专利名称：基因活化钛材及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种钛材及其制备方法。
背景技术：
钛材是常用的医用金属材料，由于其良好的生物相容性和机械性能，早在20世 纪中期就被用于医用领域，并于70年代作为植入材料开始获得广泛应用。随着生物技术 和生物医学的发展，钛材在人体植入体、替代装置和人体器官等方面的应用获得了重大突 破，主要是用作牙科植入体、人工关节及牙齿植入支架等(Mater Sci Forum， 2003 ;416 : 669-674.) CJ Mater Chem 2004 ;14 :2282-2290)。 钛材属于生物惰性生物材料，一方面，材料表面的生物惰性赋予钛材良好生物
相容性。但是另一方面，这种惰性也使得钛材的应用受到了挑战，因为惰性的钛材表面
与骨的结合是一种机械锁合方式，植入后组织反应表现为非特异性和随机性(Biomed
Pharmacother，2006，60(8) :365-369)，使得钛材植入体不能与骨组织形成牢固的、长期稳
定的结合，容易引发炎症、移位等问题，导致植入失败。因此，如何使钛材表面具有生物活
性，改善钛材的生物相容性和骨的结合能力，是钛材研究设计中的首要问题。 目前，为提高钛材表面生物活性，主要使用的是表面涂层、生化修饰等方法。研究
较多的涂层技术是在钛材表面进行羟基磷灰石涂层。在钛材表面形成一层生物活性的羟
基磷灰石可以提高钛材种植体的表面活性。早在1991年，L. L. Hench等证实钛材表面的羟
基磷灰石涂层能加强钛植入体与宿主骨之间的固定作用，促使骨细胞向植入体生长(J Am
Ceram Soc 1991;74:1485-1510.)。而生化修饰是获得具有活性的钛材表面的另一有效途
径。Le Gui 1 lou-Buf f e 1 loD等证实经RGD修饰的钛材表更有利于成骨细胞的粘附、铺展、分
化已经存活等生物学行为(Tissue Eng Part A. 2008， 14(8) :1445-55)。 这些方法在一定程度上改善了钛材的生物相容性和骨结合能力，但是这些方法仍
不能使钛材具有良好的骨诱导性能，钛材难以主动的与机体结合并调控骨细胞粘附、增值、
迁移及分化等生物行为，使得钛材无法具有与骨组织发生良好骨结合的能力。 壳聚糖是甲壳质经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖(pKa = 6.3)，具有可
降解性、良好的生物相容性及一定的抗菌等优异性能，广泛应用于组织工程、药物释放等领
域。pEGFP-hBMP2质粒是一种重组质粒，可在真核细胞内表达绿色荧光蛋白和骨形态发生蛋
白，绿色荧光蛋白用来监控转染效率，骨形态发生蛋白属于骨诱导生长因子，可诱导骨源性
细胞向骨细胞生长，促进骨生成。壳聚糖与质粒pEGFP-hBMP2形成的多层膜可以在生理条
件下发生降解，使得质粒DNA或壳聚糖-质粒DNA颗粒在长时间内持续产生，维持质粒DNA
的浓度。生长在这种基因活化的钛材表面的细胞(如骨髓基质干细胞)吸收复合颗粒后，
在较长的时间内使质粒DNA持续表达并合成功能蛋白——骨形态发生蛋白，原位诱导骨髓
基质干细胞向成骨细胞的生成，赋予钛材主动与骨组织发生良好的骨结合能力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种基因活化钛材，具有良好的生物相容性 及骨诱导性能，能够提高宿主骨细胞的转染率，有效地调控基因释放并增强细胞活力，诱导 骨细胞的生成，从而使钛材本体能够主动与骨组织发生良好结合。 本发明所述的基因活化钛材，包括钛材本体，钛材本体表面由内向外依次间隔覆 有pEGFP-hBMP2质粒层和壳聚糖层形成活化层。 进一步，所述钛材本体由医用钛材制得，所述活化层中pEGFP-hBMP2质粒层和壳 聚糖层的总层数为9-21层。 本发明的目的之二是提供制备所述基因活化钛材的方法，包括如下步骤(l)将所 述钛材本体浸于聚乙烯亚胺溶液中10-20分钟后，用去离子水浸泡1-3次，每次1-2分钟；
(2)将步骤(1)所得钛材本体浸入含有质粒pEGFP-hBMP2的磷酸盐缓冲液中 10-20分钟后，用去离子水浸泡1-3次，每次1-2分钟； (3)将步骤(2)所得钛材本体浸于壳聚糖的乙酸溶液中10-20分钟后，用去离子水 浸泡1-3次，每次1-2分钟； (4)依次重复步骤(2)和步骤(3)，直至得到所需基因活化钛材。 进一步，所述聚乙烯亚胺溶液中所含组分及相应组分在溶液中的浓度分别为氯
化钠100-150mM和聚乙烯亚胺2-5mg/ml ; 进一步，所述含有质粒pEGFP-hBMP2的磷酸盐缓冲液pH值为7. 4，质粒浓度为 0. l_lmg/ml ; 进一步，所述壳聚糖的乙酸溶液中，乙酸质量百分比为1_3%，壳聚糖浓度为 3_5mg/ml。 本发明的有益效果是 本发明的基因活化钛材具有良好的生物相容性及骨诱导性能，能够提高宿主骨细 胞的转染率并有效调控基因释放和增强细胞活力，诱导骨细胞的生成，从而使钛材本体能 够主动与骨组织发生良好结合，非常适合临床应用。 本发明所述的制备基因活化钛材的方法利用壳聚糖分子与质粒DNA之间的静电 作用使壳聚糖层与质粒pEGFP-hBMP2层在钛材表面依次沉积，不仅操作简单，成本低廉， 而且实施容易，制得的基因活化钛材能有效诱导骨源细胞向骨细胞的转化并与骨组织牢固 的、长期稳定的结合，本发明方法非常适合用于产业化应用。 本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并 且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可 以从本发明的实践中得到教导。
附图为实施例所得基因活化钛材进行表面诱导大鼠骨髓间充质干细胞向骨细胞 转化过程中，碱性磷酸酶的检测结果，图中，1-孔板，2-表面涂覆脂质体2000的孔板，3-表 面涂覆脂质体2000的钛材，4-实施例所得基因活化钛材，5-壳聚糖/DNA层状组装修饰的 钛材；白色框为细胞在第七天时产生碱性磷酸酶的总量，黑色框为第十四天时细胞产生磷 酸酶的总量。
具体实施例方式以下将结合具体实施例对本发明进行详细的描述。应当理解，所选实施例仅为了
说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
实施例 ①将钛材本体浸于聚乙烯亚胺溶液中10分钟，然后用去离子水浸泡1分钟，再将 所得钛材浸入含有质粒pEGFP-hBMP2的pH7. 4的磷酸盐缓冲液中20分钟，然后用去离子水 浸泡1分钟；最后将钛材浸于壳聚糖的乙酸溶液中，10分钟后，用去离子水浸泡1分钟；
②重复步骤①的操作直至在钛材外表面形成pEGFP-hBMP2质粒层和壳聚糖层总 层数为15层的活化层，得所需基因活化钛材。所述聚乙烯亚胺溶液以100-150mM氯化钠溶 液为溶剂，溶液中聚乙烯亚胺浓度为2-5mg/ml 本实施例所述聚乙烯亚胺溶液中所含组分及相应组分在溶液中的浓度分别为氯
化钠150mM和聚乙烯亚胺5mg/ml，所述磷酸盐缓冲液中pEGFP-hBMP2质粒浓度为lmg/ml，
所述壳聚糖乙酸溶液中，乙酸质量百分比为1 % ，壳聚糖浓度为5mg/ml 。 本实施例中，聚乙烯亚胺溶液中，氯化钠浓度为100-150mM、聚乙烯亚胺浓度
为2-5mg/ml均可，含有pEGFP-hBMP2质粒的磷酸盐缓冲液的pH值为7. 4、质粒浓度为
0. l-lmg/ml均可，壳聚糖乙酸溶液中，乙酸质量百分比为l-3X、壳聚糖浓度为3-5mg/ml均可。 本实施例中，活化层中pEGFP-hBMP2质粒层和壳聚糖层总层数不低于五层皆可， 原因在于总层数大于5层的活化层，其结构才较为完善；壳聚糖与质粒pEGFP-hBMP2形成的 多层膜可以在生理条件下发生降解，使得质粒DNA(既质粒pEGFP-hBMP2)或壳聚糖-质粒 DNA颗粒在一定时间内持续产生，并维持一定浓度，钛材表面经壳聚糖与质粒DNA层状自组 装修饰后，生长在这种基因活化钛材表面的细胞(如骨髓基质干细胞)能够吸收质粒DNA 或复合颗粒并在较长时间内使质粒DNA持续表达并合成功能蛋白——骨形态发生蛋白，原 位诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞的生成，赋予钛材主动与骨组织发生良好的骨结合，使 用者可以根据需要限定钛材本体表面活化层的总层数，以实现特定时间内质粒DNA的持续 释放，活化层总层数以9-21层最佳，原因在于9层以上的质粒DNA层数是能够确保质粒DNA 的总含量，达到长时间持续释放的目的，但过多层数可能导致质粒DNA在特定时间段释放 过量或难于控制。 所述基因活化钛材制备方法中，钛材本体在聚乙烯亚胺溶液、磷酸盐缓冲液以及 壳聚糖的乙酸溶液中的浸泡时间可分别为10-20分钟，但并不表示本发明方法中，各溶液 浸泡阶段的时间局限于10-20分钟，浸泡的目的在于使质粒层及壳聚糖层能够依次间隔附 着于钛材本体的外表面，由于同层介质(聚阴离子或聚阳离子)的同性电荷排斥，理论上倾 向于形成单层结构，浸泡时间长，可使聚阴离子或聚阳离子层形成更充分，对钛材表面覆盖 更完整，形成的覆盖层更平整，浸泡时间以质粒DNA层或者壳聚糖层能够完整覆盖钛材表 面形成单层结构即可。 本实施例中，各溶液对钛材的浸泡结束后，皆需采用去离子水进行浸泡洗涤，各阶 段去离子水浸泡的次数均以1-3次为宜、去离子水浸泡时间均以每次l-3min为宜，原因在 于浸泡的主要目的是移除在同一层中可能形成双层或多层聚阴离子或聚阳离子，以免它
5们导致后面铺层结构不稳定，但浸泡时间过长，则可能导致已形成的多层结构解离。
结果验证 将本实施例所得基因活化钛材进行表面诱导大鼠骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)向骨细胞转化的鉴定 操作如下采用密度梯度离心法和差时贴壁法培养大鼠间充质干细胞(MSCs)，将 MSCs分别接种到孔板、表面涂覆脂质体2000的孔板、表面涂覆脂质体2000的钛材、壳聚糖 /pGB修饰的基因活化钛材以及壳聚糖/DNA层状自组装修饰的钛材表面，细胞接种密度为 40000 cells/cm2 ;用DMEM培养基加10% (w/v)的新生牛血清进行培养，每3天换液一次； 细胞在基因活化钛材表面接种分别培养7和14天后，以0. 25%胰酶消化，收集细胞，用1% Triton-X100裂解细胞，检测细胞裂解液中碱性磷酸酶的表达量。 结果如附图，从图可知，细胞在基因活化钛材的表面，第7天及14天产生碱性磷酸 酶的量均高于其它对照组，说明该基因活化的钛材能够更有利于促进间充干细胞向成骨细 胞的分化。 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。
权利要求
一种基因活化钛材，其特征在于包括钛材本体，钛材本体表面由内向外依次间隔覆有pEGFP-hBMP2质粒层和壳聚糖层形成活化层。
2. 根据权利要求l所述的基因活化钛材，其特征在于所述钛材本体由医用钛材制得， 所述活化层中pEGFP-hBMP2质粒层和壳聚糖层的总层数为9-21层。
3. 制备权利要求1所述的基因活化钛材的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将所述钛材本体浸于聚乙烯亚胺溶液中10-20分钟后，用去离子水浸泡1-3次，每次1-2分钟；(2) 将步骤(1)所得钛材本体浸入含有质粒pEGFP-hBMP2的磷酸盐缓冲液中10-20分 钟后，用去离子水浸泡1-3次，每次1-2分钟；(3) 将步骤(2)所得钛材本体浸于壳聚糖的乙酸溶液中10-20分钟后，用去离子水浸泡 1-3次，每次1-2分钟；(4) 依次重复步骤(2)和步骤(3)，直至得到所需基因活化钛材。
4. 根据权利要求4所述的制备基因活化钛材的方法，其特征在于所述聚乙烯亚胺溶 液中所含组分及相应组分在溶液中的浓度分别为氯化钠100-150mM和聚乙烯亚胺2-5mg/ ml。
5. 根据权利要求5所述的制备基因活化钛材的方法，其特征在于所述含有质粒 pEGFP-hBMP2的磷酸盐缓冲液pH值为7. 4，质粒浓度为0. l-lmg/ml。
6. 根据权利要求6所述的制备基因活化钛材的方法，其特征在于所述壳聚糖的乙酸 溶液中，乙酸质量百分比为1_3%，壳聚糖浓度为3-5mg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种基因活化钛材，包括钛材本体，钛材本体表面由内向外依次间隔覆有pEGFP-hBMP2质粒层和壳聚糖层形成活化层，所述基因活化钛材具有良好的生物相容性及骨诱导性能，能够提高宿主骨细胞的转染率并有效调控基因释放和增强细胞活力，诱导骨细胞的生成，从而使钛材本体能够主动与骨组织发生良好结合；本发明还提供了制备所述基因活化钛材的方法，利用壳聚糖分子与质粒DNA之间的静电作用使壳聚糖层与质粒pEGFP-hBMP2层在钛材表面依次沉积，不仅操作简单，成本低廉，而且实施容易，制得的基因活化钛材能有效诱导骨源细胞向骨细胞的转化并与骨组织牢固的、长期稳定的结合，适合用于产业化运用。
文档编号A61L27/34GK101745150SQ200910250890
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者罗忠, 胡燕, 蔡开勇 申请人:重庆大学