534,544-553, 556-567,578-595,601-620,626-636,646-658,666-681,715-721,762-768,778-785, 789-803，809-819，22-108，153-318,391-527 和 638-757 ；Seq IDNo 305 的 6-21,32-43, 62-92,104-123,135-141,145-152,199-216,218-226,237-247,260-269,274-283, 297-303,1-72 和 127-211 ；Seq ID No 306 的 6-26，50-56，83-89，108-114，123-131， 172-181，194-200，221-238，241-247，251-259，263-271，284-292，304-319，321-335， 353-358,384-391,408-417,424-430,442-448,459-466,487-500,514-528,541-556, 572-578,595-601,605-613,620-631,635-648,660-670,673-679,686-693,702-708, 716-725,730-735,749-755,770-777,805-811,831-837,843-851,854-860,863-869, 895-901,904-914,922-929,933-938,947-952,956-963,1000-1005,1008-1014, 1021-1030，1097-1103，1120-1130，1132-1140，1-213,269-592 和 992-1120 ；Seq ID No 307 的 9-16,33-39,47-59,65-79,81-95,103-108，115-123，138-148，163-171，176-185， 191-196，205-211，213-221，224-256，261-276，294-302，357-363，384-390，95-111 和 161-189 ；Seq ID No 308 的 21-27，35-45，70-76，92-105，129-143，145-155，161-166， 170-191，204-211，214-231，234-246，249-255，259-275 和 1-18 ；Seq ID No 309 的 21-35， 45-53，56-64，69-97 和 1-16 ；Seq ID No 310 的 25-33，41-47，61-68，86-101，106-114，
113116-129，134-142，144-156，163-176，181-190，228-251，255-261，276-292，295-305， 334-357,368-380,395-410,424-429,454-460,469-482,510-516,518-527,531-546, 558-570,579-606,628-636,638-645,651-656,668-674,691-698,717-734,742-754, 765-770,792-797,827-835,847-859,874-881,903-909,926-933,942-961,964-977, 989-1004,1010-1028,1031-1047,1057-1075,1081-1095,1108-1117, 1138-1144, 1182-1189,1193-1206,1220-1229,1239-1246,1257-1267,1271-1279,1284-1301, 1312-1320,1329-1335,1341-1347,1358-1371,1399-1404,1417-1426,1458-1463, 1468-1476,1478-1485,1493-1506,1535-1541,1559-1574,1583-1590,1595-1601, 1603-1611,1622-1628,1634-1644,1671-1685,1689-1696, 1715-1720, 1734-1746, 1766-1775,1801-1806,1838-1844,1858-1871,1910-1917,1948-1955,1960-1974, 2000-2015，2019-2036，2041-2063，748-847 和 1381-1391 ；Seq ID No 311 的 5-12，18-24， 27-53，56-63，96-113，119-124，131-136，157-163，203-209，215-223，233-246，264-273， 311-316,380-389,393-399,425-433,445-450,457-462,464-470,475-482,507-513, 527-535,542-548,550-565,591-602,607-613,627-642,644-664,673-712,714-732, 739-764，769-782，812-818，826-838，848-854，860-871，892-906，930-938，940-954， 957-973,990-998,1002-1021，1024-1033，1037-1042，1050-1060，1077-1083，1085-1092， 1100-1129，1144-1161，1169-1175，1178-1189，1192-1198，1201-1207，1211-1221， 1229-1239,1250-1270,1278-1292,1294-1300,1314-1335,1344-1352,1360-1374, 1394-1405,1407-1414,1416-1424,1432-1452,1456-1462,1474-1497, 1500-1510, 1516-1522，1534-1542，1550-1559，1584-1603，1608-1627，187-273 和 306-441 ；Seq ID No 312 的 70-80，90-97，118-125，128-140，142-148，154-162，189-202，214-222，224-232， 254-260,275-313,317-332,355-360,392-398,425-432,448-456,464-470,476-482, 491-505,521-528,533-546,560-567,592-597,605-614,618-626,637-644,646-653, 660-666，677-691 和 207-227 ;Seq ID No 313 的 5-19，26-34，37-55，57-66，69-83，86-102， 115-134，138-143，154-172，178-195，209-246，251-257，290-302，306-311 和 256-266 ；Seq ID No 314 的 10-20，22-28，35-57，72-79，87-103，108-128，130-144，158-171，190-198， 225-242，274-291，301-315，317-324，374-385 和 353-365 ;Seq ID No 315 的 4-9，17-30， 34-54，59-66，73-94，118-130，135-150，158-171，189-198，219-239，269-275，283-301， 89-106 和 176-193 ；Seq ID No 316 的 14-20，22-74，77-86，89-99，104-109，126-135， 154-165，181-195，197-212，216-224，264-275 和 107-118 ；Seq ID No 317 的 4-18，21-38， 63-72,101-109,156-162,165-179,183-192,195-210,212-218,230-239,241-256, 278-290, 299-311, 313-322,332-341,348-366,386-401,420-426,435-450,455-460, 468-479,491-498,510-518,532-538,545-552,557-563,567-573,586-595,599-609, 620-626，628-636，652-657，665-681 和 1-198 ；Seq ID No 318 的 4-10，16-38，51-68， 73-79，94-115，120-125，132-178，201-208，216-223，238-266，269-295，297-304，337-342， 347-356，374-401，403-422，440-447，478-504，510-516，519-530，537-544 和 191-206 ；Seq IDNo 319 的 12-40，42-48，66-71，77-86，95-102，113-120，129-137，141-148，155-174， 208-214，218-225，234-240，256-267，275-283，300-306，313-321，343-350，359-367， 370-383，398-405，432-439，443-461，492-508，516-526，528-535 和 370-478 ；Seq ID No320 的 6-14,20-37,56-62,90-95,97-113,118-125，140-145，161-170，183-202，237-244， 275-284,286-305,309-316,333-359,373-401,405-412 和 176-187 ；Seq ID No 321 的 33-44,50-55,59-80,86-101,129-139，147-153，157-163，171-176，189-201，203-224， 239-245，257-262，281-287，290-297，304-320，322-331，334-350，372-390，396-401，71-88 和 353-372 ；Seq ID No 322 的 5-11，15-24，26-33，40-47，75-88，95-103，105-112 和 17-30 ；Seq ID No323 的 5-11，16-39，46-54，62-82，100-107，111-124，126-150，154-165，
167-183，204-238，245-295，301-313，316-335和 8-16 ；Seq ID No 324 的 4-19，34-48， 69-74，79-107，115-127，129-135，143-153，160-169，171-182 和 142-153 ;Seq ID No 325 的 4-30，65-74，82-106，110-120，124-132，135-140，146-175，179-184，190-196，217-223， 228-233，250-267，275-292，303-315，322-332 和 174-186 ;Seq ID No 326 的 9-16，29-41， 47-57,68-84,87-109,113-119,162-180，186-193，195-201，203-208，218-230，234-243， 265-271，281-292，305-312，323-332，341-347，349-363，368-374，383-390，396-410， 434-440，446-452，455-464，466-473，515-522，529-542，565-570，589-600，602-613， 618-623,637-644,1019-1027，1238-1244，1258-1264，1268-1276，1281-1292，1296-1302 和 883-936 ；Seq ID No 327 的 10-17，23-32，39-44，54-72，75-81，88-111，138-154，160-167， 178-185, 201-210, 236-252,327-334,336-342,366-376,388-400,410-430,472-482, 493-526，552-558，586-592，598-603，612-621，630-635，641-660 和 384-393 ;Seq IDNo 328 的 4-22，24-39，50-59，73-84，100-105，111-117，130-138，155-161，173-178，182-189， 205-215,266-284,308-313,321-328,330-337,346-363,368-374,388-395,397-405, 426-434, 453-459, 482-492,501-507,509-515,518-523,527-544,559-590,598-612, 614-629，646-659，663-684，686-694，698-721 和 445-461 ；Seq IDNo 329 的 14-22，27-33 和 3-17 ;Seq ID No 330 的 29-41，66-73，81-87，90-108，140-146，150-159，165-184， 186-196，216-226，230-238，247-253，261-269 和 126-140 ;Seq ID No 331 的 5-12，16-25， 27-33，36-45，60-68，83-88，103-126 和 86-101 ；Seq ID No332 的 14-23，36-47，56-66， 84-89,94-105,111-127,140-153，160-174，176-183，189-203，219-225，231-237，250-257 和 194-227 ;Seq ID No 333 的 4-25，54-60，64-71，73-82，89-106，117-124，157-169， 183-188，199-210，221-232，236-244，255-264 和 58-98 ;Seq ID No 334 的 13-19，26-36，
41-53,55-71,77-84,86-108,114-135，157-172，177-183，187-194，208-213，218-226， 110-125 和 156-170 ；Seq ID No 335 的 5-24，63-69，77-85，94-112，120-137，140-146， 152-159，166-172，179-187，193-199，206-212，222-228，234-240，244-252，257-264， 270-289，298-309，316-328，337-348，363-375，1-56 和 340-352 ;Seq ID No 336 的 18-39，
42-71,78-120,124-144，152-173，179-189，199-209，213-222，228-258，269-304，329-361， 364-372，374-389，396-441 和 313-327 ;Seq ID No 337 的 19-25，91-98，108-120，156-162，
168-174，191-204，211-216，232-266，272-278，286-308，316-321，327-333，344-355， 358-364,384-391,395-428,464-476,487-495,497-511,544-561,563-573,575-582, 588-594，10-25 和 322-338 ;Seq ID No 338 的 14-26，32-49，51-57，59-72，80-91，102-112， 119-125，147-161，164-173，175-183，188-213，217-222，246-254，260-276，282-303， 308-318，321-328，333-350，352-359，371-378，392-401，407-414，416-443，448-463， 471-484，490-497，501-514，519-527，539-551，557-570，578—590，592—598，600—610，
115618-629,633-647,654-667,676-689,702-709,718-726,728-737,741-760,764-780, 786-795,808-826,836-842,845-852,865-874,881-887,931-945,949-957,968-974, 979-986，1003-1009，1023-1029 和 90-103 ;Seq ID No 339 的 11-16，37-56，60-66，69-77， 80-88,93-106,117-139,166-171 和 72-90 ；Seq ID No 340 的 59-84，123-133，145-150， 161-167,178-189 和 115-128 ；Seq ID No 341 的 15-33，39-46，52-64，74-87，108-124， 127-144，150-156,173-179，184-194，201-208，219-236，243-269，272-295，302-309， 343-349，356-361，370-379，405-411，414-423，430-451，457-464，466-475，477-483， 496-502,507-522,541-548,557-563,571-577,579-585,590-605,626-642,650-662, 671-691,704-710,751-769,775-781,786-791,794-829,851-858,868-878,884-904, 913-919,931-939 和 132-142 ;Seq ID No 342 的 33-58，64-71，74-80，83-88，96-120， 122-139，146-157，167-177，207-213，220-225，236-242，264-279，300-305，326-336， 340-347，350-360，97-115 和 199-211 ；Seq ID No 343 的 4-26，43-57，70-99，102-117， 121-133，142-148，151-168，170-183，192-220，235-249，258-279 和 30-41 ;Seq ID No 344 的 34-42，48-58，70-94，110-130，154-160，164-172，178-183，195-203，211-222，229-250， 256-261，274-284，286-292，312-323 和 222-233 ；Seq ID No 345 的 4-9，15-36，38-45， 49-74，78-88，100-112，136-191，211-220，226-233，239-246，254-274，287-307，316-322， 342-353,356-366,373-378,384-393,405-431,449-457,459-468,487-511,515-524, 529-541，544-552，562-568，571-576 和 208-280 ;Seq ID No 346 的 10-27，31-37，39-54，
71-108,124-143和 2-107 ;Seq ID No 347 的 16-27，38-57，64-70，90-102，104-113， 116-137,160-166 和 1-80 ；Seq IDNo 348 的 13-21，31-36，56-67，127-136，153-171， 173-180，184-200，214-222，225-231，239-263，267-273 和 135-159 ；Seq IDNo 349 的 12-27,31-51,68-74,77-87,94-101,108-114,117-123,127-134,138-168,173-196, 201-207，212-217，227-237，247-257，264-280 和 205-223 ;Seq ID No 350 的 17-22，25-54， 70-76，92-100 和 98-110 ;Seq ID No 351 的 7-29，40-50，60-67，87-96，105-111，119-164， 172-199，206-212，220-227，237-259，272-279，282-293，295-309，313-319，321-328， 345-363，376-386 和 159-176 ;Seq ID No 352 的 4-19，24-30，36-43，50-68，71-89，93-106， 141-152，154-172，179-197，199-215，229-239，246-252，255-263，281-298，319-325， 329-356,358-368,374-390,397-409,420-429,432-444,450-456,459-475,483-494, 496-502，520-528，532-556 和 362-377 ；Seq ID No 353 的 18-25，40-62，77-85，91-97， 105-116，123-133，139-184，189-197 和 122-140 ；Seq ID No 354 的 4-49，52-58，62-70， 79-105, 109-133, 142-150,163-168,206-214,220-228,233-240,243-254,274-281, 303-311,327-338,357-373,378-396,403-413,420-436,441-453,461-467,475-481, 484-498，506-512，514-521，523-529，562-579，589-595，598-603，615-648，714-722， 728-742，749-758，777-792，795-807 和 643-658 ；Seq IDNo 355 的 8-27，37-48，51-56，
72-79，87-106，120-138，140-147，167-176，187-197，205-216，222-229，234-239，243-249， 277-288,292-315,334-343,347-353,363-391,398-404,430-447,461-467,478-492, 498-507 和 456-470 ;Seq ID No 356 的 5-12，18-24，59-69，80-93，95-109，119-125， 130-137，139-147，158-163，168-176，182-202，206-215，222-239，241-249，267-277， 291-298，311-318，321-327，338-344，348—355，373—386，393—406，411—417，434—443，446-465，473-484，514-521，532-553，584-594 和 221-237 ;Seq ID No 357 的 4-14，27-34， 50-58，63-72，79-106，109-114，121-142，146-154，161-167，169-175，178-201，223-238， 249-254，259-264，278-292，294-312，319-330 和 167-191 ；Seq ID No 358 的 7-28，36-42， 50-61,63-80，122-152，161-174，176-191 和 140-190 ；Seq ID No 359 的 20-57,59-65, 70-78,86-102,119-133,142-161，163-173，177-188，192-202，204-220，222-236，240-253， 279-319，326-331，337-383，390-399，406-412，420-427，431-438 和 381-395 ；Seq ID No 360 的 13-18，28-34，37-43，50-59，75-81，83-97，105-121，139-147，200-206，209-227， 231-247，260-271，318-327，366-381，388-394，399-406 和 182-201 ；Seq ID No 361 的 6-29,37-43,51-56,70-77,82-102,110-119,127-143,178-190,201-209,216-243, 261-269，281-292，305-313，327-339，341-354，356-373，391-397，423-429，438-445， 450-478 和 21-314 ;Seq ID No 362 的 4-12，15-21，32-41，59-76，80-89，96-104 和 90-103 ； Seq ID No363 的 9-28，30-41，44-54，69-74，77-82，90-97，104-123，125-135，149-155， 164-173，177-184，217-226，230-235，238-244，258-272，282-297，300-305，309-315， 317-322,327-336,348-362,368-374,380-387,400-411,414-424,451-458,460-466, 483-494,497-503,506-511,521-528,540-553,569-587,598-606,628-642,661-681, 688-700，718-733，740-749，752-764，769-783，823-834，848-854，862-872，878-884， 886-898，915-920，938-951，954-961，963-972，982-989，996-1003，1010-1016，1021-1032， 1038-1044,1047-1057,1060-1070,1079-1088,1094-1102,1117-1127, 1129-1135, 1142-1153,1158-1204,1212-1229,1234-1263,1269-1277,1308-1313,1327-1338, 1344-1376，1400-1415，1436-1443，1448-1458，1497-1504，1511-1522，1544-1566，3-82 和 509-576 ；Seq ID No 364 的 8-36，40-64，71-79，88-94，102-109，118-127，138-148，
151-159，163-174，192-198，200-206，220-233，268-273，290-301，304-309，316-323， 331-349，378-391，414-420，427-437，455-475，494-510，541-547，549-555，616-640，1-60, 55-139，212-308，386-458 和 458-624 ；Seq ID No 365 的 16-31，35-42，70-77，91-101， 120-130，132-140，143-153，185-190，195-202，215-222，228-238，241-251，257-264， 268-277,288-302,312-324,326-333,341-348,364-382,415-429,438-454,458-466, 491-499,501-521 和 273-281 ;Seq ID No 366 的 8-14，32-57，74-149，155-177，179-212， 221-266，271-296，304-324，329-346，349-359，368-401，413-419，426-454，465-478， 493-510 和 466-490 ；Seq IDNo 367 的 22-28，33-51，64-89，96-119，126-132，138-146，
152-159，161-169，172-179，193-198，205-211，221-231，235-254，273-280，297-303， 312-320，328-346，351-373，378-384，391-398，448-454，460-468，470-481，516-558， 574-593,597-602,613-623,626-646,649-656,668-673,675-683,696-708,715-722, 724-739，745-751，759-777，780-804，816-822 和 102-113 ;Seq ID No 368 的 12-28，41-91， 98-107，112-120，125-131，151-193，215-221，240-250，263-280 和 128-138 ；Seq ID No 369 的 16-24，32-38，46-62，68-81，90-105，127-133，144-150，160-166，178-184，186-202， 210-219，232-240，252-258，264-273，293-324，337-344，349-357，360-369，385-398， 410-416,419-427,441-449,458-476,508-515,523-539,544-549,562-569,571-579, 96-109 和 127-139 ;Seq ID No 370 的 19-25，28-34，56-61，85-97，110-116 和 39-53 ;Seq ID No 371 的 4-37，41-50，62-72，91-97，99-109，114-125，136-141，149-158，160-166，
117201-215 和 27-225 ;Seq ID No 372 的 15-31，44-51，96-105，122-130，149-157，162-168， 178-183，185-192，198-204，206-213，221-234，239-245，248-255，257-266，289-335， 349-357，415-422，425-441，448-454，462-468 和 463-481 ;Seq ID No 373 的 5-31，39-55， 63-72，76-99，106-155，160-177，179-199，207-217，223-240，245-255，261-267，294-316， 321-343,354-378,382-452,477-488,529-536,555-569,584-591,593-612,620-627, 632-640，647-654，671-680，698-704，723-730，732-750，769-775，781-788，822-852 和 505-525 ；Seq ID No 374 的 3-18 ；Seq ID No 375 的 4-14 和 12-24 ；Seq ID No 376 的 4-11，22-30 和 12-25 ；Seq IDNo 377 的 5-12 和 4-18 ；Seq ID No 378 的 4-28 和 7-14 ；Seq IDNo 379 的 6-16 和 8-16 ;Seq ID No 380 的 4-15，18-33 和 24-36 ;Seq ID No 381 的 4-10， 16-21 和 20-31 ；Seq ID No 382 的 6-19 ；Seq ID No 383 的 11-18 和 3-10 ；Seq ID No 384 的 13-24 和 3-15 ；Seq ID No 385 的 15-27 和 7-16 ；Seq ID No 386 的 11-16 禾口 1-15 ；Seq ID No 387 的 4-16 和 9-21 ；Seq ID No 388 的 4-24，40-48，54-67 和 22-39 ;Seq ID No 389 的 6-30，34-55，62-68，78-106 和 68-74 ;Seq ID No 390 的 3-14 ;Seq ID No 391 的 9-19 和 6-21 ；Seq ID No 392 的 4-17 和 1-9 ；Seq ID No 393 的 5-30 和 1-8 ；Seq ID No 394 的 4-16，23-46，51-56 和 45-55 ;Seq ID No 395 的 7-16 ;Seq ID No 396 的 2-14 ;Seq ID No 397 的 4-36，43-65 和 50-62 ；Seq ID No 398 的 10-30 和 14-21 ；Seq ID No 399 的 9-17 和
I-10；Seq ID No 400 的 4-12 和 3-16 ；Seq ID No 401 的 4-15 和 5-23 ；Seq ID No 402 的 10-21 ；Seq ID No 403 的 6-16 ；SeqID No 404 的 4-29，31-38 和 2-14 ；Seq ID No 405 的 4-35 和 33-42 ;Seq ID No 406 的 2_17;Seq ID No 407 的 9-18，30-35 和 15-33 ;Seq ID No 408 的 4-9 和 6-12 ；Seq ID No 409 的 3-17 ；Seq ID No 410 的 12-21，37-44，52-61，72-80 和 38-48 ；Seq ID No411 的 4-10，29-44，54-61，69-78 和 13-27 ；Seq ID No 412 的 13-23， 36-53和 2-15 ;Seq ID No 413 的 4-25，28-46，56-72，81-99，120-132，134-142，154-160 和 129-141 ；Seq ID No 414 的 4-15，24-33，35-41，64-86 和 21-33 ;Seq ID No 415 的 9-15 禾口 4-13 ；Seq ID No 416 的 4-11，13-19，34-48和 15-32 ;Seq ID No417 的 4—21和 11—31 ;Seq ID No 418 的 23-57 和 38-50 ；Seq IDNo 419 的 4-32 和 3-13 ；Seq ID No 420 的 4-10， 13-25，32-42，56-68，72-84 和 26-38 ;Seq ID No 421 的 4-20，31-48，52-58，65-71，80-93， 99-108，114-123和 37-49 ;Seq ID No 422 的 6-12，14-20和 3-25 ;Seq ID No 423 的 14-25， 27-38 和 5-14 ;Seq IDNo 424 的 4-41，57-105，109-118，123-136，144-152 和 86-99 ;Seq ID No 425 的 6-19 ；Seq ID No 426 的 2-19 ；Seq ID No 427 的 14-47 和 1-14 ；Seq ID No 428 的 4-21，29-44 和 2-18 ； Seq ID No429 的 23-29 和 10-28 ;Seq ID No 430 的 6-16，22-36 和
II-22；Seq ID No 431 的 4-19，30-44 和 18-27 ;Seq ID No 432 的 5-15，37-45，58-65 和 38-47 ；Seq ID No 433 的 4-15，23-34 和 4-15 ;Seq ID No 434 的 30-36，44-54，79-85， 101-114，138-152，154-164，170—175，179—200，213—220，223—240，243—255，258—264， 268-284和10-28 ；包含表IB的“相同区域”纵栏的氨基酸序列的肽，尤其是包含如下氨基 酸的肽:Seq ID No 449 的 210-226 和 738-753 ；Seq ID No450 的 326-344，326-348， 338-354，371-392，801-809 和 877-901 ;Seq ID No 451 的 893-906 ;Seq ID No 452 的 51-69 ；Seq ID No 453 的 110-125 ；Seq ID No 454 的 291-305 ；Seq ID No 455 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 456 的 326-344，326-348，338-354，371-392，801-809 和 877-901 ； Seq ID No 457 的 893-906 ；Seq ID No 458 的 51-69 ；Seq ID No 459 的 110-125 ；Seq ID
118No 460 的 291-305 ；Seq ID No 461 的 32-44 ；Seq ID No 462 的 399-410 ；表 2 的“氨基酸 从”到“氨基酸至”纵栏中指定的血清反应性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽Sep ID No 218 的 120-143，138-161 和 156-179 ;SeqID No 219 的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 222 的 74-90 ；SeqID No 223 的 759-773 ；Seq ID No 224 的 237-260 ；Seq ID No 225 的 265-284 ；Seq ID No 226 的 65-74 ；Seq ID No 227 的 41-50 ；Seq ID No 229 的 163-174 ； Seq ID No 230 的 26-37 ；Seq ID No 232 的 174-189 ；Seq ID No 234 的 240-256 ；Seq ID No 236 的 285-297 ；Seq ID No 238 的 238-247 ；Seq ID No 239 的 491-519 ；Seq ID No243 的 114-140 ;Seq ID No 250 的 267-284 ;Seq ID No 252 的 439-453 ;Seq ID No 253 的 162-178 ；Seq ID No 254 的 347-364 ;Seq ID No 255 的 699-715 ;Seq ID No 256 的 60-71; Seq ID No 257 的 244-257 ;Seq ID No 258 的 44-63 和 57-76 ;Seq ID No 260 的 185-196 ； Seq ID No 263 的 119-129 ;Seq ID No 266 的 182-195 ;Seq ID No 267 的 32-44 和 424-442 ；Seq ID No 268 的 247-256 ;Seq ID No 269 的 678-694，785-805，55-77 和 72-94 ； Seq ID No 281 的 210-226 ；Seq ID No 289 的 37-59 ；Seq ID No 296 的 13-29 ；Seq ID No 348 的 136-159 ;Seq ID No 349 的 205-222 ;Seq ID No350 的 99-110 ;Seq ID No 351 的 160-176 ；Seq ID No 355 的 457-470 ；Seq ID No 356 的 221-237 ；Seq ID No 357 的 167-190 ；Seq ID No 361 的 96-120 ；Seq ID No 364 的 399-417，503-519 和 544-563 ；Seq ID No 371 的 46-68，159-183 和 184-198 ；Seq ID No372 的 463-481 ；表 4 的“氨基酸从，，到 “氨基酸至”纵栏中指定的免疫原性表位；尤其是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 219的 110-129 和 168-184 ；Seq ID No 277 的 877-901，333-354，326-344 和 801-809 ;Seq ID No 347 的 l-54;Seq ID No 364 的 544-563，31-51，107-119，399-417 和 503-519 ;Seq ID No 218 的 120-198 ;Seq IDNo 219 的 20-35 ;Seq ID No 221 的 118-201 ;Seq ID No 242 的 48-132 ；Seq ID No 249 的 118-136 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No 254 的 347-364 ；Seq ID No 255 的 699-715 ；Seq ID No258 的 50-76 ；Seq ID No 269 的 785-819 和 44-128 ；Seq ID No274 的 90-128 ；Seq ID No 289 的 314-384 ；Seq ID No 293 的 327-349 ；Seq ID No 304 的 242-314，405-478 和 23-100 ;Seq IDNo 305 的 129-210 ;Seq ID No 307 的 162-188 ；Seq ID No 310 的 750-772 ；Seq ID No 335 的 1-56 ；Seq IDNo 337 的 322-337 ；SeqID No 339 的 72-90 ；Seq ID No 345 的 374-395 ；Seq ID No 348 的 136-159 ； Seq ID No 358 的 141-164 ；Seq ID No 361 的 96-157 ；Seq ID No 363 的 1-82 ；Seq ID No 364的489-556 ；Seq ID No 371的159-183和49-133 ；包含表5的“推定的免疫原性氨基 酸”和“鉴别的免疫原性区域(aa)的位置”纵栏的氨基酸序列的肽，尤其是包含如下氨基酸 的肽Seq ID No 475 的 4-26，35-41，53-61，73-84，103-108，114-120，140-146，156-162， 192-208，214-219，227-233，239-252，260-268，284-297，1-48 和 113-133 ;Seq ID No 476 的 4-27，38-44，50-56，59-64，72-79，83-89，92-97，108-116，123-148，152-167，183-196， 200-220，232-244，255-261，265-274，282-302，309-317，1-79 和 231-302 ;Seq ID No 477 的 6-28，66-72，85-105，115-121，144-151，160-170，176-185，223-230，252-288，296-310， 319-333，367-374，458-464，471-480，483-488，520-528，530-549，559-564，593-601， 606-616,636-643,655-662,676-682,684-699,719-726,735-750,757-764,777-785, 799-810,812-843,846-853,868-873,880-889,891-899,909-929,934-940,963-969, 998-1004，1007-1014，1016-1022，1030-1046，1-80 和 808-821 ;Seq ID No 478 的 7-24，35-41,75-81,91-114,122-132，137-144，148-156，183-192，194-200，212-228，233-238， 251-258，275-295，326-332，337-346，1-79 和 305-321 ；Seq ID No 479 的 31-38，42-52， 66-72,86-92,98-104,115-122,127-146，154-164，169-187，198-212，225-237，255-269， 13-92 和 135-142 ；Seq ID No 480 的 4-36，39-49，63-69，71-77，81-88，123-131，133-139， 160-169，174-180，188-194，210-217，273-278，289-300，317-334，336-341，383-401， 425-438，1-68,212-270 和 402-446 ;Seq ID No 481 的 21-29，31-42，49-63，72-79，81-93， 112-132，159-165，188—195，197-232，262-267，279-286，294-301，318-326，348-366， 381-405，409-426，436-465，471-480，484-492，497-505，521-544，554-561，567-577， 581-589,601-609,611-622,636-651,653-667,669-685,700-708,716-722,729-744, 749-766,780-786,789-811,814-864,1-57 和 84-106 ；Seq ID No 482 的 6-24,35-48, 57-63，72-78，87-92，113-119，123-137，147-153，173-181,212-233 和 1-124 ;Seq ID No483 的 13-34, 62-69, 78-83, 86-91, 98-104, 107-115，146-159，179-188，195-205， 209-221，226-233，239-253，276-282，284-294，297-308，331-354，375-382，388-399， 421-433,449-458,464-469,472-491,508-513,525-531,534-550,575-593,601-618, 629-635,654-661,666-680,706-721,723-740,771-805,810-830,845-851 和 1-84 ；Seq ID No 484 的 4-32，45-64，73-83，86-92，100-111，125-147，157-163，170-175，177-188， 226-232，245-252，258-274，320-335，348-359 和 1-71 ；Seq ID No 485 的 13-40,43-71, 76-83,87-101,109-119,125-156，162-175，182-219，226-232，240-262，270-287，306-318， 326-342，344-408，414-444，449-456 和 1-51 ;Seq ID No 486 的 4-16，18-34，45-54， 99-108,134-140,203-212,241-257,266-274,279-291,308-315,330-336,355-370, 374-382,402-410,428-455,466-472,474-480,531-554,560-566,572-580,597-618, 632-660，664-674，676-685，691-705，708-735，750-768，1-87 和 342-480 ；表 6 的“氨基酸 从”到“氨基酸至”的纵栏中指定的血清反应性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽No 475 的 115-132 和 1-26 ；Seq ID No 476 的 33-55 ；Seq ID No 478 的 1-25 ；Seq IDNo 479 的 37-61 ；Seq ID No 480 的 1-24 ；Seq ID No 481 的 1-23 ；Seq ID No 482 的 46-60 ；Seq ID No 483 的 1-28，23-50 和 45-71 ；Seq ID No 484 的 1-22 和 17-38 ；Seq ID No 485 的 1-22 和17-38 ；Seq ID No 486的1-27，22-47和422-447 ；表7的“氨基酸从”到“氨基酸至”纵 栏中指定的免疫原性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 475的115-132和 1-47 ；Seq ID No 476 的 1-55 ;SeqID No 477 的 22-85 ;Seq ID No 478 的 307-320 和 1-44 ； Seq IDNo 479 的 15-76 和 40-92 ；Seq ID No 480 的 1-59，213-269 和 403-445 ；Seq ID No 481 的 1-56 和 85-105 ；Seq ID No 482 的 37-121 ；Seq ID No 483 的 1-71 ；Seq ID No 484 的 1-38 ；Seq IDNo 485 的 1-38 ；Seq ID No 486 的 1-47。15. 一种生产根据项目11至14中任何一个的无乳链球菌超免疫血清反应性抗原 或其片段的方法，包括表达根据项目1至7中任何一个的核酸分子。16. 一种生产表达根据项目11至14中任何一个的无乳链球菌超免疫血清反应性 抗原或其片段的细胞的方法，包括用根据项目8或项目9的载体转化或转染合适的宿主细 胞。17. 一种药用组合物，尤其是疫苗，包含如项目11至14中任何一个定义的超免疫 血清反应性抗原或其片段或根据项目1至7中任何一个的核酸分子。
18.根据项目17的药物组合物，尤其是疫苗，特征在于它进一步包含一种免疫刺 激物质，优选地选自尤其是聚阳离子肽的聚阳离子聚合物、免疫刺激脱氧核苷酸(ODN)、包 含至少两个LysLeuLys基序的肽、尤其是人生长激素的神经活性化合物、明矾、弗氏完全或 不完全佐剂或其组合。19.根据项目1至7中任何一个的核酸分子或根据项目11至14中任何一个的超 免疫血清反应性抗原或其片段用于制备药物制品，尤其是用于制备抗无乳链球菌感染的疫 苗的用途。20. 一种抗体或至少其有效部分，所述抗体至少结合根据项目11至14中任何一个 的超免疫血清反应性抗原或其片段的选择性部分。21.根据项目20的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。22.根据项目20或21的抗体，其中所述有效部分包含Fab片段。23.根据项目20至22中任何一个的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。24.根据项目20至23中任何一个的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。25.产生根据项目20至24中任何一个的抗体的杂交瘤细胞系。26. 一种产生根据项目20的抗体的方法，特征在于下面的步骤 通过给予非人的动物项目11至14中任何一个定义的超免疫血清反应性抗原或 其片段而引发所述动物的免疫反应， 从所述动物移出含有抗体的体液，以及 通过对所述含有抗体的体液进行进一步的纯化步骤而产生所述抗体。27.产生根据项目21的抗体的方法，特征在于下面步骤 通过给予非人的动物如项目12至15中任何一个定义的超免疫血清反应性抗原 或其片段而引发所述动物的免疫反应， 从所述动物移出脾或脾细胞， 产生所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞， 挑选并克隆特异于所述超免疫血清反应性抗原或其片段的杂交瘤细胞， 通过所述克隆杂交瘤细胞的培养和可选的进一步的纯化步骤产生所述抗体。28.根据项目20至24中任何一个的抗体用于制备治疗或预防无乳链球菌感染的 药物的用途。29. 一种拮抗剂，其结合根据项目11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或 其片段。30. 一种鉴别能够结合根据项目11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或 其片段的拮抗剂的方法，包括a)在允许候选拮抗剂与分离的或固定化的根据项目11至14中任何一个的超免疫 血清反应性抗原或其片段结合的条件下，在能提供响应于所述候选拮抗剂与所述超免疫血 清反应性抗原或其片段结合的可检测信号的组分的存在下，将所述超免疫血清反应性抗原 或其片段与所述候选拮抗剂接触；以及b)检测响应于所述拮抗剂与超免疫血清反应性抗原或其片段的结合产生的信号 的存在与否。31.鉴别能够降低或抑制根据项目11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段与其相互作用伴侣之相互作用活性的拮抗剂的方法，包括a)提供根据项目11-14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其高免疫片段，b)向尤其是根据项目20至24中任何一个的抗体的所述超免疫血清反应性抗原或 其片段提供相互作用伴侣，c)允许所述超免疫血清反应性抗原或其片段与所述相互作用伴侣相互作用以形 成相互作用复合物，d)提供候选拮抗剂，e)允许候选拮抗剂和相互作用复合物之间发生竞争反应，f)测定候选拮抗剂是否抑制或降低超免疫血清反应性抗原或其片段与相互作用 伴侣的相互作用活性。32.根据项目11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的用途，用于 所述超免疫血清反应性抗原或其片段的相互作用伴侣的分离和/或纯化和/或鉴别。33. 一种体外诊断与根据项目11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其 片段的表达相关的疾病的方法，包括测定编码所述超免疫血清反应性抗原和片段的根据项 目1-7中任何一个的核酸序列的存在，或根据项目11-14中任何一个的超免疫血清反应性 抗原或其片段的存在。34. 一种细菌感染，尤其是无乳链球菌感染的体外诊断的方法，包括分析编码所述 超免疫血清反应性抗原或其片段的根据项目1至7中任何一个的核酸序列的存在，或者根 据项目11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的存在。35.根据项目11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的用途，用于 产生结合所述超免疫血清反应性抗原或其片段的肽，其中所述肽选自抗促成素。36.根据项目11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段用于功能性 核酸制造的用途，其中所述功能性核酸选自适体和镜面体。37.根据项目11至14中任何一个的核酸分子用于制备功能性核糖核酸的用途，其 中功能性核糖核酸选自核酶、反义核酸和siRNA。序列表SeqID 1atgaagaaagttttaaccttcttattatgtagcttatattttgtatcaatcccagctata60
agtaccgaggagccattaacgctttctcaaaatagacgatacgccttaactcagacagtt120
gtggataaggaaatgtattttgatgctattccagagagacC 3.3. C 3. C 3.3.3.aattgaaata180
agcagttttcaagatgaagctttaaccataacaggagagactttagttccaaatacttta240
ttgtcgattgtttctcttacaattaattcaaatggaattccagtatttactttgtccaat300
ggacagttcataaaggctagtcgtgaagctatttttaatgatttagtttctaagcagcaa360
tctgtctcattggattattggttaaaaccttcttttgtgacttatgaagcaccttacaca420
aatggtgttagtgaagttaa3.3.3. 3.3. 3.aaaccttattccagagtgcatttagtagaa480
caagcagaaacagaacatggtatttattataaaacggacagtggtttttggatatcagta540
gaagatctatcggttgctgataatcgtatggctaaggttcaagaagtattattggaaaaa600
tataataaagataaatatggtatatacatcaaacaattaaatacacagacagtagctggt660
attaatattgataggtcaatgtactctgcaagtattgcaaaattagcaacactttatgct720
122
gttaaatacggtggtgtcctagaaagtcttgctctcatgacttttggtaaccgtatcggg2640
gcctctgttgaaattgcagagcttgacagtagcttgacagctcaactcggaggctttgtc2700
tttacatcagctgaggaaattgctgactcggtgaaaatcggtcaaactcaggcagccttt2760
acacttactgtcaatggaaatgaccttgctggggcaagccttctatcagtcttcgaaggc2820
aaattggaagaggtttacccaacagagtttgaacaggcagacgctcttgaagaagttcct2880
gctgtggtatcagatactgttatcaaggctaaggaaacaattgaaaaaccagtggtttac2940
attccagtcttccctggtaccaactcagaatatgattcagctaaggcctttgaacaggtt3000
ggagctagtgtcaacttggtagcatttgtaaccttgaatgaggctgctattgctgactca3060
gttgacacaatggtcgctaatattgctaaggcaaatatcatcttctttgctggaggattc3120
tcagcagcggatgaaccagatgggtctgctaagtttatcgtcaatatcttgcttaacaag3180
aaggttcgcgcagctattgacagcttcatcgaaaaaggtggccttatcatcggtatctgt3240
aatggtttccaagcccttgttaaatcaggtcttcttccatacggaaacttcgaggaagct3300
ggtgagacaagtccaaccctcttctataacgatgccaaccagcacgttgccaagatggtt3360
gagactcgtatcgcaaataccaactcaccttggttggtaggagttgaggtcggcgatatt3420
catgccatcccagtttcacacggtgaaggtaaatttgttgtcagcgcttctgaatttgca3480
gagctaagagacaatggtcaaatctggagccaatatgtggactttgacggacaaccatct3540
atggattctaaatacaatccaaatggctctgtcaatgccatcgaagggattaccagcaag3600
aatggtcaaatcatcggtaagatggggcactcagaacgctgggaagacggcctcttccaa3660
aatatccctggtaacaaagaccaagccttgtttgctagtgcagtaaaatattttacagga3720
￡1￡1￡Ι ￡1￡13726
SeqID 4
atgaaaatgaataaaaaggtactattgacatcgacaatggcagcttcgctattatcagtc60
gcaagtgttcaagcacaagaaacagatacgacgtggacagcacgtactgtttcagaggta120
aaggctgatttggtaaagcaagacaataaatcatcatatactgtgaaatatggtgataca180
ctaagcgttatttcagaagcaatgtcaattgatatgaatgtcttagcaaa3.3. 3.3.3. 3.3. C240
attgcagatatcaatcttatttatcctgagacaacactgacagtaacttacgatcagaag300
agtcatactgccacttcaatgaaaatagaaacaccagcaacaaatgctgctggtcaaaca360
acagctactgtggatttgaaaaccaatcaagtttctgttgcagaccaaaaagtttctctc420
aatacaatttcggaaggtatgacaccagaagcagcaacaacgattgtttcgccaatgaag480
acatattcttctgcgccagctttgaaatcaaaagaagtattagcacaagagcaagctgtt540
agtcaagcagcagctaatgaacaggtatcaccagctcctgtgaagtcgattacttcagaa600
gttccagcagctaaagaggaagttaaaccaactcagacgtcagtcagtcagtcaacaaca660
gtatcaccagcttctgttgccgctgaaacaccagctccagtagctaaagtagcaccggta720
agaactgtagcagcccctagagtggcaagtgttaaagtagtcactcctaaagtagaaact780
ggtgcatcaccagagcatgtatcagctccagcagttcctgtgactacgacttcaccagct840
acagacagtaagttacaagcgactgaagttaagagcgttccggtagcacaaaaagctcca900
acagcaacaccggtagcacaaccagcttcaacaacaaatgcagtagctgcacatcctgaa960
aatgcagggctccaacctcatgttgcagcttataaagaaaaagtagcgtcaacttatgga1020
gttaatgaattcagtacataccgtgcgggagatccaggtgatcatggtaaaggtttagca1080
125
actgaagttagtgaaaaagaacctttgacacgtgaaaaactatcacctgttattgccgta1080
ttgaaagctgaatctacagaagatggtgttgaaaaagctcgtcaaatggttgagtttaat1140
ggtctaggacactcagctgctattcatacaaaagatgcagacttagctcgtgaatttgga1200
actagaattcgtgctatccgtgttatttggaattctccttctacttttggtggtattggg1260
gatgtttacaatgctttcttgccatcattgactcttggttgtggttcgtatggacgtaac1320
tcagttggtgataacgttagtgctataaatctcttgaatatcaaaaaagtaggaagacgt1380
agaaataatatgcaatggtttaaagtcccttcaaaaacatacttcgaacgtgattctatt1440
caatatttgcaaaaatgtcgcgatgttgaacgtgtcatgattgttacagatcacgccatg1500
gttgagcttggtttcttggatcgtatcattgaacaacttgatcttcgtcgcaataaagtt1560
gtttatcagatttttgctgaagtagaaccagatccagacattacaacagtaatgaaagga1620
acagatttgatgcgtaccttcaaaccagacactattattgcattaggtggtggttctcct1680
atggatgctgcgaaagttatgtggctcttctatgaacaaccagaagttgatttccatgac1740
ctcgttcaaaaattcatggatatccgtaaacgtgcgttcaaattcccagaacttggtaag1800
aaaacaaaatttgttgctattccaacaacttctggaacaggttctgaagtgacaccattt1860
gccgttatctctgacaaagcaaataatcgtaaatatccaatcgctgattattcattaaca1920
ccaactgtagctatcgttgatccggcccttgttatgactgttcctggttttattgcggct1980
gatacgggtatggatgtattgacacatgcaacagaggcttatgtttaacagatggcaaat2040
gattatacagacggacttgcccttcaagcaattaaaattgtgtttgactacttagaacgc2100
tcagtaaaagatgctgattttgaagcacgtgaaaagatgcacaatgcgtcaactatggca2160
ggtatggctttcgccaatgcattcttaggtatttctcactcaatggcgcataaaattggc2220
gcacaattccataccgtacacggacgtacaaatgcaattcttttgccgtatgttatccgc2280
tataatggaactcgtccagctaaaacagcaacatggcctaagtacaattactatcgtgct2340
gatgaaaaatatcaagatatcgctaaattactcggcttaccagcagcaacaccagaagaa2400
gctgtcgaatcatatgcaaaagctgtgtatgaccttggaacacgtttaggtattaagatg2460
aatttccgcgaccaaggcattgatgaaaaagaatggaaagaaaaatctcgtgaactagct2520
ttcttagcatatgaagatcaatgttcaccagcaaatccacgccttccgatggtagatcac2580
atgcaagaaatcatcgaagatgcttattatggttatgaggaacgtccaggacgtcgtaag2640
taa2643
SeqID 7
gtgggtattaaagtttataa accaacgaca aatggccgtcgtaatatgacttctttggat60
tttgcagaaatcactacaaa cactcctgag aaatcattgcttgtttcactaaagaataaa120
gcaggacgtaacaacaacggacgtattactgttcgtcaccaaggtggtgg acacaaacgt180
cattaccgtttgattgacttcaaacgtaataaagatggtg ttgaagcagttgttaaaaca240
attgaatacgatccaaatcg tactgcaaatattgctcttg tacactatactgatggtgtt300
aaagcttacattcttgcgcctaaaggccttgaagtaggtcaacgcattatttctggtcca360
gaagcagatatcaaagttgg taacgcacttccacttgcta acattccagtcggtacagtt420
atccataatattgaattgca accaggtaaa ggtgctgaattgattcgtgcCgCgggtgCt480
tctgctcaagtacttggtca agaaggtaaa tatgttcttg ttcgccttca atcaggtgaa540
gtacgtatgatccttggtacttgccgtgca acaattggta ctgttggtaa tgaacaacaa 127600
tcacttgttaacattggtaaagcaggacgtaatcgttggaaaggtgttcgccctacagtt660
cgtggttctgtaatgaaccctaatgatcacccacacggtggtggtgaaggtaaagcacca720
gttggtcgtaaagcaccatctactccatggggtaaacctgcacttggacttaaaactcgt780
aataagaaagctaaatcagacaaacttattgttcgtcgtcgtaaccaaaa834
SeqID 8
atgattgagtttgaaaaacc3.3. 3.3. 3.3. C 3.aaaattgatgaaaataaagattacggcaga60
tttgtcatcgaaccactagaacgtggctacggtacaactctaggaaactctcttcgtcgt120
gtgcttctgtcttcacttccaggtgcagcagtcacatcaatcaaaattgatggagtatta180
cacgaatttgatactatcccaggtgtacgtgaagatgtgatgcaaatcatccttaatgta240
aaaggacttgctgtgaaatcttacgtcgaagacgaaaagattatcgaactagacgttgaa300
ggtcctgcagaaattactgccggagatattttaacagatagtgatatcgaaattgtaaac360
cctgaccattatcttttcacaattgctgaaggtcacagtttgaaagcaacaatgacagtt420
gctaaaaaccgaggttatgttccagcagaaggaaataaaaaagatgatgcaccagtggga480
acattggctgtagattcaatctatacaccagtgaaaaaagttaattatcaagttgaacct540
gctcgtgtaggtagtaacgatggctttgataaattaactattgaaatcatgacaaatggc600
acaatcattcctgaggatgctcttggtctttcagctcgcgtcttaattgaacacttaaac660
ttgtttactgatttaacagaggttgctaaagcaactgaagtaatgaaggaaacagagaaa720
gtgaacgatgagaaagtgcttgaccgcacaattgaggaacttgatttgtcagtgcgctca780
tataactgtttaaaacgtgctggaattaatacagtatttgatttaacagaaaaaactgag840
cctgaaatgatgaaagtccgaaacttaggacgtaagagtcttgaagaagttaaaatcaaa900
cttgccgatctaggtcttggattaaaaaacgataaataa939
SeqID 9
atgaaaaagattcgattatcaaagtttattaaaatgattgttgttattttgtttttaatt60
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atttcaaatggtcaacgtaagcctggaaactctttatatgcttatgataaatcctttgat180
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agtatggtttatgacaactataaagctacagcaggtaagaaagagctttatattgtaaaa840
ggggcaaaacatgcgaaatcttttgaaacagagccagaaaaatatgagaaacgtatctct900
agttttttgaaaaaatatga927
SeqID 10
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SeqID 13
atggctaaagtatgttatttcacaggacgtaaaacagtttctggtaacaaccgttcacac60
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cgcgtttaa189
SeqID 14
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acgagaccagatttggctactaaagttgatgtttcaaaagatggtttaacttatacagct300
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tattcatggcaacgtttagttgatcctaagacagcttcacaatatgcttaccttgctgtt420
gaagggcatgtgcttaatgccgataaaatcaacgaaggacaagagaaagacttgaataag480
ctaggtgttaaggcagaaggcgatgacaaagttgttattactttatctagtccgtctcca540
caattcatctactaccttgcattcactaatttcatgccacaaaaacaagaagttgttgaa600
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atttatcaagC 3.3- 3.3.3.3.3.taataaagatgtcacagatgttctagaagcgaccactgcc900
tatatgcaatataatactactggttctgtgaaagggcttgataatgttaagattcgtcgc960
gccttaaacttagcaactaaccgtaaaggagttgttcaagcagccgttgatacaggctca1020
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gttcctgctgccaaaaactctgttgactatatcaagtctacttgggaagctgctcttcca1260
ggacttactgttgaagaaaaatttgtaacctttaaacaacgcttagaagacagtagaaaa1320
caaaactttgatatcgtagtttctgtttggggtggggattatccagaagggtcaactttc1380
tacggcctctttaagtcagattcacaaaataacgatggaaaatttgctaacaaggactat1440
gacgctgcttataacaaggcaatttccgaagatgccttaaaaccagaagaatcagcaaag1500
130
caaccgcaaacgaataatacaccagttactccaggggtta acaatactgttccgactcca660
ggaactggtactgcacctgctactaatggg acgggtgttg ctcagtaa708
SeqID 19
atgactaaagatttattattggagcttggccttgaagagttgccagcttatgttgtgaca60
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tttgaaactgttcaaactttttcaactccacgtcgtttggctgttcgtgttaaaggattg180
gcagaccagcagacagatttaacagaagatttcaagggtccttctaagaaaattgctttg240
gatgcagaagggaatttttctaaagcagcccaaggttttgttcgcggaaaaggtttaagt300
gttgatgatatcgaatttcgtgaagttaagggagaagaatatgtttatgtcactaagcat360
gaaactggaaaaagtgcgattgatgttttagcaagtgtgacagaggtattaacagaattg420
actttcccagtgaacatgcattgggcaaataatagttttgaatatattcgtccagttcac480
actttagtggtattattagatgatcaagccttagagctagacttccttgatattcattca540
gggcgtattagtcgagggcaccgtttcttgggttctgacactgaaattttatctgctagt600
tcgtatgaagatgacttgcgacaacaatttgttattgctgatgcaaaagaacgccagcaa660
atgatcgttg￡ C C ￡1tgctatcgaagaaaaggaaaatatttcagttgaaattgac720
gaagatttactaaatgaagtgcttaatttagttgagtatccgacagcattcttgggttct780
tttgacgagaaataccttgatgtacctgaagaagttttagtcacttcaatgaaaaatcat840
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289FHINHIHAIVLPESVQEIGRSAFRQNGALHLMFIGNKVKTIGEMAFLSNKLESVNLSEQKQLKTIEVQAFSDNALSE VVLPPNLQTIREEAFKRNHLKEVKGSSTLSQIAFNAFDQNDGDKRFGKKVVVRTHNNSHMLADGERFIIDPDKLSST MVDLEKVLKIIEGLDYSTLRQTTQTQFREMTTAGKALLSKSNLRQGEKQKFLQEAQFFLGRVDLDKATAKAEKALVT KKATKNGHLLERSINKAVLAYNNSAIKKANVKRLEKELDLLTDLVEGKGPLAQATMVQGVYLLKTPLPLPEYYIGLN VYFDKSGKLIYALDMSDTIGEGQKDAYGNPILNVDEDNEGYHALAVATLADYEGLYIKDILNSSLDKIKAIRQIPLA KYHRLGFFQAIRNAAAEADRLIPKTPKGYLNTVPNYRKKQVEKNSKPVDYKTPIFDKALPNEKVD⑶RVAKGHNINA ETNNYVAVTPIRSEQQLHKSQSDVNLPQTSSKNNFIYEILGYVSLCLLFLVTAGKKGKRARKSeqID 478MNKKIAGIGLASIAVLSLAACGHRGASKSGGKSDSLKVAMVTDTGGVDDKSFNQSGWEGMQAWGKKNGL KKGAGFDYFQSASESDYATNLDTAVSSGYKLIFGIGFSLHDAIDKAADNNKDVNYVIVDDVIKGKDNVASVVFADNE SAYLAGIAAAKTTKTKTVGFVGGMESEVITRFEKGFEAGVKSVDKSIKIKVDYAGSF⑶AAKGKTIAAAQYASGADI VYQVAGGTGAGVFSEAKSRNESLKEADKVWVLGVDRDQAAEGKYTSKDGKASNFVLASSIKEVGKSVELIATKTSKG KFPGGNVTTYGLKDGGVDIATTNLSDDAVKAIKEAKAKIISGDIKVPSKSeqID 479MRIQTTNLDKGGGGKSSHTYNE⑶WLSRVMGKRVLLIDGARECNLTHSFDVTSDKTIYDIFITGEYEIC 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权利要求
编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子，其包含选自如下的核酸序列a)与Seq ID No 463或Seq ID No 72的核酸分子具有至少95％序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)在严格杂交条件下退火于a)或b)的核酸分子的核酸分子，d)杂交于a)、b)或c)中定义的核酸分子之核酸分子的简并性序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中序列相同性是100%。
3.编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子，包含选自如下的核酸序列a)与SeqID No 463或Seq ID No 72的核酸分子具有96%或高于96%序列相同性的 核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)在严格杂交条件下退火于a)或b)的核酸分子的核酸分子，d)杂交于a)、b)或c)中定义的核酸分子之核酸分子的简并性序列。
4.权利要求3的分离的核酸分子，其中所述序列相同性是98%。
5.权利要求3的分离的核酸分子，其中所述序列相同性是100%。
6.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸是DNA。
7.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸是RNA。
8.权利要求1的分离的核酸分子，其中从基因组DNA分离所述核酸分子。
9.权利要求8的分离的核酸分子，其中所述基因组DNA是无乳链球菌(S.agalactiae) 基因组DNA。
10.包含权利要求1的核酸分子的载体。
11.权利要求10的载体，其中所述载体经改造适于权利要求1至9中任一项的核酸分 子编码的超免疫血清反应性抗原或其片段的重组表达。
12.包含权利要求10或11的载体的宿主细胞。
13.包含权利要求1_6、8和9中任一项的核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫血清反 应性抗原及其片段。
14.权利要求13的超免疫血清反应性抗原及其片段，其中所述氨基酸序列为SeqID No 475 或 Seq ID No 289。
15.超免疫血清反应性抗原的片段，其选自 包含表IA “推定的免疫原性氨基酸”和“鉴别的免疫原性区域的位置”纵栏的氨基 酸序列的肽、 表2的“氨基酸从”到“氨基酸至”纵栏中指定的血清反应性表位、 表4的“氨基酸从”到“氨基酸至”纵栏中指定的免疫原性表位、 包含表5的“推定的免疫原性氨基酸”和“鉴别的免疫原性区域的位置”纵栏的氨基 酸序列的肽、 表6的“氨基酸从”到“氨基酸至”的纵栏中指定的血清反应性表位、及 表7的“氨基酸从”到“氨基酸至”纵栏中指定的免疫原性表位。
16.权利要求15的超免疫血清反应性抗原的片段，其中所述包含表IA“推定的免疫 原性氨基酸”和“鉴别的免疫原性区域的位置”纵栏的氨基酸序列的肽是包含如下氨基酸 的肽Seq ID No 289 的 14-37，45-50，61-66，77-82，93-98，109-114，125-130，141-146， 157-162，173-178，189-194，205-210，221-226，237-242，253-258，269-274，285-290， 301-306,316-332，349-359，371-378，385-406，34-307 和 312-385。
17.权利要求15的超免疫血清反应性抗原的片段，其中所述表2的“氨基酸从”到“氨 基酸至”纵栏中指定的血清反应性表位是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 289的37_59。
18.权利要求15的超免疫血清反应性抗原的片段，其中所述表4的“氨基酸从”到“氨 基酸至”纵栏中指定的免疫原性表位是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 289的314-384。
19.权利要求15的超免疫血清反应性抗原的片段，其中所述包含表5的“推定的免疫 原性氨基酸”和“鉴别的免疫原性区域的位置”纵栏的氨基酸序列的肽是包含如下氨基酸 的肽Seq ID No 475 的 4-26，35-41，53-61，73-84，103-108，114-120，140-146，156-162， 192-208，214-219，227-233，239-252，260-268，284-297，1-48 和 113-133。
20.权利要求15的超免疫血清反应性抗原的片段，其中所述表6的“氨基酸从”到“氨基 酸至”的纵栏中指定的血清反应性表位是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 475的115-132 和 1-26。
21.权利要求15的超免疫血清反应性抗原的片段，其中所述表7的“氨基酸从”到“氨 基酸至”纵栏中指定的免疫原性表位是包含如下氨基酸的肽Seq ID No 475的115-132和 1-47。
22.生产权利要求13或14的无乳链球菌超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中 任一项的无乳链球菌超免疫血清反应性抗原的片段的方法，包括表达权利要求1至9中任 一项的核酸分子。
23.生产表达权利要求13或14的无乳链球菌超免疫血清反应性抗原或权利要求 15-21中任一项的无乳链球菌超免疫血清反应性抗原的片段的细胞的方法，包括用权利要 求10或权利要求11的载体转化或转染合适的宿主细胞。
24.药用组合物，包含权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中 任一项的超免疫血清反应性抗原的片段或权利要求1至9中任一项的核酸分子。
25.权利要求24的药物组合物，特征在于它进一步包含免疫刺激物质。
26.权利要求25的药物组合物，其中所述免疫刺激物质选自聚阳离子聚合物、免疫刺 激脱氧核苷酸(ODN)、包含至少两个LysLeuLys基序的肽、神经活性化合物、明矾、弗氏完全 或不完全佐剂或其组合。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述聚阳离子聚合物是聚阳离子肽。
28.权利要求26的药物组合物，其中所述神经活性化合物是人生长激素。
29.权利要求24-28中任一项的组合物，其中所述药物组合物是疫苗。
30.权利要求1至9中任一项的核酸分子或权利要求13或14的超免疫血清反应性抗 原或权利要求15-21中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段用于制备药物制品的用途。
31.权利要求30的用途，其中所述药物制品是抗无乳链球菌感染的疫苗。
32.抗体或至少其有效部分，所述抗体至少结合权利要求13或14的超免疫血清反应性 抗原或权利要求15-21中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段的选择性部分。
33.权利要求32的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
34.权利要求32或33的抗体，其中所述有效部分包含Fab片段。
35.权利要求32的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
36.权利要求32的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
37.杂交瘤细胞系，其产生至少结合权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利 要求15-21中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段的选择性部分的抗体或至少其有效 部分。
38.产生权利要求32的抗体的方法，特征在于下面的步骤 通过给予非人的动物权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21 中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段而引发所述动物的免疫反应， 从所述动物移出含有抗体的体液，以及 通过对所述含有抗体的体液进行进一步的纯化步骤而产生所述抗体。
39.产生权利要求32的抗体的方法，特征在于下面步骤 通过给予非人的动物权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21 中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段而引发所述动物的免疫反应， 从所述动物移出脾或脾细胞， 产生所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞， 挑选并克隆特异于所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血清反应性抗原的片 段的杂交瘤细胞， 通过所述克隆杂交瘤细胞的培养和可选的进一步的纯化步骤产生所述抗体。
40.权利要求32的抗体用于制备治疗或预防无乳链球菌感染的药物的用途。
41.拮抗剂，其结合权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中任 一项的超免疫血清反应性抗原的片段。
42.鉴别能够结合权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中任 一项的超免疫血清反应性抗原的片段的拮抗剂的方法，包括a)在允许候选拮抗剂与分离的或固定化的权利要求13或14中任一项的超免疫血清反 应性抗原或权利要求15-21中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段结合的条件下，在能 提供响应于所述候选拮抗剂与所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血清反应性抗原 的片段结合的可检测信号的组分的存在下，将所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血 清反应性抗原的片段与所述候选拮抗剂接触；以及b)检测响应于所述拮抗剂与所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血清反应性抗 原的片段的结合产生的信号的存在与否。
43.鉴别能够降低或抑制权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求 15-21中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段与其相互作用伴侣之相互作用活性的拮抗 剂的方法，包括a)提供权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中任一项的超免 疫血清反应性抗原的片段，b)向所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血清反应性抗原的片段提供相互作用 伴侣，c)允许所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血清反应性抗原的片段与所述相互 作用伴侣相互作用以形成相互作用复合物，d)提供候选拮抗剂，e)允许候选拮抗剂和相互作用复合物之间发生竞争反应，f)测定候选拮抗剂是否抑制或降低所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血清反 应性抗原的片段与相互作用伴侣的相互作用活性。
44.权利要求43的方法，其中所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血清反应性抗 原的片段是权利要求32-36中任一项的抗体。
45.权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中任一项的超免疫 血清反应性抗原的片段的用途，用于所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血清反应性 抗原的片段的相互作用伴侣的分离和/或纯化和/或鉴别。
46.权利要求1-9中任一项的核酸序列或权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原 或权利要求15-21中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段用于制备诊断与权利要求13 或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中任一项的超免疫血清反应性抗原的片 段的表达相关的疾病的的药物的用途。
47.权利要求1至9中任一项的核酸序列或者权利要求13或14的超免疫血清反应性 抗原或权利要求15-21中任一项的超免疫血清反应性抗原的片段用于制备诊断细菌感染 的药物的用途。
48.权利要求47的用途，其中所述细菌感染是无乳链球菌感染。
49.权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中任一项的超免疫 血清反应性抗原的片段的用途，用于产生结合所述超免疫血清反应性抗原或所述超免疫血 清反应性抗原的片段的肽，其中所述肽选自抗促成素。
50.权利要求13或14的超免疫血清反应性抗原或权利要求15-21中任一项的超免疫 血清反应性抗原的片段用于功能性核酸制造的用途，其中所述功能性核酸选自适体和镜面 体。
51.权利要求1至9中任一项的核酸分子用于制备功能性核糖核酸的用途，其中功能性 核糖核酸选自核酶、反义核酸和siRNA。
全文摘要
本发明公开了编码超免疫血清反应性抗原或其片段和来自无乳链球菌的超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子、分离这样的抗原的方法及其特定用途。
文档编号A61K39/395GK101914552SQ20091022280
公开日2010年12月15日 申请日期2004年5月6日 优先权日2003年5月7日
发明者A·梅克, E·纳吉, M·汉纳, M·霍基, S·卡伦达, S·普拉斯托莫斯基 申请人:英特塞尔股份公司