专利名称：一种含有Wnt蛋白的生发剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生发剂，尤其涉及一种通过Wnt/ {3 -catenin信号通路发挥作用的Wnt蛋 白的促进毛囊生长的生发剂，尤其涉及一种含有Wnt3a蛋白的促进毛囊生长的生发剂。
背景技术：
毛和发为哺乳动物所特有，是长在全身皮肤表面的角化的丝状结构，为表皮衍生的附属 器。兽皮肤的毛极多，对保持体温和对抗机械性损害起重要作用。人类的毛已相当退化，但 毛囊有丰富的神经末梢，是灵敏的触觉感受器。同时，人类的毛影响着人的外表，具有重要 的社会意义。
伸出皮肤外的毛称毛干，埋在皮肤内的称毛根，毛根包在由上皮和结缔组织组成的鞘状 毛囊内。毛根和毛囊的下端结合在一起，形成膨大的毛球。毛球的地面内凹，其内容纳毛乳 头，也叫真皮乳头。
毛囊是具有周期性生长特性的一个特殊的亚器官，由呈同心圆排列的三层结构(毛干、 内根鞘、外根鞘)组成，包含十多种细胞类群(见图l)。毛囊位于真皮和皮下组织中，较 短的毛囊位于真皮中。在纵切面上，生长期的毛囊可分为三段①漏斗部，其上端为毛囊的 开口，下端到皮脂腺开口；②峡部，此段较短，上端至皮脂腺开口，下端至立毛肌附着处； ③下段，由立毛肌附着处到毛囊底部，包括内根鞘、外根鞘和毛球。整个毛囊由结缔组织鞘
所包绕。结缔组织鞘也称纤维鞘，其中富含m型胶原和弹性纤维，并有丰富的感觉神经末梢
和血管。
毛囊干细胞位于毛囊上段与立毛肌连接处的隆突区，在形态学和生物化学上表现为原始 细胞，细胞动力学特征是标记保留细胞，并有若干明确的分子标记物。毛囊干细胞具有三向 分化潜能下行分化为毛囊的各种类群的细胞，向上迀移分化为皮脂腺细胞以及在特定情况下分化为皮肤的表皮细胞。目前，隆突区是毛囊干细胞栖息地的学说已经得到普遍认同。
哺乳动物的毛囊呈周期性生长，在哺乳动物的整个生命期间循环往复(见图2)。毛囊 周期分为三个期生长期的毛囊和毛活跃生长；退化期的毛停止生长，毛囊和毛球发生退化 ;静止期的毛囊和毛球萎縮，毛易脱落。
在生长期末，毛球发生一系列退化性变化。在退化期开始时，毛母质细胞停止增殖，同 时，外根鞘上皮退縮成角化的上皮管，包过毛干的球形下端，形成杵状毛。
在静止期，杵状毛下方的上皮细胞柱萎縮并向上方移动，游离的毛乳头伴随在上皮柱下 端，并有结缔组织尾随在退縮的上皮柱后面。最后，杵状毛上移到立毛肌附着毛囊处。在静 止期中，某些因素如激素、药物等激活毛囊干细胞，则毛囊进入下一个生长期。
生长期开始时，毛乳头与一部分围绕它的未分化细胞发生重建。毛芽生成新的毛母质， 并增大和变长，沿遗留的结缔组织鞘与毛乳头一起向下移，同时分化形成内根鞘和毛干。新 生的毛干向上生长，将原有的杵状毛推出。
人体的毛脱落不明显，也不规则，因为相邻的毛处于生长周期的不同时期，不利于研究 。而小鼠的毛囊呈波浪形生长，即同一横截面的毛囊处于同一周期，且整个背部的周期头尾 相差仅约2天，给毛囊的研究提供了便利的模型。
Wnt基因是鼠类乳腺癌病毒(MMTV)诱导的小鼠乳腺癌中克隆出的一种原癌基因，由 Nusse等人于1982能发现并报道，当时称为int基因。后来的研究发现int基因与Sharma 报道的果蝇的无翅基因wingless (wg)为同源基因，因而将两者合称为Wnt。近十年来对果 蝇、两栖类、哺乳类到人类Wnt族基因，编码产物及其生物学效应的研究表明，Wnt信号途 径参与了从胚胎到成体的一系列控制细胞生长发育及分化的调控，特别是在干细胞和肿瘤生 物学研究中越来越突出了其潜在的价值。
Wnt蛋白家族是一系列高度保守的分泌性的糖蛋白。动物体早期发育中，Wnt信号决定 背腹轴的形成、胚层建立、体节分化、组织或器官形成等一系列重要事件，并直接控制着增 殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等细胞的命运。同时，Wnt信号途径也与肿瘤发生密切相关 。许多Wnt蛋白分子发挥作用都是通过其经典信号途径，经典Wnt信号途径也称为Wnt/{3 -catenin信号途径。在不同物种中Wnt/{3 -catenin信号转导的分子机制具有极高的保守性
Wnt/e-catenin信号通路对毛囊的生长和发育都起了非常重要的作用。胚胎发育时持续 过表达Wnt通路的抑制剂DKKl，毛囊完全不能生成，出生后过表达DKK1抑制毛囊的生长。相
4反，持续表达稳定形式的e-catenin，小鼠毛囊生成的数量增多。
Wnt3a是wnt家族成员之一，Wnt3a参与肺、牙、毛囊等器官的早期形成，调节造血干细 胞的自我更新。体外培养发现，wnt3a能够促进表皮干细胞和间充质干细胞的增殖，抑制其 分化。毛囊中的真皮乳头细胞能够诱导表皮干细胞的分化，体外培养研究发现，Wnt3a能够 维持真皮乳头细胞的这种诱导作用。
随着社会竞争加剧，各种压力增大，高脂性饮食增多，现代生活导致睡眠减少，都会使 脱发的发病率呈逐渐上升以及愈来愈年轻化的趋势。近年来，在我国城市医院(特别是大城 市医院)中脱发患者的门诊量在不断上升。
早期的生发剂，从来自民间医学的药方、偏方为主，以改善微循环达到促进生发作用， 后来发展为以临床研究方法为主，根据脱发的生理病理原因有针对性地研制产品，如应用扩 张血管药促进微循环，调节激素及抗炎杀菌药剂等。
目前，我国市场上各种各样的生发剂品种繁多，以中药品种为主，大多为外用药。西药 及内服药较少。市场上大部分产品的疗效不尽如意，患者使用后症状改善不明显。有关调査 还显示，有98%左右的脱发患者认为市场上传统的治疗脱发药物不能带来满意疗效，大多数 患者在试用生发剂半年无效时会选择弃用。即便如此，由于人们生活水平不断提高，越来越 注重外表美的问题，因此购买生发剂的人不断增多。因此，如何能有效地治疗脱发，是广大 患者更为关心的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有Wnt蛋白的生发剂。它使毛囊呈现生长期表型，毛囊从静 止期向生长期转化，具有起效快，效果明显，机制清楚等优点，对开发促毛发生长药物具有 重要的社会和经济意义。
本发明的技术方案是
所述生发剂包含通过Wnt/{3 -catenin信号通路促进毛囊生长的Wnt蛋白。 所述通过Wnt/e -catenin信号通路促进毛囊生长的Wnt蛋白为Wnt3a蛋白。 通过Wnt/e-catenin信号通路促进毛囊生长的Wnt蛋白在制备治疗脱发药物中的应用。 毛囊的周期性生长受复杂机制的调控。Wnt信号通路在毛囊发育和再生中都发挥重要作 用，可以筛选到有明显促毛作用的wnt蛋白为基础，开发促进毛囊生长的生发剂。作为皮肤 的附属器官，毛发具有重要的生理学与社会学功能。毛发缺失给患者带来很大的心理负担，开发促毛发生长药物具有重要的社会和经济意义。
Wnt3a蛋白通过直接激活wnt经典信号通路，使毛囊从静止期迅速进入生长期，从而促进 毛囊生长。以此为基础开发的生发剂，具有效果明显，起效快，机制清楚等优点，为临床脱 发患者带来福音。
下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图l是生长期毛囊结构图； 图2是毛囊周期图； 图3为AdWnt3a感染293细胞的情况； 图4为小鼠注射AdWnt3a后14天的整体照相；
图5A和5B为分别注射AdGFP组和注射AdWnt3a组经HE染色的毛囊生长图示； 图6A和图6B为AdWnt3a处理后毛囊器官培养l天和4天对照图示；加入AdWnt3a组毛囊生长 明显加快。
图7为小鼠注射AdWntl0b后14d的整体照相；
图8A和图8B分别为注射AdWntl0b和注射AdGFP组经HE染色的毛囊生长的图示。
具体实施例方式
本实施例所采用的试剂均为用于细胞实验的市售产品。 WilliamE无血清培养基自配，配方见实施例2。 C57BL/6小鼠购自第三军医大学实验动物中心。 实施例l AdWnt3a的构建与扩增
采用何通川等的AdEasy系统，获得AdWnt3a的滴度为10、fu/ml 。参考基因序列 NM—011718.1。(具体方法见文献1. He TC， Zhou S， da Costa LT， et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A， 1998， 95:2509-14 2. Luo丄Deng ZL， Luo X， et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc， 2007， 2:1236-47.)实施例2 Wnt3a促进毛发生长试验 (1)动物实验
1) 注射取8周龄雌性C57BL/6小鼠，此时小鼠背毛处于静止期，分组如下重组腺病毒 AdWnt3a注射组36只，AdGFP对照组(空载体)36只，PBS对照组36只。
腹腔注射100yl 1%戊巴比妥。约5分钟后，小鼠处于麻醉状态，用剃毛器小心剃除小鼠 背部被毛，注意不要剃伤皮肤和拔动毛囊。
剃毛后，沿背中线中间取一点，皮内注射25yl AdWnt3a，病毒滴度l()Spfu/ml，注意不 要注射到皮下。注射后，注射部位产生一个直径约5mm的皮丘，用3%苦味酸沿皮丘边缘标记 注射部位。
2) 观察注射后每天观察并照相，注意注射部位皮肤颜色变化和毛囊生长情况。
3) 取材注射后3天、5天、7天、9天、14天、28天分别处死6只小鼠，取注射部位皮肤 ，4%多聚甲醛固定过夜后，常规石蜡包埋，5ym厚度切片，进行HE染色观察。
HE染色步骤
① 切片梯度水合二甲苯I15分钟一二甲苯II15分钟一100%乙醇13分钟一95%的乙醇11 3分钟一85%乙醇3分钟一75%乙醇3分钟一50%乙醇3分钟一蒸馏水洗3分钟。
② 苏木素染色2分钟，自来水冲洗，至切片发蓝。
③ 分色1%盐酸乙醇分色3-5秒(提插数下)，且切片变红，颜色较浅即可。
④ 返蓝自来水浸泡15分钟或温水(约5(TC) 5分钟。(显微镜下见细胞核蓝色，细胞 质和结缔组织无色为宜)
复染伊红液2分钟。
⑥ 梯度脱水50%乙醇3分钟一75%乙醇3分钟一85%乙醇3分钟一95%的乙醇3分钟一 100%乙醇I3分钟一100%乙醇II 3分钟用吸水纸吸干多余乙醇，二甲苯I3分钟一二甲苯II 3分钟。
⑦ 封片将玻片从二甲苯中取出，用吸水纸搽去组织片周围的二甲苯，迅速滴一滴中性 树脂于组织上，取清洁的盖玻片，在酒精灯上烘一下去湿，以未烘的一面轻轻盖在树胶上， 应避免产生气泡。
⑧ 观察显微镜下观察，照相。(2)器官培养
1) 取新生7天健康C57BL/6小鼠一只，此时毛囊处于生长期，易于分离。颈椎脱臼处死 ，酒精棉球消毒触须部位。眼科剪垂直皮肤剪下小鼠两边触须皮肤，放入装有D-Hank' s液 的培养皿中。用镊子夹着皮肤稍做清洗，吸去多余D-Hank' s液；
2) 解剖显微镜下(X3.2)用27号针头将毛囊连同结缔组织鞘一起分出来，D-Hank' s液 洗净，移入24孔板中，每孔5根毛囊，加入lml WilliamE无血清培养基；
3) 分别加入AdWnt3a、 AdGFP和等量PBS，使病毒终浓度达到10、fu/ml滴度，放入孵箱 培养。
4) 每2天换液，所有孔都加入相同的培养基。
5) 观察每天在显微镜下观察，用测微尺测量毛囊长度并照相。 WilliamE无血清培养基配方
WilliamE: 100ml 氢化可的松10ng/ml 胰岛素10ug/ml 谷氨酰胺2mmol/L 青霉素/链霉素100U/ml 实施例3结果分析
1. AdWnt3a的获得
经过多次扩增，获得AdWnt3a的滴度为109 pfu/ml。图3为AdWnt3a感染293细胞2天的情 况。可见，感染后2天，293细胞感染率达100%。
2. Adwnt3a促进毛发生长
(1)动物实验。在注射AdWnt3a后9d，注射部位皮肤开始变黑(18只中有15只出现)； ll天，有毛干长出表皮(12只中有10只出现)；14天，毛干全长出(12只中有11只出现)。而整 个期间，注射AdGFP和注射PBS组，注射部位仍处于静止期，与注射周边无明显变化。见图4 ，其中，左边2只分别为PBS对照组和空载体对照组，右边3只为AdWnt3a注射组。可见，注射 AdWnt3a部位长出新的被毛(生长期)，而其他部位仍处于静止期。
HE染色观察，AdWnt3a注射后3天，注射部位毛囊开始出现生长期早期结构(6只中有4只出现)；注射后5天，注射后部位毛囊呈生长期表型(6只中6只出现)；注射后7天、9天、 14天、28天毛囊均呈生长期表型。整个期间，AdWnt3a注射组(图5B)毛囊处于典型生长期 ，而AdGFP组(图5A)毛囊仍处于静止期。 (2)器官培养
毛囊在分离后培养，继续生长(包括内根鞘、外根鞘和毛干)。在加入AdWnt3a后，毛 囊生长明显加快。见图6A和图6B，实验组为加入AdWnt3a组，对照组为加入AdGFP组。培养毛 囊加入AdWnt3a后，毛囊生长明显加快。在体动物实验和体外器官培养实验都证实，AdWnt3a 作用后，毛囊呈现生长期表型，使毛囊从静止期向生长期转化。
用上述相同方法获得AdWntlOb，并采用上述同样的方法进行处理。结果显示，AdWntl0b 同样具有促进毛囊生长的作用。图7为AdWntl0b处理后14d，左边2只小鼠为AdWntl0b处理组 (注射部位沿背中线选取2点)，右边l只为对照组，可见，AdWntlOb处理组部位处于典型生 长期，而未处理部位仍处于静止期，S卩AdWntlOb促进了毛囊的生长。图8A为AdWntl0b处理后 14d后HE染色结果，图8B为AdGFP (对照)处理后14d后HE染色结果，与大体照相结果一致。
本实施例对小鼠的处理方法为皮内注射给药，通过涂抹、口服等给药途径可以达到同样 的效果。
结论Wntl0b和Wnt3a同样具有促进毛囊生长的作用，它们都是通过激活Wnt/{3 -catenin信号通路而发挥促进毛囊生长的作用。因此，其他通过该通路发挥作用的Wnt蛋白 同样具有促进毛囊生长的作用。
本实施例对小鼠的处理方法为皮内注射给药，本发明所述生发剂采用其他给药方式如涂 抹、口服等均可以达到本发明所述同样的效果。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的 技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护 范围当视权利要求所界定者为准。
权利要求
1.一种生发剂，其特征在于所述生发剂包含通过Wnt/β-catenin信号通路促进毛囊生长的Wnt蛋白。
2.根据权利要求l所述的生发剂，其特征在于所述通过Wnt/{3 -catenin信号通路促进毛囊生长的Wnt蛋白为Wnt3a蛋白。
3.通过Wnt/e-catenin信号通路促进毛囊生长的Wnt蛋白在制备治疗 脱发药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种含有Wnt蛋白的生发剂，所述生发剂包含通过Wnt/β-catenin信号通路促进毛囊生长的Wnt蛋白。本发明所述生发剂使毛囊呈现生长期表型，毛囊从静止期向生长期转化，具有效果明显，起效快，机制清楚等优点，对开发促毛发生长药物具有重要的社会和经济意义。
文档编号A61K38/17GK101642563SQ20091030658
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月4日 优先权日2009年9月4日
发明者何通川, 李玉红, 恬 杨, 连小华 申请人:中国人民解放军第三军医大学