肽、组合物及其应用的制作方法

专利名称：肽、组合物及其应用的制作方法
肽、组合物及其应用本申请要求2008年1月22日提交的美国第61/022，747号临时申请的申请日权 益，该临时申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
背景技术：
细胞外基质(ECM)是在活体系统内围绕并支持细胞的复杂的结构体。在哺乳动物 组织中，ECM最常见于结缔组织内，例如腱、软骨、骨或皮肤的真皮。细胞外基质引导组织的生成和伤口的修复，并且几种医学状况也归因于合成有缺 陷的ECM(例如坏血病)、不断降解的ECM(例如牙周病、难愈性溃疡)，或者恶化的ECM或减 少的ECM生成(例如衰老的组织)。ECM的重要性已经促进了 EMC供给疗法的发展，用于组 织生成、伤口修复、疾病和老化治疗以及化妆品应用。发明概述
本发明公开了能够刺激细胞外基质(ECM)蛋白在细胞(例如成纤维细胞)内生成 以及由此能够用作组织和皮肤生成剂及用作化妆品的肽。在某些方面，本公开内容提供了包括氨基酸序列YAIGYSC(SEQID NO 6)的分离的 肽。在某些实施方案中，该肽刺激ECM蛋白(例如纤连蛋白、腱生蛋白、胶原蛋白、前胶原蛋 白或其组合物)的生成。在某些方面，本公开内容提供了与SEQ ID NO 6基本上同源或一致的分离的肽。在某些方面，本公开内容提供了与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3基本上同源的分 离的肽。在另一方面，本公开内容提供了包括本文描述的肽的化妆品组合物(例如与一种 或多种化妆用可接受的赋形剂组合)。在另一方面，本公开内容提供了包括本文描述的肽的药物组合物(例如与一种或 多种药学上可接受的赋形剂组合)。本发明在下文中被进一步描述时，我们在此处注意到，本发明包含分离的肽，其 由与氨基酸序列YAIGYSC (SEQ ID NO 6)具有至少70 %—致性(例如至少75 %，80 %， 85 %，90 %，95 %或100 %的一致性)的氨基酸序列组成，或包含与氨基酸序列YAIGYSC (SEQ ID NO 6)具有至少70%—致性(例如至少75%，80%，85%，90%，95%或100%的一 致性)的氨基酸序列。该肽能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤维细胞内的生 成(即它们能够在活体内或组织培养中刺激生成)。该分离的肽能够由与氨基酸序列 YAIGYSCKDYK (SEQ ID NO 1)具有至少 70%—致性(例如至少 75%，80%，85%，90%，95% 或100%的一致性)的氨基酸序列组成，或包含与氨基酸序列YAIGYSCKDYK (SEQ ID NO 1)具有至少70%—致性(例如至少75%，80%，85%，90%，95%或100%的一致性)的氨 基酸序列。这种肽还能够刺激一种或多种ECM蛋白在细胞内(例如在成纤维细胞内)的 生成。该分离的肽能够由与氨基酸序列APLWILSTDYDNYAIGYSC(SEQ ID NO 3)具有至少 70%—致性(例如至少75%，80%，85%，90%，95%或100%的一致性)的氨基酸序列组 成，或包含与氨基酸序列APLWILSTDYDNYAIGYSC(SEQ ID NO :3)具有至少70%—致性(例 如至少75%，80%，85%，90%，95%或100%的一致性)的氨基酸序列。这种肽还能够刺
4激一种或多种ECM蛋白在细胞内(例如在成纤维细胞内)的生成。该分离的肽能够由与 氨基酸序列APLWILSTDYDNYAIGYSCKDYK(SEQ ID NO 5)具有至少70%—致性(例如至少 75 %，80 %，85 %，90 %，95 %或100 %的一致性)的氨基酸序列组成，或包含与氨基酸序列 APLffILSTDYDNYAIGYSCKDYK(SEQ ID NO 5)具有至少 70%—致性(例如至少 75%，80%， 85%，90%，95%或100%的一致性)的氨基酸序列。这种肽还能够刺激一种或多种ECM蛋 白在细胞内(例如在成纤维细胞内)的生成。该分离的肽能够由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列，所述序列由于包括一个或 多个氨基酸取代、添加或删除而与参照序列(例如SEQID NO :6，SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 3或SEQ ID N0:5)不同。例如，该分离的肽能够通过多达四个的氨基酸取代、添加和/或 删除而与由SEQ ID NO :6所示的肽不同。不同于参照序列的该肽能够刺激一种或多种ECM 蛋白在成纤维细胞内的生成。其他的分离的肽能够通过多达六个的氨基酸取代、添加和/ 或删除而与SEQ ID NO :1不同，并且能够刺激一种或多种ECM蛋白在成纤维细胞内的生成。 其他的分离的肽能够通过多达十二个的氨基酸取代、添加和/或删除而与SQ ID N0:5不 同，并且能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤维细胞内的生成。本发明还包含药物组合物，该药物组合物包括此处描述的肽(例如，由与氨基酸 序列YAIGYSC(SEQ ID NO :6)具有至少70%—致性的氨基酸序列组成，或包含与氨基酸序 列YAIGYSC(SEQ ID NO 6)具有至少70%—致性的肽)。该药物组合物能够包括药学上可 接受的载体(例如水基稀释剂)，并且能够是液体或膏体形式。该药物组合物还能够包括伤 口愈合剂。该药物组合物能够被配制用于经口、肌肉内、静脉内、皮下、表面、肺部、鼻内、颊 部、直肠、舌下、皮内、腹腔或鞘内使用。本发明的方法包括通过给予个体(例如人类患者)的细胞一种或多种此处描述的 药物组合物来减少个体内细胞死亡和/或组织退化的方法。该个体可能已经被确定为正经 历由例如疾病、外伤或老化导致的细胞死亡和/或组织生成。该方法还能够包括给予伤口 愈合剂。本发明的方法包括通过给予个体(例如人类患者)一种或多种此处描述的药物组 合物来愈合个体伤口和/或再生个体组织的方法。根据对患者治疗需要的判断，该方法还 能够包括鉴定需要治疗的患者以及任选地进一步给予伤口愈合剂的步骤。任一种组合物都能够以治疗有效量给药。本文描述的分离的肽在制备药物方面的应用也在本发明范围内。该药物能够用于 减少细胞死亡和/或组织退化，或者用于伤口愈合和/或再生组织。附图概述

图1是柱状图，显示了通过MTT (3-[4，5_ 二甲基_2_噻唑]_2，5_ 二苯基溴化四氮 唑)测定的四种肽对细胞活力的影响。图2是线状图，显示了肽CNF011.05B对在添加有1%FBS的培养基中孵育了 120 小时的内皮细胞活力的影响，活力通过MTT测定。图3是线状图，显示了肽CNF011.05D对在添加有1%FBS的培养基中孵育了 120 小时的内皮细胞活力的影响，活力通过MTT测定。图4是柱状图，显示了肽CNF011. 05D加上L-NAME对在添加有1 % FBS的培养基中 孵育的中性粒细胞活力的影响，活力通过流式细胞术测定。
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图5是柱状图，显示了肽CNF011. 05D加上L-NAME对在添加有1 % FBS的培养基中 孵育的原代内皮细胞活力的影响，活力通过流式细胞术测定。图6是柱状图，显示了用格里斯反应(Griess reaction)测量的肽CNF011. 05D加 上L-NAME对中性粒细胞生成NO2的影响。图7是说明了在用0. 35μ g和5μ g的肽CNF011. 05D孵育时成纤维细胞产生的纤 连蛋白的百分比的图。图8是说明了在用0. 35 μ g禾Π 5 μ g肽CNFOl 1. 05D孵育时成纤维细胞产生的腱生 蛋白的百分比的图。图9是说明了在用0. 35 μ g和5 μ g肽CNF011. 05D孵育时成纤维细胞产生的前胶 原蛋白的百分比的图。发明详述本公开内容提供了用于刺激ECM蛋白，特别是纤连蛋白、腱生蛋白、胶原蛋白和前 胶原蛋白生成的新型的肽。本文描述了应用这种肽的方法，生产这种肽的方法以及包含这 种肽的试剂盒和组合物。上述肽可以用于生成细胞外基质蛋白，特别是纤连蛋白、腱生蛋白、胶原蛋白和前 胶原蛋白。该肽可以用于各种有益的用途，例如已经染病、受损或失去(例如，由于伤口、外 伤、外科手术或组织植入、骨病、外观缺陷、软骨病、牙周病、光老化或慢性老化、由循环障碍 导致的真皮创伤、糖尿病、传染病等)的组织的生成。该肽可以用于防止由组织疾病、外伤 或老化导致的组织退化(例如衰退的组织结构或组织缺损)。该肽可以用于伤口修复。该 肽能够用于减少疤痕的伤口修复(例如，愈合后与未治疗的相比，减少了疤痕组织或致密 纤维结缔组织量)。它们还能够用于与胶原蛋白或ECM组分机能失常有关的不同疾病(例 如哮喘)。对本发明的应用和实施方案的描述只是为了说明，而非限制。^X“细胞外基质”或ECM是复杂的结构体，其在活体系统内围绕在细胞周围并支持细 胞。在哺乳动物组织中，ECM最常见于结缔组织内，例如腱、软骨、骨和皮肤的真皮。ECM由 其存在的细胞产生和维持。“细胞外基质蛋白”或ECM蛋白是纤连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、腱生蛋白、 巢蛋白、血小板反应蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原蛋白、原纤蛋白、分区蛋白、锚定蛋白、软骨 粘连蛋白、连接蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、表皮粘连蛋白(印inectin)、透明 质粘连蛋白、波状蛋白、表皮整联配体蛋白和缰蛋白中的一种或多种。该术语包括将来可能 被发现、目前还未知的细胞外基质蛋白，因为它们作为细胞外基质蛋白的特征会被本领域 技术人员确定。“基本上同源”指当使用序列比对算法，例如BLAST算法(Altschulet al.，JMB 215 :403-410(1990))、Smith&ffaterman 的同源算法(Adv. Appl. Math. 2 482 (1981)), Needleman&ffunsch 的同源算法(JMBM 443 (1970))，以及 Pearson&Lipman 的相似性检索方 法(PNAS USA85 =2444(1988))比对或对齐，以得到最大对应性时，肽所包含的氨基酸序列 与另一氨基酸序列(例如，SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列)具有至少70% (例如70%， 75 %, 80 %, 82 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %,
697%,98%,99%)的一致性。几种计算机程序能够实现这些算法(例如GAP，BESTFIT，FASTA 禾口 TFASTA(Wisconsin Genetics Computer Group, USA))。iHS组织能够承受多种伤害，包括穿透伤、烧伤和钝伤。所有这些伤害促使与愈合反应 相关的一系列按次序发生的事件发生，其特征是特化细胞移动到伤口部位。如果组织已经 被破坏，特化细胞会将细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白)沉积在伤口部位，这是修复缺陷和 恢复解剖结构及功能所需要的。如果沉积的细胞外基质蛋白太少，伤口脆弱并有可能裂开。愈合及愈合级联反应由以下三个阶段组成炎症期、增生期和重塑期。炎症期由伤 口形成过程中暴露的胶原蛋白引发，其激活凝血蛋白。此后不久，炎症细胞迁移到伤口。第 一反应细胞-血小板释放包括纤连蛋白在内的一些蛋白，其控制出血并趋化其他细胞。第 二反应细胞-中性粒细胞杀死细菌并清除外源碎片。更迟反应细胞_白细胞和巨噬细胞释 放清除伤口的包括胶原酶在内的一些蛋白以及细胞因子，所述细胞因子刺激通过成纤维细 胞的胶原蛋白生成和血管生成。增生期包括上皮形成、血管生成、肉芽组织形成和胶原蛋白沉积。在上皮形成过程 中，如果基膜是完整的(如在一级烧伤中)，上皮细胞正常迁移到伤口。如果基膜已经被破 坏(如在二级和三级烧伤中)，来自外围的上皮细胞使伤口再形成上皮。在血管生成过程 中，内皮细胞迁移到伤口并且形成毛细血管。在肉芽组织形成和胶原蛋白沉积过程中，成纤 维细胞分化并使基质(例如细胞外基质蛋白(例如前胶原蛋白))沉积到伤口。成熟期的特征是新的细胞外基质的交联和组织(例如，胶原蛋白的特异性酶降 解)。伤口的处理被分成两大类(1) 一期愈合涉及伤口的物理闭合，通常是利用缝合 线、带子、缝合钉和绷带等。在一期愈合期间，愈合的主要机制是结缔组织基质沉积，其中胶 原蛋白、蛋白多糖及附着蛋白沉积形成新的细胞外基质；以及(2) 二期愈合使伤口开放， 并且通过收缩愈合；细胞和基质间的相互作用导致细胞和组织朝向伤口的中心移动。能够利用本文描述的肽再生或修复组织的实例包括神经组织，皮肤，血管组织，心 肌组织，心包组织，肌肉组织，眼组织，牙周组织，诸如骨、软骨、腱和韧带的结缔组织，诸如 肾组织和肝组织的器官组织，诸如胰腺组织、乳腺组织和肾上腺组织的腺组织，诸如膀胱组 织和输尿管组织的泌尿系统组织，以及诸如肠道组织的消化系统组织。老化老化的组织例如皮肤的特征是ECM的退化或ECM的生成减少，以及ECM基础的退 化。这些特性导致组织结构衰退。与年轻的皮肤相比，老化的组织较脆弱并且缺少弹性和 柔韧性。它失去了抵抗力，并且老化的皮肤经受起皱(例如长皱纹)。皱纹(和疤痕)的处理主要涉及将填充物注射到临近组织的缺陷或目的区的皮肤 的真皮层中。填充物的实例包括矿物油、脂肪、牛胶原蛋白和人胶原蛋白。所有的填充物都 有证据充分的局限性。例如，人胶原蛋白对减少皱纹部分有效，但需要使用大号针头的重复 疼痛注射，以补偿被身体吸收的胶原蛋白。Jt本发明描述了能够刺激细胞外基质(ECM)蛋白(例如纤连蛋白、腱生蛋白、胶原蛋 白和前胶原蛋白)生成的肽，该肽由此能够用作生成组织或皮肤或者促进组织或皮肤生成
7的制剂，以及能够用作伤口修复剂。本发明的肽包括由以下序列组成或包含以下序列的肽YAIGYSC (SEQ ID NO :6)、YAIGYSCKDYK(SEQ ID NO 1) , APLffILSTDYDNYAIGYSC(SEQ ID NO 3)或 APLffILSTDYDNYAIGYSCKDYK(SEQ ID NO 5)。由 SEQ ID NO 1 组成的肽在本文称为 “CNFO11. 05D 肽”。还包括与SEQ ID NO 6基本上同源的肽；以及由在高严格条件下与SEQ ID NO 6 的肽杂交的核酸编码的肽。还包括与SEQ ID NO 1基本上同源的肽；以及由在高严格条件下与SEQ ID NO 1 的肽杂交的核酸编码的肽。还包括与SEQ ID NO 3基本上同源的肽；以及由在高严格条件下与SEQ ID NO 3 的肽杂交的核酸编码的肽。如本文所使用的，术语“在高严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂 交反应的操作指南可以在Current Protocols inMolecular Biology (现代分子生物学实 验技术)，John ffiley&Sons, N. Y. (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6中找到，其内容通过引用并入本文。 高严格杂交条件包括在大约45°C条件下在6X SSC中杂交，然后在65°C于0. 2X SSC.0. 1% SDS中进行一次或多次洗涤，或者是与此基本上相似的条件。还包括包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成，或由氨基酸序列组成的肽，所 述氨基酸序列通过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、 14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个酸取代、添加或删除而与SEQ ID NO 5的序列不同。它们能够位于任一位置，例如内部或末端(例如在N或C末端)。肽的N-和/或C-末端能够被修饰，以增加稳定性，例如降低降解，例如蛋白水解 性的降解。该肽能够被修饰，以包含表位标签(例如His (例如6x His或聚-His)，Myc，HA, GST, MBP, VSV，硫氧还蛋白，β-半乳糖苷酶，FLAG，荧光蛋白(例如GFP)标签等)，例如， 来辅助肽的识别和纯化。裂解位点(例如Xa因子蛋白酶、肠激酶、凝血酶、TEV蛋白酶、 PRESCISSI0N 蛋白酶、介素1或介素2，或信号肽酶等的识别位点)能够任选地位于标签和 肽序列之间，以便标签能够从肽上裂解下来。这种技术是本领域已知的。也参见Current Protocols in Molecular Biology, John Wileyand Sons, Inc, New York, NY。肽的制备本文描述的肽能够在生物系统内或通过化学合成的方法制备。在生物系统内生产该肽，该肽能够通过重组DNA技术来生产。例如，包含编码本文 描述的肽的核酸序列的表达载体(例如，SEQ IDN0:5所示的肽能够由核酸序列gca-ccg-ctg-tgg-att-ctt-tct-act-gat-tac-gac-aac-tat-gct-atc-ggc-tac-tcc-tgc-aaa-gac-t ac-aag(SEQ ID NO 7)或按照遗传密码的相关序列编码；以及SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO :3所示的肽能够由衍生自SEQ ID NO :7的核酸序列或按照遗传密码的相关序 列编码)能够通过标准技术被导入生物系统(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物的表 达系统)并表达。然后，通过标准纯化技术(例如，利用基于肽的物理或化学特性的分离技 术，或者亲和纯化技术)从生物系统中(例如从细胞或培养基中)纯化所述肽。这些技术 为本领域的技术人员所熟知。参见，例如Current Protocols in Molecular Biology 3rded. , John Wileyand Sons, Inc, New York, NY。能够通过化学方法合成肽，例如，利用液相或固相合成法。这种技术在本领域内 是标准技术，参见例如 Atherton, E. , Sheppard, R. C. Solid Phase peptide synthesis :A practical approach. IRL Press, Oxford, England,1989 ；Stewart J. Μ. , Young, J. D.的 Solid phase peptide synthesis，第 2 片反，Pierce Chemical Company, Rockford,1984 ； Carpino (J. Am. Chem. Soc. 115 =4397-4398 (1992))。通过将羧基或一个氨基酸的 C-末端偶 联到氨基或另一个氨基酸的N末端合成肽。化妆品组合物本公开内容的肽能够配制成化妆品组合物，例如，用于给予个体以处理皮肤。该肽 能够被单独给予，或与在同一组合物中的其他化妆品联合给予或者与作为单独的组合物的 其他化妆品联合给予。通常地，化妆品组合物包括化妆用可接受的载体。如本文所使用的，“化妆用可接 受的载体”包括任一和所有的固体、半固体和液体增稠剂；赋形剂、稀释剂；具有过滤紫外线 性质的物质；香水；化妆品基质；以及化妆品配方。该化妆品组合物可以以多种形式存在。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂 型，诸如液体溶液、粉剂、膏剂、凝胶、乳剂、粘合剂等。药物组合物本公开内容中的肽能够被配制成药物组合物，例如，用于给予个体，以生成组织或 修复皮肤。该肽能够被单独给予或者与在同一组合物中的其他药物联合给予，或者与作为 单独的组合物的其他药物联合给予。通常地，药物组合物包括药学上可接受的载体。如本文所使用的，“药学上可接受 的载体”包括生理学上相容的任一和所有的溶剂、赋形剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌 剂、等张和吸收延迟剂、脂质体、微粒、微球、纳米球等等。药物组合物能够包括肽的药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见例 如 Berge et al. J. Pharm. Sci. 66 1-19 (1977))。药物配制是成熟的领域，并且还在例如Gennaro (ed.)，Remington =The Science and Practice of Pharmacy,20th ed. , Lippincott, ffilliams&ffilkins(2000)(ISBN 0683306472) ；Ansel et al. , Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems,7th Ed. , Lippincott Wi11iams&Wilkins Pub 1ishers(1999) (ISBN 0683305727) ；and Kibbe(ed. ), Handbook of Pharmaceutical Excipients American PharmaceuticalAssociation, 3rd ed. (2000) (ISBN :091733096X)中有描述。在一个实施方案中，赋形剂包括盐水、氯化钠、七水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和稳 定剂。该药物组合物可以以多种形式存在。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型， 诸如液体溶液(例如可注射且能注入的溶液)、分散液或悬液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、凝胶 或软膏。优选的形式取决于给药的期望方式和治疗应用。该药物组合物能够被配制用于表面给药，例如在伤口部位。表面给药包括例如表 皮、鼻内、吸入和阴道给药。该组合物能够被给予皮肤(例如用于烧伤、水泡或割伤)、嘴唇、 齿龈、牙齿、口腔、目艮睛、耳朵、甲床或咽喉等，例如在伤口部位。用于表面给药的组合物能够是乳剂、凝胶、洗剂或膏剂等形式。在某些实施方案中，药学上可接受的载体能够保护肽，防止肽快速释放或降 解(例如，制备可控释放制剂)，包括植入物和微胶囊化递送系统。能够使用可生物降 解的、生物兼容的聚合物，诸如醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚 乳酸。制备这些制剂的许多方法都已经被授予专利或广为所知，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York，1978。在某些实施方案中，该药物组合物可以与伤口愈合剂同时制备。如本文所使用 的，“伤口愈合剂”包括任一和所有的促进伤口修复、组织生成，或者阻止或抑制组织退 化的药剂。伤口愈合剂的实例包括刺激细胞外基质(ECM)蛋白生成的药剂、ECM结构成 分(例如蛋白、糖蛋白、蛋白多糖和糖胺聚糖)、生长因子和分化因子(参见Adams et al. , Development 117 1183-1198(1993)and Kreis et al. (eds. ), "Guidebookto the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins", Oxford UniversityPress (1993)(后文 称〃 Kreis et al .")，以及支架材料(例如，美国第20030211793号专利申请)。Adams et al.和Kreis et al.的教导通过引用并入本文，其描述了调节分化和发育的生长因子和 ECM组分。生长因子和分化因子的实例包括但不限于表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、 胰岛素生长因子、神经生长因子、肥大细胞刺激因子、血小板衍生生长因子、转化生长因 子-d、血小板衍生生长因子、分散因子(scatter factor)、肝细胞生长因子和雪旺细胞生长 因子。当该肽与伤口愈合剂联合使用时，这两种药剂能够被单独配制或一起配制。能够通过多种方法将上述肽给予个体，例如人个体。在许多应用中，给药途径是肠 胃外给药，例如静脉注射或输注(IV)、动脉内注射、皮下注射(Sc)、腹腔(IP)、心内注射、骨 髓腔内输注、皮内注射、腹腔输注或注射、玻璃体内注射、肌内注射、鞘内注射、关节内注射、 硬膜外给药中的一种。在一些优选的实施方案中，该肽通过肠道途径给药(例如口服)。该 肽能够被局部给予，例如经表面(例如经表皮、经鼻内、经吸入、经阴道等)(例如以乳剂、凝 胶、洗剂或膏剂的形式)，例如给予皮肤、嘴唇、齿龈、口腔或咽喉，例如在伤口部位。在某些 情况下，可以直接给予到需要细胞外基质的部位。能够局部或全身给予肽。能够例如通过注射、输注、扩散、植入物、表面施用或口服递送给肽予。能够以固定剂量，或者以yg/kg或mg/kg剂量给予肽。还能够选择剂量以减少或避免抗该肽的抗体的生成。该肽的给药途径和/或方式还能够针对个体情况而个性化，例如通过评价和监测 个体，例如利用肌电图、神经传导检测、诱发电位检测、核磁共振成像、神经系统检查、X射 线，和/或与特定病症相关的标准参数，例如评价背痛的标准。给药方案被调整，以提供所需的反应，例如治疗反应或组合的疗效。通常，能够使 用该肽(以及任选地第二药剂，例如，如本文描述的)的任何剂量组合(单独或共同配制 的)，以便为个体提供生物可利用的量的肽。例如，能够给予在0. 1 μ g/kg-10mg/kg, 1 μ g/
10kg-lmg/kg,1 μ g/kg-100μ g/kg,5 μ g/kg-500μ g/kg,0. l-100mg/kg,0. 5-100mg/kg,lmg/ kg-lOOmg/kg, 0. 5-20mg/kg或l-10mg/kg范围内的剂量。也能够使用其它剂量。本文所使用的剂量单位形式或“固定剂量”指物理上的离散单位，其适合作为用 于待治疗的个体的单位剂量；每个单位包含经计算产生所需治疗效果的预定量的活性化合 物，其与必需的药学上的载体结合，以及任选地与其他药剂结合。可以给予单一或多重剂 量。可选择地，或作为补充地，该肽可以通过连续输注的方式给予。能够例如每天一次或两次，或每周约1-4次，或优选地每周一次、两周一次或每月 一次给予肽，例如，给予约1-10周，或者对于疗程长的个体，如果需要的话更长。熟练的技 术人员会认识到，某些因素可以影响有效治疗个体所需的剂量和时间安排，这些因素包括 但不限于疾病或病症的严重程度、制剂、递送途径、先前的治疗、个体的总体健康状况和/ 或年龄、存在的其它疾病，以及个体经历的其它治疗。而且，用治疗有效量的肽的治疗可以 包括单次治疗，或优选地，可以包括系列治疗。动物模型还能够用于测定有效剂量，例如初 始剂量或方案。例如，动物研究能够用于测量由该肽促进的细胞外基质维持多长时间。如果个体面临由组织损伤、疾病或外伤导致的组织退化(例如衰退的组织结构老 化或组织缺失)的危险，能够在可能导致组织退化的事件发生之前或发生过程中给予上述 肽，例如作为预防性措施。这种预防性治疗的持续时间能够是该肽的单次剂量，或者治疗可 以从事件前、事件中和/或事件后的某个时间持续(例如多重剂量)，例如以将个体的损失 降到最低。例如，面临组织缺失风险的个体可以在可能导致组织退化的事件前几小时或几 天用该肽治疗，以预防组织缺失的发生或减少已经发生的组织缺失的量。药物组合物可以包括“治疗有效量”的本文描述的肽。这种有效量能够基于给予 的药剂(例如肽)的效果来确定，或者是如果使用了超过一种的药剂，根据药剂的组合效果 来确定。药剂的治疗有效量还可以根据诸如疼痛类型、疾病状态、年龄、性别、个体的重量以 及该药剂在个体中引发所需反应例如伤口修复的能力等因素而变化。治疗有效量还是治疗 上有益的作用超过组合物任何毒性或有害作用的量。如本文所使用的，“个体”可以是需要修复、重建或替代细胞外基质以生成或修复 已经受损、患病或缺失的组织的任何生物体。例如哺乳动物，例如人、农场动物(例如马、 驴、骡、牛、奶牛、公牛、绵羊、猪等)、家养宠物(例如狗、猫、大鼠、小鼠、兔子、仓鼠、荷兰猪、 雪貂等)，或动物园里的动物(例如长颈鹿、狮子、老虎、熊、斑马、猴子、大猩猩、鲸鱼、海豚
寸乂 O体外应用该肽可以在体外用于例如作为研究的模型系统，或用于制作假体或植入物，以替 代受损的或患病的组织，或用于提供支架，其当被细胞例如宿主细胞占据时，被重塑成为功 能性组织。装置和试剂盒包括上述肽的药物组合物能够通过医疗装置给药。该装置能够包括例如用于储存 包含该肽的药物制剂的一个或多个空间，以及能够被配置以递送一个或多个单位剂量的该 肽。该装置能够被进一步地配置以给予第二药剂，例如本文描述的组织生成或伤口修复剂， 其或者作为也包括该肽的单一药物组合物，或者作为两个单独的药物组合物。例如，该药物组合物能够利用无针皮下注射装置给药(例如美国专利5，399，163 ；
115，383，851 ；5，312，335 ；5，064，413 ；4，941，880 ；4，790，824 或 4，596，556)；通过植入物、模 块或泵(例如美国专利4，487，603 ；4, 447，233 ；4, 447，224)给药；通过皮肤给药装置(例 如美国专利No. 4，486，194)，以及渗透药物递送系统(例如美国专利4，439，196)给药。许 多其它装置、植入物、递送系统和模块也是已知的。肽能够提供在试剂盒中。在一个实施方案中，试剂盒包括(a)包含组合物的容器 以及任选地(b)信息性资料，所述组合物包括本文描述的肽。信息性资料可以是说明性的、 指导性的、销售性的资料或者涉及本文描述的方法和/或所述肽用于治疗益处的应用的其 他资料。在一实施方案中，试剂盒还包括用于组织生成或伤口修复的第二药剂，例如本文 描述的另一药剂。例如，该试剂盒包括包含组合物的第一容器，包括第二药剂的第二容器， 以及任选地信息性资料，所述组合物包括该肽。除了该肽之外，试剂盒中的组合物能够包括其它成分，诸如溶剂或缓冲剂、稳定剂 或者防腐剂。该肽能够以任一种形式提供，例如液体、干燥或冻干形式，优选基本上纯的和 /或无菌的。当药剂以干燥形式提供时，通常通过添加适合的溶剂使其复水。该溶剂，例如 无菌水或缓冲液，能够任选地提供在试剂盒中。试剂盒任选地包括适于组合物给药的装置，例如注射器或其它适合的递送装置。 提供的装置可以用上述药剂的一种或两种预载，或者可以是空的，但适于加载。
实施例本发明的说明性实施例利用了表1中呈现的合成肽，其由ORPEGEN Pharma(德国) 合成。表 权利要求
分离的肽，其包含与氨基酸序列YAIGYSC(SEQ ID NO6)具有至少70％一致性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的肽，其中所述肽能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤维 细胞内的生成。
3.如权利要求1所述的肽，其中所述肽包含氨基酸序列YAIGYSC(SEQ ID NO :6)。
4.如权利要求1所述的肽，其中所述肽包含与氨基酸序列YAIGYSCKDYK(SEQID NO 1) 具有至少70% —致性的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的肽，其中所述肽能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤维 细胞内的生成。
6.如权利要求4所述的肽，其中所述肽包含氨基酸序列YAIGYSCKDYK(SEQID NO :1)。
7.如权利要求1所述的肽，其中所述肽包含与氨基酸序列APLWILSTDYDNYAIGYSC(SEQ ID NO 3)具有至少70% —致性的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的肽，其中所述肽能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤维 细胞内的生成。
9.如权利要求7所述的肽，其中所述肽包含氨基酸序列APLWILSTDYDNYAIGYSC(SEQID NO 3)。
10.如权利要求1所述的肽，其中所述肽包含与氨基酸序列 APLffILSTDYDNYAIGYSCKDYK(SEQ ID NO 5)具有至少 70% —致性的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的肽，其中所述肽能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤 维细胞内的生成。
12.如权利要求10所述的肽，其中所述肽包含氨基酸序列 APLffILSTDYDNYAIGYSCKDYK(SEQ ID NO :5)。
13.分离的肽，其包含通过多达四个的氨基酸取代、添加或删除而与SEQID N0:6的氨 基酸序列不同的氨基酸序列，其中所述肽能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤维细 胞内的生成。
14.分离的肽，其包含通过多达六个的氨基酸取代、添加或删除而与SEQID N0:1的氨 基酸序列不同的氨基酸序列，其中所述肽能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤维细 胞内的生成。
15.分离的肽，其包含通过多达十二个的氨基酸取代、添加或删除而与SEQID N0:5的 氨基酸序列不同的氨基酸序列，其中所述肽能够刺激一种或多种细胞外基质蛋白在成纤维 细胞内的生成。
16.包含权利要求1所述的肽的药物组合物。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载体。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是水基稀释剂。
19.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述组合物是液体或软膏形式。
20.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述组合物包含伤口愈合剂。
21.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于经口、肌肉内、静脉 内、皮下、表面、肺部、鼻内、颊部、直肠、舌下、皮内、腹腔或鞘内使用。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于表面使用或皮间使用。
23.减少个体细胞死亡的方法，所述方法包含给予个体的细胞如权利要求16所述的药 物组合物。
24.如权利要求23所述的方法，其中细胞死亡由疾病、外伤或老化导致。
25.减少个体组织退化的方法，所述方法包含给予个体如权利要求16所述的药物组合物。
26.如权利要求25所述的方法，所述方法还包含给予伤口愈合剂。
27.在个体内再生组织的方法，所述方法包含给予个体如权利要求16所述的药物组合物。
28.如权利要求27所述的方法，所述方法还包含给予伤口愈合剂。
29.个体内伤口愈合的方法，所述方法包含给予个体如权利要求16所述的药物组合物。
30.如权利要求29所述的方法，该方法还包含给予伤口愈合剂。
31.权利要求1-15中任一项所述的分离的肽在制备药物中的应用。
32.权利要求1-15中任一项所述的分离的肽在制备用于治疗伤口的药物中的应用。
全文摘要
本发明描述了用于再生组织和伤口修复等应用的组合物。
文档编号A61K38/48GK101965398SQ200980108018
公开日2011年2月2日 申请日期2009年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者安娜·玛丽萨·储德金斯基-塔瓦希, 琳达·克里斯蒂安·卡瑞周卡瓦洛, 贾耐那·德索萨温图拉 申请人:圣保罗州研究奖励基金会;生物实验萨纽斯药物有限公司;安娜·玛丽萨·储德金斯基-塔瓦希