专利名称：生长因子缓释型双层人工皮肤的制作方法
技术领域：
本发明属于医疗器械领域。更确切地说，本发明涉及一种用于皮肤损伤修复、且具
有相关生长因子缓释功能的人工皮肤及其制备方法。
背景技术：
皮肤不仅能使人不受到污物或细菌的侵袭，也能保持人体内的水分不致逃逸。皮肤作为覆盖和保护体表的重要组织器官，非常容易受到外伤、烧伤、炎症等因素的损害。当大面积的皮肤受到严重的烧伤或损害，医生必须立即输入液体并保护伤口，如果仅是皮肤的浅层受损，新皮肤会再生。如果病人受到了严重的烧伤，皮肤就不能靠自己修复，通常须将身体其他部位的表层皮肤移植到伤口上。 由于没有可替代的皮肤来源，治疗上多采用自体皮肤移植，如邮票植皮、网状植皮、嵌皮等方法——医生需要从他们身体其他部位取下一块完好的皮肤，重新植入创伤部位。尽管能治愈创面，但在取皮部位却留下了新的创伤，常常导致疤痕增生，甚至因过深取皮，供皮区难以自愈，形成水疱，反复溃疡，导致"好了旧伤又添新疤"。遇到大面积严重烧伤的病人，如果其正常皮肤所剩无几，缺乏自体皮肤及时封闭创面，常常引起创面及全身严重的感染等一系列并发症，严重时有可能危及生命。 为了修复、替代缺损的皮肤组织，各国科学家都致力于人造皮肤的研究，仅美国等少数国家掌握该项技术并实现产业化。国外已经产业化了一些人工皮肤产品，包括Integra、 AlloDerm、 Biobrane、 Dermagraft 等，亦有一些产品处于研发阶段，如ICX-SKN。但是这些产品很多是异体或异种皮经过加工处理得到的，存在着加工成本高，免疫排斥等问题。 国内经过十多年的研究，第四军医大学金岩教授项目组的一个产品进入产业化，
并于2007年获得医疗器械产品注册证书。目前已开始正式进入临床应用。 为了克服异种或异体皮原料的缺陷，采用仿生合成的方法并复合皮肤修复的相关
生长因子，开发新型的人工皮肤市场前景广阔，意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于皮肤损伤修复、且具有相关生长因子缓释功能的人工皮肤。 本发明的人工皮肤由表皮层和真皮层组成。 本发明的人工皮肤的表皮层，由与空气接触的表皮层上层和与真皮接触的表皮层下层构成，是微孔半渗透性的双层薄膜，具备防水、透气、保护真皮层的功能。表皮层的上下两层之间通过化学修饰，以此提高相互作用来实现两层的复合。 其中，与空气接触的表皮层上层的组成材料为聚氨酯、或硅橡胶、或聚乙二醇，或对苯二甲酸乙二醇酯等医用材料； 与真皮接触的表皮层下层是由丝素蛋白和壳聚糖组合构建的天然生物大分子薄膜制成。 天然生物大分子薄膜的制备方法如下
壳聚糖溶液和丝素蛋白溶液的配制
壳聚糖溶液的浓度为1% 3%的壳聚糖溶液，
丝素蛋白溶液的浓度为1% 5%的蛋白溶液。
配制方法 (1).壳聚糖溶液。取取一定量的去离子水或一定浓度的有机溶剂，溶解一定质量的壳聚糖，得到壳聚糖粘稠溶液，浓度为1% 3%。 (2).配制蛋白溶液。取一定量的去离子水或一定浓度的有机溶剂，溶解一定质量的丝素蛋白得到蛋白溶液。浓度为1% 5%。 将蛋白溶液/壳聚糖溶液混合，二者在混合溶液中的浓度范围分别是0.5% 5%和0. 5% -3%。 在模具里干燥，制成薄膜。 本发明的人工皮肤的真皮层是由胶原蛋白，多糖和负载生长因子的微球构成的。 其中的胶原蛋白是由I型胶原蛋白或III型胶原蛋白中的一种或两种的混合物， 多糖为透明质酸、或壳聚糖、或海藻酸，或葡聚糖中的一种或两种。
微球为生物缓释微球，所载的生长因子为表皮细胞生长因子(EGF)、或重组表皮
细胞生长因子(RHEGF)、或真皮细胞生长因子(DGF)、或重组真皮细胞生长因子(RHDGF)中
的一种或两种。
真皮层的载生长因子的微球的制备步骤如下 (1)将多糖与生长因子在水中混合，制备多糖/生长因子溶液， (2)将多糖/生长因子溶液滴入生物相容性好的交联剂溶液中，在交联剂的作用
下，多糖/生长因子溶液的液滴固化成球，然后过滤和干燥，得到载生长因子的微球。
其中交联剂溶液选自多聚磷酸钠、或氯化钙、或柠檬酸钙、或甘油磷酸钠中的一种。 本发明的人工皮肤的制备方法，其中表皮层制备步骤是
(1)、将上层的一面用硫酸或硝酸或盐酸修饰。 (2)、在模具中加入丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液，二者在混合溶液中的浓度范围分别是0.5% 5%和0.5% _3%。，经过梯度干燥，制备出均匀的丝素蛋白和壳聚糖的薄膜，该层薄膜呈微孔结构，孔的尺寸在20 100微米之间。 (3)、将上述(1)所制备的修饰过的上层与(2)所制备的下层通过施加一定的压力
复合制备得到表皮层，并用醇溶液固化。 真皮层的载生长因子微球的制备步骤是 (1)将海藻酸，壳聚糖或葡聚糖中一种多糖与选取的生长因子在水中混合制备出多糖/生长因子溶液，多糖的浓度范围为0. 5% 10%，生长因子的浓度为5 50ug/ml。
(2)将多糖/生长因子溶液滴入生物相容性好的交联剂溶液中，在交联剂的作用下，多糖/生长因子溶液的液滴固化成球，然后过滤和干燥，得到载生长因子的微球。
本发明的人工皮肤的表皮层和真皮层的复合步骤如下 (1)将胶原蛋白、多糖和载生长因子的微球在水中混合制备得到三者的混合液，其中胶原蛋白的浓度为0. 5% 30%，多糖的浓度为0. 1% 10%，微球的浓度为0.01 0. 2%。
(2)将混合液喷涂在表皮层上，然后冷冻干燥，真皮层的厚度由涂覆和冷冻干燥次数决定，可根据需要进行调整。即制备出载有生长因子的人工皮肤。
本发明最优选的制备方法在实施例中。 本发明的人工皮肤具备缓释相关生长因子的功能，厚度在O. 5 1. 5毫米之间，可
根据需要调整厚度。 本发明的人工皮肤具有很好的缓释功能，缓释周期3-4周，3周后生长因子释放完80%。 本发明的人工皮肤与现有技术相比具有防水性好，透气性好，修复性强，排斥性小，具有缓释功能，成本低廉，制备方法简单，适合大规模生产。
具体实施例方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的人工皮肤，但不起到限制作用。
实施例1、人工皮肤
表皮层制备 (1)、将聚氨酯上层的一面用棉签涂覆一层浓硫酸，放置2小时，清洗干净。 (2)、在模具中加入丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液，二者在混合溶液中的浓度分别
是4%和1%。 经过梯度干燥，制备出均匀的丝素蛋白和壳聚糖薄膜，该层薄膜呈微孔结构。
(3)、将上述两层薄膜通过施压复合制备得到表皮层，并用甲醇液固化，真空干燥，除去甲醇。
真皮层的载生长因子微球的制备步骤 (4)将3%海藻酸溶液与生长因子EGF相混合制备海藻酸/EGF溶液，生长因子的浓度为30ug/ml。 (5)将海藻酸/EGF溶液滴入0. 1M/ml氯化钙溶液中，液滴迅速固化成微球，然后过
滤，冷冻干燥，得到载生长因子的微球。 人工皮肤的表皮层和真皮层的复合步骤 (6)将胶原蛋白、壳聚糖和载生长因子的微球在水中混合制备得到三者的混合液，其中I型胶原蛋白的浓度为3%， III型胶原蛋白的浓度为1%，壳聚糖的浓度1%，微球的浓度为0.2%。 (7)将混合液喷涂在表皮层上，然后冷冻干燥，涂覆和冷冻干燥5次，制备出载生长因子EGF的人工皮肤，厚度为0. 70±0. 1毫米。
实施例2、人工皮肤
表皮层制备 (1)、将硅橡胶上层的一面用棉签涂覆一层浓硫酸，放置1小时，清洗干净。 (2)、在模具中加入丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液，二者在混合溶液中的浓度分别
是3%和1% 经过梯度干燥，制备出均匀的丝素蛋白/壳聚糖薄膜，该层薄膜呈多孔结构。
(3)、将上述两层薄膜通过施压复合制备得到表皮层，并用甲醇液固化，然后真空干燥，除去甲醇。
真皮层的载生长因子微球的制备步骤 (4)将1%海藻酸溶液与生长因子EGF相混合制备海藻酸/EGF溶液，生长因子的浓度为30ug/ml。 (5)将海藻酸/EGF因子溶液滴入0. 1M/ml氯化钙溶液中，液滴迅速固化成球，然后
过滤，冷冻干燥，得到载生长因子的微球。 人工皮肤的表皮层和真皮层的复合步骤 (6)将胶原蛋白、透明质酸和载生长因子的微球在水中混合，制备得到三者的混合液，其中I型胶原蛋白的浓度为4 % ， 111型胶原蛋白的浓度为1 % ，透明质酸的浓度0. 5 % ，微球的浓度为0.2%。 (7)将混合液喷涂在表皮层上，然后冷冻干燥，涂覆和冷冻干燥8次，制备出载有生长因子的人工皮肤，厚度为0. 85±0. 1毫米。
实施例3、人工皮肤
表皮层制备 (1)、将硅橡胶上层的一面用棉签涂覆一层浓硫酸，放置1小时，清洗干净。 (2)、在模具中加入丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液，二者在混合溶液中的浓度分别
是5%和3%。 经过梯度干燥，制备出均匀的丝素蛋白/壳聚糖薄膜，该层薄膜呈多孔结构。
(3)、将上述两层薄膜通过施压复合制备得到表皮层，并用甲醇液固化，然后真空干燥，除去甲醇。 真皮层的载生长因子微球的制备步骤 (4)将1%海藻酸溶液与生长因子EGF相混合制备海藻酸/EGF溶液，生长因子的浓度为30ug/ml。 (5)将海藻酸/EGF因子溶液滴入0. 1M/ml氯化钙溶液中，液滴迅速固化成球，然后
过滤，冷冻干燥，得到载生长因子的微球。 人工皮肤的表皮层和真皮层的复合步骤 (6)将胶原蛋白、葡聚糖和载生长因子的微球在水中混合，制备得到三者的混合液，其中I型胶原蛋白的浓度为0. 2 % ， 111型胶原蛋白的浓度为0. 3 % ，葡聚糖的浓度0. 1%，微球的浓度为0. 1%。 (7)将混合液喷涂在表皮层上，然后冷冻干燥，涂覆和冷冻干燥8次，制备出载有生长因子的人工皮肤，厚度为0. 85±0. 1毫米。
实施例4、人工皮肤
表皮层制备 (1)、将硅橡胶上层的一面用棉签涂覆一层浓硫酸，放置1小时，清洗干净。 (2)、在模具中加入丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液，二者在混合溶液中的浓度分别
是3%和1%。 经过梯度干燥，制备出均匀的丝素蛋白和壳聚糖薄膜，该层薄膜呈多孔结构。
(3)、将上述两层薄膜通过施压复合制备得到表皮层，并用甲醇液固化，然后真空干燥，除去甲醇。
真皮层的载生长因子微球的制备步骤 (4)将1%海藻酸溶液与生长因子EGF相混合制备海藻酸/EGF溶液，生长因子的 浓度为30ug/ml。 (5)将海藻酸/EGF因子溶液滴入0. 1M/ml氯化钙溶液中，液滴迅速固化成球，然后
过滤，冷冻干燥，得到载生长因子的微球。 人工皮肤的表皮层和真皮层的复合步骤 (6)将胶原蛋白、壳聚糖和载生长因子的微球在水中混合，制备得到三者的混合 液，其中I型胶原蛋白的浓度为20%， III型胶原蛋白的浓度为10%，壳聚糖的浓度10%， 微球的浓度为0.01%。 (7)将混合液喷涂在表皮层上，然后冷冻干燥，涂覆和冷冻干燥8次，制备出载有 生长因子的人工皮肤，厚度为0. 85±0. 1毫米。
权利要求
一种人工皮肤，由表皮层和真皮层组成，其特征在于，表皮层由与空气接触的上层和与真皮接触的下层的微孔半渗透性双层薄膜构成，与空气接触的上层的材质为聚氨酯、或硅橡胶、或聚乙二醇，或对苯二甲酸乙二醇酯等医用材料；与真皮接触的下层是丝素蛋白和壳聚糖构建的天然生物大分子薄膜。
2. 根据权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于，其中下层中的天然生物大分子薄膜 的制备方法如下壳聚糖溶液和蛋白溶液的配制， 壳聚糖溶液的浓度为1% 3%的壳聚糖溶液， 丝素蛋白溶液的浓度为1% 5%的蛋白溶液， 配制方法(1) .壳聚糖溶液，取取一定量的去离子水或一定浓度的有机溶剂，溶解一定质量的壳 聚糖，得到壳聚糖粘稠溶液，浓度为1% 3%，(2) .配制蛋白溶液，取一定量的去离子水或一定浓度的有机溶剂，溶解一定质量的丝 素蛋白得到蛋白溶液，浓度为1% 5%，将蛋白溶液/壳聚糖溶液混合，二者在混合溶液中的浓度范围分别是0. 5% 5%和 0. 5 % -3 % ，在模具中干燥，制成薄膜。
3. 根据权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于，真皮层是由胶原蛋白，多糖和载生长 因子微球构成的。
4. 根据权利要求3所述的人工皮肤，其特征在于，胶原蛋白是由I型胶原蛋白或III型胶原蛋白中的一种或两种的混合物，多糖为透明质酸、或壳聚糖、或海藻酸，或葡聚糖等 中的一种或两种，生长因子为表皮细胞生长因子、或重组表皮细胞生长因子、或真皮细胞 生长因子、或重组真皮细胞生长因子中的一种或两种。
5. 根据权利要求4所述的人工皮肤，其特征在于，真皮层的载生长因子微球的制备步骤如下(1) 将多糖与生长因子在水中混合，制备多糖/生长因子溶液，(2) 将多糖/生长因子溶液滴入生物相容性好的交联剂溶液中，在交联剂的作用下，多 糖/生长因子溶液的液滴固化成球，然后过滤和干燥，得到载生长因子的微球，其中交联剂 溶液选自多聚磷酸钠、或氯化钙、或柠檬酸钙、或甘油磷酸钠中的一种。
6. 权利要求1所述的人工皮肤的制备方法，其特征在于，具体步骤如下 表皮层制备步骤是(1) 、将上层的一面用硫酸或硝酸或盐酸修饰；(2) 、在模具中加入丝素蛋白和壳聚糖混合溶液，二者在混合溶液中的浓度范围分别是 0. 5% 5%和0. 5% -3%，经过梯度干燥，制备出均匀的丝素蛋白和壳聚糖的薄膜，该层薄膜呈微孔结构，孔的尺 寸在20 100微米之间；(3) 、将上述(1)所制备的修饰过的上层与(2)所制备的下层通过施加一定的压力复合 制备得到表皮层，并用醇溶液固化；真皮层的载生长微球的制备步骤如下(1)将多糖与选取的生长因子在水中混合制备出多糖/生长因子溶液，多糖的浓度范围为0. 5% 10%，生长因子的浓度为5 50ug/ml ;(2)将多糖/生长因子溶液滴入生物相容性好的交联剂溶液中，在交联剂的作用下，多糖/生长因子溶液的液滴固化成球，然后过滤和干燥，得到载生长因子的微球；
7. 权利要求1所述的人工皮肤的制备方法，其特征在于，人工皮肤的表皮层和真皮层的复合步骤如下(1) 将胶原蛋白、多糖和载生长因子的微球在水中混合制备得到三者的混合液，其中胶原蛋白的浓度为O. 5% 30%，多糖的浓度为0. 1% 10%，微球的浓度为0.01 0. 2% ;(2) 将混合液喷涂在表皮层上，然后冷冻干燥，真皮层的厚度由涂覆和冷冻干燥次数决定，可根据需要进行调整；即制备出载有生长因子的人工皮肤。
8. 根据权利要求9所述的人工皮肤的制备方法，其特征在于，具体步骤如下表皮层制备(1) 、将聚氨酯上层的一面用棉签涂覆一层浓硫酸，放置2小时，清洗干净，(2) 、在模具中加入丝素蛋白和壳聚糖混合溶液，二者在混合溶液中的浓度分别是4%和1 % ，经过梯度干燥，制备出均匀的丝素蛋白和壳聚糖薄膜，该层薄膜呈微孔结构，(3) 、将上述两层薄膜通过施压复合制备得到表皮层，并用甲醇液固化，真空干燥，除去甲醇，真皮层的载生长因子微球制备步骤(4) 将3%海藻酸溶液与生长因子EGF相混合制备海藻酸/EGF溶液，生长因子的浓度为30ug/ml，(5) 将海藻酸/EGF溶液滴入0. 1M/ml氯化钙溶液中，液滴迅速固化成微球，然后过滤，冷冻干燥，得到载生长因子的微球。
9. 权利要求1所述的人工皮肤的制备方法，其特征在于，人工皮肤的表皮层和真皮层的复合步骤如下(1) 将胶原蛋白、多糖和载生长因子的微球在水中混合制备得到三者的混合液，其中I型胶原蛋白的浓度为3%， III型胶原蛋白的浓度为1%，壳聚糖的浓度1%，微球的浓度为0. 2%，(2) 将混合液喷涂在表皮层上，然后冷冻干燥，涂覆和冷冻干燥5次，制备出载生长因子EGF的人工皮肤，厚度为0. 70±0. l毫米。
10. 根据权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于，表皮层制备(1) 、将聚氨酯上层的一面用棉签涂覆一层浓硫酸，放置2小时，清洗干净，(2) 、在模具中加入丝素蛋白和壳聚糖的混合溶液，二者在混合溶液中的浓度分别是4%和1%，经过梯度干燥，制备出均匀的丝素蛋白和壳聚糖薄膜，该层薄膜呈微孔结构，(3) 、将上述两层薄膜通过施压复合制备得到表皮层，并用甲醇液固化，真空干燥，除去甲醇，真皮层的载生长因子微球的制备步骤(4) 将3%海藻酸溶液与生长因子EGF相混合制备海藻酸/EGF溶液，生长因子的浓度为30ug/ml，(5) 将海藻酸/EGF溶液滴入0. 1M/ml氯化钙溶液中，液滴迅速固化成微球，然后过滤，冷冻干燥，得到载生长因子的微球。人工皮肤的表皮层和真皮层的复合步骤(6) 将胶原蛋白、壳聚糖和载生长因子的微球在水中混合制备得到三者的混合液，其中I型胶原蛋白的浓度为3%， III型胶原蛋白的浓度为1%，壳聚糖的浓度1%，微球的浓度为0. 2%，(7) 将混合液喷涂在表皮层上，然后冷冻干燥，涂覆和冷冻干燥5次，制备出载生长因子EGF的人工皮肤，厚度为0. 70±0. 1毫米。
全文摘要
本发明涉及一种用于皮肤损伤修复、且具有相关生长因子缓释功能的生长因子缓释型双层人工皮肤及其制备方法，该人工皮肤分为表皮层和真皮层两层，其中表皮层是由具备防水、透气、保护真皮的微孔双层薄膜构成，与空气接触的上层的材质为聚氨酯、或硅橡胶、或聚乙二醇，或对苯二甲酸乙二醇酯等医用材料；与真皮接触的下层是丝素蛋白和壳聚糖构建的天然生物大分子薄膜，人工皮肤的真皮层是由胶原蛋白、多糖和载皮肤再生和修复相关生长因子的微球构成的，微球具有很好的缓释功能，缓释周期等于或稍长于胶原蛋白和多糖的降解周期，能与皮肤再生修复周期相匹配，该人工皮肤的厚度在0.5～1.5毫米之间，可根据需要调整厚度。
文档编号A61L27/54GK101716376SQ200910223208
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者佘振定, 王明波, 谭荣伟 申请人:佘振定