专利名称：一种基因传递系统的三维纳米支架及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及三维非病毒基因传递系统，具体地说，涉及三维纳米支架、种子细胞的 培养及其基因转染。
背景技术：
基于组织工程三维支架的非病毒基因传递系统(3 dimensional scaffolds genedelivery system, 3DS-GDS)已经成为非病毒型⑶S研究的又一重要方向。种子细胞， 三维支架及生长因子是组织工程研究的三大要素，三维支架和生长因子构成细胞赖以生存 的微环境。细胞培养过程中，生长因子往往直接加入培养液中，由于生长因子半衰期短，易 被稀释和降解，这种“外加法”需要反复大剂量给药，繁琐且价格非常昂贵。通过转基因技 术将生长因子基因导入种子细胞后，可使细胞自身表达生长因子，这种“内加法”无疑是有 利于组织的修复与再生。传统的基因传递技术，无论是病毒型还是非病毒型，一般只是瞬时 转染，难以实现生长因子持续高效的表达。为此，人们尝试在三维支架中包嵌DNA，以便基 因随着支架的逐步降解缓慢释放，持续转染细胞(参见StorrieH，Mooney DJ. Sustained delivery of plasmid DNA from polymeric scaffolds fortissue engineering. Adc Drug Deliv Rev. ,2006,58 (4) 500~514 ；Tabata Y.Regenrative inductive therapy based on DDS technology of protein and gene. JDrug Target,2006,14(7) :483_495)。 目前可用于基因缓释的支架材料有(参见CaptioRM，Sepctor Μ. Collagen scaffolds for nonviral IGF-I gene delivery in articularcartiIage tissue engineering[J]. Gene Ther. 2007,14(9) 721-32 ；Yuanyuan W, Li L, Shengrong G. Characterization of biodegradable and cytocompatiblenano-hydroxyapatite/poly caprolactone porous scaffolds in degradation in vitro [J].Polymer Degradation and Stability, 2009,1-7)细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)、天然或合成的高分子及其共聚 物等，其中 ECM (参见SepidehHeydarkhan-Hagval 1, Katja Schenke-Layland，Andrew P.Dhanasopon, et al. Three-dimensional electrospun ECM-based hybrid scaffolds for cardiovasculartissue engineering[J]. Biomaterials,2008,29 (19) 2907-2914) 是由邻近细胞分泌的蛋白纤维、蛋白聚糖和非纤维蛋白等成分通过化学和物理交联组成的 具有三维结构的网状结构，为组织和细胞的生长提供支撑和弹性，与细胞特别亲合、易于模 拟体内环境。Capito等将胰岛素样生长因子的基因与脂质体转染试剂复合后，与ECM(胶 原-氨基聚糖)三维支架交联，在两周培养期内仅释放出约1%，连续表达的胰岛素样生 长因子可显著促进组织的再生(参见Captio RM, Sepctor M. Collagen scaffolds for nonviralIGF-I gene delivery in articular cartilage tissue engineering[J]. Gene Ther. 2007，14(9) :721_32)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基于组织工程三维支架的非病毒基因传递系统及其在非病毒基因传递系统中的应用。本发明的技术方案如下一种基因传递系统的三维纳米支架，它是由胶原、壳聚糖以及纤维粘结蛋白 (Fibronectin, FN)组成的三维纳米支架，其特征是它包含有载有基因的磷酸钙复合纳米 粒，它是一种疏松多孔的三维纳米支架，所述的胶原、壳聚糖、纤维粘结蛋白和交联剂戊二 醛的质量比为1 1 0. 0005 0.0124 1 100 0. 08 0. 24，所述的纤维粘结蛋 白为含有天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的纤维粘结蛋白，所述的载有基因的磷酸钙 复合纳米粒是球形的、粒径小于50nm的载有治疗基因的磷酸钙纳米粒，其含量为三维纳米 支架总质量的0.01% -1%。一种制备上述的基因传递系统的三维纳米支架的方法，它是在胶原醋酸溶 液0. 1 Iml中加入壳聚糖醋酸溶液0. 1 1ml，加入0. 25%戊二醛50yL Iml 交联，室温过夜，冷冻干燥，缓冲液(PBS)洗涤三次，细胞培养基(Dulbecco，s Modified EagleMedia, DMEM)浸泡过夜后再冷冻干燥，用PBS洗涤，加入载有治疗基因的磷酸钙纳米 粒0. 6 μ g 60 μ g和纤维粘结蛋白(FN) 0. 05 μ g 8 μ g，冷冻干燥得到基因传递系统的三 维纳米支架。本发明的基因传递系统的三维纳米支架在非病毒基因传递系统中的应用。实验表明应用本发明的基因传递系统的三维纳米支架的非病毒基因传递系统具 有高效缓释的特性，其所负载的基因的表达可达到外加因子的水平。本发明的有益之处是本发明是在三维支架中加入如含有RGD序列的FN及磷酸 钙-TGFi3 1复合纳米粒，形成新型三维非病毒纳米基因传递系统，这种新型的传递系统具 有高效缓释的特性，其所负载的基因的表达可达到外加因子的水平。为非病毒基因传递及 组织工程修复方面提供了新的思路。
图1自制载有治疗基因磷酸钙纳米粒的电镜2为胶原_壳聚糖-FN三维支架扫描电镜图(不含载基因的磷酸钙纳米粒)。图3为含有载基因磷酸钙纳米粒的三维支架扫描电镜图(箭头所示为复合纳米 粒)。图4为三维非病毒纳米基因传递系统接种细胞的扫描电镜图(箭头所示为细胞)。图5为ELISA法测定三维纳米支架与游离DNA+支架在不同时间(3_15天)细胞 蛋白表达浓度。(*P > 0. 05，**P < 0. 05，***P < 0. 01)。图6为ELISA法测定三维纳米支架与市售转染试剂脂质体lipfeCtamineTM2000 3-15天细胞表达的目的蛋白结果图(*P > 0. 05，**P < 0. 05，_P < 0. 01)。
具体实施例方式本发明通过实施例作进一步的说明。实施例1 载有治疗基因的磷酸钙纳米粒的制备(1)制备将0. IM Igepal C0-520溶于25ml环己烷，加入1. 36M氯化钙，搅拌混勻形成微乳1;将0. IM Igepal C0-520, 50 μ ITis-HCL (pH 7.4)溶于25ml环己烷，加入磷酸氢二钠和TGF-β 1质粒，加入磷酸氢二钠的质量为3. 4785 μ g，磷酸氢二钠与质粒的质量 比为0. 1 1 10 1，搅拌形成微乳2，将微乳2缓慢滴加到微乳1中，搅拌lOmin，形成 载有基因的磷酸钙复合纳米粒的乳液。(2)载有基因的磷酸钙复合纳米粒的分离(a)层析柱的预处理
取90g硅球加入含有0. 336nL氨基丙基三乙氧基娃烷(aminopropyltriethoxysilane, 八卩5)，1.511^冰乙酸，7.51^双蒸水的150mL乙醇溶液中，搅拌过夜，70°C烘干备用；(b)载有基因的磷酸钙复合纳米粒的分离将上述制得的载有基因的磷酸钙复合纳米粒乳液过硅胶层析柱，先用无水乙醇洗 脱环己烷及游离的质粒和盐，然后用浓度为5X10_4mol/L的NaCl的70%乙醇溶液洗脱载 基因的磷酸钙复合纳米粒；(c)载有基因的磷酸钙复合纳米粒乙醇液的浓缩将步骤2所得的含有载有基因的磷酸钙复合纳米粒的乙醇液在37°C旋转减压蒸 发6h除去乙醇，浓缩液置于12KD的透析袋中，置于磷酸盐缓冲液中，4°C透析过夜，即得到 载有基因的磷酸钙复合纳米粒。得到的载有基因的磷酸钙复合纳米粒的电镜照片见图1。实施例2 —种作为对比的三维支架的制备取胶原醋酸溶液0. Iml加入壳聚糖溶液0. 1ml，冷冻干燥，加入0. 25 % 戊二醛50 μ L交联，室温过夜，冷冻干燥，PBS洗涤三次，冷冻干燥，加入纤维粘结蛋白 (FN) 1 μ g，得到不含载有治疗基因的磷酸钙纳米粒的三维支架，其电镜照片见图2。实施例3 本发明的三维纳米支架的制备取胶原醋酸溶液0. Iml加入壳聚糖溶液0. 1ml，冷冻干燥，加入0. 25 % 戊二醛50yL交联，室温过夜，冷冻干燥，PBS洗涤三次，20min/每次，细胞培养基 (Dulbecco' sModified Eagle Media, DMEM)浸泡过夜；PBS 洗涤三次，20min/每次，加入实 施例1制得的载有基因的磷酸钙复合纳米粒1 μ g和FNl μ g，冷冻干燥得到本发明的三维纳 米支架，其电镜照片见图3。实施例4 本发明的三维纳米支架的制备取胶原醋酸溶液0. Iml加入壳聚糖溶液10ml，冷冻干燥，加入0. 25 % 戊二醛Iml交联，室温过夜，冷冻干燥，PBS洗涤三次，20min/每次，细胞培养基 (Dulbecco' sModified Eagle Media, DMEM)浸泡过夜；PBS 洗涤三次，20min/每次，加入实 施例1制得的载有基因的磷酸钙复合纳米粒60 μ g和FN8 μ g，冷冻干燥得到本发明的三维 纳米支架，其形貌和性能同实施例3制得的三维纳米支架。实施例5 大鼠间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)的培养将SD大鼠拉颈处死，体积分数为75%乙醇浸泡3 5min，无菌条件下取出胫骨 和股骨；将其两端干骺端切除，显露骨髓腔，用无菌注射器吸取适量PBS彻底冲洗骨髓腔； 反复吹打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散；所获骨髓单细胞悬液沿管壁缓慢滴加于预加 的Percoll分离液(相对体积质量1. 073)的离心管中，骨髓单细胞悬液与分离液的比例为 1 1 ;2000rpm，离心20min，吸取中间云雾状细胞层，用PBS洗涤3次；重新悬起细胞，加入 完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基)，置于培养瓶中，37°C体积分数 为5%的CO2培养箱中培养。
实施例6 三维纳米支架的体外转染(1)取适量实施例3制得的三维纳米支架置于24孔板中，将MSC按2X 104/mL接 种于支架上，加入完全培养基至500μ L，置37°C、5% CO2培养箱中培养；分别在3、6、9、12、 15d收集上清培养液于-20°C保存，细胞继续用完全培养基进行培养。接种有细胞的三维支 架电镜照片见图4。(2)对照组一取适量的三维支架置于24孔板中，将MSC按2 X 104/mL接种于支架 上，加入完全培养基至500 μ L，置37°C、5% CO2培养箱中培养；24h，吸弃前一天铺板的培养 液，加入游离质粒以及无血清的DMEM培养液至500μ L，置37°C、5% CO2培养箱中培养；分 别在3、6、9、12、15d收集上清培养液于-20°C保存，细胞继续用完全培养基进行培养。(3)对照组二 取适量的三维支架置于24孔板中，将MSC按2 X 104/mL接种于支架 上，加入完全培养基至500 μ L，置37°C、5% CO2培养箱中培养；24h，吸弃前一天铺板的培养 液，用PBS洗涤后，加入市售转染试剂脂质体lipfeCtamineTM2000以及无血清的DMEM培养 液至500 μ L，继续培养6h ；换用完全培养基继续培养。分别在3、6、9、12、15d收集上清培养 液于-20°C保存，细胞继续用完全培养基进行培养。
实施例7 体外转染细胞的转染效率测定收集细胞培养物上清，离心，加到酶标板中。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。 除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品lOOul，注意不要有气泡，轻轻混勻，酶标板加 上盖，37°C反应120分钟。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液lOOul， 37°C，60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。每孔加检测溶液B工作液lOOul, 37°C，60分 钟，洗板5次，甩干。依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光显色30分钟(此时肉眼可见标准 品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显)。依序每孔加终止溶液50ul，终止 反应(此时兰色立转黄色)。用酶联免疫检测仪在450nm波长测量各孔的光密度(0D值)， 测定目的蛋白表达量，其结果见图5和图6。三维纳米支架在3-15天内，蛋白表达水平维持在lOng/ml左右，显著高于对照 组一(游离DNA+三维支架)(P < 0. 01)。从第6天开始，对照组二(市售转染试剂脂质 体lipfectamine 2000+三维支架)的蛋白表达水平远低于三维纳米支架(P < 0. 05或P < 0.01)，说明嵌合有载有基因的磷酸钙复合纳米粒的三维纳米支架具有明显的长效、缓释 特征。
权利要求
一种基因传递系统的三维纳米支架，它是由胶原、壳聚糖以及纤维粘结蛋白(Fibronectin，FN)组成的三维纳米支架，其特征是它包含有载有基因的磷酸钙复合纳米粒，它是一种疏松多孔的三维纳米支架，所述的胶原、壳聚糖、纤维粘结蛋白和戊二醛的质量比为1∶1∶0.0005∶0.0124～1∶100∶0.08∶0.24，所述的纤维粘结蛋白为含有天门冬氨酸序列的纤维粘结蛋白，所述的载有质粒的磷酸钙复合纳米粒是球形的、粒径小于50nm的载有治疗基因的磷酸钙纳米粒，其含量为三维纳米支架总质量的0.01％～1％。
2.一种制备权利要求1所述的基因传递系统的三维纳米支架的方法，其特征是它是 将质量百分浓度为的胶原醋酸溶液加入壳聚糖，使壳聚糖的质量百分浓度达到1%，冷 冻干燥，加入0. 25%，50 y L戊二醛交联，室温过夜后再冷冻干燥，用缓冲液洗涤，加入载有 治疗基因的磷酸钙纳米粒0. 6 ii g 60 ii g和纤维粘结蛋白0. 05 ii g 8 ii g，冷冻干燥得到 基因传递系统的三维纳米支架。
3.根据权利要求1所述的基因传递系统的三维纳米支架在非病毒基因传递系统中的 应用。
全文摘要
一种基因传递系统的三维纳米支架，它是由胶原、壳聚糖以及纤维粘结蛋白组成的三维纳米支架，其特征是它包含有载有基因的磷酸钙复合纳米粒，它是一种疏松多孔的三维纳米支架，所述的胶原、壳聚糖、纤维粘结蛋白和戊二醛的质量比为1∶1∶0.0005∶0.0124～1∶100∶0.08∶0.24，所述的纤维粘结蛋白为含有天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的纤维粘结蛋白，所述的载有质粒的磷酸钙复合纳米粒是球形的、粒径小于50nm的载有治疗基因的磷酸钙纳米粒，其含量为三维纳米支架总质量的0.01％～1％。本发明的基因传递系统的三维纳米支架在3-15天内，蛋白表达水平维持在10ng/ml左右，说明嵌合有载有基因的磷酸钙复合纳米粒的三维纳米支架具有明显的长效、缓释特征。
文档编号A61L31/16GK101829367SQ20091026411
公开日2010年9月15日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者余江南, 徐希明, 曹霞, 苏伟燕 申请人:江苏大学