专利名称：一种可治疗肝癌的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物，尤其是一种可治疗肝癌的药物。
背景技术：
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡排位中仅次于胃、食道 而居第三位；在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人， 占全世界肝癌死亡人数的45%。肝癌的治疗多采用手术切除，放疗和化疗相结合的方式，目前常用的化疗药为顺 氯铵钼、阿霉素或表阿霉素、丝裂霉素、5-氟脲嘧啶或氟苷等，这些药物在杀伤肿瘤细胞的 同时，对正常组织和细胞产生了很大的损伤，使病人不能耐受。因此，寻找高效、高选择性、 低毒的抗肿瘤化疗药成为当前抗癌药物研究的方向和迫切任务。从天然物质中寻找抗肿瘤 药物被认为是一种有效的途径，对天然活性物质进行抗肿瘤作用的研究，尤其在抑制增殖 及诱导凋亡和分化方面进行探索，将有助于获得理想的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够通过启动凋亡机制治疗肝癌的药物，它对人肝癌 细胞可产生选择性杀伤，而对人正常肝细胞影响却较小。为了解决上述技术问题，本发明提供了壳聚糖亚硒酸酯在制备一种可治疗肝癌的 药物中的应用。其中壳聚糖亚硒酸酯为药物的有效成分。进一步的，上述治疗肝癌的药物可为片剂、胶囊、混悬剂。其中，片剂的制备方法为壳聚糖亚硒酸酯50 IOOmg/片、硬脂镁0.65mg/片、无 水乳糖80mg/片，将壳聚糖亚硒酸酯过200目筛，与硬脂镁，无水乳糖混勻、压片。胶囊的制备方法为壳聚糖亚硒酸酯50 IOOmg/胶囊、淀粉150mg/胶囊、硬脂镁 Img/胶囊，将壳聚糖亚硒酸酯过200目筛，与硬脂镁，淀粉混勻，装入2号硬空心胶囊。混悬剂的制备方法为壳聚糖亚硒酸酯50 100mg/5ml、单硬脂酸铝75/5ml、椰子 油5ml，将壳聚糖亚硒酸酯过200目筛，单硬脂酸铝均勻分散于椰子油中加热至摄氏115度， 放冷后加入过筛后的壳聚糖亚硒酸酯及适量的校味剂。再进一步的，所述壳聚糖亚硒酸酯的口服剂量范围为每日1000毫克至4克。有益效果本发明所述的一种壳聚糖亚硒酸酯在制备治疗肝癌的药物中的应用，通过研究表 明硒是人和动物体内必需的微量元素之一，硒对多种肿瘤都具有显著的预防和治疗作用。 而壳聚糖[β (1，4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是存在于自然界中的一种碱性生物多 糖，在酸性条件下带正电，与肿瘤细胞表面的阴离子可以通过吸附放电进行中和，抵制其生 长，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种生物活性，且生物相容性良好，几乎无毒性，没有其它不 良反应，壳聚糖亚硒酸酯是将硒酸根吸附于壳聚糖单体2-ΝΗ2和6-0Η制备成的低分子量有 机硒，可有效克服无机硒不易被细胞吸收，活性和毒性范围较窄，致死量LC5tl相对较小，具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制等缺点。因此，壳聚糖亚硒酸酯比无机硒 具有更强的抗肿瘤作用，且毒副作用也小得多。
具体实施例方式以下通过对具体实施例的研究分析进一步分析、确认本发明。实施例1 壳聚糖亚硒酸酯对体外培养的人肝癌细胞增殖抑制作用及对人正常肝 细胞的影响。取对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721和人正常肝细胞L02接种于96孔培养板 上，每孔接种量分别为3000 4000个/100 μ L和6000个/100 μ L，培养24h后，实验组加入 不同浓度的壳聚糖亚硒酸酯100 μ L，每个浓度做三个复孔；阴性对照组加培养液100μ L， 作用不同时间(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT 20 μ L，继续培养4h，甩去上清，每孔 加二甲亚砜150 μ L。用DG-3022型酶标仪(中国南京)测定550nm处各孔的吸光度值，各 组取平均值，计算抑制率。生长抑制率=(空白组光密度-实验组光密度)/空白组光密 度X 100%。用SPSS13.0软件进行统计学分析，并计算IC5(I。结果壳聚糖亚硒酸酯对人肝 癌细胞SMMC-7721具有明显的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性和时间依赖性，其4 和7 的IC5tl值分别为35. 25%和12. 71% ；而壳聚糖亚硒酸酯对人正常肝细胞抑制作用则较小， 其4 和72h的IC5tl值分别大于80%和40%。可见壳聚糖亚硒酸酯对肝癌细胞具有明显 的选择性抑制作用。实施例2 壳聚糖亚硒酸酯对体外培养的人肝癌细胞诱导凋亡作用。(1)壳聚糖亚硒酸酯对人肝癌细胞形态的影响①荧光显微镜观察不同浓度的壳聚糖亚硒酸酯处理12J4和7 后的肝癌细胞 用丫啶橙(AO)和溴化乙锭(EB)混合荧光染料染色后，分别接种于多个盖玻片上，在荧光显 微镜下观察细胞的形态学变化。结果镜下可观察到早、中期凋亡细胞的细胞核或细胞质内 有浓染致密的颗粒状黄绿色荧光，核染色质浓缩，核破裂，凋亡小体释放等典型的凋亡细胞 形态学改变；同时凋亡有时间及剂量依赖关系。②电子显微镜观察100mg/L壳聚糖亚硒酸酯处理人肝癌细胞4 后为实验组，不 加硒化壳聚糖及壳聚糖处理的肝癌细胞为对照组，两组细胞经0. 25%胰酶消化后，离心收 集细胞沉淀，用4°C预冷的2. 5%戊二醛加多聚甲醛混合液固定，锇酸后固定，环氧 树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬铅染色，日立HU-12A型透射电镜观察并拍照。结果不 同浓度的壳聚糖亚硒酸酯处理后的肝癌细胞出现典型的凋亡形态学改变，细胞变小，细胞 质浓缩，内质网扩张，核仁消失，细胞核内染色质边聚集于核膜下，可见核固缩、核破裂和凋 亡小体；凋亡细胞约占10%至20%。(2)流式细胞仪分析收集壳聚糖亚硒酸酯作用后的细胞，加70%乙醇lml，-20°C 固定Mh，加入碘化丙锭(PI)(终浓度为50ul/ml)和RNA酶(终浓度为0. 25mg/ml)，室温下 避光孵育30min后，用Epics Elite ESP型流式细胞仪作DNA分析，以DNA含量低于Gl期 的亚Gl期细胞为凋亡细胞，以ModFit LT软件分析，拟合计算出各时相细胞的百分比。结 果肝癌细胞经不同浓度壳聚糖亚硒酸酯作用对和4 后，可见到典型的亚二倍体凋亡峰， 且呈明显的时间和剂量依赖性。软件分析可见随着壳聚糖亚硒酸酯剂量的增加，GO-Gl期细 胞的比例由对照的35. 4%上升到58. 2%，S期细胞的比例由对照的58. 5%下降至41. 4%,而G2-M期细胞的比例则由对照的6. 下降至0. 4%，细胞受阻于GO-Gl期。(3)片段化DNA的琼脂糖凝胶电泳测定收集3X IO6个实验组和对照组细胞， 用PBS离心洗涤，置_20°C冰箱放置IOmin后，加入Iml细胞裂解液(lOmmol/LTris. HCL PH8. 0,0. lmmol/L EDTA, 10mmol/L NaCL, 1% SDS)中，再加入蛋白酶 K 至终浓度为 lg/L，轻 轻振摇使溶液混勻呈粘糊状，50°C过夜，待其冷却至室温后，加入等体积的饱合酚溶液，混 合两相，IO5g离心lOmin，小心吸出上层水相，再加入等体积饱合酚溶液重复抽提1次，直 到无蛋白混入，吸上清加入氯仿异戊醇(1 1)按上述方法再抽提1次后，取水相层加入 1/10体积3mol/L醋酸钠溶液，混勻后加入2. 5倍体积的冰冷无水乙醇混合置_20°C中放 置30min，IO5g离心IOmin沉淀DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将EP管倒置于 吸水纸上，吸干乙醇，加入 200 μ ITE 缓冲液(lmmol/L EDTA, lOmmol/LTris. HCLPH7. 8)溶 解DNA，再加入25ulRNA酶(10g/L)放置37°C中，30min后，置4°C冰箱保存。琼脂糖凝胶电 泳用TBE (lmmol/L EDTA PH 8.0,45mmol/L Tris.硼酸)缓冲液配制1. 8%琼脂糖凝胶，取 10 μ IDNA样品与含0. 25%溴酚兰、4%蔗糖的上样缓冲液混勻后加样。电压60V，电泳Ih 后，以终浓度为0. 5mg/L溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察并拍照。结果对照组在靠近加 样孔的地方出现了一个大分子条带，而壳聚糖亚硒酸酯100、200mg/L作用4 可引起肝癌 细胞DNA的降解，见明显的凋亡特征性梯状条带。结果表明，壳聚糖亚硒酸酯对肝癌细胞具有显著的诱导凋亡作用。实施例3 壳聚糖亚硒酸酯对肝癌细胞CaSpaSe-3、8、9酶活性影响。收集3 X IO6个实验组和对照组细胞，加预冷)细胞裂解液05 μ L/106个细 胞)混勻，冰浴IOmin后IO5g离心lmin，吸取上清存于冰水浴管中，用于测定Caspase酶 活性及蛋白含量。按顺序加入50 μ L上清，50 μ L反应液(临用前每ImL反应液加IOyL DTT)、5 μ L底物于96孔板中，37°C温育池，酶标仪检测405nm波长光密度。设无上清孔及阴 性对照孔，实验重复三次。结果壳聚糖亚硒酸酯100、200mg/L作用肝癌细胞24h、4 !后， Caspase-3,9酶活性较对照组显著升高，且随药物剂量增加及时间延长酶活性也相应升高， 存在一定的剂量和时间依赖关系。而Caspase-8酶活性与对照比较无意义。说明壳聚糖亚 硒酸酯能够激活肝癌细胞CaspaseU，而不能激活Caspase-8。实施例4 壳聚糖亚硒酸酯对小鼠灌胃或皮下注射的半数致死量(LD5tl)测定。以小鼠能允许的最大浓度10%的壳聚糖亚硒酸酯混悬液0.%il/10g灌胃或皮下 注射测不出ID5tl，根据新药审批办法中对急性毒性的要求，进行了最大耐受量的测定，当给 予壳聚糖亚硒酸酯16g/kg. Mh，对小鼠未见明显毒性反应，表明其最大耐受量大于16g/ kg，毒性很低。实施例5 壳聚糖亚硒酸酯对动物肝癌腹水瘤的抑制作用。选择肿瘤生长良好，全身状态较好的肝癌腹水瘤荷瘤小鼠，颈椎脱白处死，固定后 碘酒酒精消毒，无菌条件下抽取腹水，按1 4比例加入无菌生理盐水，取0.2mL接种于ICR 小鼠(合格证书SCXK(鄂)2007-0001)腹腔中，接种肿瘤后，小鼠按体重随机分组，设阳性 对照组、阴性对照组及不同剂量给药组。阳性对照组给予氟尿嘧啶，阴性对照组给予等量溶 剂，给药组给予不同剂量壳聚糖亚硒酸酯。于接种当日开始给药，连续10d。记录实验小鼠 生存时间，并计算生命延长率。生命延长率％=(药物组平均生存时间/阴性对照组平均 生存时间-1) X 100%，将结果进行统计学处理。结果大、中、小剂量壳聚糖亚硒酸酯(3、2、
5lg/kg)皮下注射对肝癌腹水瘤荷瘤小鼠生命延长率分别是36. 3%,21.9%,19. 3%;而灌胃 给药生命延长率则分别是39.4%, 31. 5%和20. 4% ο综上所述，本发明所涉及的壳聚糖亚硒酸酯可通过激活肝癌细胞CaspaseU从 而启动凋亡，对人肝癌细胞产生选择性杀伤作用，而对人正常肝细胞影响较小。本发明中所述的壳聚糖亚硒酸酯的制备方法参见篇名为《硒化壳聚糖的制备及其 表征》，期刊为海峡药学STRAIT PHARMACEUTICAL JOURNAL 2005年17卷3期的文章。文中 所述的硒化壳聚糖化学名称为壳聚糖亚硒酸酯。
权利要求
1.壳聚糖亚硒酸酯在制备一种可治疗肝癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种可治疗肝癌的药物，其特征在于所述壳聚糖亚硒酸酯 为药物的有效成分。
3.根据权利要求1或2所述的所述的一种可治疗肝癌的药物，其特征在于所述药物 为片剂、胶囊、混悬剂。
4.根据权利要求3所述的一种可治疗肝癌的药物，其特征在于所述片剂是由壳聚糖 亚硒酸酯50 IOOmg/片、硬脂镁0. 65mg/片、无水乳糖80mg/片组成，将壳聚糖亚硒酸酯 过200目筛，与硬脂镁、无水乳糖混勻，然后压片。
5.根据权利要求3所述的一种可治疗肝癌的药物，其特征在于所述胶囊是由壳聚糖 亚硒酸酯50 IOOmg/胶囊、淀粉150mg/胶囊、硬脂镁Img/胶囊组成，将壳聚糖亚硒酸酯 过200目筛，与硬脂镁、淀粉混勻，装入2号硬空心胶囊。
6.根据权利要求3所述的一种可治疗肝癌的药物，其特征在于所述混悬剂是由壳聚 糖亚硒酸酯50 100mg/5ml、单硬脂酸铝75/5ml、椰子油5ml组成，将壳聚糖亚硒酸酯过 200目筛，单硬脂酸铝均勻分散于椰子油中加热至摄氏115度，放冷后加入过筛后的壳聚糖 亚硒酸酯及适量的校味剂。
全文摘要
本发明提供了壳聚糖亚硒酸酯在制备一种可治疗肝癌的药物中的应用。通过研究表明硒是人和动物体内必需的微量元素之一，硒对多种肿瘤都具有显著的预防和治疗作用。而壳聚糖[β(1，4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是存在于自然界中的一种碱性生物多糖，在酸性条件下带正电，与肿瘤细胞表面的阴离子可以通过吸附放电进行中和，抵制其生长，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种生物活性，且生物相容性良好，几乎无毒性，没有其它不良反应，壳聚糖亚硒酸酯是将硒酸根吸附于壳聚糖单体2-NH2和6-OH制备成的低分子量有机硒，具有较强的抗肿瘤作用，且毒副作用也小得多。
文档编号A61P35/00GK102078324SQ20091027294
公开日2011年6月1日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者余开峰, 曹凤军, 曾小华, 李林均, 李芳 , 潘东风, 王一平, 蔡晓军, 邓守恒, 陈萍 申请人:郧阳医学院附属人民医院