专利名称：川芎或其提取物在制备延缓衰老产品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及川芎或其提取物延缓衰老的新用途，特别涉及川芎或其提取物在制备 延缓衰老产品中的应用。
背景技术：
随着人口老龄化形势日趋严峻，衰老机制、延缓衰老药物研究已经成为生命科学 的热点和重点问题。衰老的机制复杂、学说繁多，迄今为止，解释衰老机理的理论或学说 多达200余种，其中包括遗传控制说、细胞端粒说、自由基损伤说、体细胞突变说、免疫紊 舌L说、线粒体损伤学说等(Fossel M. Cell Senescence in HmanAging and Disease. In Harman D. (Ed. ) Increasing healthy lifespan, conventionalmeasures and slowing the innate aging process. ANN N Y ACAD SCI，2002，959 :14 23)。其中较为公认的延缓 衰老的途径主要有两条，一是胰岛素信号传导途径(AntebiA. Inside insulin signaling, communication is key to long life[J]. SciAgingKnowledge environ,2004, (23) pe25) ；二是热量限制途径(Koen Houthoofd, JacquesR. Vanfleteren. The longevity effect of dietary restriction in Caenorhabditis elegans[J]. Experimental Gerontology,2006(41) : 1026-1031)。川弯(Ligusticum chuanxiong Hort.)为常用传统中药，始载于《神农本草经》，性 温味辛，历代医家多用于活血行气、祛风止痛。2005年版《中国药典》I部收载的564种成 方制剂和单味制剂中，使用川芎的有85种，约占药典收载中成药的15%，川芎在临床的广 泛应用促进了对其新的药效功能的开发及相关机制研究。尽管川芎在老年性疾病的治疗中 广泛应用并取得较好的疗效，但对其延缓衰老作用的研究未见报道。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,简称线虫)是一种相对简单 的多细胞生物，雌雄同体，是研究衰老的卓越的模式生物(H. Gershon, D. Gershon. Caenorhabditiselegans-a paradigm for aging research :advantages and limitations. Mechanisms of Ageing and De_elopment 123 (2002) 261-274)，与其它物种相 比具有以下难以比拟的优势1)寿命周期短(平均为18 21天)，子代数目多；2)容易培 养，观察及操作方便；3)细胞高度分化且细胞谱系清楚；4)是第一个完成全基因组测序的 动物，其遗传背景清楚，衰老机制研究相对明确。5)与人类同源性较好，编码的基因中至少 40%在人类基因组中有明显的同源物。基于线虫这一模式生物开发延缓衰老的传统中药不但能进一步挖掘中药的价值， 而且还能对延长人类的寿命作出贡献。
发明内容
本发明的目的是提供)I丨芎或其提取物的新用途。本发明所提供的川芎或其提取物的新用途有如下四个1)川芎或川芎提取物在制备延缓衰老产品中的应用；
2)川芎或川芎提取物在制备调节热量限制通路基因表达产品中的应用；3)川芎或川芎提取物在制备调节胰岛素信号通路基因表达产品中的应用；4)川芎或川芎提取物在制备线虫寿命延长剂中的应用。上述川芎提取物可为川芎水提取物。其中，川芎水提取物可从商业途径得到。川 芎水提取物也可按照常规方法进行制备，如可用下述方法得到选取药材川芎(伞形科植 物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎)碎块，加入5 10倍纯水，加热，煮沸 后保持微沸状态继续加热0. 5 1小时，然后过滤收集滤液1 ；接着在滤渣中再加入5 10 倍纯水，加热，煮沸后保持微沸状态继续加热0. 5 1小时，然后过滤收集滤液2 ；将滤液1 与滤液2混勻，干燥得到川芎水提取物。上述1)、2)和3)的三种产品均可为药物、保健品或食品添加剂等。所述调节热量限制通路基因表达可通过上调skn-1基因的表达实现；所述调节胰 岛素信号通路基因表达可通过上调hsp-70基因的表达，下调akt-2和/或tub-1基因的表 达实现。其中所述线虫具体可为秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)。需要的时候，在上述产品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载 体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面 活性剂、吸附载体、润滑剂等。用川芎提取物制备的延缓衰老药物、保健品可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、 胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方 法制备。本发明采用线虫这一模式生物，以整体动物实验作为检测手段，观察CXE对线虫 寿命的影响，发现多个浓度CXE对线虫均有延寿作用或延寿趋势，其中25mg/L的延寿效果 最佳，平均寿命和最大寿命均延长约15%。利用已知的线虫衰老相关基因，采用qRT-PCR方 法进行延寿的分子机制研究，表明CXE通过干预Insulin/IGF-1通路和限食通路而延长寿 命，为该药的分子机制研究提供了新的内容和方向，也为中药延缓衰老研究提供了新的思 路和手段。
图1为实施例1中的线虫生存曲线图。图2为实施例2中川芎提取物对线虫衰老相关基因表达的影响，与act-1比较， P < 0. 05，2)P < 0. 01。图3为川芎提取物影响线虫衰老相关基因表达的示意图。
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1、川芎提取物对秀丽隐杆线虫寿命的影响试验1 材料1. 1菌株、线虫
菌株E. coli 0P50、野生型秀丽隐杆线虫Bristol (N2)均购自线虫遗传中心(CGC)。1. 2药物和试剂川芎提取物按照下述方法进行制备选取药材川芎(伞形科植物川芎 Ligusticumchuanxiong Hort.的干燥根茎)碎块，加入6倍纯水，加热，煮沸后保持微沸状 态继续加热40分钟，然后过滤收集滤液1 ；接着在滤渣中再加入6倍纯水，加热，煮沸后保 持微沸状态继续加热40分钟，然后过滤收集滤液2 ；将滤液1与滤液2混勻，干燥得到的粉 末，即为川芎水提取物。按照该方法，20克生药制备得到1克川芎水提取物。琼脂粉(日本协和株式会社)，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu) (Sigma)，蛋白 月东(peptone)>tryptone(0X0ID),SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo),TRIzol reagent (Invitrogen)，反转录试剂盒(Promega)，其余试剂均为国产。1. 3 仪器 MIR-553恒温培养箱(日本SANYO公司)，S6E体视显微镜(德国Leica公司)， XTS30-D体视显微镜(北京泰克仪器有限公司)，Rotergene 3000荧光定量PCR仪(澳 大利亚Corbett公司)梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)，台式高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司)、G:B0X全自动凝胶成像仪(英国Syngene公司)、MLS-3780高压灭菌锅 (日本SANYO公司)等。2 方法2. 1试验分组设为对照组和4个CXE用药组，将药物溶于水，配成从低到高浓度依次为12. 5、 25、50和100mg/L的药物溶液。2. 2线虫的常规培养雌雄同体线虫N2，接种于涂布E. Coli 0P50的标准线虫培养基(nematode growthmedium,NGM)，于20°C恒温培养。每升培养基含3g氯化钠、20g琼脂粉、2. 5g蛋白胨、 lml 胆固醇乙醇溶液(浓度为 5mg/ml)、lml CaCl2 溶液(lmol/L) Uml MgS04 溶液(lmol/L) 和 25ml KP04 溶液(pH = 6)。2. 3寿命实验2. 3. 1同步化用M9缓冲溶液(每升M9溶液的溶质为Na2HP04 5. 8g，KH2P043. 0g， NaCl 0. 5g, NH4C1 1. Og)将年轻成虫洗至无菌EP管中，加适量裂解液(0. 5%次氯酸钠， 0. mol/L氢氧化钠)裂解线虫，置低速离心机上离心(3000rpm，lmin)，弃上清，再用M9缓冲 溶液冲洗线虫2次，离心弃上清后用移液枪吸取EP管底部线虫滴于NGM的无菌区，约48小 时后裂解的线虫体内的受精卵基本发育成L4期幼虫，完成同步化用于寿命实验。2. 3. 2培养基制备对照组培养基中含12. 5mg/L 5_Fu，药物组培养基中含12. 5mg/ L 5-Fu和不同浓度的CXE。2. 3. 3寿命实验挑取同步化的L4线虫到各组培养基中，每组平均80 110条，每 个板中约有15条。从转移时刻起开始计算线虫存活天数，转移当天记为寿命实验第0天 (day 0)。每天检查线虫，记录死亡线虫数，剔除意外死亡、逃逸和囊样线虫。线虫死亡判断 标准用钼丝轻触虫体，无任何反应，即判断为死亡。以上实验均重复两次。2. 4统计学分析采用AN0VA方差检验分析寿命实验结果，定量资料以X士S表示；采用两样本t检验方法比较分析目的基因差异表达。3 结果与对照组比较，第1次实验中，12. 5、25、50、100mg/L CXE均能显著延长线虫的平 均寿命(分别为 15. 4%,29. 7%,23. 3%U7. 1%, P < 0. 01)，25mg/L CXE 能显著延长线虫 的最大寿命(9.4%,P < 0.01),50U00mg/L CXE也具有类似作用(1.8%,4.8% )；第2次 实验结果与第1次相似，见表1。综合两次实验结果，25、50、100mg/L CXE均能显著延长线虫 的平均寿命(分别为15. 7%、9. 1%,6.2%,P<0.01)和最大寿命(分别为15. 0%、6. 8%、 6. 6%, P < 0. 01)。表1不同浓度川芎提取物对线虫寿命的影响(X士S) 注最大寿命为群体最后生存15%的平均寿命；与对照组比较，DP < 0. 05,2)P < 0. 01综合两次实验结果，对线虫全程存活情况做生存曲线(见图1)显示，25、50、 100mg/L CXE均能使线虫的生存曲线右移，以25mg/L尤为显著。实施例2、川芎提取物延长秀丽隐杆线虫寿命的分子机制1材料、仪器同实施例1。2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验分组设为对照组和用药组(寿命实验中延寿 作用最强组，浓度为25mg/L的CXE溶液)。3延寿的分子机制研究3. 1线虫总RNA的提取和cDNA合成对照组和用药组各挑取约1000条L4期线虫到培养基中，饲养10天后，分别收集 各组线虫，用TRIZ0L法抽提总RNA，RNase free DNase酶切，TRIZ0L法纯化后琼脂糖凝胶 电泳鉴定RNA没有明显降解，于-80°C冻存。取2 y g总RNA，用MML-V逆转录酶按说明书进 行反转录。3. 2引物合成对已知线虫中与衰老相关的基因，根据wormbase公布的序列设计合 成PCR引物(北京奥科生物技术有限责任公司)，序列如下akt_2上游引物 5 ‘ -ATTCAGCGAAGCACGAAC-3 ‘，下游引物5 ‘ -CACAACCCAAAGTCAGTG-3 ‘ ；hsp-70 上游引物5 ‘ -GGGTACTACGTACTCATG-3 ‘，下游引物5 ‘ -ATCACCAACGAGTCTCTC-3 ‘ ；skn-1 上 游引物5 ‘ -AGTGACTGCAACAGCTAC-3 ‘，下游引物5 ‘ -AGAAACGAGACTCGTGAG-3 ‘ ； tub-1 上游引物5 ‘ -TCCAATTGCTCAACCACG-3 ‘，下游引物5 ‘ -AGGGAGTACTTCACTTGG-3 ‘， 并以act-1作为内部参照物，其上游引物5 ‘ -AAGACCACGTCATCAAGG-3 ‘，下游引物 5' -TTCTCCATATCATCCCAGTT-3‘。3. 3实时荧光定量PCR检测对照组和用药组目的基因表达差异采用嵌合荧光法检测目的基因表达差异。采用20 u L反应体系(SYBR GREENMaster Mix 101^，上游引物、下游引物(101111101)各11^，模板00嫩2iig，以去离子水补足 20 ii L体系)。PCR反应条件94 °C预变性5min，94 °C变性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸 30s，共40个循环。每个样品均做3次生物学重复。采用2_AAGt方法(参见文献Livak， K.J. ；Schmittgen, T.D.Analysis of relative gene expressiondata using real-time quantitative PCR and the 2 (-AA Ct)method. Methods, 2001, 25 402-408)
进行分析。4、统计学分析采用AN0VA方差检验分析寿命实验结果，定量资料以X士S表示；采用两样本t检 验方法比较分析目的基因差异表达。5、川芎提取物对衰老相关基因表达的影响25mg/L CXE干预10天后，线虫体内衰老相关基因表达发生变化，见表2、图2。与 看家基因act-1相比，用药后hsp-70、skn-1基因表达明显上调，而akt_2、tub_l基因表达 显著下调。表2对照组和用药组各目的基因Ct和-AA Ct值
注Ct值指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 表中数值为3次重复中的其中1次结果。
在衰老的机制研究中，胰岛素和胰岛素样生长因子-Klnsulin/IGF-l)信号通路
是一个高度保守(包括线虫、果蝇、小鼠乃至灵长类动物)、研究最为详尽的寿命调控环节 正常条件下线虫体内释放多种Insulin/IGF样肽，这些肽与细胞表面的受体结合而在细胞内产生一系列的信号级联反应，最终通过磷酸化DAF-16而抑制其进入细胞核；在外界环境 发生变化时(如饥饿，虫口过密)Insulin/IGF-1信号通路被抑制，导致DAF-16未被磷酸化 而入核，在细胞核内DAF-16发挥转录因子的作用而促进许多抗逆性基因的表达而发挥延 长寿命的作用，因此与该信号通路相关基因的表达改变能直接或间接地影响衰老进程，调 控寿命长短。akt-2编码的蛋白是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt/PKB的同源物，它位于DAF-16 上游，能磷酸化DAF-16，抑制其进入细胞核，因此，akt-2基因表达下调可延长线虫寿命。 hsp-70编码的热休克蛋白是一种分子伴侣，帮助蛋白正确折叠为天然构象，对寿命发挥正 调节作用。在线虫体内，tub-1位于daf-16上游，其低表达具有延寿作用且该作用依赖于 DAF-16。skn-1基因编码的蛋白是Nrf2的同源物，它位于Insulin/IGF-1信号通路下游，该 信号通路激酶AKT-1，AKT-2等能磷酸化SKN-1而直接抑制其表达；SKN-1能提高机体抗应 激能力，延长线虫寿命，且其延寿作用独立于DAF-16。限食(即热量限制)在许多物种中可 引起长寿，并且可以降低和衰老相关的疾病发病率。限食可以促进skn-1表达，提高线虫的 呼吸作用而延长线虫寿命。上述基因对线虫寿命影响的示意图如图3所示。本发明中，CXE通过上调Insulin/IGF-1信号通路中对延寿具有正调控作用的 基因，如hsp-70 ；下调该通路中部分负调控寿命的基因，如akt-2、tub-1而发挥延寿作用； 此外，限食(热量限制)是一个公认的极好的延寿方法，我们的实验表明CXE通过上调限食 重要调控基因skn-1而引起长寿。同时，CXE对寿命的多种调控机制也反映了中药对衰老 的影响具有多靶点、多效应的特点。 序列表 <160>10 <210>1 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> <400>1
attcagcgaa gcacgaac18
<210>2 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> <400>2
cacaacccaa agtcagtg18
<210>3
<211>18
<212>DNA<213>人工序列 <220> <223> <400>3
gggtactacg tactcatg
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
atcaccaacg agtctctc
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
agtgactgca acagctac <210>6 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> <400>6
agaaacgaga ctcgtgag
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
tccaattgct caaccacg
<210>8
<211>18
18
18
18<212>DNA <213>人工序列 <220> <223> <400>8
agggagtact tcacttgg18
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
aagaccacgt catcaagg18
<210>10 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> <400>10
ttctccatat catcccagtt20
权利要求
川芎或川芎提取物在制备延缓衰老产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述产品为药物、保健品或食品添加剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述川芎提取物为川芎水提取物。
4.川芎或川芎提取物在制备调节热量限制通路基因表达或调节胰岛素信号通路基因 表达的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述产品为药物、保健品或食品添加剂。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述调节热量限制通路基因表达通 过上调skn-1基因的表达实现；所述调节胰岛素信号通路基因表达通过上调hsp-70基因的 表达，下调akt-2和/或tub-1基因的表达实现。
7.根据权利要求4至6中任一所述的应用，其特征在于所述川芎提取物为川芎水提 取物。
8.川芎或川芎提取物在制备线虫寿命延长剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述线虫为秀丽隐杆线虫。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述川芎提取物为川芎水提取物。
全文摘要
本发明公开了川芎或其提取物的新用途。川芎或其提取物的新用途有如下四个1)在制备延缓衰老产品中的应用；2)在制备调节热量限制通路基因表达产品中的应用；3)在制备调节胰岛素信号通路基因表达产品中的应用；4)在制备线虫寿命延长剂中的应用。本发明采用线虫这一模式生物，以整体动物实验作为检测手段，观察CXE对线虫寿命的影响，发现多个浓度CXE对线虫均有延寿作用或延寿趋势，其中25mg/L的延寿效果最佳，平均寿命和最大寿命均延长约15％。利用已知的线虫衰老相关基因，采用qRT-PCR方法进行延寿的分子机制研究，表明CXE通过干预Insulin/IGF-1通路和限食(热量限制)通路而延长寿命，为该药的分子机制研究提供了新的内容和方向，也为中药延缓衰老研究提供了新的思路和手段。
文档编号A61P39/06GK101874819SQ200910243699
公开日2010年11月3日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者于友华, 喻晓春, 李连达, 汪晓燕, 王丹巧, 王香明 申请人:中国中医科学院医学实验中心