丙型肝炎病毒疫苗的制作方法

专利名称：丙型肝炎病毒疫苗的制作方法
丙型肝炎病毒疫苗本申请是以下申请的分案申请申请日2002年10月10日；申请号 02824665. 9 (PCT/US02/32512)；发明名称同上。相关申请本申请要求申请日为2002年3月13日的美国临时申请流水号60/363，774和申 请日为2001年10月11日的美国临时申请流水号60/328，655的优先权，以上两份申请分 别被收作本文参考。
背景技术：
在本申请中所引用的参考文献并非承认是本发明的现有技术。世界人口的大约3%受到了丙肝病毒(HCV)的感染(Wasley等，Semin. Liver Dis. 20，1-16，2000)。接触HCV导致明显的急性疾病的只占很小的百分比，而在大多数情 况下所述病毒会形成慢性感染，导致肝脏炎症并且缓慢发展成肝脏衰竭和硬化(Iwarson， FEMSMicrobiol. Rev. 14，201-204，1994)。另外，流行病学调查表明，HCV在肝细胞癌的发 病方面起着重要作用(Kew, FEMS Microbiol. Rev. 14，211-220，1994，Alter, Blood 85， 1681-1695，1995)。在1992年对HCV进行常规血液筛查之前，大部分感染是通过意外接触受感染的血 液、血液制品或移植器官而感染的。在进行HCV液筛查的地方，HCV主要是通过直接透过皮 肤接触受感染的血液，即静脉内用药而感染的。较少见的传播方法包括围产期接触，血液透 析，以及与 HCV 感染患者的性接触(Alter 等，N. Engl. J. Med. 341 (8)，556-562，1999, Alter, J. Hepatol. 31Suppl. 88—91，1999. Semin. Liver. Dis. 201，1—16，2000)。HCV基因组由大约9. 5kb的单链RNA组成，它编码具有大约3000个氨基酸的前 体多蛋白(Choo 等，Science 244，362-364，1989，Choo 等，Science 244，359-362，1989， Takamizawa等，J. Virol. 65，1105-1113，1991)。所述HCV多蛋白包括以下顺序的病毒蛋白 C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。各个病毒蛋白是通过HCV多蛋白的蛋白水解而产生的。宿主细胞蛋白酶能释放推 测的结构蛋白(』132，和？7，并且在810号氨基酸上产生赂2的N-末端(Mizushima等， J. Virol. 68，2731-2734，1994，Hijikata 等，P. N. A. S. USA 90，10773-10777，1993)。推测非结构蛋白NS3，NS4A, NS4B, NS5A和NS5B形成了病毒复制机制，并且是从 所述多蛋白中释放出来的。与NS2和NS3的N-末端相关的锌-依赖型蛋白酶负责NS2和 NS3 之间的裂解(Grakoui 等，J. Virol. 67，1385-1395，1993，Hijikata 等，P. N. A. S. USA90, 10773-10777，1993)。位于NS3的N-末端结构域中的一种特殊的丝氨酸蛋白酶，负责在 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A 和 NS5A/NS5B 接合处的蛋白水解裂解(Bartenschlager 等，J. Virol. 67，3835-3844，1993, Grakoui 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90，10583-10587， 1993，Tomei 等，J. Virol. 67，4017-4026，1993)。NS4A 提供了 NS3 活性的辅因子(FaiIla 等，J. Virol. 68，3753-3760，1994，De Francesco 等，美国专利号 5，739，002)。 NS5A是能产生干扰素抗性的高度磷酸化的蛋白(De Francesco等，Semin. Liver Dis.，20(1),69-83，2000，Pawlotsky, ViralHepat.Suppl. 1，47-48，1999)。
NS5B提供了一种RNA-依赖型RNA聚合酶(De Francesco等，国际公开号WO 96/37619，Behrens 等，EMBO 15，12-22，1996，Lohmann 等，Virology 249，108-118，1998)。发明概述本发明涉及Ad6载体和编码含有失活的NS5B RNA-依赖型RNA聚合酶区的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸。所述核酸特别适合用作提供多种抗原的腺病 毒载体或DNA质粒疫苗的成分，用于产生针对HCV的HCV特异性细胞介导的免疫(CMI)反应。HCV特异性CMI反应表示能识别HCV抗原的细胞毒性T淋巴细胞和T辅助细胞的 产生。CMI反应还可以包括非HCV特异性免疫作用。优选的核酸编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽，它基本上与 SEQ. ID. NO. 1 相似，并且具有足够的蛋白酶活性，以便对它自身进行加工，产生基本上相似于存在于 SEQ. ID. NO. 1中的NS5B区的至少一种多肽。所产生的相当于NS5B区的多肽是无酶促活性 的。更优选的是，所述HCV多肽具有足够的蛋白酶活性，以便产生基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 1 中的 NS3, NS4A, NS4B, NS5A，禾口 NS5B 区的多肽。所提到的“基本上相似的序列”表示与参考序列的同一性至少为大约65%。因此， 举例来说，具有基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的氨基酸序列的多肽，与SEQ. ID. NO. 1具有至少 大约65%的总体氨基酸同一性。相当于赂3，赂44，赂48，赂54，和赂58的多肽，与SEQ. ID. NO. 1上的相应的区具有 至少大约65%的氨基酸序列同一性。所述相应的多肽在本文中又被称为NS3，NS4A, NS4B, NS5A 禾口 NS5B 多肽。
因此，本发明的第一方面披露了包括编码基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核苷酸序列的核酸。所编码的多肽具有足够的蛋白 酶活性，以便对它自身进行加工，产生无酶促活性的NS5B多肽。在一种优选实施方案中，所述核酸是能够在需要的人细胞中表达 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的表达载体。在人细胞内的表达具有治疗作用，可以有 效治疗HCV感染，并且预防性治疗HCV感染。表达载体包括编码一种多肽的核苷酸序列以及进行正确转录和加工的调节元件。 可以存在的调节元件包括与编码所述多肽的核苷酸天然相关的调节元件，以及不是与所述 核苷酸序列天然相关的外源调节元件。诸如外源激发子的外源调节元件可用于在特定宿主 中表达，如在人细胞中表达。可用于功能性表达的调节元件的例子包括激发子，终止子，核 糖体结合位点和聚腺苷酸化信号。本发明的另一方面，披露了包括能够在人细胞中表达基本相似于SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表达盒的核酸。所述多肽能够对它自身进行加 工，以便产生无酶促活性的NS5B蛋白。所述基因表达盒至少包括以下部分a)与编码多肽的核苷酸序列转录性偶联的激发子；b)与所述核苷酸序列功能性偶联的5'核糖体结合位点；c)与所述核苷酸序列的3'末端连接的终止子；和d)与所述核苷酸序列功能性偶联的3'聚腺苷酸化信号。所提到的“转录性偶联”表示所述激发子的定位使得可以通过结合在所述激发子上的RNA聚合酶使核苷酸序列转录。转录性偶联并不要求被转录的序列靠近所述激发子。所提到的“功能性偶联”表示介导一种对所述核苷酸序列的作用的能力。功能性 偶联并不需要所偶联的序列彼此接近。与所述核苷酸序列功能性偶联的聚腺苷酸化信号有 利于转录的RNA的裂解和聚腺苷酸化。与所述核苷酸序列功能性偶联的5’核糖体结合位 点有利于核糖体结合。在优选实施方案中，所述核酸是适合用于治疗HCV的治疗性用途或用作生产治疗 载体的中间物的DNA质粒载体或腺病毒载体。治疗HCV，包括主动治疗HCV感染和预防性治 疗HCV感染。本发明的另一方面披露了包括能够表达基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的多肽的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒的腺病毒载体，所述腺病毒载体是通过以下方法生 产的，该方法包括(a)同源重组和(b)腺病毒载体回收(rescue)。所述同源重组步骤中产 生了一种腺病毒基因组质粒。所述腺病毒载体回收步骤产生了来自所述腺病毒基因组质粒 的腺病毒载体。本文所披露的腺病毒基因组质粒包括一种重组腺病毒基因组，它具有一个在El 区上的缺失，和任选在E3区上的缺失，以及插入所述缺失区之一中的基因表达盒。所述重 组腺病毒基因组是由基本上相似于一种或多种腺病毒血清型的区域组成的。本发明的另一方面披露了包括SEQ. ID. NO. 4的核酸序列的腺病毒载体或它的衍 生物，其中，所述衍生物的存在于SEQ. ID. NO. 4上的HCV多蛋白编码序列被SEQ. ID. NO. 3， SEQ. ID. NO. 10或SEQ. ID. NO. 11中任一个的HCV多蛋白编码序列所取代。本发明的另一方面披露了一种包括含有编码基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的序列的核酸的培养的重组细胞。所述重组细胞具有 多种用途，如用于通过载体构建方法复制编码所述多肽的核酸。本发明的另一方面披露了一种制备包括能够表达基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的 多肽的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒的腺病毒载体的方法。该方法包括以下步 骤(a)生产包括重组腺病毒基因组的腺病毒基因组质粒，它在El和E3区具有缺失，并且 具有插入所述缺失区之一中的基因表达盒，和(b)从所述腺病毒基因组质粒中回收腺病毒 载体。本发明的另一方面披露了包括用于表达基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的载体和可以药用载体的药物组合物。所述载体适合 给患者施用，并且在患者体内表达多肽。“患者”表示能够感染HCV的哺乳动物。患者可能感染了或没有感染HCV。患者的 例子有人和黑猩猩。本发明的另一方面披露了一种治疗患者的方法，包括给所述 患者施用有效量的表 达基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的载体的步骤。所述 载体适合给患者施用，并且在患者体内表达多肽。进行治疗的患者可能有或没有感染HCV。对于感染了 HCV的患者来说，有效量足以 获得以下作用中的一种或多种减弱HCV复制的能力，减少HCV负荷，提高对病毒的清除，并 且增强一种或多种HCV特异性CMI反应。对于没有感染HCV的患者来说，有效量是足以获 得下列一种或多种效果的用量增强产生针对HCV感染的HCV特异性CMI反应的一种或多种成分的能力，降低了对HCV感染的易感性，和减弱了传染性病毒建立导致慢性疾病的持 久感染的能力。本发明的另一方面涉及包括Ad6区和一个不存在于Ad6中的区的重组核酸。所提 到的“重组”核酸表示存在两个或两个以上不是天然彼此相关的核酸区。所述Ad6重组核 酸优选包括Ad6区和编码与Ad6异源的多肽的基因表达盒。通过本文所提供的包括不同实施例的其他说明，可以理解本发明的其他特征和优 点。所提供的实施例说明了用于实施本发明的不同成分和方法。这些实施例不构成对本发 明的限定。根据本发明的说明，技术人员能够确定和采用可用于实施本发明的其他成分和 方法。附图的简要说明图 IA 和 IB 表示 SEQ. ID. NO. 1。图 2A, 2B, 2C 和 2D 表示 SEQ. ID. NO. 2。SEQ. ID. NO. 2 提供了编码 SEQ. ID. NO. 1 的 核苷酸序列，同时提供了优化的内部核糖体进入位点和TAAA终止序列。1-6号核苷酸提供 了优化的内部核糖体进入位点。7-5961号核苷酸编码HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽，5137-5145号位置上的核苷酸提供了 1711-1713号氨基酸位置上的AlaAlaGly序列， 它使得NS5B失活。5962-5965号核苷酸提供了 TAAA终止序列。图 3A, 3B, 3C 和 3D 表示 SEQ. ID. NO. 3。SEQ. ID. NO. 3 是 SEQ. ID. NO. 2 的密码子优 化形式。7-5961 号核苷酸编码 HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽。图 4A-4M 表示 MRKAd6-NSmut (SEQ. ID. NO. 4)。SEQ. ID. NO. 4 是包括一个表达盒的腺 病毒载体，其中，SEQ. ID. NO. 1的多肽是由SEQ. ID. NO. 2编码的。碱基对1-450相当于Ad5 的碱基对1-450 ；碱基对462-1252相当于人CMV激发子；碱基对1258-1267相当于Kozak 序列；碱基对1264-7222相当于NS基因；碱基对7231-7451相当于BGH聚腺苷酸化信号； 碱基对7469-9506相当于Ad5碱基对3511-5548 ；碱基对9507-32121相当于Ad6碱基对 5542-28156 ；碱基对 32122-35117 相当于 Ad6 碱基对 30789-33784 ；碱基对 35118-37089 相 当于Ad5碱基对33967-35935。图5A-50表示SEQ. ID. NOs. 5和6。SEQ. ID. NO. 5编码具有有活性的RNA依赖型 RNA 聚合酶的 HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽。SEQ. ID. NO. 6 提供了所述多肽的氨
基酸序列。图 6A-6C 提供了 pVlJnsA 的核酸序列(SEQ. ID. NO. 7)。图7A-70提供了 Ad6基因组的核酸序列(SEQ. ID. NO. 8)。图8A-8K提供了 Ad5基因组的核酸序列(SEQ. ID. NO. 9)。
图9表示Ad6基因组的不同的区。线性(35759bp)ds DNA基因组用双平行线表示， 并且被划分成100个作图单位。转录单位是以相对它们在基因组上的位置和方向形式示出 的。早期基因(E1A，E1B，E2A/B，E3*E4)是通过灰色箭头表示的，通过黑色箭头表示的晚 期基因(LI-L5)，是通过对由主要晚期激发子(MLP)产生的转录物的可变剪接而产生的，并 且它们都包括位于5'末端的三联前导序列(1，2，3)。E1区位于大约1.0-11.5的作图单位， E2区位于75. 0-11. 5的作图单位，E2位于76. 1-86. 7的作图单位，E4区位于99. 5-91. 2 的作图单位。所述主要晚期转录单位位于16. 0和91. 2作图单位之间。

图10表示回收含有Ad6和Ad5区的pAdEl_E3+的同源重组。
图11表示回收包括Ad6区的pAdEl_E3+的同源重组。图12表示来自用表达不同的HCV NS盒的质粒DNA转染的293细胞的全细胞提 取物的Western印迹。用特异性抗体检测成熟的NS3和NS5A产物。“pVlJns-NS 〃表 示 pVlJnsA 质粒，其中，Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽是由 SEQ. ID. NO. 5 编码的， 并且 SEQ. ID. NO. 5 被插入 SEQ. ID. NO. 7 的 1881-1912 号碱基之间。“pVlJns-NSmut “ 表示pVlJnsA质粒，其中，SEQ. ID. NO. 2被插入SEQ. ID. NO. 7的1882-1925号碱基之 间。“pVlJns-NSOPTmut “表示 pVlJnsA 质粒，其中 SEQ. ID. NO. 3 被插入 SEQ. ID. NO. 7 的 1881-1905号碱基之间。图13A禾口 13B表示通过IFNyELIspot显示的在C57black6小鼠(A)和BalbC小 鼠(B)体内诱导的T细胞反应，包括用基因电转移装置(GET)分别注射25微克和50微克 的编码不同HCV NS盒的质粒DNA。图14表示在感染HeLa细胞之后，来自不同腺病毒载体的蛋白表达。MRKAdS-NSmut 是基于Ad5序列的腺病毒载体(SEQ. ID. NO. 9)，其中，Ad5基因组具有碱基对451-3510的El 缺失，碱基对28134-30817的E3缺失，并且具有插入450-3511号位置之间的SEQ. ID. NO. 4 的碱基对451-7468所提供的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒。Ad5_NS是基于Ad5主链的 腺病毒载体，具有碱基对342-3523的El缺失，和碱基对28134-30817的E3缺失，并且包括 编码来自 SEQ. ID. NO. 5 的 NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 的表达盒。“MRKAd6_NS0PTmut 〃 表 示具有修饰过的SEQ. ID. NO. 4序列的腺病毒载体，其中，SEQ. ID. NO. 4的碱基对1258-7222 被SEQ. ID. NO. 3所取代。图15表示由IFN γ ELIspot显示的通过两次注射109vp含有不同HCV非结构基因 盒的腺病毒载体，在C57black6小鼠体内诱导的T细胞反应。图16A-16D表示由I FN y EL I s po t显示的通过一次或两次注射10lclvp(A)或 IO11Vp(B)含有不同HCV非结构基因盒的腺病毒载体，在猕猴体内诱导的T细胞反应。图17A和17B表示由IFNyELIspot显示的通过两次注射IOicVp(A)或IO11Vp(B) 编码不同HCV非结构基因盒的腺病毒载体，在猕猴体内诱导的CD8+T细胞反应。图18A-18F表示由大量CTL分析显示的通过两次注射IO1Vp的Ad5_NS (A)， MRKAdS-NSmut (B)，或MRKAd6_NSmut (C)在猕猴体内诱导的T细胞反应。图19表示质粒pE2。图 20A-D 表示部分密码子优化序列 NSsuboptmut (SEQ. ID. N0. 10)。 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的编码序列是从7-5961号碱基。本发明的详细说明本发明涉及Ad6载体和编码含有失活的NS5B区的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A_NS5B 多肽的核酸。提供失活的NS5B区，提供了 NS5B抗原，同时降低了由活性病毒RNA聚合酶导 致的不利副作用的可能性。所述核酸的用途包括用作疫苗成分，以便将HCV多肽导入细胞， 它能提供用于产生针对HCV的CMI反应的多种抗原，并且用作用于生产所述疫苗成分的中 间产物。适应性细胞免疫反应，由于主要组织相容性复合物(MHC) I型和II型表达的普遍 分布，起着能够在整体身体内的HCV感染的细胞中识别病毒抗原的作用，以便诱导免疫学 记忆，并且保持免疫学记忆。上述功能是由抗原特异性⑶4+T辅助细胞(Th)和⑶8+细胞毒性T细胞(CTL)提供的。在通过它们的特异性T细胞受体激活之后，HCV特异性Th细胞实现了多种免疫调 控功能，其中大部分功能是通过Thl和Th2细胞因子介导的。HCV特异性Th细胞有助于B 细胞的激活和分化，并且有助于病毒特异 性细胞毒性T细胞的诱导和刺激。Th细胞与CTL 一起还能分泌能抑制若干病毒的复制和基因表达的IFN-γ和TNF-α。另外，Th细胞和CTL 即主要效应细胞，可以诱导病毒感染过的细胞的程序凋亡和裂解。HCV特异性CTL是由专门的抗原呈递细胞(pAPCs)加工的抗原产生的。抗原可以 是在pAPCs内合成的或者是导入的。PAPC中的抗原合成，可以通过将编码序列所述抗原的 表达盒导入所述细胞而完成。施用核酸疫苗的一种优选途径是肌内途径。肌内施用似乎会导致将核酸导入体细 胞和pAPCs，并且在那里表达。在所述体细胞中产生的HCV抗原可以转移到pAPCs，以便在 I 类 MHC 分子中呈递(Donnelly 等，Annu. Rev. Immunol. 15 :617_648，1997)。PAPCs在蛋白酶体复合物中将较长的抗原加工成较小的肽抗原。所述抗原被转运 到内质网/高尔基复合体分泌途径中，以便与I类MHC蛋白结合。CD8+T淋巴细胞通过T细 胞受体(TCR)和CD8细胞表面蛋白识别与I类MHC结合的抗原。用编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸作为疫苗成分，可以从一种单 一载体生产多种能够产生CMI反应的抗原。所述多肽应当能够对它自身进行充分加工，以 便产生至少一个相当于NS5B的区。优选的核酸编码基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的氨基酸 序列，它具有足够的蛋白酶活性，以便对它自身进行加工，产生基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 1 上的 NS3, NS4A, NS4B, NS5A 和 NS5B 的各个 HCV 多肽。基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的多肽，具有足够的蛋白酶活性，在细胞中对它自身 进行加工，给所述细胞提供存在于若干不同HCV菌株中的T细胞表位。蛋白酶活性是由NS3 和NS3/NS4A蛋白提供的，在合适的裂解位点上消化Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽， 以便释放相当于赂3，赂4六，赂48，赂5六，和赂58的多肽。Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A_NS5B的 自我加工，产生了接近天然存在的HCV多肽的多肽。根据本文所提供的指导，可以产生足够强的免疫反应，以便在患者体内获得有益 作用。所提供的指导包括与HCV序列选择，载体选择，载体生产，组合治疗和施用相关的信 肩、οI. HCV 序列可以将多种不同的核酸序列用作疫苗成分，以便给细胞提供 HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，或作为生产疫苗成分的中间物。用于获得合适核 酸序列的起点，优选是被修饰而产生失活的NS5B的天然存在的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽。在以下文献中披露了利用HCV核酸序列提供HCV非结构抗原，以便产生CMI反应 Cho 等，Vaccinel7 :1136_1144，1999，Paliard 等，国际公开号 W001/30812 (并不被认为是 本发明的现有技术)，和Coit等，国际公开号W001/38360(并不被认为是本发明的现有技 术)。例如，所述文献没有披露对它自身进行加工以便产生失活的NS5B的多肽，特别是没有 披露HCV序列与本文所采用的递送载体的组合。对HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽序列的修饰，可以通过改变其编码核酸而产生。可以进行改变，以便产生缺失，插入和取代。可以在NS5B上进行小的修饰，以便通过导向于复制所必需的基序产生失活的聚 合酶。NS5B活性所必需的基序的例子，以及为了生产失活的NS5B而可以进行的修饰披露 于以下文献中Lohmann等，Journal of Virology 71 :8416_8426，1997，和Kolykhalov等， Journal of Virology 74 :2046_2051，2000。在产生对HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的修饰时需要考虑的其他因 素，包括保持自身加工的能力和保持T细胞抗原。HCV多肽进行自身加工的能力，在很大程 度上是通过功能性NS3蛋白酶确定的。能保持NS3活性蛋白酶活性的修饰，可以通过NS3 蛋白，用作NS3的辅因子的NS4A，和存在于NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽中的NS3蛋白酶 识别位点而获得。可以对天然存在的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽序列进行不同的修饰，以便产 生能够诱导多种T细胞反应的多肽。影响一种多肽诱导多种T细胞反应的能力的因素，包 括HCV特异性T细胞抗原区的保存或导入，以及不同T细胞抗原区在不同HCV分离物中的 优势。天然存在的HCV分离物的多种例子为本领域所熟知。HCV分离物可以划分成以下 六种包括一种或多种亚型的主要基因型HCV-l/(la，lb，lC)，HCV-2/(2a,2b,2c), HCV-3/ (3a,3b,10a), HCV—4/(4a)，HCV_5/(5a)禾口 HCV—6/(6a，6b，7b，8b，9a，1la)(Simmonds， J. Gen. Virol.，693-712，2001)。诸如 HCV-BK, HCV-J, HCV-N, HCV-H 的特定 HCV 序列的例 子，业已在GenBank保藏，并且在多个文献中披露(例如，参见Chamberlain等，J. Gen. Virol.，1341-1347，1997)。例如，HCV T细胞抗原可以通过经验性实验鉴定。鉴定T细胞抗原的一种方法包 括用较大长度的多肽产生一系列重叠的短肽，然后从受感染的患者中筛选T细胞群体的阳 性克隆。阳性克隆是通过特定肽激活/激发的。可以将诸如IFNY-ELISP0T，IFNy-细胞 内染色和大量(bulk) CTL分析的技术用于测定肽活性。由此鉴定的肽可以视为代表了各病 原体的T细胞表位。例如，通过生产包括来自两种或两种以上天然存在的序 列的区域的杂合 NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，可以将来自不同HCV分离物的HCV T细胞抗原区导入一种 单一序列。所述杂合体可以包括其他修饰，所述修饰优选不会减弱所述多肽产生HCV CMI 反应的能力。可以用本文所披露的或为本领域所熟知的技术，确定修饰过的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽对它自身进行加工，并且产生CMI反应的能力。所述 技术包括使用IFN y -ELISPOT, IFN γ -细胞内染色和大量CTL分析，测定HCV特异性CMI反应。A. Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 序列SEQ. ID. NO. 1 提供了 优选的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A_NS5B 序列。SEQ. ID. NO. 1 包 括大量的HCV特异性T细胞抗原，这些抗原存在于若干不同的HCV分离物中。SEQ. ID. NO. 1 与HCV BK菌株核苷酸序列(GenBank保藏号M58335)的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B部分相 似。在SEQ. ID. NO. 1中，对于I类MHC分子识别来说，重要的锚定位点是保守的或代表HCV多蛋白的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B部分上的20种已知T细胞表位中的18种的保守 性取代。就其余两种已知的T细胞表位而言，一种在SEQ. ID. NO. 1上具有一个非保守性锚 定取代，该取代仍然能被不同的HLA超类型识别，而一种表位具有一个不是保守的锚定残 基。HCV T-细胞表位披露于以下文献中Chisari 等，Curr. Top. Microbiol Immunol.，242 299-325，2000，和 Lechner 等 J. Exp. Med. 9 1499-1512，2000。HCV-BK NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 核苷酸序列和 SEQ. ID. NO. 1 之间的差别包括 在5，末端引入一个甲硫氨酸，以及修饰过的NS5B活性位点残基在SEQ. ID. NO. 1上的存在。 所述修饰将GlyAspAsp换成了 AlaAlaGly (1711-1713号残基)，以便使NS5B失活。所编码的HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽，优选具有基本 上相似于SEQ. ID. NO. 1的氨基酸序列。在不同的实施方案中，所编码的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽，与 SEQ. ID. NO. 1 的氨基酸同一'性为至少 65%，至少 75%，至少 85%，至少 95%，至少 99%或 100% ；或与 SEQ. ID. NO. 1 具有 1-2，1-3，1-4，1-5， 1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11,1-12,1-13,1-14,1-15,1-16,1-17,1-18,1-19,或 1-20 个氨 基酸的差别。Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽和 SEQ. ID. NO. 1 之间的氨基酸差别，是通过 确定两种序列不同的氨基酸修饰的最低数量计算的。氨基酸修饰可以是缺失，添加，取代或 它们的任意组合。氨基酸序列同一性，是通过本领域众所周知的方法确定的，所述方法将一种多肽 的氨基酸序列与第二种多肽的氨基酸序列进行比较，并且产生一种序列比对。氨基酸同一 性是通过所述比对计算的，包括统计具有相同氨基酸的比对的残基对的数量。用于确定序列同一性的方法包括披露于以下文献中的方法Schuler，G. D. in Bioinformatics :A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins， Baxevanis, A. D.禾口 Ouelette，B. F. F.，eds.，John Wiley&Sons, Inc，2001 ；Yona，等，in Bioinformatics :Sequence，structure and databanks，Higgins，D.and Taylor, W. eds, Oxford University Press,2000 ；andBioinformatics :Sequence and Genome Analysis, Mount，D. W.，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001o 确定氨基酸序列同一 性的方法，在可公幵获得的计算机程序中进行了汇编，如GAP (Wisconsin Package Version 10. 2, Genetics Computer Group (GCG)，Madison，Wise), BLAST (Altschul 等，J. Mol. Biol.215(3) 403-10,1990),禾P FASTA(Pearson，Methods in Enzymology 183:63-98， 1990，R. F. Doolittle，ed)。
在本发明的一种实施方案中，两种多肽之间的序列同一性是通过使用GAP程序 石角定的(Wisconsin Package Version 10. 2, GeneticsComputer Group (GCG), Madison, Wise)。GAP 采用了 Needleman 和 Wunsch 的比对方法(Needleman,等，J. Mol. Biol. 48 443-453，1970)。GAP考虑了两种序列之间的所有可能的比对和空位位置，并且产生一种 将匹配的残基数量最大化以及将空位的数量和大小最小化的总体比对。利用一种评分距阵 确定符号匹配值。另外，为了限制向所述比对中插入空位，需要空位产生罚分和空位延伸罚 分。利用GAP进行多肽比较的默认程序参数是BL0SUM62 (Henikoff等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 10915-10919，1992)氨基酸评分距阵(MATrix = blosum62. cmp)，空位产生参 数(GAP权重=8)，而空位延伸参数(LENgth权重=2)。
更优选的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，除了在它们的整个长度上基 本上相似于SEQ. ID. NO. 1之外，还能产生基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 1上的相应的区 域的各个NS3，NS4A, NS4B, NS5A和NS5B区，SEQ. ID. NO. 1上的相应的区是以如下形式提供 的Met-NS3的1-632号氨基酸；NS4A的633-686号氨基酸；NS4B的687-947号氨基酸；NS5A 的948-1394号氨基酸和NS5B的1395-1985号氨基酸。在不同实施方案中，NS3，NS4A, NS4B, NS5A和/或NS5B区与SEQ. ID. NO. 1上的相 应区域的氨基酸同一性为至少65 %，至少75 %，至少85 %，至少95 %，至少99 %或100 % ；或 具有 1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7,1-8,1-9,1-10,1-11,1-12,1-13,1-14,1-15,1-16,1-17, 1-18，1-19，或1-20个氨基酸的氨基酸差别。SEQ. ID. NO. 1的氨基酸修饰，优选保持了所有的或大部分的T细胞抗原区。天然 存在的氨基酸差别，是由于不同的氨基酸侧链(R基团)产生的。R基团能影响氨基酸的不 同的性质，如物理尺寸，电荷，和疏水性。可以将氨基酸划 分成以下不同类型中性和疏水性 (丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，和甲硫氨酸)；中性和极性 (甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺)；碱性(赖氨酸，精氨 酸，和组氨酸)；和酸性(天冬氨酸和谷氨酸)。一般，在取代不同的氨基酸时，优选用具有相似性质的氨基酸取代。在特定类型内 部取代不同的氨基酸，如用缬氨酸取代亮氨酸，用精氨酸取代赖氨酸，和用天冬酰胺取代谷 氨酰胺是不会导致多肽三级结构改变的很好的候选取代。基于特定的氨基酸序列和已知的遗传密码的间并性，可以获得大量不同的编码 核酸序列。遗传密码的间并性是由于几乎所有氨基酸都是由核苷酸三联体或"密码子" 的不同组合编码的。特定密码子翻译成特定氨基酸为本领域所熟知(例如，参见Lewin GENESIV, p. 119，Oxford University Press, 1990)。氨基酸是由以下密码子编码的A = Ala =丙氨酸密码子 GCA，GCC, GCG, GCUC = Cys =半胱氨酸密码子UGC，UGUD = Asp =天冬氨酸密码子GAC，GAUE = Glu =谷氨酸密码子 GAA，GAGF = Phe =苯丙氨酸密码子UUC，UUUG = Gly =甘氨酸密码子 GGA，GGC, GGG, GGUH = His =组氨酸密码子 CAC，CAUI = Ile =异亮氨酸密码子 AUA，AUC，AUUK = Lys =赖氨酸密码子 AAA，AAGL = Leu =亮氨酸密码子 UUA，UUG, CUA, CUC，CUG，CUUM = Met =甲硫氨酸密码子AUGN = Asn =天冬酰胺密码子AAC，AAUP = Pro =脯氨酸密码子 CCA，CCC, CCG, CCUQ = Gln =谷氨酰胺密码子CAA，CAGR = Arg =精氨酸密码子 AGA, AGG，CGA, CGC, CG G, CGUS = Ser =丝氨酸密码子 AGC，AGU, UCA，UCC, UCG, UCUT = Thr =苏氨酸密码子 ACA，ACC, ACG, ACU
V = Val =缬氨酸密码子GUA，⑶C，⑶G，⑶UW = Trp =色氨酸密码子UGGY = Tyr =酪氨酸密码子 UAC，UAU。可以优化核酸序列，以便增强在宿主中的表达。要考虑的因素包括C:G含量，优选 的密码子，以及避免抑制性二级结构。所述因素能够以不同的方式组合，以便获得在特定宿 主中具有增强了的表达的核酸序列(例如，参见Donnelly等，国际公开号WO 97/47358)。特定序列在特定宿主中具有增强了的表达的能力涉及某些经验实验。所述实验包 括测定保护性核酸序列的表达，以及，如果必要的话，改变所述序列。B.编码核苷酸序列SEQ. ID. NOs. 2 和 3 提供 了编码 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A_NS5B 序列的核苷酸 序列的两种例子。SEQ. ID. NO. 2的编码序列，与天然存在的HCV-BK序列(GenBank保藏 号 M58335)的 NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 区相似(核苷酸序列同一'性为 99. 4 % )，SEQ. ID. NO. 3是SEQ. ID. NO. 2的密码子优化形式。SEQ. ID. NOs. 2和3具有78. 3%的核苷酸序列 同一性。HCV-BK NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 核苷酸(GenBank 保藏号 M58335)和 SEQ. ID. NO. 2之间的差别，包括SEQ. ID. NO. 2具有一个核糖体结合位点，一个ATG甲硫氨酸密码 子，一个编码修饰过的NS5B催化结构域的区，一种TAAA终止信号和另外30个核苷酸的差 另U。编码AlaAlaGly(1711-1713号残基)的修饰过的催化结构域取代了 GlyAspAsp，以便使 NS5B失活。编码HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核苷酸序列，优选基本上相似于 SEQ. ID. NO. 2的编码区。在不同实施方案中，编码HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多 肽的核苷酸序列，与SEQ. ID. NO. 2编码区的核苷酸序列的同一性为至少65%，至少75%， 至少 85%，至少 95%，至少 99%，或 100% ；或与 SEQ. ID. NO. 2 具有 1-2，1-3，1-4，1-5，1-6， 1-7，1-8，1-9，1-10，1-11，1-12,1-13,1-14,1-15,1-16,1-17,1-18,1-19,1-20,1-25,1-30, 1-35，1-40，1-45，或1-50个核苷酸的差别。编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的序列和SEQ. ID. NO. 2编码区之间的核苷酸 差别，是通过确定两种序列差别的核苷酸修饰的最低数量计算的。核苷酸修饰可以是缺失， 添加，取代或它们的任意组合。核苷酸序列同一性，是通过本领域熟知的方法确定的，该方法比较了一种序列的 核苷酸序列和另一种序列的核苷酸序列，以便产生一种序列比对。序列同一性是根据所述 比对，通过统计具有相同核苷酸的比对位置的数量确定的。用于确定两种多核苷酸之间的核苷酸序列同一性的方法，包括披露于以下文献中 的方法Schuler，in Bioinformatics :A PracticalGuide to the Analysis of Genes and Proteins，Baxevanis,A. D.禾口 Ouelette，B. F. F.，eds.，John Wiley&Sons,Inc，2001 ；Yona 等，.in Bioinformatics :Sequence， structure anddatabanks， Higgins， D.禾口 Taylor， W.eds, Oxford UniversityPress,2000 ；and Bioinformatics :Sequence and Genome Analysis, Mount，D. W.，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001。确定核苷酸 序列同一性的方法，在可公幵获得的计算机程序中进行了汇编，如GAP (Wisconsin Package Version 10. 2, Genetics ComputerGroup (GCG)，Madison，Wise), BLAST (Altschul 等，J. Mol.Biol. 215(3) :403_10，1990)，和FASTA(Pearson，W. R. ,Methods inEnzymology 183 63-98，1990，R.F. Doolittle, ed)。在本发明的一种实施方案中，两种多核苷酸之间的序列同一性，是通过采用GAP 石角定的(Wisconsin Package Version 10. 2, GeneticsComputer Group (GCG), Madison, Wise)。GAP 采用 了 Needleman 和 Wunsch 的比对方法(Needleman 等，J. Mol. Biol. 48 443-453，1970)。GAP考虑了两种序列之间所有可能的比对和空位位置，并且产生了使匹配 的残基数量最大化，并且使空位的数量和大小最小化的总体比对。用一种评分距阵确定符 号匹配值。另外，需要用空位产生罚分和空位延伸罚分来限制将空位插入所述比对中。采 用GAP的多核苷酸比较的默认程序参数是nwsgapdna. cmp评分距阵(MATrix = nwsgapdna. cmp)，空位产生参数(GAP权重=50)和空位延伸参数(LENgth权重=3)。更优选的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B核苷酸序列，除了在其整个长度 上基本上相似之外，产生了基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 2中的相应区域的各个NS3， NS4A，NS4B，NS5A和NS5B区。SEQ. ID. NO. 2上的相应的编码区是以如下形式提供的Met_NS3 的7-1902号核苷酸；NS4A的1903-2064号核苷酸；NS4B 2065-2847号核苷酸；NS5A的 2848-4188号核苷酸；NS5B的4189-5661号核苷酸。在不同实施方案中，NS3，NS4A, NS4B, NS5A和/或NS5B编码区与SEQ. ID. NO. 2上 的相应的区域上的核苷酸序列同一性为至少65 %，至少75 %，至少85 %，至少95 %，至少 99%，或 100% ；或与 SEQ. ID. NO. 2 具有 1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11， 1-12，1-13，1-14，1-15，1-16,1-17,1-18,1-19,1-20,1-25,1-30,1-35,1-40,1-45,或 1-50 个核苷酸的差别。C.基因表达盒基因表达盒包括多肽表达所需要的元件。所提到的“多肽”没有提供大小限制，并 且包括蛋白。存在于基因表达盒中的调节元件通常包括(a)与编码所述多肽的核苷酸序 列转录性偶联的激发子，(b)与所述核苷酸序列功能性偶联的5'核糖体结合位点，(c)与 所述核苷酸序列的3'末端连接的终止子，和(d)与所述核苷酸序列功能性偶联的3'聚腺 苷酸化信号。还可以存在用于增强或调控基因表达或多肽加工的其他调节元件。激发子是由RNA聚合酶识别，并且介导下游区域转录的遗传元件。优选的激发子 是强激发子，它能提供较高水平的转录。强激发子的例子包括立即早期人巨细胞病毒激发 子(CMV)，和具有内含子 A 的 CMV (Chapman 等，Nucl. Acids Res. 19 :3979_3986，1991)。激发 子的其他例子包括天然存在的激发子，如EFl α激发子，鼠CMV激发子，Rous肉瘤病毒激发 子，和SV40早期/晚期激发子和β-肌动蛋白激发子；以及人工激发子，如合成的肌肉特异 性激发子和嵌合型肌肉_特异性/CMV激发子(Li等，Nat. Biotechnol. 17 =241-245,1999， Hagstrom 等，Blood 95 :2536_2542，2000)。所述核糖体结合位点位于起始密码子上或靠近起始密码子。优选的核糖体结合位 点的例子包括CCACCAUGG，CCGCCAUGG,和ACCAUGG，其中AUG是起始密码子(Kozak，Cell44 283-292，1986)。核糖体结合位点的另一种例子是 GCCACCAUGG (SEQ. ID. NO. 12)。聚腺苷酸化信号负责裂解转录的RNA，并且在所述RNA上添加poly (A)尾。高等真 核生物中的聚腺苷酸化信号包括AAUAAA序列，距离聚腺苷酸化添加位点大约11-30个核苷 酸。AAUAAA 序列参与 RNA 裂解的信号传递(Lewin，Genes IV，Oxford University Press,NY，1990)。poly (A)尾对于mRNA加工来说是重要的。可以用作基因表达盒的一部分的聚腺苷酸化信号，包括最小兔珠蛋白聚腺苷 酸化信号和牛生长激素聚腺苷酸化(BGH) (Xu等，Gene272 =149-156, 2001, Post等，美国专 利U. S. 5，122，458)。其他例子包括合成的聚腺苷酸化信号(SPA)和SV40聚腺苷酸化信 号。所述 SPA 序列如下AAUAAAAGAUCUUUAUUUUCAUUAGAUCUGUGUGUUGGUUUUUU⑶⑶G (SEQ. ID. NO. 13)。可以存在的用于增强或调控基因表达或多肽加工的其他调节元件的例子，包括 增强子，前导序列和操纵子。增强子区能增强转录。增强子区的例子包括CMV增强子和 SV40 增强子(Hitt 等，Methods inMolecular Genetics 7 13-30，1995，Xu，等，Gene 272 149-156,2001)。增强子区可以与激发子结合。
前导序列是多肽上的氨基酸区，它能引导所述多肽进入蛋白酶体。编码序列所述 前导序列的核酸是结构基因的5'末端，并且是随所述结构基因一起转录的。前导序列的例 子是tPA。可以用操纵子序列调控基因表达。例如，可以利用Tet操纵子序列抑制基因表达。II.治疗性载体可以用适合治疗性施用的载体将编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核 酸导入患者体内。合适的载体能够将核酸递送到靶细胞中，而又不会导致不可接受的副作用。细胞表达是利用编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表达盒实现的。 所述基因表达盒包括用于在靶细胞内产生并且加工足够数量的核酸，以便获得有利效果的 调节元件。可用于治疗性用途的载体的例子包括第一和第二代腺病毒载体，辅助依赖型 腺病毒载体，腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体，α病毒载体，Venezuelan马脑炎病毒 载体，和质粒载体(Hitt 等，Advancesin Pharmacology 40 137-206，1997，Johnston 等，美国专利号6，156，588，和Johnston等，国际公开号WO 95/32733)。用于将 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽导入对象体内的优选载体，是第一代腺病毒载体和质 粒DNA载体。A.第一代腺病毒载体用于表达基因表达盒的第一代腺病毒载体，包括El和任选的E3缺失重组腺病毒 基因组内的表达盒。El区上的缺失足够大，以便去除腺病毒复制所必需的元件。用于表达Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的第一代腺病毒载体，包括El和 E3缺失的重组腺病毒基因组。El区的缺失足够大，以便去除腺病毒复制所必需的元件。El 和E3区缺失的组合足够大，以便能容纳编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表 达盒。所述腺病毒具有双链线性基因组，在两端具有反向末端重复。在病毒复制期间，将 所述基因组包装在病毒衣壳内，以便形成毒粒。所述病毒通过病毒附着以及随后的内化，进 入它的靴细胞(Hitt 等，Advances in Pharmacology 40 137-206，1997)。腺病毒载体可以基于不同的腺病毒血清型，如出现在人或动物体内的血清型。动 物腺病毒的例子包括牛，猪，黑猩猩，鼠，犬和禽(CELO)腺病毒。优选的腺病毒载体是基于人血清型的，更优选基于B，C或D型血清型。人腺病毒B，C，D或E血清型的例子包括2型 (“Ad2" )，4型(“Ad4" )，5型(“Ad5" )，6型(“Ad6" )，24 型(〃 Ad24" )，26 型 (〃 Ad26〃)，34型(〃 Ad34〃)和35型(〃 Ad35〃)。腺病毒载体可以包括来自单一腺 病毒或来自两种或两种以上腺病毒的区域。 在不同的实施方案中，腺病毒是基于Ad5，Ad6，或它们的组合的。Ad5披露于以下 文献中Chroboczek 等，J. Virology 186 :280_285，1992。Ad6 披露于图 7A-7N 中。包括 Ad5 区的基于Ad6的载体披露于下面所提供的实施例部分。腺病毒载体不一定完全去掉了它们的El和E3区。相反，去掉了足够数量的El区， 使得在缺乏El蛋白的条件下，不能复制的载体是以反式形式提供的；并且El缺失和El或 E3缺失的组合大到足够容纳一个基因表达盒。El缺失可以从Ad5的大约碱基对342开始一直进行到大约碱基对3523，或相当于 来自其他腺病毒的区域。所缺失的区域包括去掉从Ad5的大约碱基对450到大约碱基对 3511的区域，或来自其他腺病毒的相应区域。始于大约碱基对341的较大的El区缺失，去 掉了有利于病毒包装的元件。E3缺失能够从Ad5的大约27865号碱基对到大约30995号碱基对，从或者其他腺 病毒载体的相应的区域获得。所述缺失区优选包括去掉了从Ad5的大约28134号碱基对到 大约30817号碱基对的区域，或其他腺病毒载体的相应的区域。El区以及任选的E3区的缺失的组合应当足够大，以便包括所述基因表达盒的 重组基因组的总体大小，不超过野生型腺病毒基因组的大约105%。例如，当重组腺病毒 Ad5基因组的大小增加超过大约105%时，所述基因组会变得不稳定(Bett等，Journal of Virology 67:5911-5921,1993)。包括所述基因表达盒的重组腺病毒基因组的大小优选为野生型腺病毒基因组的 大约85% -大约105%。在不同实施方案中，包括所述表达盒的重组腺病毒基因组的大小 为野生型基因组大小的大约100% -大约105. 2%，或大约100%。可以将大约7，500kb插入具有El和E3缺失的腺病毒基因组中。在没有任何缺失 的情况下，Ad5基因组为35，935个碱基对，而Ad6基因组为35，759个碱基对。第一代腺病毒载体的复制可以通过提供反式El基因产物而实现。El基因产物能 够以反式形式提供，例如，通过使用业已用腺病毒El区转化过的细胞系。用腺病毒El区 转化过的细胞和细胞系的例子有HEK 293细胞，911细胞，PERC. 6 细胞和转染过的原代人 aminocytes 细胞(Graham Journal of Virology 36 :59_72,1977, Schiedner 等，Human Gene Therapy 11 :2105_2116，2000，Fallaux等，Human Gene Therapy 9:1909-1917,1998， Bout等，美国专利号6，033，908)。应当将Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒插入重组腺病毒基因组的相当于 缺失的El区或缺失的E3区的区域。所述表达盒可以具有平行的或反向平行的取向。在平 行取向中，所述插入基因的转录方向与缺失的El或E3基因的方向相同。在反向平行取向 的转录中，将相反的链用作模板，而转录方向是沿相反方向进行的。在本发明的一种实施方案中，所述腺病毒载体具有插入到El缺失区的基因表达 盒。该载体包括a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的El平行或El反向平行取向的基因表达盒；c)与所述表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548的第 二腺病毒区或从相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；d)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或 从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；e)与所述第三区连接的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或 从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或 从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区。在本发明的另一种实施方案中，所述腺病毒载体具有插入到E3缺失区的表达盒。 该载体包括a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述第一区连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从 相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；c)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或 从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；e)与所述基因表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对 33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或 从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区。在涉及腺病毒区的优选的不同实施方案中，存在(1)相当于Ad5的第一，第二，第 三，第四，和第五区；(2)相当于Ad6的第一，第二，第三，第四，和第五区；和(3)相当于Ad5 的第一区，相当于Ad5的第二区，相当于Ad6的第三区，相当于Ad6的第四区，和相当于Ad5 的第五区。B. DNA质粒载体DNA疫苗质粒载体包括一个基因表达盒和有利于复制并且优选有 利于载体选择的 元件。优选的元件提供了用于在非哺乳动物细胞中复制的元件和选择标记。所述载体应当 不包括提供在人细胞中复制的元件或用于整合到人核酸中的元件。有利于核酸选择的选择标记包括所述标记。优选的选择标记是能产生抗生素抗性 的标记。抗生素选择基因的例子，包括编码氨苄青霉素，新霉素，和卡那霉素抗性的核酸。可以用含有细菌复制起点和选择标记的质粒起始生产合适的DNA疫苗载体。能提 供较高产量的细菌复制起点的例子，包括ColEl质粒-衍生的细菌复制起点(Donnelly等， Annu.Rev. Immunol. 15 :617_648，1997)。细菌复制起点和选择标记的存在，使得能够在诸如大肠杆菌的细菌菌株中生产 DNA载体。利用选择标记排除不包括DNA载体的细菌。III.AD6 重组核酸Ad6重组核酸包括基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 8中的Ad6区的Ad6区，和不存 在于Ad6核酸中的区域。包括Ad6区的重组核酸具有不同的用途，如用于生产不同的Ad6区，作为生产基于Ad6的载体的中间物，以及用作递送重组基因的载体。如图9所示，Ad6的基因组组构与Ad5的基因组组构非常相似。Ad5和Ad6之间的 同源性大约为98%。在不同实施方案中，Ad6重组核酸包括基本上相似于E1A，ElB, E2B, E2A，E3，E4， Li，L2，L3，或L4的核苷酸区，或它们的任意组合。与Ad6区基本上相似的核酸区具有至 少65%，至少75%，至少85%，至少95%，至少99%或100%的核苷酸序列同一性；或具有 1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7,1-8,1-9,1-10,1-11,1-12,1-13,1-14,1-15,1-16,1-17,1-18, 1-19，1-20，1-25，1-30，1-35,1-40,1-45，或1-50个核苷酸的核苷酸差别。在上文的I. B.节 中披露了用于确定基本上相似的核酸序列的技术和实施方案。重组Ad6核酸优选包括编码不存在于Ad6中的多肽的表达盒。 表达盒的例子包 括编码HCV区的表达盒，和编码其他类型多肽的表达盒。可以采用不同量的Ad6生产不同类型的腺病毒载体，如第一代和第二代腺病毒载 体。正如在上文的II. A.节中所指出的，第一代腺病毒载体是El缺陷型的，并且在提供反 式El时能够复制。第二代腺病毒载体包括比第一代载体少的腺病毒基因组，并且可用于与互补的 细胞系和/或补充腺病毒蛋白的辅助载体连接。在不同的参考文献中，披露了第二代 腺病毒载体，如 Russell，Journal ofGeneral Virology 81 :2573_2604，2000 ;Hitt 等， 1997, HumanAd vectors for Gene Transfer, Advances in Pharmacology,Vol40Academic Press。在本发明的实施方案中，Ad6重组核酸是El缺陷型腺病毒载体，它能够在补充反 式El时复制。可以将表达盒插入缺失的El区和/或缺失的E3区。具有在缺失的El区提供的表达盒的基于Ad6的腺病毒载体的例子包括以下成分 或由其组成a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述第一区连接的El平行或El反向平行取向的基因表达盒；c)与所述表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从 相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；d)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或 从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；e)与所述第三区连接的从相当于Ad5的大约碱基对28134到大约碱基对30817或 从相当于Ad6的大约碱基对28157到大约碱基对30788的任选存在的第四个区；f)从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或从相当于Ad6的大约 碱基对30789到大约碱基对33784的第五腺病毒区，其中，如果存在第四区，所述第五区与 所述第四区连接，或如果不存在所述第四区，所述第五区与第三区连接；和g)与所述第五区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或 从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第六腺病毒区；其中，存在至少一个Ad6区。在本发明的不同实施方案中，以上所有区都来自Ad6 ；除第一和第二区外所有的 区都来自Ad6 ；而选自第二，第三，第四，和第五区的1，2，3或4个区来自Ad6。
具有在缺失的E3区提供的表达盒的基于Ad6的腺病毒载体的例子包括以下成分 或由其组成a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述第一区连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从 相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；c)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或 从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；e)与所述基因表达盒连接的相当于从Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对 33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和 f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或 从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区；其中，存在至少一个Ad6区。在本发明的不同实施方案中，以上所有区都来自Ad6 ；除第一和第二区外所有的 区都来自Ad6 ；而选自第二，第三，第四，和第五区的1，2，3或4个区来自Ad6。IV.载体生产可以用重组核酸技术生产载体，如包括使用限制酶，核酸连接，和同源重组的技 术。重组核酸技术为本领域所熟知(Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley,1987-1998,禾口 Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2' dEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。利用中间载体驱动治疗性载体，或将表达盒或它的一部分从一种载体转移到另一 种载体。中间载体的例子包括腺病毒基因组质粒和穿梭载体。中间载体上的有用元件包括复制起点，选择标记，同源重组区，和常见的限制位 点。可以利用常见的限制位点促进核酸序列的克隆或释放。同源重组区提供了与另一种核酸分子上的目标区同源的核酸序列区。该同源区 位于要插入所述目标区的核酸序列侧翼。在不同实施方案中，同源区的长度优选为大约 150-600个核苷酸，或长度为大约100-500个核苷酸。本发明的一种实施方案披露了包括Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒，选择 标记，细菌复制起点，导向于要插入或取代El区的表达盒的第一腺病毒同源区和第二腺病 毒同源区的穿梭载体。所述第一和第二同源区位于所述表达盒侧翼。第一同源区包括至 少大约100个碱基对，它们基本上与野生型腺病毒区的大约碱基对4-450的至少右侧末端 (3'末端)同源。第二同源区包括至少大约100个碱基对，它们基本上与Ad5的大约碱基 到3511-5792的至少左侧末端(5’末端)或来自另一种腺病毒的相应区同源。所提到的“基本上同源”表示与目标区特异性重组的足够的同源性程度。在不同 实施方案中，基本上同源表示至少85 %，至少95 %或100 %的序列同一性。序列同一性可以 按照上文I. B.节中所披露的方法进行。生产腺病毒载体的一种方法是通过产生包括一个表达盒的腺病毒基因组质粒。前 腺病毒质粒包括在需要的互补细胞系中复制所需要的所有腺病毒序列。然后用限制酶消化 所述前腺病毒质粒，以便释放病毒ITR' s，并且转染到所述互补细胞系中，进行病毒回收。ITR' s必须从质粒序列上释放，以便能够进行复制。腺病毒载体回收导致了含有所述表达 盒的腺病毒载体的产生。A.腺病毒基因组质粒腺病毒基因组质粒包括存在于较大长度质粒(它可以是粘粒)上的腺病毒载体序 列。所述较大长度的质粒可以包括其他元件，如根据生产和保持所述质粒所采用的方法， 有助于真核细胞或细菌细胞生长和选择的元件。用于生产腺病毒基因组质粒的技术，包括 与使用穿梭载体和同源重组相关的技术，和与将基因表达盒插入腺病毒粘粒相关的技术 (Hitt 等，Methods in Molecular Genetics 7 13-30,1995, Danthinne 等，Gene Therapy 7 1707-1714,2000)。腺病毒基因组质粒优选具有插入El或E3缺失区的基因表达盒。在本发明的一种 实施方案中，所述腺病毒基因组质粒包括插入El缺失区的基因表达盒，复制起点，选择标 记，和重组腺病毒区，该腺病毒区由以下成分组成a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述第一区连接的El平行或El反向平行取向的基因表达盒；c)与所述表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从 相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；d)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或 从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；e)与所述第三区连接的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或 从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或 从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区；和g)相当于存在于Ad5或Ad6中的E3区的全部或一部分的任选存在的E3区，根据 需要的腺病毒载体的总体大小，可以提供较小的插入片段。在本发明的另一实施方案中，所述重组腺病毒基因组质粒具有插入到E3缺失区 的基因表达盒。所述载体包括复制起点，选择标记，和以下部分a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从 相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；c)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或 从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；e)与所述基因表达盒结合的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对 33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或 从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区。在不同实施方案中，存在相关的腺病毒区(1)相当于Ad5的第一，第二，第三，第四和第五区；(2)相当于Ad6的第一，第二，第三，第四和第五区；和
(3)相当于Ad5的第一区，相当于Ad5的第二区，相当于Ad6的第三区，相当于Ad6 的第四区和相当于Ad5的第五区。本发明的一种实施方案披露了一种制备腺病毒载体的方法，包括生产腺病毒基因 组质粒的同源重组步骤和腺病毒回收步骤。所述同源重组步骤包括使用其侧翼为腺病毒同 源区的包括Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒的穿梭载体。所述腺病毒同源区将表达 盒导向于El或E3缺失区。在本发明的一种实施方案中，涉及生产腺病毒基因组质粒，将基因表达盒插入载 体，包括从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；与所 述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从相当于Ad6的大 约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；与所述第二区连接的从相当于Ad5的 大约碱基对5549到大约碱基对28133或从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对 28156的第三腺病毒区；与所述第三区连接的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱 基对33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和 与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或从相当于 Ad6的大约碱基对 33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区。所述腺病毒基因组质粒应 当包括复制起点和选择标记，并且可以包括Ad5或Ad6的E3区的全部或一部分。在涉及腺病毒区的不同实施方案中，存在(1)相当于Ad5的第一，第二，第三，第 四和第五区；(2)相当于Ad6的第一，第二，第三，第四和第五区；和(3)相当于Ad5的第一 区，相当于Ad5的第二区，相当于Ad6的第三区，相当于Ad6的第四区，和相当于Ad5的第五 区。B.腺病毒载体回收可以用本领域已知的或本文所披露的技术，从重组腺病毒基因组质粒中回收腺 病毒载体。用于回收腺病毒的技术的例子为本领域所熟知，并且披露于以下文献中=Hitt 等，Methods in Molecular Genetics7 13-30,1995,禾口 Danthinne 等，Gene Therapy 7: 1707-1714，2000。回收本文所披露的腺病毒载体的优选方法，包括加强腺病毒复制。例如，加强腺病 毒复制可以通过在独立的载体上补充腺病毒功能，如E2蛋白(聚合酶，前末端蛋白和DNA 结合蛋白)以及E4或f6进行。下面的实施例10披露了加强腺病毒复制，以便回收包括密 码子优化的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒的腺病毒载体。V.部分优化的HCV编码序列HCV多蛋白编码核酸的部分优化提供了优化用于在人体内表达的较少量的密码子 而不是全面优化。总体目标是提供由于密码子优化而产生的增强表达的优点，同时有利于 生产包括具有优化密码子的HCV多蛋白编码核酸的腺病毒载体。HCV多蛋白编码序列的完全优化，提供了每一种氨基酸的最常见的人密码子。完 全优化可以用本领域所熟知的密码子频率表进行，并且使用诸如BACKTRANSLATE的程序 (Wisconsin Package version 10，Genetics Computer Group，GCG，Madison，Wise.) 0部分优化可以对所存在的完整HCV多蛋白编码序列(例如，NS3-NS5B)进行，或对 存在的一个或多个局部区域进行。在不同实施方案中，所存在的完整HCV编码多肽的GC含 量不超过至少大约65% ；并且一个或多个局部区域的GC含量不超过大约70%。
局部区域是存在于HCV编码核酸中的区域，并且其大小可以改变。例如，局部区域 的长度可以为大约60，大约70，大约80，大约90或大约100个核苷酸。部分优化可以通过首先构建要根据天然存在的序列部分优化的HCV编码多蛋白 序列而实现。另外，可以将优化的HCV编码序列用作比较的基础，以便产生部分优化的序 列。VI. HCV组合治疗可以使用HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B疫苗本身来治疗患者，可以与其他 HCV治疗剂组合使用，并且可以与针对其他类型疾病的试剂一起使用。其他治疗剂包括治疗 HCV和具有高的HCV感染倾向人体内的疾病的其他治 疗剂。针对其他类型疾病的试剂包括 针对HIV和HBV的疫苗。用于治疗HCV的其他治疗剂，包括疫苗和非疫苗制剂(Zein，Expert Opin. Investig. Drugs 10 1457-1469，2001)。其他HCV疫苗的例子包括为了诱导针对HCV核心 抗原和HCV El, E2或p7区的免疫反应而设计的疫苗。疫苗成分可以是天然存在的HCV多 肽，HCV模拟表位(mimotope)多肽或编码序列所述多肽的核酸。HCV模拟表位多肽包括HCV表位，但是具有与天然存在的HCV抗原不同的序列。 HCV模拟表位可以与天然存在的HCV抗原融合。在以下文献中，提供了披露用于生产模拟 表位的一般性技术的参考文献，并且披露了不同的HCV模拟表位Felici等，美国专利号 5，994，083 和 Nicosia 等，国际申请号 WO 99/60132。VII.药物施用可以采用本文所提供的说明以及本领域所熟知的技术，制备并且给患者施用HCV 疫苗。例如，一般性药物施用的指南披露于以下文献中=Modern Vaccinology, Ed. Kurstak, Plenum Med. Co. 1994 ；Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences 18thEdition, Ed. Gennaro, Mack Publishing,1990 ；禾口 Modern Pharmaceutics 2 " d Edition, Eds. Banker和Rhodes，Marcel Dekker, Inc.，1990，其中的每一份文献都被收作本文参考。HCV疫苗可以通过不同途径施用，如静脉内，腹膜内，皮下，肌内，真皮内，通过皮肤 的按压或鼻内途径。优选的途径是肌内途径。肌内施用可以使用不同的技术进行，例如通过使用或不用一个或多个电脉冲注 射。电介导的转移，可能有利于通过刺激体液和细胞免疫反应进行遗传学免疫。疫苗注射可以用不同的技术进行，如通过采用针头注射系统或无针头注射系统。 无针头注射系统的例子是喷射注射装置(Donnelly等，国际公开号WO 99/52463)。A.电介导的转移电介导的转移或基因电-转移(GET)，可以通过在核酸注射之后输送合适的电脉 冲进行(参见Mathiesen，国际公开号WO 98/43702)。质粒注射和电穿孔可以用不锈钢针头 进行。针头是成对的，三联的或更复杂的形式的。在一种设计中，将所述针头焊接在印刷电 路板上，所述电路板是机械支持物，并且通过合适的电缆将针头与电场发生器连接在一起。以电脉冲形式提供电刺激。脉冲可以具有不同的形式(矩形，正弦，三角形，指数 衰减)和不同的极性(具有阳性或阴性极性的单极，双极)。脉冲可以以稳定的电压或稳定 的电流形式输送。可以利用不同形式的电治疗，将包括HCV的核酸疫苗和其他核酸疫苗导入患者体内。可行的电治疗方式包括以下方案治疗1 每隔1秒钟输送10串1000个矩形双极脉冲，脉冲长度为0. 2毫秒/相， 频率为1000Hz，稳定电压模式，45伏/相，浮动电流。治疗2 每隔1秒钟输送2串100个矩形双极脉冲，脉冲长度为2毫秒/相，频率 为IOOHz，稳定电流模式，100毫安/相，浮动电压。治疗3 :2串双极脉冲，脉冲长度为大约2毫秒/相，总长度为大约3秒钟，其中，穿 过组织的实际电流固定在大约50毫安。
电脉冲是通过电场发生器输送的。合适的发生器可以包括3个独立的硬件部件， 它们组装于一个共同的底盘，并且通过便携式PC运行驱动程序驱动。所述软件同时管理基 础功能和辅助功能。该装置的部件包括(1)通过微处理器驱动的信号发生器，(2)电放大 器和(3)数字示波器。所述信号发生器，在特定范围内在软件控制下输送具有任意频率和形状的信号。 所述相同的软件具有用于要输送的波形的相互作用编辑器，所述发生器涉及一种数字控制 的电流限制装置(控制最大电流输出的安全装置)。所述电力放大器可以将所产生的信号 放大到+/-150V。所述示波器是数字化的，并且能够对由所述放大器输送的电压和电流进行 取样。B.药用载体可以药用的载体有利于疫苗的保存和给对象施用。在本文中披露了可以药用的载 体的例子。其他可以药用的载体为本领域所熟知。可以药用的载体可以包括不同的成分，如缓冲液，普通盐水或磷酸缓冲的盐水， 蔗糖，盐和聚山梨酸酯。可以药用的载体的例子如下2.5-10mM TRIS缓冲液，优选大约 5mM TRIS缓冲液；25_100mM NaCl，优选大约75mM NaCl ；2. 5-10%蔗糖，优选大约5%蔗糖； 0. 01-2mMMgCl2 ；和0. 001 % -0. 01 %聚山梨醇酯80 (来自植物的)。PH优选为大约7. 0-9. 0， 更优选大约8.0。载体的一种具体例子包括5mM TRIS,75mM NaCl，5 %蔗糖，ImM MgCl2, 0. 005%聚山梨醇酯80，pH 8. 0。C.用药方案可以根据特定疫苗效力和诸如患者年龄，体重，性别和医学状况等因素；施用途 径；需要的效果；以及用药次数，确定合适的用药方案。特定疫苗的效力取决于不同因素， 如特定疫苗产生多肽的能力，所述多肽是在细胞中表达和加工的，并且以I类和II类MHC 复合物的形式出现。给患者施用的HCV编码核酸可以是包括病毒载体在内的不同类型载体的一部 分，如腺病毒载体，和DNA质粒疫苗。在涉及施用DNA质粒的不同实施方案中，给患者施用 大约0. I-IOmg质粒，以及给患者施用大约l_5mg质粒。在涉及施用病毒载体，优选腺病毒 载体的不同实施方案中，给患者施用大约IO5-IO11病毒颗粒，以及给患者施用大约IO7-IOki 病毒颗粒。病毒载体疫苗和DNA质粒疫苗可以单独施用，或者可以作为激发和加强施用方案 的一部分。激发和加强接种的一种混合形式，包括用DNA激发和用病毒载体疫苗加强，或用 病毒载体疫苗激发和用DNA疫苗加强。可以使用多次激发，例如大约2-4次或更多次。激发和加强之间的时间长度，通常从大约4个月到1年，不过，可以采用其他时间方案。采用DNA疫苗的激发方案，可优选用 于患有以前存在的腺病毒免疫反应的患者的场合。在本发明的一种实施方案中，将IX IO7-IX IO12腺病毒载体颗粒，优选大约 IX IOltl-I X IO11腺病毒载体颗粒直接施用于肌肉组织中。在初次接种之后，用腺病毒载体 或DNA疫苗进行加强。在本发明的另一种实施方案中，初次的接是通过直接进入肌肉组织中的DNA疫苗 进行的。在初次免疫之后，用腺病毒载体或DNA疫苗进行加强。可以同时施用诸如白介素-12，6厘义5 ，87-1，87-2，1 10，1^8-1的试剂，以便加强 免疫反应。所述试剂可以作为蛋白施用，或者通过使用核酸载体施用。 D.异源激发-加强异源激发_加强是一种混合形式，它包括使用一种类型的病毒载体进行激发，而 用另一种类型的病毒载体进行加强。所述异源激发_加强可包括相关的载体，如基于不同 腺病毒血清型的载体，以及关系更远的病毒，如腺病毒和痘病毒。在以下文献中披露了利用 痘病毒和腺病毒载体防止小鼠出现疟疾Gilbert等，Vaccine 20 :1039_1045，2002。涉及激发和加强的不同实施方案，包括表达所需抗原的以下类型的载体，如 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B :Ad5 载体，随后是Ad6 载体；Ad6 载体，随后是Ad5 载体；Ad5 载体，随后是痘病毒载体；痘病毒载体，随后是Ad5载体；Ad6载体，随后是痘病毒载体；和 痘病毒载体，随后是Ad6载体。激发和加强之间的时间长度，通常为大约4个月到1年，不过，可以使用其他时间 方案。最低时间方案应当足够允许免疫学休息。在一种实施方案中，这种休息是为期至少 6个月的时间。激发可能包括用一种类型的载体多次激发，如激发2-4次。存在于水痘病毒载体中的表达盒，应当包括一个激发子，该激发子是天然的，或 源于感兴趣的痘病毒或其他痘病毒成员。构建和使用不同类型的痘病毒型载体的不同 方法，包括基于痘苗病毒，修饰过的痘苗病毒，禽痘病毒，浣熊痘病毒，修饰过的痘苗病 毒Ankara，金丝雀痘病毒(如ALVAC)，禽痘病毒，牛痘病毒，和NYVAC的载体是本领域所 熟知的(Moss, Current Topics in Microbiology andlmmunology 158 :25_38,1982 ； Earl 等，In Current Protocolsin Molecular Biology, Ausubel 等 eds. , New York GreenePublishing Associates&ffiley Interscience ； 1991 16. 16. 1-16. 16. 7, Child 等，Virology 174(2) :625_9，1990 ；Tartaglia 等，Virology 188 :217_232，1992 ；美国专 利号 4，603，112，4，722，848，4，769，330，5，110，587，5，174，993，5，185，146，5，266，313， 5，505，941，5，863，542，和 5，942，235)。E.佐剂HCV疫苗可以与佐剂一起配制。对于DNA质粒疫苗来说，佐剂是特别有用的。佐剂 的例子包括明矾，AlPO4, alhydrogel，脂质-A及其衍生物或变体，弗氏不完全佐剂，中性脂 质体，含有疫苗和细胞因子的脂质体，非离子型嵌段共聚物和趋化因子。含有聚环氧乙烷(POE)和聚环氧丙烷(POP)的非离子型嵌段聚合物，如 Ρ0Ε-Ρ0Ρ-Ρ0Ε 嵌段共聚物可以用作佐剂(Newman 等，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15 :89_142，1998)。可以用与阴离子型表面活性剂组合的非离子型 嵌段共聚物增强核酸的免疫反应。
佐剂制剂的一种具体例子是含有CRL-1005 (CytRx ResearchLaboratories)，DNA， 和benzylalkonium chloride (BAK)的制剂。该制剂可以通过使用正位移移液管将纯的聚合 物添加到溶解在PBS中的质粒DNA的冷却(<5°C)溶液中而制备。然后对该溶液进行涡 旋搅拌，以便使所述聚合物溶解。在所述聚合物完全溶解之后，在低于所述聚合物的絮凝点 (大约6-7°C)的温度下获得了透明溶液。然后通过缓慢添加溶解在PBS中的BAK的稀释溶 液，将大约4mM BAK添加到溶解在PBS中的DNA/CRL-1005溶液中。在添加聚合物和BAK之 前，最初DNA浓度为大约6mg/mL，而最终DNA浓度为大约5mg/mL。在添加BAK之后，对该制 剂进行充分涡旋搅拌，然后使它的温度提高到高于絮凝点大约2V。冷却和混合同时使它的 温度提高到高于絮凝点大约2°C，重复进行若干次，直到该制剂的粒度为大约200-500nm， 该粒度是通过动态光学散射测定的。然后将该溶液保存在冰上一直到该溶液透明，然后放 在-70°C下保存。在使用之前，让该溶液在室温下解冻。F.疫苗保存可以利用不同类型的缓冲液保存腺病毒载体和DNA疫苗。例如，可以用下面的实 施例9中所披露的缓冲液A105保存载体。通过清除或螯合微量金属离子，可以改善对DNA的保存。可以将琥珀酸或苹果酸 的试剂和螯合剂用于改善DNA疫苗的稳定性。螯合剂的例子包括多种磷酸配体和EDTA。添 加诸如乙醇或甘油的非还原性自由基清除剂还可以防止因为自由基的产生对DNA质粒的 破坏。另外，在所述制剂中可以控制缓冲液的类型，PH，盐浓度，光照，以及消毒方法的类型， 以便优化所述DNA疫苗的稳定性。
实施例提供下面的实施例是为了进一步说明本发明的不同特征。这些实施例还说明了可 用于实施本发明的方法。这些实施例没有限定要求保护的本发明。实施例1 :Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 表达盒根据Ib亚型HCV BK菌株构建了编码HCVNS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的不同的基 因表达盒。所编码的序列具有下列任一种序列(1)活性NS5B序列(“NS" )，(2)失活的 NS5B序列(〃 NSmut" )，(3)具有失活的NS5B序列的密码子优化序列(“NSOPTmut")。 所述表达盒还包括CMV激发子/增强子和BGH聚腺苷酸化信号。NS核苷酸序歹Ij (SEQ. ID. NO. 5)与HCV BK菌株GenBank保藏号M58335相比，在 5952个核苷酸中有30个核苷酸不同。 NS氨基酸序列(SEQ. ID. NO. 6)与相应的Ib基因型 HCV BK菌株在1984个氨基酸中有7个氨基酸不同。为了能够起始翻译，在NS序列的5' 末端存在一个ATG密码子。在NS序列的3 ‘末端存在一个TGA终止序列。NSmut核苷酸序列(SEQ. ID. NO. 2，图2)与NS序列相似。NSmut和NS之间的差别 包括NSmut具有改变了的NS5B催化位点；在5 ‘末端具有一个最佳核糖体结合位点；以及 在3 ‘末端具有一个TAAA终止序列。NS5B上的改变包括5138-5146号碱基，这些碱基编码 1711-1713号氨基酸。所述改变导致了氨基酸GlyAspAsp改变成AlaAlaGly，并且产生了失 活形式的NS5B RNA-依赖型RNA-聚合酶NS5B。NSOPTmut序列(SEQ. ID. NO. 3，图3)是根据由NSmut编码的氨基酸序列设计的。使 用 GCG(Wisconsin Package version 10, Genetics Computer Group, GCG, Madison, Wise)BACKTRANSLATE程序将NSmut氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列。为了制备NSOPTmut核苷 酸序列，其中的每一种氨基酸是由相应的最常见的人密码子编码的，该程序是这样进行的 选择最可能的氨基酸序列的产生作参数，并且规定在GCG软件包内可获得的高度表达的人 基因(human-high, cod)的密码子频率表作为翻译方案。实施例2 制备具有NS，NSmut或NSOPTmut序列的pVlJns质粒含有NS，NSmut或NSOPTmut序列的pVlJns质粒是通过以下方法制备和表征的
具有NS序列的pVl Jns质粒将来自HCV BK型菌株的编码区Met-NS3-NS4A-NS4B_NS5A和编码区Met_NS3 -NS4A-NS4B-NS5A-NS5B (Tomei 等，J. Virol. 67 :4017_4026，1993)克隆到 pcDNA3 质粒 (Invitrogen)上，分别制备 pcD3_5a 和 pcD3_5b 载体。用 HindIII 消化 PcD3_5A，用 Klenow 填充片段补平末端，随后用XbaI消化，以便产生相当于Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A的编码区 的片段。将该片段克隆到pVlJns-poly上，用BglII消化，用Klenow填充片段补平末端，随 后用Xba I消化，制备pVlJnsNS3-5A。pVlJns-poly 是 pVlJnsA 质粒的衍生物(Montgomery 等，DNA andCell Biol. 12 777-783，1993)，通过将含有XbaI, PmeI, PacI的识别位点的多接头插入独特的BglII和 NotI限制位点进行修饰。具有NS序列的pVlJns质粒(pVlJnsNS3-5B)是通过以下方法获 得的同源重组到细菌菌株BJ5183中，用通过XbaI和NotI消化线性化的PV1JNS3_5A和含 有大约200bp的NS5A，NS5B编码序列和大约60bp的BGH聚腺苷酸化信号共转化。所得到 的质粒被称为pVlJns-NS。pVlJns-NS可以归纳如下碱基pVlJnsA 的 1-1881 号碱基一个额外的 AGCTT随后是 Met-NS3_NS5B 序列(SEQ. ID. NO. 5)然后是 wt TGA终止子一个额外的 TCTAGAGCGTTTAAACCCTTAATTAAGG(SEQ. ID. N0. 14)碱基pVlJnsA 的 1912-4909 号碱基具有NSmut序列的pVl Jns质粒通过添加完整Kozak序列修饰VlJnsNS3-5A质粒的5'末端的NS3编码序列。 该质粒(VlJNS3-5AkoZak)是通过重组到细菌菌株BJ5183中，用通过A/HI消化线性化的 V1JNS3-5A和包括内含子A的近端部分，限制位点BglII，完整的Kozak翻译起始序列和NS3 编码序列的一部分的PCR片段共转化获得的。通过用Xba I消化使所得到的质粒(VlJNS3-5AkoZak)线性化，并且与包括大约 200bp的NS5A，NS5B突变序列，强翻译终止序列TAAA和大约60bp的BGH聚腺苷酸化信号的 PCR片段一起共转化到细菌菌株BJ5183中。所述PCR片段是通过组装两个22bp的重叠片段 获得，其中，通过用于扩增它们的寡核苷酸引入了突变。所得到的质粒被称pVlJns-NSmut。pVlJns-NSmut 可以归纳如下碱基pVlJnsA 的 1-1882 号碱基随后是 kozak Met-NS3-NS5B (mut) TAAA 序列(SEQ. ID. NO. 2)一个额外的 TCTAGA
碱基 pVlJnsA 的 1925-4909 号碱基
具有NSOPTmut序列的pVI Jns质粒通过位于该基因5’和3’末端的BamHI和SalI限制位点消化人密码子优化的合 成基因(NSOPTmut)，它具有突变的NS5B，以便破坏酶促活性，完整的Kozak翻译起始序列和 强翻译终止序列。然后将该基因克隆到存在于VlJnsA质粒的多接头上的BglII和SalI限 制位点上，以便产生VlJns-NSOPTmut。pVIJns-NSOPTmut 可以归纳如下碱基pVlJnsA 的 1-1881 号碱基一个额外的 C然后是kozak Met-NS3_NS5B (optmut) TAAA 序列(SEQ. ID. NO. 3)一个额外的 TTTAAATGTTTAAAC(SEQ. ID. NO. 15)碱基pVIJnsA 的 1905-4909 号碱基质粒表征通过转染在补充了 L-谷氨酰胺(最终浓度4mM)的10 % FCS/DMEM中生长的 SEK293细胞，测试HCV NS蛋白的表达。在转染之前24小时，将细胞铺平板到直径35毫米 的6个孔中，以便在转染的当天到达90% -95%的铺满度。使用LIPOFECTAMINE 2000试剂， 用40纳克质粒DNA (事先确定为非饱和DNA用量)和100纳克含有Rous肉瘤病毒激发子 控制的荧光素酶报导基因的pRSV-Luc质粒共转染。在37°C下，将细胞保持在CO2培养箱中 48小时。用Triton/TEN缓冲液制备细胞提取物。将所述提取物的荧光素酶活性标准 化，并且在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上对系列稀释液进行电泳。将蛋白转移到硝酸纤维素 上，并且用针对NS3，NS5A和NS5B的抗体分析，以便评估表达强度和正确的蛋白水解裂解。 用模拟转染的细胞作为阴性对照。在图12中示出了来自测试pVlJnsNS，pVlJnsNSmut和 pVIJnsNSOPTmut的典型实验的结果。实施例3 用质粒DNA载体对小鼠进行免疫将DNA 质粒 pVlJns-NS，pVlJns-NSmut 和 pVlJnsNSOPTmut 注射到不同的小鼠株 中，以便评估它们诱导抗HCV免疫反应的潜力。两个不同的株(Balb/C和C57Black6，N = 9-10)用25或50 μ g的DNA进行肌内注射，随后进行电脉冲。每一只动物每隔3周接受2 个剂量。在两次用药之后，通过对细菌表达的NS3蛋白酶结构域进行ELISA，测定在 C57BIack6小鼠体内诱导的针对NS3蛋白的体液免疫反应。在用所有三种载体免疫的动 物体内检测到对测试抗原特异的抗体，几何平均效价(GMT)在94000-133000范围内(表 1-3)。表1 :pVljns-NS
GMT 小鼠 i 1 2 Γ~34~~ 5G7~ΓΓ~9~
效价.1 105466 I 891980 78799 39496 543542 182139 32351 95028 67800 94553
表 2 :pVljns-NSmut
权利要求
一种编码SEQ ID NO1的Met NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B多肽或与SEQ ID NO1相差1 12个氨基酸的多肽的核苷酸序列，前提是所述多肽具有足够的蛋白酶活性对它自身进行加工，以便产生NS5B蛋白，并且所述NS5B蛋白是无酶促活性的，其中所述多肽能够产生抗HCV的细胞介导的免疫反应。
2.如权利要求1的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQIDNO 2的编码序列。
3.如权利要求1的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列编码SEQID NO 1的多肽。
4.如权利要求3的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQIDNO :3，SEQ ID NO=IO 或SEQ ID NO 11的编码序列。
5.如权利要求3的核酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQIDNO :3的编码序列。
6.一种表达载体，其包含权利要求1-5中任意一项的核苷酸序列，其中所述表达载体 能够在人细胞中由所述核苷酸序列表达所述多肽。
7.—种核酸，包括能够在人细胞中表达SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽或与SEQ ID NO 1相差1_12个氨基酸的多肽的基因 表达盒，前提是所述多肽能够对它自身进行加工，以便产生无酶促活性的NS5B蛋白，所述 基因表达盒包括a)与编码所述多肽的核苷酸序列转录性偶联的启动子；b)与所述核苷酸序列功能性偶联的5'核糖体结合位点；c)与所述核苷酸序列的3'末端连接的终止子；和d)与所述核苷酸序列功能性偶联的3'聚腺苷酸化信号；前提是所述多肽能够产生抗HCV的细胞介导的免疫反应。
8.如权利要求7的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQID N0:2，SEQ ID NO :3,SEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO 11，或者与 SEQID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO 11相差1-50个核苷酸。
9.如权利要求8的核酸，其中，所述核酸是适合给人施用的质粒，并且还包括原核复制 起点和编码选择标记的基因。
10.如权利要求9的核酸，其中，所述核苷酸序列编码SEQIDNO :1的多肽。
11.如权利要求10的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11的编码序列。
12.如权利要求10的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQID NO 2或SEQ ID NO 3的 编码序列。
13.如权利要求10的核酸，其中，所述启动子是包含内含子A的人立即早期巨细胞病毒 启动子，所述5’核糖体结合位点为SEQ IDNO :12，并且所述3’聚腺苷酸化是牛生长激素聚 腺苷酸化信号。
14.如权利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因组质粒，它的组成是选择标记， 复制起点，和包括El缺失，E3缺失和所述表达盒的重组腺病毒载体基因组。
15.如权利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因组质粒，它的组成是选择标记， 复制起点，和a)从Ad5或Ad6的碱基对1到碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述第一区连接的El平行或El反向平行取向的基因表达盒；c)与所述表达盒连接的从Ad5的碱基对3511到碱基对5548的第二腺病毒区或从Ad6 的碱基对3508到碱基对5541的第二腺病毒区；d)与所述第二区连接的从Ad5的碱基对5549到碱基对28133或从Ad6的碱基对5542 到碱基对28156的第三腺病毒区；e)与所述第三区连接的从Ad5的碱基对30818到碱基对33966或从Ad6的碱基对 30789到碱基对33784的第四腺病毒区；和f)与所述第四区连接的从Ad5的碱基对33967到碱基对35935或从Ad6的碱基对 33785到碱基对35759的第五腺病毒区。
16.如权利要求15的核酸，其中，所述第一区是Ad5，所述第二区是Ad5，所述第三区是 Ad5，所述第四区是Ad5，并且所述第五区是Ad5。
17.如权利要求16的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述 5'核糖体结合位点为SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信 号。
18.如权利要求17的核酸，其中，所述表达盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQID NO 10 或 SEQ ID NO :11。
19.如权利要求15的核酸，其中，所述第一区为Ad5或Ad6，所述第二区为Ad5或Ad6， 所述第三区为Ad6，所述第四区为Ad6，并且所述第五区为Ad5或Ad6。
20.如权利要求19的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述 5'核糖体结合位点为SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信 号。
21.如权利要求20的核酸，其中，所述表达盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQID NO 10 或 SEQ ID NO :11。
22.如权利要求20的核酸，其中，所述表达盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :3。
23.如权利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因组质粒，它包括复制起点，选择 标记,和a)从Ad5或Ad6的碱基对1到碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述第一区连接的Ad5的碱基对3511到碱基对5548或从Ad6的碱基对3508到 碱基对5541的第二腺病毒区；c)与所述第二区连接的从Ad5的碱基对5549到碱基对28133或从Ad6的碱基对5542 到碱基对28156的第三腺病毒区；d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；e)与所述基因表达盒连接的从Ad5的碱基对30818到碱基对33966或从Ad6的碱基对 30789到碱基对33784的第四腺病毒区；和f)与所述第四区连接的从Ad5的碱基对33967到碱基对35935或从Ad6的碱基对 33785到碱基对35759的第五腺病毒区。
24.如权利要求23的核酸，其中，所述第一区是Ad5，所述第二区是Ad5，所述第三区是 Ad5，所述第四区是Ad5，所述第五区是Ad5。
25.如权利要求24的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述5'核糖体结合位点为SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
26.如权利要求23的核酸，其中，所述第一区是Ad5或Ad6，所述第二区是Ad5或Ad6， 所述第三区是Ad6，所述第四区是Ad6，所述第五区是Ad5或Ad6。
27.如权利要求26的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述 5'核糖体结合位点为SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
28.如权利要求8的核酸，其中，所述核酸是由包括El缺失，E3缺失，和所述表达盒的 腺病毒载体基因组组成的腺病毒载体。
29.如权利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒载体，它包括a)从Ad5或Ad6的碱基对1到碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述第一区连接的El平行或El反向平行取向的基因表达盒；c)与所述表达盒连接的从Ad5的碱基对3511到碱基对5548或从Ad6的碱基对3508 到碱基对5541的第二腺病毒区；d)与所述第二区连接的从Ad5的碱基对5549到碱基对28133或从Ad6的碱基对5542 到碱基对28156的第三腺病毒区；e)与所述第三区连接的从Ad5的碱基对30818到碱基对33966或从Ad6的碱基对 30789到碱基对33784的第四腺病毒区；和f)与所述第四区连接的从Ad5的碱基对33967到碱基对35935或从Ad6的碱基对 33785到碱基对35759的第五腺病毒区。
30.如权利要求29的核酸，其中，所述第一区是Ad5，所述第二区是Ad5，所述第三区是 Ad5，所述第四区是Ad5，所述第五区是Ad5。
31.如权利要求30的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述 5'核糖体结合位点为SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信 号。
32.如权利要求31的核酸，其中，所述表达盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQID NO 10 或 SEQ ID NO :11。
33.如权利要求29的核酸，其中，所述第一区是Ad5或Ad6，所述第二区是Ad5或Ad6， 所述第三区是Ad6，所述第四区是Ad6，所述第五区是Ad5或Ad6。
34.如权利要求33的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述 5'核糖体结合位点为SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信 号。
35.如权利要求34的核酸，其中，所述表达盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQID NO 10 或 SEQ ID NO :11。
36.如权利要求34的核酸，其中，所述表达盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :3。
37.如权利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒载体，它包括a)从Ad5或Ad6的碱基对1到碱基对450的第一腺病毒区；b)与所述第一区连接的从Ad5的碱基对3511到碱基对5548或从Ad6的碱基对3508到碱基对5541的第二腺病毒区；c)与所述第二区连接的从Ad5的碱基对5549到碱基对28133或从Ad6的碱基对5542 到碱基对28156的第三腺病毒区；d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；e)与所述基因表达盒连接的从Ad5的碱基对30818到碱基对33966或从Ad6的碱基对 30789到碱基对33784的第四腺病毒区；和f)与所述第四区连接的从Ad5的碱基对33967到碱基对35935或从Ad6的碱基对 33785到碱基对35759的第五腺病毒区。
38.如权利要求37的核酸，其中，所述第一区是Ad5，所述第二区是Ad5，所述第三区是 Ad5，所述第四区是Ad5，所述第五区是Ad5。
39.如权利要求37的核酸，其中，所述第一区是Ad5或Ad6，所述第二区是Ad5或Ad6， 所述第三区是Ad6，所述第四区是Ad6，所述第五区是Ad5或Ad6。
40.一种由SEQ ID NO :4或它的衍生物的核酸序列组成的腺病毒载体，其中，所述衍生 物具有存在于SEQ ID NO :4中的HCV多蛋白编码序列，该序列被SEQ ID NO :3,SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO :11的HCV多蛋白编码序列所取代。
41.一种培养的重组细胞，包括权利要求6的表达载体。
42.一种培养的重组细胞，包括权利要求9-27和28-40中任意一项的核酸。
43.一种药物组合物，包括权利要求9-13，28-40中任意一项的核酸，以及可以药用的 载体。
44.有效量的如权利要求9-13和28-40中任意一项的核酸在制备治疗HCV感染的药物 中的用途。
全文摘要
丙型肝炎病毒疫苗，本发明涉及Ad6载体和编码含有失活的NS5B RNA-依赖型RNA聚合酶区的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸。所述核酸特别适合用作提供多种抗原的腺病毒载体或DNA质粒疫苗的成分它，用于产生针对HCV的HCV特异性细胞介导的免疫(CMI)反应。
文档编号A61K39/00GK101988071SQ200910251298
公开日2011年3月23日 申请日期2002年10月10日 优先权日2001年10月11日
发明者A·J·贝特, A·卢扎戈, A·尼科西亚, A·拉姆, D·C·卡斯罗, E·A·埃米尼, J·W·施弗, R·科尔特斯, S·科罗卡 申请人:默沙东公司;P.安杰莱蒂分子生物学研究所