专利名称：：一种低分子灵芝多糖的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种赤灵芝多糖的制备方法，尤其涉及一种低分量子灵芝多糖的制备方法。
背景技术：
：灵芝是中医药学宝库中的珍品，属担子菌纲，多孔菌科，灵芝属，在我国有两千多年的药用史，国内外的大量研究结果表明，灵芝具有广泛的药理作用，且毒性低。灵芝化学成分复杂，主要有多糖类、核苷类、呋喃类、三萜类、生物碱、氨基酸、及微量元素。其中灵芝多糖是其扶正固本的有效成分，具有抗肿瘤作用。灵芝大分子多糖成分的免疫调节的左右已有大量的研究报道，并可通过提高机体的免疫功能而达到抗癌作用，是抗癌作用的有效成分。但往往一种职务或真菌中含有多种多糖成分，分子量大小也各不相同，其活性也各不相同，灵芝中也含有不同的分子量段的多糖成分，为提高多糖的效果，须先将无活性或活性不高的成分去除，富集有活性的多糖部分。目前已报道的具有抗肿瘤作用的灵芝多糖分子量绝大多数为高分子量(分子量为几万到几十万)多糖，对低分子量灵芝多糖的抗肿瘤研究较少。从灵芝中分类提取水溶性多糖目前普遍采用乙醇分步沉淀法，但得到的多糖杂质多，有效成分含量低，特异性不高。如进一步采用不同浓度的乙醇分步沉淀来纯化，选择性较差，回收率低，得到多糖含量在30%左右，且是多糖的混合物，同时需要使用大量的有机溶剂，提高了成本。中国专利CN1448409(2003)通过提取制备方法制备得到了分子量为4000-6000的赤灵芝多糖G1JV该发明方法中所得的低分子量的赤灵芝多糖分子量在6000以下，主要由GLPU和G1J\2组成，单一赤灵芝多糖GLPU和G1J\2的分子量分别为4100和5700，分子量较小，水溶性好，粘度低，易于制成各种剂型，给药方便。初步的药效结果表明GLPu和GLP^是很有的潜力的抗肿瘤药物。该发明方法中，低分子灵芝多糖的制备是水提物通过去除蛋白和透析后得到，但工艺复杂，需要加入氯仿和正丁醇等有机溶剂，不易工业化生产。因此，为制备分子量为4000-6000的赤灵芝多糖G1J\，解决现有技术存在的多糖纯度低、特异性不高、成本高、难以工业化化生产的问题，本发明人发现本发明的赤灵芝低分子多糖可以解决上述问题。
发明内容本发明索要解决的技术问题在提供一种低分子量灵芝多糖的制备方法，以克服现有技术中提取的多糖纯度低、特异性不高、成本高、难以工业化化生产的缺点。本发明提供一种低分子灵芝多糖的制备方法，包括如下步骤1.粉碎赤灵芝子实体(干品)经粉碎机粉碎成粉末。2.水提取称取赤灵芝子实体粉，加15-20倍的水，IO(TC提取10-20h，离心得提取液，保留，残渣加15-20倍水，IO(TC提取10-20h，离心得提取液，合并两次提取液。3.浓縮提取液浓縮至原体积的1/5±10%。4.分级丙酮沉向浓縮液中缓慢加丙酮，边加边搅拌，至含酮量35-40%，室温静置12h24h，吸取上清液(保留)，下层沉淀液离心得清液，合并上清液，加丙酮，边加边搅拌，至含酮量达到65-70%，10-15t:静置12h24h，吸取上清液，下层经离心得多糖沉淀。5.离心干燥多糖沉淀以丙酮洗涤两次，置真空恒温干燥箱4(TC干燥。本发明在进行沉淀的过程中，发现用常规的甲醇进行醇沉最后得到的灵芝多糖粗品糖含量较低、有效成分偏低、活性偏低，并且溶剂使用量很大，不适于工业化生产。通过上本发明的制备方法可获得质量稳定、有效成分含量高，且平均分子量被严格控制在4000-6000的灵芝多糖成分，本方法不仅保持了多糖的抗肿瘤活性，而且且多糖提取率高，100g子实体粉可提取得到5.5g以上的多糖粗品，即收率为55%，而按照CN1448409的方法提取得到的多糖粗品收率都在5g以下，即收50%以下；另外灵芝多糖的含量得到了提高，多糖含量超过60X，而按照CN1448409的方法提取得到的多糖粗品含量都在50%以下；同时，本发明中仅用到丙酮作为有机溶剂，而且用量大大减少。所以本制备方法是一种简便、快速、高效、成本低、步骤少、无污染、多糖纯度高的适合工业化生产的方法。以甲醇作为提取溶剂的工艺研究内容如下A.提取工艺条件的选择低分子灵芝多糖的提取工艺与提取次数，温度，提取时间，浸提比(即加水倍数)有密切关系。为了选择最佳提取条件，以灵芝多糖的收率，多糖含量为考察指标，通过设计四因素，三水平正交表，选用L9(34)正交表，进行正交实验，确定低分子灵芝多糖的最佳提取条件。表1多糖提取影响因素与水平表影响冈素水平A提取次数B提取温度c提取时间D浸提比(次)(°C)(h)(倍数)I155710II2801120m31001525表2低分子灵芝多糖提取正交试验L9(34)配方及直观分析结果4试验组号ABCD收率(％)糖含量(％)11557100.6229.5221801200.8037.79110015251.25241,0945511250.82635.2628015101.26045.1061007200.卯436.52735515201.41646.918807251.26038.469310011152.04848.02Ii138.40121.69114.50134.60多糖n,126.88121.35143.03141.22A3B3C3D2含量in,145.35147.59153.1124.81Ri6,018.2312.232.01C>B>A>Dij2.0722.3622.1843.128多糖产3.302.8203.0742.820A3B3C3D,率(％)叫4.2243.5643.4282.8380.6510.3140.2810.201A>B>C>D从&值来看Rc>RB>RA>RD，从I丄，11^11^来看，最佳组合为A3B3C3D:从Rj值来看RA>RB>Rc>RD，从Ij，IIj，IIIj来看，最佳组合为A3B3C3D对上述结果进行方差分析，见表3，4。表3低分子灵芝多糖糖含量方差分析结果方差来源离差平方和自由度均方F值PA97.42247.224.360.01<P<0.05B94.40248.7123.600.01<P<0.05C233.45116.758.370.01<P<0.05D26.19213.106.55P>0.1误差SE=SD+SC=259.6448.697由直观分析以及方差分析可以看出影响糖含量的因素大小分别为C>B>A>D，即提取时间>提取温度>提取次数>浸提比。由实验结果确定低分子灵芝多糖最佳提取条件为A3B3C3D2，即20倍水，IO(TC提取14小时，共提取三次。表4低分子灵芝多糖收率方差分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由直观分析以及方差分析可以看出，影响低分子灵芝多糖产品收率的因素大小分别为A>B>C>D，即提取次数>提取温度>提取时间>浸提比。由实验结果确定灵芝多糖最佳提取条件为A^^A,即15倍水，IO(TC提取15小时，共提取三次。综合上述两种结果，无论以糖含量还是以多糖收率为考察指标，浸提比对结果影响都最小，考虑工业生产上的可行性与节约能源的原则，选取A3B3C3D1为最优提取条件，即20倍水，IO(TC提取15小时，共提取两次。B.浓縮比例考察醇沉中，醇的用量主要与多糖提取液体积密切相关，在影响多糖提取的多种因素中，浓縮比对多糖得率的影响最小，在生产中，可以适当增加浓縮比，减少甲醇用量，降低成本，因此，在醇沉前对浓縮比例做了考察。取灵芝多糖水提液3份，分别编号1，2，3，分别浓縮至原体积的1/3，1/8倍，1/20倍，用甲醇分级沉淀，离心得沉淀，干燥，测定低分子灵芝多糖收率，糖含量。表5醇沉前浓縮比例考察结果编号_1_^_3浓缩比例1/31/81/20多糖收率(％)2.052.463.01糖含量(％)_40.84_39.32_28.84试验结果表明，随着浓縮比的增大，多糖收率增加，但产品多糖含量减少。如果再增大浓縮比，多糖浓度太大，沉淀的多糖体会包裹沉淀剂和杂质一起沉淀，形成大块胶状物，难以再溶，给后续工作造成困难。因此，为降低醇沉成本，根据试验结果选择醇沉前浓縮比为提取液体积的1/8为较为适宜。C.多批试验结果分析采用上述优化条件进行多糖的提取共四批，实验所得的数据比较接近，但是含表6多批实验的结果批次投料(g)多糖(g)收率(％)糖含量(％)X011002.86012.8636.30X021003.02193.0238.17X031002.99282.9238.76X041003.07363.0737.41平均值//2.9737.66从以上数据可以看出，利用甲醇作为提取溶剂，糖收率低，有机溶剂使用量大，不适合工业化生产。具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1多糖含量检测蒽酮硫酸比色法试剂配制蒽酮溶于硫酸中，浓度为2mg/ml，当日配制使用。葡萄糖对照品溶液配制取干燥恒重的无水葡萄糖适量，加水制成每1ml约含0.lmg葡萄糖，即得。标准曲线的绘制:分别量取葡萄糖对照品溶液O，O.l，O.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml置带塞试管中，补足蒸馏水至1ml，加蒽酮试剂4ml，混匀，沸水浴煮10min。冷却后以0管空白对照，测定620nm处的吸光度。以吸光度A对葡萄糖浓度C作图得标准曲线。样品糖含量测定取约15mg样品，精密称定，加水溶解，用水定容至50ml。量取0.5ml样品溶液，加0.5ml蒸馏水，如上法测定，再由回归方程算出相应浓度，计算得样品糖利用本发明方法制备得到的多糖含量均在60以上。而利用专利申请CN1448409所述的方法制备得到的多糖的含量均在50%以上。实施例2:低分子灵芝多糖的制备1.粉碎灵芝子实体(干品)500g经粉碎机粉碎成粉末。2.水提取称取灵芝子实体粉100g，加1.5L水，IO(TC提取15h，离心得提取液，保留，残渣加1.5L水，10(TC提取10h，离心得提取液，合并两次提取液。3.浓縮提取液减压浓縮至原体积的1/5，约700ml。4.分级丙酮沉向浓縮液中缓慢加丙酮，边加边搅拌，至含酮量35-40%，室温静置114h，吸取上清液(保留)，下层沉淀液离心得清液，合并上清液，加丙酮，边加边搅拌，至含酮量达到65-70%，10-15t:静置14h，吸取上清液，下层经离心得多糖沉淀。5.离心干燥经离心得到的多糖沉淀以丙酮洗涤两次，置真空恒温干燥箱4(TC干燥。多糖重量为6.5g，糖含量为65X。实施例3:低分子灵芝多糖的制备1.粉碎灵芝子实体(干品)1.5kg经粉碎机粉碎成粉末。2.水提取称取灵芝子实体粉lkg，加20kg的水，IO(TC提取20h，离心得提取液，保留，残渣加20kg水，IO(TC提取20h，离心得提取液，合并两次提取液。3.浓縮提取液减压浓縮至原体积的1/5，约8kg。4.分级丙酮沉向浓縮液中缓慢加丙酮，边加边搅拌，至含酮量35-40%，室温静置24h，吸取上清液(保留)，下层沉淀液离心得清液，合并上清液，加丙酮，边加边搅拌，至含酮量达到65-70%，10-15t:静置18h，吸取上清液，下层经离心得多糖沉淀。5.离心干燥经离心得到的多糖沉淀以丙酮洗涤两次，置真空恒温干燥箱4(TC干燥。多糖重量为75g，糖含量为68X。实施例4:低分子灵芝多糖的制备1.粉碎灵芝子实体(干品)2.Okg经粉碎机粉碎成粉末。2.水提取称取灵芝子实体粉1.5kg，加28kg的水，10(TC提取20h，离心得提取液，保留，残渣加28kg水，10(TC提取18h，离心得提取液，合并两次提取液。3.浓縮提取液减压浓縮至原体积的1/5，约12kg。4.分级丙酮沉向浓縮液中缓慢加丙酮，边加边搅拌，至含酮量35-40%，室温静置21h，吸取上清液(保留)，下层沉淀液离心得清液，合并上清液，加丙酮，边加边搅拌，至含酮量达到65-70%，10-15t:静置17h，吸取上清液，下层经离心得多糖沉淀。5.离心干燥经离心得到的多糖沉淀以丙酮洗涤两次，置真空恒温干燥箱4(TC干燥。多糖重量为120g，糖含量为67X。实施例4:本发明的赤灵芝多糖粗品GLPJ编号F1)的活性研究及与根据CN1448409方法制备的赤灵芝多糖粗品GLPJ编号F2)的对比(对实体荷瘤小鼠肿瘤(B16BL6)生长的抑制作用。取C57BL6)小鼠70只，随机分为7组，每组10只，分为Fl组(0.1，0.2，0.4g/kg)，F2组(0.l，O.2，0.4g/kg)，模型组(等提及NS)，灌胃给药。以0.25%胰腺酶消化贴壁生长良好的B1BL6黑色素瘤细胞，加培养液800rpm离心弃上清，再以无血清培养基混悬肿瘤细胞，调整细胞数。然后于每只小鼠右侧腹沟皮下处接种肿瘤细胞悬液0.2ml(约106个)，接种次日开始灌胃给药，连续20天，每日观察记录小鼠腹股沟皮下处肿瘤生长情况、小鼠活动状态以及小鼠死亡情况。给药结束后处死小鼠，剥取分离瘤组织，以电子天平承重，记录瘤重，计算抑瘤率。抑瘤率=1-给药组瘤重/模型组瘤重)*100%两种方法制备出来的GLP^对实体(B16BL)荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用)(X士SD)如下表所示:8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*P<0.05，**P<0.01由上述数据可看出，本发明得到的低分子灵芝多糖的抑瘤活性要优于根据CN1448409方法制备的低分子灵芝多糖。通过以上数据，表明通过上本发明的制备方法可获得质量稳定、有效成分含量高，且平均分子量被严格控制在4000-6000的灵芝多糖成分，本方法不仅保持了多糖的抗肿瘤活性，而且且多糖提取率高，含量高，本发明中仅用到丙酮作为有机溶剂，而且用量大大减少。所以本制备方法是一种简便、快速、高效、成本低、步骤少、无污染、多糖纯度高的适合工业化生产的方法。权利要求一种低分子灵芝多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤粉碎，水提取，浓缩，分级丙酮沉，离心干燥。2.根据权利要求1所述的低分子灵芝多糖的制备方法，其特征在于所述的粉碎是将赤灵芝子实体干品经粉碎机粉碎成粉末。3.根据权利要求1所述的低分子灵芝多糖的制备方法，其特征在于所述的水提取是通过以下步骤完成的称取赤灵芝子实体粉，加15-20倍的水，IO(TC提取10-20h，离心得提取液，保留，残渣加15-20倍水，10(TC提取10-20h，离心得提取液，合并两次提取液。4.根据权利要求1所述的低分子灵芝多糖的制备方法，其特征在于所述的浓縮是将水提取液浓縮至原体积的1/5±10%。5.根据权利要求l所述的低分子灵芝多糖的制备方法，其特征在于所述的分级丙酮沉与离心干燥是通过以下步骤完成的向浓縮液中缓慢加丙酮，边加边搅拌，至含酮量35-40%，室温静置12h24h，吸取上清液(保留)，下层沉淀液离心得清液，合并上清液，加丙酮，边加边搅拌，至含酮量达到65-70%，10-15t:静置12h24h，吸取上清液，下层经离心、干燥，得多糖沉淀。全文摘要本发明主要涉及一种低分子灵芝多糖的制备方法，尤其涉及一种低分子赤灵芝多糖的制备方法。该方法通过粉碎、水提取、浓缩、分级丙酮沉、离心干燥完成。本发明的低分量子灵芝多糖的制备方法本一种简便、快速、高效、成本低、步骤少、无污染、多糖纯度高的适合工业化生产的方法。文档编号A61P35/00GK101704903SQ20091023425公开日2010年5月12日申请日期2009年11月18日优先权日2009年11月18日发明者叶海,张陆勇,曹芳,李纬,江振洲,黄芳华申请人:中国药科大学