专利名称：：一种增强原花青素生物活性的分子修饰方法
技术领域：
：本发明涉及一种对天然植物多酚进行分子修饰的方法以落叶松或其它松属树皮提取分离的原花青素为原料，通过对其分子中的羟基没食子酰化，合成没食子酰化原花青素，从而实现增强原花青素抗氧化及清除自由基生物活性。
背景技术：
：原花色素(proanthocyanidins)是植物体内生成的一大类天然多酚，原花青素(procyanidins)是其中分布最广、数量最多的一种。1951年法国JacquesMasquelier首次发现原花青素具有抗氧化性能，并成功地从海岸松树皮中提取得原花青素。1967年美国Joslyn等、1976年Bombardelli等又相继发现了从葡萄籽、皮中提取分离原花青素的方法，扩展了原花青素的资源。从上世纪80年代以来，国外对于原花青素的资源开发、提取分离方法、结构鉴定及其生物活性、药用功能等进行了大量研究，已有多种产品问世，例如从海岸松和其它松属树皮中提取的原花青素(商品名Pycnogenol，中文名为碧萝芷)，从葡萄籽、皮提取的原花青素(商品名Gr即enol)等。众多研究已阐明，原花色素植物多酚具有抗氧化活性是基于多酚具有还原性，酚羟基作为H供体有捕获、钝化自由基的功能，以及多酚羟基能络合对自由基反应起催化作用的金属离子(铁，铜等)、从而抑制自由基链式反应的扩展。人们早已知悉食用油脂和富脂食品的氧化变质是由氧自由基引发。此外，现代医学方法证明，人体新陈代谢产生的自由基副产物以及通过外界辐射等途径引发自由基可对人体脂质、蛋白质、核酸、生物膜等生物大分子造成损伤，从而引发多种疾病，如心脑血管病、癌变、衰老、炎症等。为此，国内外倍加重视原花青素作为一类具有抗氧化清除自由基作用的天然药物和保健品的开发研究。我国从上世纪80年代起已加入世界研究原花色素的行列，但总体上仍处于植物化学研究阶段。近十几年来，国内在原花青素的提取和纯化工艺及其功能研究有很大进展，已有厂家生产葡萄籽、皮和马尾松树皮的提取物，作为天然抗氧化剂进入市场。纵观国内外迄今关于原花青素的研究报道，以往研究只着眼于其本身固有的功能效应，如作为一种抗氧化及自由基清除剂，在保健品、医药、食品、化妆品中得到多方面应用。但是，对通过分子结构修饰以增强生物活性的研究并未予以关注。
发明内容为了解决现有技术主要集中在提取分离及药用研究上，本发明提供一种增强原花青素生物活性的分子修饰方法，通过酰化反应在原花青素分子中羟基的位置上引入一种多酚羧酸——没食子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸)，合成没食子酰化原花青素，从而使其抗氧化、清除自由基活性得到增强。本发明的方案为一种增强原花青素生物活性的分子修饰方法，步骤为第一步，合成三乙酰基没食子酰化原花青素按原花青素与3，4，5-三乙酰基没食子酰氯物质的量比为l:51:7(mol:mol)，将原花青素与3，4，5-三乙酰基没食子酰氯在溶剂中催化剂存在下于50IO(TC下进行酰化反应，反应结束后减压蒸馏去除溶剂和过量催化剂，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压去除乙酸乙酯，干燥，得到中间产物三乙酰基没食子酰化原花青素；所述的原花青素为从落叶松或其它松属树皮提取分离得到的原花青素。所述的催化剂为吡啶，用量为三乙酰基没食子酰氯的物质的量(mol)的1.01.5倍，吡啶属弱碱性有利于防止没食子酰基酯键被破坏。所述的溶剂为1，4-二氧六环，1，4-二氧六环对原花青素和酰氯的溶解性好，可以实现均相反应；而且沸点也比较合适。第二步，脱除乙酰保护基向第一步反应得到的三乙酰基没食子酰化原花青素丙酮溶液中加碱溶液，控制溶液pH值在7.58.5，在05。C下脱除乙酰基，然后，调节溶液pH值在24;所述的碱溶液为0.050.lmol/L的NaOH或K0H。所述的酸可以使用0.lmol/L的HC1或硫酸、硝酸等酸来调节pH。第三步，纯化处理将第二步脱除乙酰保护基后的溶液，蒸除丙酮得固体产物，将固体产物溶于乙酸乙酯、水洗，蒸除乙酸乙酯即得到目标产物没食子酰化原花青素。本发明方法的可行性依据是(1)已往的研究亦已阐明，植物多酚的抗氧化性、清除自由基活性的强弱取决于其分子中酚羟基的数量及酚羟基的位置。邻酚羟基多则活性强，分子结构中含有没食子酰基能增强其活性。本发明基于上述已得到验证的结论，目标产物没食子酰化原花青素和原态原花青素生物活性功能比较试验亦证实了本发明方法获得预期效果。(2)基于原花青素分子结构特点，有引入没食子酰基的可能，本发明采用从落叶松树皮提取并纯制得原花青素作为试料，原花青素的化学结构式如下OH这是一种以黄烷-3-醇为结构单元的聚合物，其A环和B环中的酚羟基以及C环的醇羟基都具有反应活性，可以在一定反应条件下与没食子酰氯反应，从而引入没食子酰基。为了避免没食子酰基的酚羟基在反应过程中遭受破坏，采取了先将其进行乙酰化保护，在酰化反应后再脱去乙酰基，恢复酚羟基原态的方法。其效果是①将原先对功能活性无贡献的C环C3位的醇羟基通过没食子酰化使其具有功能性。②通过酚羟基的没食子酰化，以耗用一个酚羟基的代价获得增加三个邻酚羟基的功能效益。本发明提供一种通过酰化反应引入没食子酰基，对原花青素分子结构进行修饰以增强其生物活性的方法，合成具有更强抗氧化与清除自由基功能的没食子酰化原花青素。本发明采用的技术方案如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中w——羟基的乙酰保护基，m—;i<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>上式表示的原花青素分子中所有羟基全部没食子酰化只是一种理想状态。由于这些羟基的反应活性有所区别，特别是由于空间位阻的影响，实际上这种理想状态不可能实现。本发明采用适宜的催化剂和强化反应条件，通过分子修饰使目标产物中有尽可能多的没食子酰基，同时通过分析试验测定其没食子酰化程度。将目标产物和原态原花青素进行生物活性功能比较试验对不饱和油脂的抗氧化性能比较、金属离子的络合性能比较和对DPra自由基的清除能力比较测定，验证本发明方法获得预期效果。有益效果(1)本发明提出的对原花青素分子进行化学修饰，合成没食子酰化原花青素，以增强其抗氧化、清除自由基生物活性的方法，尚未见有国内外报道，扩展了我国原花青素研究领域，填补研究空白。(2)本发明采用的原花青素取自落叶松或其它松属树皮，在我国有丰富的资源。本发明将有助于这种天然资源的高效利用，也可为我国开发自主创新的植物源高效抗氧化及自由基清除剂新品种提供技术基础。(3)本发明方法可为其它种类植物多酚增强生物活性，提供可以借鉴的分子修饰方法。图1落叶松原花青素(原态)红外谱图。图2三乙酰基没食子酰化原花青素(中间产物)红外谱图。图3没食子酰化原花青素红外谱图(目标产物)红外谱图。从3个图谱比较可以看出，没食子酰化反应后，在1650cm—11750cm—1范围内出现属于羰基的C=O伸縮振动吸收峰，表明部分羟基产生酰基化反应。图3为中间产物脱除乙酰保护基后得到的目标产物，可见C二O伸縮振动吸收峰依然存在，表明在脱除乙酰保护基时没食子酰基酯键未遭受破坏。又由于在产物水解液中实测得没食子酸，从而证明目标产物确为预期的没食子酰化原花青素。具体实施方式实施例1:—种增强原花青素生物活性的分子修饰方法，步骤为(1)所采用的原料是从落叶松或其它松属树皮提取分离得到的聚原花青素，可以采用自制也可以购买市售的产品。(2)原花青素分子化学修饰的方法是首先将其与3，4，5-三乙酰基没食子酰氯在一定的溶剂中和一定催化剂和温度作用下反应，生成中间产物三乙酰基没食子酰化原花青素；将该中间产物在一定条件用稀碱液脱去乙酰基以恢复酚羟基原态，再经过后处理，获得目标产物没食子酰化原花青素。酰化反应所采用的溶剂为1，4_二氧六环，催化剂为吡啶，反应温度可以是5010(TC，原花青素、三乙酰基没食子酰氯投料量按物质的量比可以为1:51:7，反应时间可以为48h，吡啶的用量可以为三乙酰基没食子酰氯的1.01.5倍(按摩尔计)。将三乙酰基没食子酰化原花青素溶于丙酮，加适量水稀释，用0.050.lmol/L的NaOH，在05t:下脱除乙酰基，使用碱液量以控制溶液pH值在7.58.5不变为限度，而后用0.lmol/L的HC1调节pH，使产物溶液pH值为24。脱除乙酰基后，蒸出丙酮得固体产物；将固体产物溶于乙酸乙酯，充分水洗，分层，蒸出乙酸乙酯即得目标产物没食子酰化原花青素。实施例2:(1)将经净化、风干和粉碎的落叶松树皮用水浸提，得到提取物水溶液。冷至室温后分出清液；除去其中的树脂，树胶等杂质，再用乙酸乙酯进行萃取后，蒸出乙酸乙酯，冷冻干燥，得到落叶松原花青素。(2)称取10.85g实验室制备的三乙酰基没食子酰氯，溶于50mL的1，4_二氧六环，全部溶解后，加入2.0g落叶松原花青素，加入3.5mL吡啶催化剂，在10(TC下反应6h。减压蒸去1，4-二氧六环溶剂和过量的吡啶。实验室制备三乙酰基没食子酰氯是以没食子酸为原料，先用醋酐/吡啶法制成三乙酰基没食子酸，然后在四氯化碳中与PC15反应制成三乙酰基没食子酰氯。具体制法可以参考2005年02期林产化学与工业上发表的《多酚羧酸合成功能高分子材料研究(I)——没食子酸与纤维素的酯化合成及产物功能特性试验》(3)上述产物用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压蒸出乙酸乙酯，干燥，获得落叶松原花青素没食子酰化中间产物10.25g。(4)取1.0g落叶松原花青素没食子酰化中间产物，用10%的NaOH溶液20mL在氮气保护下完全水解。以标准没食子酸为对照样，用HPLC法测定水解液中没食子酸含量，计算得到没食子酰化程度为61%。(5)取lg中间产物，溶于20mL丙酮，在水浴中冷至0t:，在搅拌下于15min内滴入90mL0.lmol/L的NaOH，加入10mL水稀释。在(TC下静置3h，测pH值为8，不再变化。用0.lmol/LHC1酸化至pH为3，减压蒸出丙酮。(6)产物呈固体析出，过滤，使溶于乙酸乙酯，酯层用水洗涤，减压蒸出乙酸乙酯后获得目标产物没食子酰化原花青素0.43g。实施例3:(1)实施例2中制备得到落叶松原花青素为原料。称取15.7g实验室制备的三乙酰基没食子酰氯，溶于60mL1，4-二氧六环，加入2.0g落叶松原花青素溶解，加入4.7mL吡啶催化剂，在8(TC下反应8h。(2)减压蒸去1，4-二氧六环溶剂和过量的吡啶。溶液加入乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压蒸出乙酸乙酯，干燥，获得落叶松原花青素没食子酰化中间产物11.9g。(3)取1.0g落叶松原花青素没食子酰化中间产物，用10%的NaOH溶液20mL在氮气保护下完全水解，以标准没食子酸为对照样，用HPLC法测定水解液中没食子酸含量，计算得到没食子酰化程度为65%。(4)取lg反应得到的中间产物，先溶于20mL丙酮，在冰水浴中冷至(TC，一边搅拌一边滴加0.lmol/L的NaOH100mL，在15min内滴加完毕，然后加入10mL水稀释。(5)在(TC下静置3h，测pH值为8，不再变化。用0.lmol/LHCl酸化至pH为3，减压蒸出丙酮。(6)产物呈固体析出，过滤，使溶于乙酸乙酯，酯层用水洗涤，减压蒸出乙酸乙酯后获得目标产物没食子酰化原花青素0.49g。实施例4:(1)称取13.0g实验室制备的三乙酰基没食子酰氯，溶于17mL的1，4_二氧六环，微加热使全部溶解后，加入2.0g从马尾松树皮提取的原花青素和4mL妣啶催化剂，在IO(TC下加热回流反应4h。冷却后，减压蒸去1，4-二氧六环溶剂和过量的吡啶。(2)残余物中加水搅拌，于冰箱冷藏室中冷却lh后用布氏漏斗抽滤，并用大量水反复洗涤后得到松散固体，冷冻干燥，即得马尾松原花青素没食子酰化中间产物11.4g。(3)取2.0g中间产物，用8%的NaOH溶液25mL在氮气保护下完全水解。以标准没食子酸为对照样，用HPLC法测定水解液中没食子酸含量，计算得到没食子酰化程度为74%。(4)取lg中间产物，溶于20mL丙酮，加入30mL0.lmol/L的NaOH，10mL水，放置10h，测定pH为6，继续加入0.lmol/L的NaOH50mL，使pH值为8，过滤，滤液用0.lmol/LHCl酸化至pH为3。减压蒸出丙酮。(5)产物呈固体析出，过滤，使溶于乙酸乙酯，酯层用水洗涤，减压蒸出乙酸乙酯后获得目标产物没食子酰化原花青素0.43g。本发明中没食子酰化原花青素的抗氧化活性通过试验获得验证对不饱和油脂的抗氧化作用，络合金属离子的能力，对DPPH自由基的清除能力都得到增强。实施例5:本发明中没食子酰化原花青素和原花青素对不饱和油脂的抗氧化性能比较测定为了考察落叶松原花青素没食子酰化以后得到的产物抗氧化能力是否有所增加，采用Schaal烘箱法分别测定原花青素和没食子酰化原花青素对植物油脂热氧化的抑制能力。按lkg底物油加入0.4g抗氧化剂的比例计算所需加入试样量。以市售植物调和油经过实验室处理后作为底物试验用油样。7(1)称取试验用油样30.0g(准确至±0.lg)，于洁净的250mL三角瓶中；(2)分别准确称取0.0120g的自制的落叶松原花青素、没食子酰化原花青素，使溶于2.5mL95%乙醇和3.5mL蒸馏水。(3)将称取好的试验用油样加热至6(TC，在搅拌的情况下分别加入上述准备的样品，充分混合，然后超声乳化使成乳液；(4)将配置好的试料移入烘箱中，控制烘箱内温度63±rC;(5)每隔24h取样分析测定其过氧化值P0V(meq/kg)。过氧化值测定过程按GB5009.37-2003中4.2.2节比色法进行，过氧化值的含量按以下公式计算结果wx^x55.84x2式中X——试样中过氧化值的含量，meq/kg;c——由标准曲线上查得试样中的铁的质量，g;c。——由标准曲线上查得零管铁的质量，Pg;Vi——试样稀释总体积，mL;V2——测定时取样体积，mL;m——试样质量，g;55.84-Fe的原子量；2——换算因子。结果如下表1.不同时间下的过氧化值表过氧化值，meq/kg时间，h024487296120原花青素+试验油样一2.7266.02213.42820.55024.441没食子酰化原花青素+试验油样一1.2472.204'7.3279.99215.901经测定计算实验室处理过的底物试验油样的基础过氧化值为0.337，从结果数据可见，与落叶松原花青素相比，经过没食子酰化改性以后得到的没食子酰化原花青素对不饱和油脂的抗氧化作用得到增强。实施例6:本发明中没食子酰化原花青素和原花青素对金属离子的络合性能比较测定利用原花青素能与Fe2+离子生成有色络合物的特性，在波长578nm处有特征吸收峰，其吸光度与络合物的浓度成正比。利用络合浓度的差别来比较没食子酰化前后的原花青素活性差别。称取实施例2中制备的没食子酰化原花青素试样0.2062g(精确至0.lmg)，溶于200mL蒸馏水中，其浓度为0.1031g/mL;原花青素试样O.2024g(精确至0.lmg)，溶于200mL蒸馏水中，其浓度为0.1012g/mL;称取O.3684g(精确至0.lmg)FeCl241120，溶于lOOmL蒸馏水中，Fe2+浓度为1.62mg/mL。在5mL的原花青素溶液和没食子酰化原花青素溶液中，分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.OmL的Fe2+溶液，再分别用蒸馏水定容至10mL，用分光光度计在578nm处(1cm比色皿)分别测定吸光度，当Fe2+溶液加入量增加至吸光度保持恒定时，表明试样溶液对Fe2+离子的络合已经饱和。记录此时加入的Fe"离子用量。由此分别计算两种溶液对Fe2+离子的络合能力，得到原花青素溶液对Fe2+离子的饱和络合能力为0.973mg/mg，没食子酰化原花青素的能力为1.416mg/mg。结果数据表明，没食子酰化原花青素对金属离子的络合能力得到增强。实施例7:本发明中没食子酰化原花青素和原花青素对自由基的清除能力比较测定以二苯基-苦基-肼基自由基(DPPH，美国Sigma公司)为标准物，用分光光度法分别测定本发明中目标产物没食子酰化原花青素和原花青素对DPra清除率并作比较。配制工作溶液DPra的乙醇溶液，浓度为0.025mg/mL;落叶松提取原花青素试样的乙醇溶液，浓度为0.05mg/mL;目标产物没食子酰化原花青素试样的乙醇溶液，浓度为0.05mg/mL。分光光度计测定(A=517nm;lcm比色皿)DPPH溶液原始吸光度DPPH溶液5mL加乙醇lmL，吸光度为0.441。加入目标产物试样的DPra溶液的吸光度变化情况DPra溶液5mL加入目标产物试样溶液，然后用乙醇定容至6mL，混合后即开始测定吸光度，随后每间隔lmin测定1次，吸光度持续下降，当吸光值持续下降至恒定不变时，记录达到吸光值恒定时需要的时间(TS)和吸光值(As)。按上述同样方法对落叶松提取原花青素试样进行对比试验。按下面公式计算清除效率SE(%)和清除速率SR/g(mgmin)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>式中A。_不加清除剂的DPra溶液的吸光值；m「试液中DPffl的质量，g;m2_试液中清除剂的质量，mg;TS-达到吸光值恒定时需要的时间，min。测定结果见表2:表2清除DPra自由基的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从结果可以看出，在加入相同用量试样的DPra溶液中，加入没食子酰化原花青素试样吸光度下降至恒定值的时间比加入原花青素的试样用时少，通过计算得到的DPra清除率和清除速率也可以看出目标产物没食子酰化原花青素的清除自由基能力得到增强。权利要求一种增强原花青素生物活性的分子修饰方法，其特征在于，步骤为第一步，合成三乙酰基没食子酰化原花青素按原花青素与3，4，5-三乙酰基没食子酰氯物质的量比为1∶5～1∶7(mol∶mol)，将原花青素与3，4，5-三乙酰基没食子酰氯溶于溶剂，在催化剂存在下于50～100℃下进行酰化反应，反应结束后减压蒸馏去除溶剂和过量催化剂，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压去除乙酸乙酯，干燥，得到三乙酰基没食子酰化原花青素；第二步，脱除乙酰保护基向第一步反应得到的三乙酰基没食子酰化原花青素丙酮溶液中加碱溶液控制溶液pH值在7.5～8.5，在0～5℃下脱除乙酰基，然后，调节溶液pH值在2～4；第三步，纯化处理得到没食子酰化原花青素将第二步脱除乙酰保护基后的溶液，蒸除丙酮得固体产物，将固体产物溶于乙酸乙酯、水洗，蒸除乙酸乙酯即得到没食子酰化原花青素。2.如权利要求1所述的增强原花青素生物活性的分子修饰方法，其特征在于，所述的原花青素为从落叶松以及其它松属树皮提取分离得到的原花青素。3.如权利要求1所述的增强原花青素生物活性的分子修饰方法，其特征在于，所述的催化剂为吡啶，用量为三乙酰基没食子酰氯的物质的量(mol)的1.01.5倍。4.如权利要求1所述的增强原花青素生物活性的分子修饰方法，其特征在于，第一步中所述的溶剂为1，4-二氧六环。5.如权利要求1所述的增强原花青素生物活性的分子修饰方法，其特征在于，所述的碱溶液为0.050.lmol/L的NaOH或KOH。全文摘要本发明涉及一种增强原花青素生物活性的分子修饰方法，以落叶松或其它松属树皮提取的原花青素为原料，通过酰化反应对其分子进行修饰，在其分子中原有的羟基位置引入没食子酰基以增加分子中邻酚羟基的数量和密度，合成目标产物没食子酰化原花青素，实现增强生物活性。其特征是以1，4-二氧六环为溶剂，吡啶为催化剂，在一定温度下使原花青素与3，4，5-三乙酰基没食子酰氯反应，制得中间产物，而后脱去三乙酰基，经过后处理获得目标产物没食子酰化原花青素。文档编号A61K31/352GK101747308SQ20091026483公开日2010年6月23日申请日期2009年12月24日优先权日2009年12月24日发明者吴冬梅,吴在嵩,张亮亮,徐曼,汪咏梅,陈笳鸿申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所