专利名称：预防和治疗关节炎疾病的包含混合草药金银花和知母提取物的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，该组合物包含一种混合草药金银花(Lonicera japonica THUNB)和知母(Anemarrhena asphodeloides BUNGE)的提取物，用于预防和治疗关节炎疾病。
背景技术：
关节炎是一种自身免疫性疾病，以它们的症状如关节中的疼痛、肿胀和僵直为特 征。在哺乳动物中两种主要类型的关节炎是炎症性关节炎如类风湿性关节炎(RA)和骨关 节炎(OA)，一种经常继发于机械应激、衰老、发育异常情况和/或破坏的软骨渐近的、退化 的损失。关节炎的症状一般与脊柱关节有关，例如，趾僵化、关节化脓性银屑病或者风湿性 关节炎。骨关节炎表现出与类风湿性关节炎(RA)相似的症状。特别地，虽然骨关节炎以关 节软骨的退化开始，但是类风湿性关节炎以滑膜中的炎症开始。在骨关节炎中，随着软骨恶 化，后来经常发展为反应性的滑膜炎。相反地，随着类风湿性关节炎侵蚀软骨，继发的骨关 节炎改变骨和软骨的发育。在骨关节炎和类风湿性关节炎的最后阶段，患有两种疾病的关 节相互之间出现相同的现象。骨关节炎通常表示伴随运动恶化的疼痛或简单X-射线辐射清晰地显示出减薄的 软骨。一般受影响的关节是膝关节、髋关节、脊柱关节、指关节、拇指或大脚趾的底部等等。 该疾病涉及到由MMPs (基质金属蛋白激酶)引起的关节软骨的破环，该酶主要使软骨缺失， 其以关节软骨中的退化改变为特征和由炎症性细胞因子(例如，白介素-l(IL-l)，肿瘤坏 死因子-α (TNF-α)等等)的过度产生导致，从而导致关节、肌腱、肌肉和韧带中极严重的 疼痛(Fernandes J. C. , The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology, 39, pp237-246，2002)。类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病，以关节的肿胀、变 形和破坏为特征，达到极点时会造成严重的身体残疾。类风湿性疾病包括发生在肌肉、肌 腱、关节、骨或窦处的疾病，其一般以炎症和/或退化为特征。患有类风湿性关节炎的患者 表现出免疫系统中的失衡，其导致前炎症性细胞因子例如，TNF-α、IL-I等等的过度产生， 和抗炎症性细胞因子的缺乏例如，IL-10、IL-I等等。类风湿性关节炎的特征是滑膜炎症， 其可进展为软骨破坏，骨侵蚀和随后的关节变形。在炎症的过程期间，从关节中释放出多形 核细胞，巨噬细胞和淋巴细胞。被激活的T-淋巴细胞产生细胞毒素和前炎症性细胞因子， 而巨噬细胞则刺激前列腺素和细胞毒素的释放。在炎症的位点释放血管活性物质如组胺、 激肽和前列腺素，它们在发炎的关节区域导致水肿、红斑和疼痛。受影响的滑膜组织的主要病理是增生和T和B淋巴细胞的内膜下浸润。滑膜组织 增生在血管翳组织中形成，其在不可逆地破坏受影响关节中的软骨和骨。类风湿性关节炎 的进展是与巨噬细胞和树突状细胞产生的TNF-α和IL-I β的提高的水平、Thl/Th2的失 衡和抗原特异性免疫球蛋白的过度产生相关的。尤其地，TNF-α和IL-I β直接诱导蛋白质水解酶如基质金属蛋白激酶(MMPs)的合成，该酶可以分解细胞外的基质大分子。在正常 情况下，金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)以1 1的比例与MMPs正常地结合。由于MMPs 水平的上调而引起TIMPs与MMPs的失衡比例(其一般由MMPs的上调导致)导致类风湿性 关节炎中持续的基质破坏。用于治疗关节炎的急救药物包括用于减轻疼痛和炎症的药物，其被分类为非甾体 类抗炎症性药(NSAIDs)，例如，阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤等等。次级急救药物包 括皮质类固醇类，慢效抗风湿药物(SAARDs)或缓解疾病的药物(DMs)，例如，青霉胺、环磷 酰胺、金盐、硫唑嘌啉、左旋咪唑等等。由FDA批准的第一组用于治疗类风湿性关节炎的生 物反应调节剂(BRMs)是TNF-α拮抗剂，该拮抗剂通过与它的受体结合或直接与TNF-α蛋 白结合而起作用。然而，各种弊端阻碍了对DMARDs的利用，例如，潜在的长期的副作用和毒 性，成本高，对药物的超敏反应和由于TNF-α阻塞而引起的感染等等。退行性关节炎，作为代表性骨关节疾病的一种，是一种慢性关节炎。临床中用常规 有效的抗炎症性药物很难治疗这种疾病。而且，药物引起全身的不良反应如消化紊乱、胃 肠道紊乱和肾脏功能紊乱，以及随着患者年龄的增长会更加频繁地发生药物的不良反应， 其在老年人中进行长期全身治疗的情况下会导致很多问题。因此，与以前的全身治疗疗法 相比，最近更迫切地需要开发出靶向抗炎症作用、对软骨具有保护和再生作用的新的药物。 药物开发的最新理念已经聚焦到关节组织裂解酶抑制剂，自由基清除剂如S0D，通过对关节 组织组分(如软骨素或氨基葡萄糖等等)的长期治疗而使用的保守治疗(Badger A.M.等 人，J. Pharmacol. Exp. Ther. ,290, pp587-593,1999 ；Choi J. H.等人，Osteoarthritis Cartilage,10(6)，pp471~478,2002)。在体内，各种生物化学机理，特别是，产生一氧化氮的一氧化氮合成酶(NOS)酶和 其它涉及前列腺素(PGs)合成的酶在关节炎的病因中起了重要的作用。因此，从L-精氨酸 中产生NO的NOS酶或涉及各种前列腺素合成的环氧合酶(COX)成为阻断关节炎炎症的主 要靶点。根据最新报道，人体内存在几种NOS酶例如存在于脑中的bNOS(脑N0S)、在神经系 统中的nNOS(神经N0S)、在内皮系统中的eN0S(内皮N0S)等等，其在人体中以有规律的水 平进行表达。因而所产生的少量NO在维持稳态如神经传输或诱导血管舒张等等中起着重 要作用。然而，通过各种细胞因子或外界刺激物诱导的iN0S(诱导型N0S)使过量的NO突然 发生会引起细胞毒性或炎症性反应。慢性炎症与增加的iNOS的活性相关(Chan P. S.等人， Osteoarthritis cartilage, 13 (5), ρρ387~394, 2005 ；Appleton I. ^Α Adv. Pharmacol., 35, pp27-28,1996)。一般来说，软骨恶化和通过软骨中蛋白聚糖或胶原的晚期产生速率引起的关节炎 发生，其导致缓冲功能的丧失。关节软骨由对润滑和生长而言必需的水(70 80%)、胶原 (10 15% )、蛋白聚糖(5 10% )和软骨细胞组成，其中蛋白聚糖具有附上数个粘多糖 (GAG)的核心蛋白的特殊结构(Hardingham 等人，J. Rheum(Suppl)，43 (2)，pp86~90,1995)。金银花(Lonicerae Japonicae)是金银花属(属于忍冬科)的花蕾部分。它们味 甜并对解毒是有用的，其传统地用于痢疾、疼痛和肿胀。已知它们具有抗溃疡、抗细菌、抗病 毒、抗痉挛、利尿、抗炎症和止痛的生物活性。主要成分是毛地黄黄酮、肌糖、皂甙、丹宁、异 绿原酸、绿原酸等等(B. S. Chung 等人 HyangYakDaeSaJeon，Youngrimsa，pp939-940，1989)。
知母属于仙茅(Haemodoraceae)。它们味酸，其传统地用于发热、渴甚、咳嗽和糖尿 病。已知它们具有降血糖、解热、抗血小板聚集、抑制应激性溃疡、镇静、抑制cAMP磷酸二酯 酶和Na/K-ATPase、溶血、抗肿瘤的生物活性。主要成分是各种皂甙如知母皂甙A_I、知母皂 甙A-II、知母皂甙A-III、知母皂甙A-IV、知母皂甙B-I和知母皂甙B-II、烟酸、芒果甙、异 芒果甙等等(B. S. Chung 等人 HyangYakDaeSaJeon，Youngrimsa, pp203_204，1989)。然而，在以上列举的文献中尚未报道或披露关于混合草药金银花和知母提取物对 关节炎疾病的治疗作用，其中的公开通过引用并入本文。因此，本发明者通过各种实验确认混合草药金银花和知母提取物具有有效的抗 炎症作用，也就是，在软骨组织中对蛋白聚糖和II型胶原的分解的抑制作用；通过由于 MMP-I、MMP-3和MMP-13活性的抑制而对软骨的保护作用；和对软骨组织的修复作用；在水 肿动物模型中的抗炎症和消炎作用；通过对PEG2活性、GAG降解的抑制实验和各种遗传毒 性实验确认的抗炎症作用，因此，它可用作治疗和预防关节炎疾病的有效而安全的治疗法 或健康食品。
发明内容
技术问题根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于预防和治疗关节炎疾病的包含混 合草药金银花和知母提取物的组合物及其应用。技术方案因此，本发明的目的是提供一种包含混合草药金银花和知母提取物的药物组合 物，作为治疗和预防关节炎疾病的活性成分，特别是通过刺激软骨组织的修复，由于刺激软 骨组分和抑制软骨分解而保护软骨不受破坏，以及抑制炎症和疼痛。本发明提供一种包含混合草药金银花和知母提取物的药物组合物，作为预防和治 疗关节炎疾病的活性成分。此处所述的术语“提取物”包括可溶于水、C1至C4的低级醇及其混合物的粗提取 物；和通过使用丁醇溶液从粗提取物中分级分离获得的可溶于丁醇的提取物。此处所述的术语“混合草药金银花和知母”包括的混合草药的混合比例按重量计 算)为0. 5 3 1，优选地，按重量计算)为1 2 1，最优选地，按重量 计算(w/w% )为 1. 5 2 1。此处所述的术语“提取物”还包含金银花提取物中作为标准组分的绿原酸和知母 提取物中作为标准组分的芒果甙，这二者作为标准组分在总提取物中所占的比例优选为 0. 5 6 (w/w% )绿原酸和0. 5 4 (w/w% )芒果甙，更优选比例为1. 5 5 (w/w% )绿原 酸和0. 5 3.)芒果甙，最优选比例为3 4.)绿原酸和0. 5 2. 5 (w/ w% )芒果甙。此处所述的术语“关节炎疾病”包括退行性关节炎、风湿性关节炎或者狼疮性关节 炎，优选风湿性关节炎。本发明还提供了一种应用混合草药金银花和知母提取物来制备用于治疗和预防 哺乳动物或人类中关节炎疾病的治疗制剂。本发明的目的是提供一种治疗或预防人类或哺乳动物中关节炎疾病的方法，所述的方法包含给予作为有效成分的混合草药金银花和知母提取物的治疗有效剂量及其药学 上可接受的载体。在下文中，本发明进行详细地说明。本发明的发明提取物可以详细地通过下列方法进行制备。例如，将金银花和知母干燥、切割、粉碎，混合在一起并加入到1至20倍，优选地， 大约5至10倍体积的蒸馏水、C1至C4的低级醇或其混合物中，优选地水和醇的混合物以大 约1 0. 1至1 10，更优选地以1 0.5至1 5的混合比例(ν/ν)混合；将所述的溶液 用10°C 100°C温度范围的热水处理，优选地，60°C 100°C的热水进行1至6个小时的时 间范围的处理，优选地，为2至4个小时，其提取方法可以通过用热水、冷水、回流提取或超 声波处理提取的提取，优选为用热水提取；通过过滤收集提取液，在减压情况下将其浓缩、 干燥以获得本发明的发明粗提取物。另外，将等量的丁醇可溶性溶液加入到上述的粗提取物中，然后将混悬液进行分 级分离以获得本发明的发明纯提取物。如前文所述提供一种制备本发明粗提取物和丁醇可溶性提取物的方法是本发明 的另一目的。按照以上所诉的方法制备的本发明粗提取物和纯提取物中包含金银花提取物中 作为标准组分的绿原酸和知母提取物中作为标准组分的芒果甙，这二者在总提取物中作为 标准组分所占的比例优选为0. 5 )绿原酸和0. 5 4(w/w% )芒果甙，更优选比 例为1. 5 )绿原酸和0. 5 3.)芒果甙，最优选比例为3. 0 4. 5 (w/ w% )绿原酸和0. 5 2. 5 (w/w% )芒果甙。此外，对以上所描述的方法也可以进一步修饰或增加其步骤，通过本领域中已知 的常规方法来分级分离或分离获得更多有效的馏分或化合物，比如可以利用文献中报道的 方法(Harborne J. B. Phytochemical methods :A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. pp6_7，1998)。因此，本发明还提供了一种应用以上所述的制备方法制备的混合草药金银花和知 母的提取物用于制备治疗和预防哺乳动物或人类中关节炎疾病的治疗制剂。本发明还提供了一种用于预防和治疗关节炎疾病的包含通过以上所述的制备方 法制备的混合草药金银花和知母的提取物作为活性成分的药物组合物及其药学上可接受 的载体。本发明的目的是提供一种治疗或预防人类或哺乳动物中关节炎疾病的方法，其中 所述的方法包含给予通过以上所述方法制备的混合草药金银花和知母提取物的治疗有效 剂量，其中所述的提取物是作为有效成分的及其药学上可接受的载体。本发明的用于预防和治疗关节炎疾病的组合物可以包含基于组合物总重量的 0. 1 50%重量的上述提取物。本发明的组合物还额外地包含本领域已知使用方法中的常规载体、佐剂或稀释 剂。所述载体优选的根据它的用途和应用方法用作适当的物质，但不限于此。适当的稀 释剂列在雷明思药学(Remington' s Pharmaceutical Science)的书面文本里(Mark Publishing co. , Easton ΡΑ)。在下文中，下列制备方法和赋形剂仅仅是示例性的而绝不限制本发明。
根据本发明的组合物可以作为一种药学组合物来提供，所述的药物组合物包含药 学上可接受的载体、佐剂或稀释剂的药物组合物，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、木糖醇、赤丁四醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、 甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟甲基苯甲酸、羟丙基苯甲酸、滑石粉、硬脂酸镁和矿物 油。这些制剂另外可以包括填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等等。本 发明的组合物可以通过利用本领域任何已知方法制成，以使病人用药后能提供快速、持久 或缓慢释放的活性成分。例如，本发明的组合物可以溶解在油、丙烯乙二醇或其它通常用于制备注射剂的 溶剂中，适合的载体实例包括生理盐水、聚乙烯乙二醇、乙醇、植物油、异丙基十四酸酯等 等，但不限于它们。作为表皮给药，本发明的提取物还可以被制成软膏和乳膏。包含本发明组合物的药物制剂可以任何形式进行制备，如口服剂型(粉剂、片剂、 胶囊、软胶囊、液体药物、糖浆、酏丸、散剂、囊剂、粒剂)，或表皮制剂(乳膏、软膏、洗剂、凝 胶、香脂、膏药、糊剂、喷雾剂、气雾剂等等)，或注射制剂(溶液、悬浮剂、乳剂)。本发明的组合物在药物剂型中可以采用其药学上可接受的盐的形式，也可以单独 使用或适当的组合，也可以与其它药学上有活性的化合物联合使用。本发明提取物或组合物的想要的剂量根据个体的情况和重量、病情的严重程度、 药物形式、给药途径以及给药周期的不同而不同，其也可以由本领域技术人员进行选择。然 而，为了获得想要的作用，对本发明的发明提取物，通常建议给药剂量范围按重量/天计算 为0. 1至1000毫克/千克，优选地，为1至100毫克/千克。剂量可以是每天单次给药或 每天分多次给药。本发明中的药物组合物通过各种途径给药至个体动物如哺乳动物(大鼠、小鼠、 驯化动物或人类)，所有的给药方式均是预期的，例如，给药可以是口服、直肠给药或经静 脉、肌肉内、皮下、皮内、鞘膜内、硬膜外或脑室内注射。因此，本发明另一目的是提供一种包含混合草药金银花和知母提取物的功能性健
康食品。此处的术语“功能性健康食品”定义为“通过在常规食物中添加本发明的提取物， 来增强功能如身体功能或生理功能的功能性食物，以预防或改善人类或哺乳动物中的目标
疾病”。本发明的另一目的是提供一种包含本发明提取物的保健食品，及营养学上可接受 的添加剂，以预防和减轻目标疾病。此处的术语“保健食品”定义为“包含本发明提取物的食品，所述的食品没有特异 性的预期作用但有一般的预期作用，可以用其少量作为添加剂，或以全量作为胶囊、粒剂、 片剂等等的形式”。此处的术语“营养学上可接受的添加剂”定义为“任何具有预期用途的物质，所述 物质将成为或合理地期望直接或间接地成为任何食物的组分或否则可以影响任何食物的 特征”，例如，稠化剂、成熟剂、漂白剂、多价螯合剂、保湿剂、抗凝剂、澄清剂、食品加工剂、乳 化齐 、稳定剂、浓缩剂、碱和酸、发泡剂、营养素、着色剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、抗氧剂等 等，其在本领域中已知的物质。如果一种物质出于特殊目的被添加到食品中，它可被称作为直接添加剂和间接食品添加剂，这些添加剂由于包装、储藏或其它处理而以微量用量成为食品的一部分。上述健康食品可以包含于食物中、健康饮料中、膳食疗法中等等，并且可以使用其 粉剂、粒剂、片剂、咀嚼片、胶囊、饮料等等形式用于预防或改善目标疾病。本发明的提取物还可以被添加到食物或饮料中用于预防和改善目标疾病。作为功 能性健康食品或保健食品，本发明提取物在食物或饮料中的数量一般为作为功能性健康食 品组分的食物总重量的大约0. 01至15 / %的范围。特别的，尽管本发明的发明提取物在 功能性健康食品、保健食品或特殊营养食品中优选用量根据每一个食品的预期目的不同而 变化，一般来说本发明的发明提取物优选地使用作为添加剂的用量在食物(如面条等等) 中是约0. 01至5%的范围，在保健食品中以100%的食物组分的比率表示为40至100%的 范围。只要本发明中的健康饮料组合物在所示比率中包含作为基本成分的本发明提取 物，那么对其它的液体组分则没有特别的限制，其中其它成分可以是各种除臭剂或天然碳 酸等等，如常规的饮料。上述天然碳酸的例子为单糖如葡萄糖、果糖等等；双糖如麦芽糖、蔗 糖等等；常规糖如糊精、环糊精；以及糖醇如木糖醇和赤丁四醇等等。除了上述提到的除臭 剂以外的其它除臭剂，还有天然除臭剂如索吗甜、甜叶菊提取物如当归皂甙A、甘草酸等等， 和合成除臭剂如糖精、阿斯巴甜等等，这些除臭剂也许是有利地使用的。上述天然碳酸的用 量一般为100毫升的本发明饮料组合物的比例中约为1至20克，优选为5至12克的范围。除了上文所述组合物以外的其它组分是各种营养素、维生素、矿物质或电解液、合 成调味剂、着色剂和奶酪巧克力等中的改进剂，果胶酸及其盐，藻原酸及其盐，有机酸，保护 性胶体粘着剂，PH调节剂，稳定剂，防腐剂，丙三醇，醇，碳酸饮料中的碳化剂等等。除了上 文所述的组分以外的其它的组分还有用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的水果汁， 其中的组分可以单独或联合使用。所述组分的比例并不是如此重要，但一般每100 / %本 发明组合物中约0至20 / %的范围。这里提到的包含上述提取物的可添加的食品的例子 是各种食物、饮料、口香糖、维生素复合物、健康改善食物等等。本领域技术人员会发现可以在不脱离本发明实质或范围的情况下对本发明的组 合物、用法和制品可以进行各种修饰和改变。本发明将通过以下的实施例更具体地进行说明，但是应该理解本发明在任何方法 中并不限于这些实施例。本领域技术人员会发现可以在不脱离本发明实质或范围的情况下对本发明的组 合物、用法和制品可以进行各种修饰和改变。有益效果包含一种混合草药金银花和知母的提取物的本发明通过各种实验显示出有效的 抗炎作用，例如，对软骨组织中蛋白多糖和II型胶原的分解的抑制作用；由于抑制MMP-1、 MMP-3和MMP-13活性对软骨的保护作用；对软骨组织的恢复作用；在水肿动物模型中的抗 炎和消炎的作用；通过对PEG2活性和GAG的降解以及各种遗传毒性实验的抑制实验证明抗 炎作用，因此，该提取物可以作为有效安全的治疗制剂或健康食品用于治疗和预防关节炎 疾病。本发明将通过以下的附图和实施例更具体地说明，但是，应该理解的是本发明并 不限于这些实施例。
从以下结合附图的具体实施方式
中，将更清晰地理解前文提到的以及本发明其它 的内容、特点和其它优点，其中图1显示绿原酸的色谱分析结果，绿原酸是包含在金银花提取物中的标准组分；图2显示芒果甙的色谱分析结果，芒果甙是包含在知母提取物中的标准组分；图3显示绿原酸的色谱分析结果，绿原酸为KM-3中的标准组分；图4显示芒果甙的色谱分析结果，芒果甙为KM-3中的标准组分；图5-A表示经KM-I处理后对NO生成的抑制作用；图5-B表示经KM-3处理后对NO生成的抑制作用；图6-A表示经KM-I处理后对PGE2生成的抑制作用；图6-B表示经KM-3处理后对PGE2生成的抑制作用；图7-A表示经KM-I处理后对IL-I β生成的抑制作用；图7-Β表示经ΚΜ-3处理后对IL-I β生成的抑制作用；图7-C表示经ΚΜ-3处理后对IL_6生成的抑制作用；图8表示KM-I和KM-3对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型肿胀的抑制作 用；图9表示KM-I和KM-3在胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型中对增加的淋巴 细胞数量的抑制作用；图10表示KM-I和KM-3在胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型中对软骨侵蚀 的抑制作用；图11表示KM-I和KM-3在胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型实验中对胶原 特异性IgG抗体生成的抑制作用；图12-A描述KM-I对蛋白聚糖降解的抑制作用；图12-B描述KM-3、芒果甙和绿原酸对蛋白聚糖降解的抑制作用；图13-A描述应用KM-I处理后，通过RT-PCR方法检验出的，患有骨关节炎患者的 软骨组织中蛋白聚糖和II型胶原的增加的mRNA基因表达；图13-B描述应用KM-3处理后，通过RT-PCR方法检验出的，患有骨关节炎患者的 软骨组织中蛋白聚糖和II型胶原的增加的mRNA基因表达；图13-C描述应用芒果甙和绿原酸处理后，通过RT-PCR方法检验出的，患有骨关节 炎患者的软骨组织中蛋白聚糖和II型胶原的增加的mRNA基因表达；图14-A描述KM-I对患有骨关节炎患者的软骨组织中MMP-13活性水平的抑制作 用；图14-B描述KM-3对患有骨关节炎患者的软骨组织中MMP-13活性水平的抑制作 用；图15-A描述KM-I对患有骨关节炎患者的软骨组织中MMP-I活性水平的抑制作 用；图15-B描述KM-3、芒果甙和绿原酸对患有骨关节炎患者的软骨组织中MMP-I活性 水平的抑制作用；
图16描述应用KM-I (A)和KM_3 (B)处理后，对骨关节炎患者软骨组织的MMP_1、 MMP-3和MMP-13的mRNA基因表达水平的抑制作用；图17描述应用KM-I (A)和KM_3⑶处理后，患有骨关节炎患者软骨组织的细胞毒 性的测定；图18-A描述在骨关节炎软骨的软骨保护中所涉及的KM-3对一些丝裂原活化的蛋 白激酶(MAPK)磷酸化的抑制作用；图18-B描述在骨关节炎软骨的软骨保护中所涉及的芒果甙对一些丝裂原活化的 蛋白激酶(MAPK)磷酸化的抑制作用；图18-C描述在骨关节炎软骨的软骨保护中绿原酸对一些丝裂原活化的蛋白激酶 (MAPK)磷酸化的抑制作用；图19表示对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型中的关节的KM-I㈧和 KM-3(B)的肿胀和活动性恢复作用；图20-A表示通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过形态学分 析获得的KM-I的软骨保护作用；图20-B表示通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过形态学分 析获得的KM-3的软骨保护作用；图21-A描述通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过番红精氧 染色分析获得的KM-I对蛋白聚糖表达的恢复作用；图21-B描述通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过番红精氧 染色分析获得的KM-3对蛋白聚糖表达的恢复作用；图22-A描述通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过马森三色 染剂分析获得的KM-I对胶原表达的恢复作用；图22-B描述通过对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中通过马森三色 染色分析获得的KM-3对胶原表达的恢复作用；图23描述KM-3对胶原酶诱导的骨关节炎(CIA)动物模型关节中来自软骨下骨和 聚集蛋白聚糖的组织的分化间充质干细胞(⑶105，⑶73)表达的软骨再生作用；图24-A表示KM-3对GAG降解实验的抑制作用，该实验是通过从骨关节炎患者的 软骨组织和软骨下骨组织中分离获得的正常区(NSC)中共同培养软骨细胞和软骨下骨组 织进行的；图24-B表示KM-3对GAG降解实验的抑制作用，该实验是通过从骨关节炎患者的 软骨组织和软骨下骨组织中分离获得的异常区(SC)中共同培养软骨细胞和软骨下骨组织 进行的；
具体实施例方式实施本发明的最好模式本领域技术人员会发现可以在不脱离本发明实质或范围的情况下对本发明的组 合物、用法和制品进行各种修饰和改造，本发明将通过以下的实施例特别说明，但是应该理解的是本发明并不限于这些实 施例。
发明模式以下的比较实施例、参考实施例、实施例和实验实施例是为了进一步证明本发明， 但并不限于它的范围。比较实施例1 金银花花苞提取物的制备将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的金银花花 苞100克干燥，切割成小块，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。将所述的溶液在85°C下搅 拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩并干燥获得35克金银花花苞提取物，该 提取物被用作对照实验的样品(如下文所指定的“U提取物”)。如图1所示，已经通过色谱分析证明LJ提取物包含2. 2%的绿原酸)(见 图1)。比较实施例2 知母提取物的制备将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的知母100 克气干，切割成小块，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。将所述的溶液在85°C下搅拌回流4 小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩、干燥获得50克知母提取物，该提取物被用作对 照实验的样品(如下文指定的“AA提取物”)。如图2所示，已经通过色谱分析证明AA提取物中包含2. 3 %的芒果甙)(见 图1)。实施例1 混合草药(KM-I)提取物的制备将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的50克金银 花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小块，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。将所 述的溶液在85°C下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩至溶液体积达到 0. 1升的程度，然后将等体积的正丁醇加入其中以进行分级分离。经过反复分级分离，收集 正丁醇可溶性馏分，将其浓缩并干燥获得9克混合草药提取物，该提取物用作实验样品(如 下文指定的“KM-1”)。如在色谱分析中所示，已经通过色谱分析证明KM-I提取物包含3%的绿原酸(w/ w% )和3. 5%的芒果甙)。实施例2 混合草药(KM-2)提取物的制备将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的50克金银 花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小块，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。将所 述的溶液在85°C下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩并干燥获得40克 混合草药提取物，该提取物用作实验样品(如下文指定的“KM-2”)。如在色谱分析中所示，已经通过色谱分析证明KM-2提取物包含1. 5%的绿原酸 (w/w% )和 1. 8% 的芒果甙(w/w% )。实施例3 混合草药(KM-3)提取物的制备将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的100克金 银花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小块，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。将 所述的溶液在85°C下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩至溶液体积达 到0. 1升的程度，然后将等体积的正丁醇加入其中以进行分级分离。经过反复分级分离，收 集正丁醇可溶性馏分，将其浓缩并干燥获得11克混合草药提取物，该提取物用作实验样品(如下文指定的“KM-3”)。如图3和图4中所示，已经通过色谱分析证明KM-3提取物包含4. 5%的绿原酸(w/ w% )和2. 的芒果甙(w/w% )(见图3和4)。实施例4 混合草药(KM-4)提取物的制备将从韩国庆熙医学中心(Kyunghee Medical Center in Korea)购买的100克金 银花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小块，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。将 所述的溶液在85°C下搅拌回流4小时并将残余物过滤。将所述的滤液浓缩并干燥获得56 克混合草药提取物，该提取物用作实验样品(如下文指定的“KM-4” )。如色谱分析中所示，已经通过色谱分析证明KM-4提取物包含2. 2%的绿原酸(w/ w% )和1. 4%的芒果甙)。参考实施例1 巨噬细胞的培养在RPMI-1640培养基(10% FBS, 2mM 1-谷氨酰胺，100单位/毫升青霉素钠，100 单位/毫升硫酸链霉素和250纳克/毫升两性霉素B)中培养小鼠巨噬细胞株(Raw264. 7， 从ATCC购买)。将培养细胞接种在24孔板上(IO6细胞/孔)，并用KM-I (10，50，100，200 微克/毫升)，KM-3(10，20，40微克/毫升)，阳性对照组，即，塞来考昔(CEL，100微克/毫 升)和ETCP (SK化学)(100，200，400微克/毫升)处理30分钟。向其中加入1微克/毫 升的LPS和1纳克/毫升的IFN-，在二氧化碳培养箱中培养24小时，并在2000rpm下离心 5分钟，收集上清，所述的上清用作以下实验的样品。参考实施例2 胶原诱导的风湿性关节炎(CIA)模型从中央实验云力物(Chungang Experiment Animals) (www, labanimals. co. kr.韩 国)购买DBA/1J小鼠。将等体积的CFA(弗氏佐剂)滴入到2毫升胶原溶液(2毫克/毫 升)中并混合均勻。取100微升混合液皮下注射到小鼠尾根上方2. 5厘米部位。注射后3 周，将2毫升胶原溶液和等体积IFA(不完全弗氏佐剂)的混合液以100微升剂量注射在小 鼠尾根部上方1厘米部位。再经过3周，小鼠经口服给予溶解于CMC溶液中的KM-I (200毫 克/千克)、KM-3(200毫克/千克)和塞来考昔(100毫克/千克)。给予CMC (羧甲基纤 维素，Sigma)溶液作为阴性对照组。参考实施例3 软骨组织的制备人类关节软骨由已经做了人造关节手术(庆熙医学中心整形外科Orthopedics Surgery Dep. of Kyunghee Medical Center)的患者提供。在无菌条件下通过外科手术取 得关节表面后，将约200-220毫克从人类和兔关节软骨制备的关节表面组织浸泡在DMEM培 养基中(FBS，GIBC0 BRL，USA)，向其中补加5%的胎牛血清和100单位/毫升的青霉素-链 霉素。将组织用该培养基清洗数次，然后在37°C增湿95%的二氧化碳培养箱中培养所述的 关节组织。培养1或2天后，将培养基用新的碱性培养基替换，然后将30毫克的软骨细胞 转移至48孔板，该新碱性培养基包含经加热处理失活的5%胎牛血清，IOmM HEPES和100 单位/毫升的青霉素-链霉素。经1小时培养后，将5纳克/微升的白介素-1 α (IL-1 α，R&D System, USA)加入 到培养基中诱导炎症，将各种浓度的实验样品KM-I，ETCP (SK化学)，塞来考昔(CEL，Pfizer Co.，USA)和氨基葡萄糖(GLUC0，Sigma Co.，USA)，S卩，0. 1,0. 2和0. 4毫克/毫升分别加入 此培养基中。所述培养基在37°C下再经过7天的培养，收集上清，将其储存在-20°C以用作
13对照性实验和实验的样品。 参考实施例4 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)将根据参考实施例1中公开的方法培养的软骨细胞用TRIzoI试剂(Invitrogen Corporation, CA, USA)处理来分离RNA，通过向培养基中加入包含寡(dT) 12引物、三磷酸碱 基脱氧核苷酸(Dntp) (IOmM),0. IM 二硫苏糖醇(DDT)的缓冲液，逆转录酶和RNA酶抑制剂 来进行对1微克总RNA的逆转录。将所述的培养基在42°C培养60分钟。通过使用表1和 序列(SEQ) I. D. 1至16中公开的引物进行PCR(聚合酶链式反应)，该PCR应用1微克的每 一个由上述方法制备的cDNA，2. 5单位的嗜热水生菌(Taq)聚合酶(TaKaRa Taq , Takara, Japan), 1. 5mM dNTP, IX 的缓冲液(IOmM Tris-HCl pH 8. 3,50mM KCl, TritonX-100)和 20pM的表1和序列I. D. 1至16中每一配对引物来进行。将所述溶液用蒸馏水调节至10微 升的总体积，然后通过使用热循环装置(Bio-Rad，USA)按照如下的方法进行聚合酶链式反 应(PCR)经过94°C 5分钟的变性后，PCR按照94°C反应60秒，55°C反应60秒和72°C反应 90秒的顺序进行。该循环重复30次，最后的延伸是在72°C进行5分钟。通过PCR获得的 产物在1. 8%琼脂糖凝胶上进行电泳(5V/厘米)，并用2微克/毫升的溴化乙锭(EtBr)染 色5分钟。染色产物用蒸馏水洗10分钟，其结果在紫外波长(260nm)处进行检测。表 权利要求
一种包含混合草药金银花Lonicera japonica THUNB和知母Anemarrhena asphodeloides BUNGE提取物的药物组合物，该组合物作为治疗和预防关节炎疾病的活性成分。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的提取物是指一种粗提取物或丁醇可 溶性提取物。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述的粗提取物是用选自水、C1至C4的低 级醇或二者混合物的溶剂进行提取的。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述的丁醇可溶性提取物是通过将权利要 求3所述的粗提取物用丁醇分级分离获得的。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的混合草药金银花Lonicera japonica THUNB 和知母 Anemarrhena asphodeloides BUNGE 是按重量计算 0. 5 3 1 的 混合比例范围进行混合的。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的提取物包含绿原酸和芒果甙作为标 准组分。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述的提取物包含0.5 )绿原 酸和0. 5 )芒果甙作为标准组分。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的关节炎疾病是退行性关节炎、风湿 性关节炎或狼疮性关节炎。
9.、混合草药金银花Lonicera japonica THUNB 禾口知母 Anemarrhena asphodeloides BUNGE的提取物在制备用于治疗和预防哺乳动物或人类中关节炎疾病的治疗制剂中的用 途。
10.一种治疗或预防人类或哺乳动物中关节炎疾病的方法，其中所述的方法包括 给予治疗有效量的作为有效成分的混合草药金银花Lonicera japonica THUNB和知母 Anemarrhena asphodeloides BUNGE提取物及其药学上可接受的载体。
11.一种保健食品，其包含作为活性成分的混合草药金银花Lonicera japonica THUNB 和知母Anemarrhena asphodeloides BUNGE的提取物以及营养学上可接受的添加剂，用于 预防和减轻关节炎疾病。
12.根据权利要求11所述的保健食品，其中所述的提取物是一种粗提取物或丁醇可溶 性提取物。
13.根据权利要求12所述的保健食品，其中所述的粗提取物是用选自水、C1至C4的低 级醇或二者混合物的溶剂进行提取的。
14.根据权利要求12所述的保健食品，其中所述的丁醇可溶性提取物是通过将权利要 求13的粗提取物用丁醇分级分离获得的。
15.根据权利要求11所述的保健食品，其中所述的混合草药金银花Lonicera japonica THUNB 和知母 Anemarrhena asphodeloides BUNGE 是按重量计算 0. 5 3 1 的 混合比例范围进行混合的。
16.根据权利要求11所述的保健食品，其中所述的提取物包含绿原酸和芒果甙作为标 准组分。
17.根据权利要求16所述的保健食品，其中所述的提取物包含0.5 )绿原酸和0. 5 )芒果甙作为标准组分。
18.根据权利要求11所述的保健食品，其中所述的关节炎疾病是退行性关节炎、风湿 性关节炎或狼疮性关节炎。
19.根据权利要求11所述的保健食品，其中所述的保健食品是作为制成粉剂、粒剂、片 剂、胶囊或饮料的形式提供的。
全文摘要
本发明涉及本发明的组合物，该组合物包含混合草药金银花和知母提取物，并显示有效的抗炎症活性，因此，可将其用作治疗和预防关节炎疾病的有效及安全的治疗制剂或健康食品。
文档编号A61K36/8964GK101939018SQ200980104672
公开日2011年1月5日 申请日期2009年2月19日 优先权日2008年2月19日
发明者俞明哲, 崔道永, 朴东锡, 李栽东, 梁馨仁, 白容铉, 许桢恩, 许锺铉, 赵龙白, 郑仁镐, 金璟洙 申请人:庆熙大学产学协力团;丸仁制药株式会社