专利名称：通过将粘膜暴露到天然α干扰素的宿主防御机制的基因调控的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于激活抗击癌或由细菌或原生动物引起的感染的免疫响应的 α-干扰素(IFN-α)组合物的应用，所述组合物含有天然存在的α -干扰素和其它可选成 分的混合物。本发明还提供医学治疗方法和药物制备方法。
背景技术：
免疫系统由先天性免疫和适应性免疫组成，先天性免疫不需要抗原选择和T细胞 辅助，而适应性免疫需要接触抗原后较长时间来诱导。因此，先天性免疫可以针对(i)诸如 细菌和原生动物等外来侵入物或(ii)前癌性和癌性病况中的细胞转化快速反应，但这种 反应没有特异性。1型干扰素(特别是那些IFN- α干扰素)在免疫响应期间起着使各种可溶性免 疫介导体(例如细胞因子)的时机和相对量同步的作用。缺乏IFN-α可引起先天性免疫 的失调(也称为“细胞因子风暴”)，导致难以抵抗的肺炎。事后分析检查(Post mortem examination)表明，这些炎症性细胞因子(例如α肿瘤坏死因子或TNF-α )能够通过这种 免疫失调损害肺，并可能引起死亡。可以在严重的病毒性感染的早期之前或期间通过将极 小剂量的α干扰素施用到口、鼻或颊粘膜而使免疫失调正常化。我们现在已经发现利用低 剂量的α干扰素施用到口、鼻或颊粘膜以治疗由癌或细菌或原生动物引起的感染的功用。 令人惊奇地是，与仅对特定微生物或癌有效的其它化学治疗剂(例如，抗细菌性青霉素、抗 疱疹性疟疾氯喹碘苷和抗癌性药甲氨蝶呤)不同，低剂量的口服IFN-α作为可通过直接作 用于免疫系统而对治疗细菌、原生动物和癌有效的抗微生物化学治疗剂具有广泛应用。美国专利4，497，795公开，口服施用剂量约0. 10 1. 5国际单位(IU)/磅体重/ 天的人α干扰素增加了食物利用效率。美国专利5，830，456公开，使口腔和/或咽部粘膜接触剂量小于5IU/磅体重/天 的干扰素，“以便在罹患以免疫系统功能明显活动过度或活动不足为特征的免疫抗性疾病 状态的脊椎动物中加强疾病矫正性免疫响应”。其中所列出的可治疗疾病的实例为“特征为 慢性组织变性炎症的赘生性疾病、高过敏性(hyperallergenicity)、免疫抗性病毒感染或 免疫虚弱性病毒感染以及自身免疫疾病”。用α干扰素可治疗罹患急性类风湿性关节炎、 多发性硬化、哮喘、痤疮、恶性淋巴瘤、间皮瘤或阿弗他口炎(apthous stomatitis)的人类 患者。每天两次以缓冲溶液形式施用0.7IU/磅体重的α干扰素，所述缓冲溶液的浓度使 得单次剂量可以在体积为约Iml 约20ml的液体中施用。患者将该液体剂量保持在口中 最多约1分钟。
美国专利6，361，769公开了使用对口或咽粘膜施用的1500IU/天 20 X IO6IU/天 的干扰素以治疗自身免疫疾病、分枝杆菌疾病、神经退行性疾病、寄生物疾病或病毒疾病。但是现有技术未教导或建议如本发明中所用的不同人干扰素的经高度纯化的混 合物，本发明实现了涉及免疫调节的广谱基因的系统性激活和调控。因此，本发明的目的在于为需要抗细菌剂、抗原生动物剂和/或抗增殖剂的患者 提供治疗。本发明还提供了用于治疗受试对象的方法，和药物(特别是涉及传染病和/或 细胞转化的药物)的制备方法。以下描述其它目的和优点。
发明内容
本发明的一个目的在于治疗罹患初期或已建立的细菌感染或原生动物感染的受 试对象(例如，人类或动物)，由此使得针对所述感染的免疫响应重新达到平衡(即再调 节)，和避免失调的免疫响应的破坏。具体而言，可以降低α肿瘤坏死因子(TNF-α)的水 平，并且可以避免肺部病变(例如，经测定为诸如氧化损伤、肺水肿和出血等肺炎样指症的 数量或严重性的降低)。受试对象可以被细菌或原生动物感染。对受试对象施用由低剂量的IFN-α混合 剂(cocktail)组成的药物组合物。与未用低剂量的IFN-α混合剂治疗的受试对象相比， 如对于恢复时间的减少、免疫性的增加(即，抗体滴度增加、淋巴细胞的增殖或受感染细胞 的杀伤)、感染原的分裂或生长的降低或其任意组合所测试，受试对象的感染由此得以减少 或消除。本发明的另一目的在于治疗罹患原癌性或癌性病况(例如赘生物或肿瘤)的受试 对象(例如，人类或动物)，由此上调宿主对转化细胞或无限增殖化细胞的防御响应和控制 异常细胞增殖。受试对象可能罹患异常细胞增殖(例如，赘生物或肿瘤、其它转化细胞)。对所述 受试对象施用由低剂量的IFN-α混合剂组成的药物组合物。与未用低剂量的IFN-α混合 剂治疗的受试对象的情况相比，如对于发病率或死亡率的改善、免疫性的增加(例如，抗体 滴度的增加、淋巴细胞增殖或转化细胞的杀伤)、增殖细胞或转化细胞的分裂或生长的降低 或者其任意组合所测试，受试对象中的疾病由此得以减弱或消除。本发明的再一目的在于治疗被细菌或原生动物感染或罹患致病性疾病过程(即， 自身免疫疾病或神经退行性疾病)的受试对象(例如，人类或动物)，所述致病性疾病过程 易受由1型干扰素调节的特定基因的治疗影响。对所述受试对象施用由低剂量的IFN-a 混合剂组成的药物组合物。与未用低剂量的IFN-α混合剂治疗的受试对象的情况相比，受 试对象中的疾病通过表达不足的基因的表达的增加和过度表达的基因的表达的减少而由 此得以减少或消除。IFN-α混合剂可以是不同人α干扰素蛋白的混合物。其包括至少3种、至少6 种、至少10种、至少14种或至少18种不同的亚型的人α干扰素蛋白(即，1型的种类)， 所述人α干扰素蛋白可以在哺乳动物细胞中天然或重组地生产。可以从人血液产品、培养 受病毒感染的人白细胞的培养基、或其中经培养哺乳动物细胞或转基因哺乳动物细胞重组 表达人IFN-α基因的培养基或体液(例如血液、乳、尿)中纯化IFN-α蛋白。因此纯化的 混合剂含有不同的根据哺乳动物糖基化模式修饰的源自天然的人1F/-α亚型序列。优选将所述纯化混合剂通过经口腔、鼻和/或颊粘膜的局部施用(即，口咽施用)而不是经肠施 用或胃肠外施用来施用，或通过鼻内吸入或气管内吸入来施用。纯化混合剂的施用至少会 对微生物或由导致受试对象中自身免疫或神经退行性病变的过程引发的细胞因子生产或 共刺激分子信号传导进行再调节(即，增加或减少回到健康受试对象的正常水平)。本发明还提供了药物的使用和制备方法。然而，应该注意的是，针对产品的权利要 求不必受这些方法限制，除非在产品权利要求中引述所述方法的特定步骤。根据以下描述的具体实施方式
和权利要求以及由其概括的内容，本发明的其它方 面将对本领域技术人员显而易见。
具体实施例方式可以治疗由细菌或原生动物引起的感染。它可以感染人类或动物受试对象。所 述感染可以是初期的感染或已建立的感染。微生物可以是细菌或原生动物，特别是能引起 疾病的那些微生物(即，病原性微生物)。这里，术语“微生物(microbe)”和“微生物体 (microorganism) ”可相互替换地使用。细菌可以是以下属的种芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，炭疽芽孢杆菌 (B. anthracis)、蜡状芽孢杆菌(B. cereus))、巴尔通氏体属(Bartonella)(汉氏巴 尔通氏体(B. henselae))、博德特氏菌属(Bordetella)(例如，百日咳博德特氏菌 (B. pertussis))、疏螺旋体属(Borrelia)(例如，布氏疏螺旋体(B. burgdorferi))、布鲁氏 菌属(Brucella)(例如，流产布鲁氏菌(B. abortus))、弯曲杆菌属(Campylobacter)(例如， 空肠弯曲杆菌(C. jejuni))、衣原体属(Chlamydia)(例如，肺炎衣原体(C. pneumoniae))、 梭菌属(Clostridium)(例如，肉毒梭菌(C. botulinum)、艰难梭菌(C. difficile)、产
^ II (C. perfringens)(C. tetani))、_ 木干胃 M (Corynbacterium)
(例如，无枝菌酸棒杆菌(C. amycolatum)、白喉棒杆菌(C. diphtheriae))、埃希氏菌 属(Escherichia)(例如，大肠埃希氏菌(E. coli 0175:H7))、嗜血菌属(Haemophilus) (例如，流感嗜血菌(H. influenzae))、螺杆菌属(Heliobacter)(例如，幽门螺杆菌 (H. pylori))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae))、军团菌 属(Legionella)(例如，嗜肺军团菌(L. pneumophila))、利斯特氏菌属(Listeria)(例 如，单核细胞增生利斯特氏菌(L. monocytogenes))、分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如， 鸟分枝杆菌(M. avium)、牛分枝杆菌(M. bovis)、布兰德里分枝杆菌(M. branderi)、麻风分 枝杆菌(M. 1印rae)、结核分枝杆菌(M. tuberculosis))、支原体属(Mycoplasma)(例如， 生殖支原体(M. genitalium)、肺炎支原体(M. pneumoniae))、奈瑟氏球菌属(Neisseria) (例如，淋病奈瑟氏球菌(N. gonorrheae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis))、肺孢 子虫属(Pneumocystis)(例如，卡氏肺孢子虫(P. carinii))、假单胞菌属(Pseudomonas) (铜绿假单胞菌(P. aeruginosa))、立克次氏体属(Rickettsia)(例如，立氏立克次氏体 (R. rickettsia)、斑疹伤寒立克次氏体(R. typhi))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，肠沙 门氏菌(S. enterica))、志贺氏菌属(Shigella)(例如，痢疾志贺氏菌(S. dysenteriae))、 葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，金黄色葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌 (S.印idermidis))、链球菌属(Sti^ptococcus)(例如，肺炎链球菌(S. pneumoniae)、酿脓 链球菌(S. pyogenes))、密螺旋体属(Tr印onema)(例如，苍白密螺旋体(T. pallidum))、弧菌属(Vibrio)(例如，霍乱弧菌(V. cholerae)、创伤弧菌(V. vulnificus))或耶尔森氏菌属 (Yersinia)(例如，鼠疫耶尔森氏菌(V. pestis))。这些细菌包括革兰氏阴性菌或革兰氏阳 性菌、衣原体、螺旋菌、分枝杆菌和支原体。原生动物可以是以下属的种隐孢子虫属(Cryptosporidium)(例如，人隐孢子虫 (C.hominis)、微小隐孢子虫(C.parvum))、内阿米巴属(Entamoeba)(例如，溶组织内阿米 巴(E. histolytica))、贾第鞭毛虫属(Giardia)(例如，肠贾第鞭毛虫(G. intestinalis)、 蓝氏贾第鞭毛虫(G. Iamblia))、利什曼原虫属(Leishmania)(例如，亚马逊利什曼原虫 (L. amazonensis)、巴西利什曼原虫(L. brasiliensi)、杜氏利什曼原虫(L. donovani)、墨 西哥利什曼原虫(L.mexicana)、热带利什曼原虫(L. tropica))、疟原虫属(Plasmodium) (例如，恶性疟原虫(P. falciparum)、间日疟原虫(P. vivax))、弓形虫属(Toxoplasma)(例 如，刚地弓形虫(T. gondii))、或锥虫属(Trypanosoma)(例如，布氏锥虫(T. bruci)、克氏锥 虫(T. cruzi)) ο罹患异常增殖的受试对象的细胞可以是赘生物或肿瘤(例如癌、肉瘤、白血病、淋 巴瘤)，特别是由肿瘤病毒(例如，携带转化基因或癌基因的DNA病毒或RNA病毒)转化的 细胞或是被与癌相关的病毒感染的细胞。例如，Epstein-Barr病毒(EBV)与鼻咽癌、霍奇金 氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和其它B细胞淋巴瘤相关；人类乙型肝炎和丙型肝炎病毒(HBV 和HCV)与肝癌相关；人类疱疹病毒8 (HHV8)与卡波西肉瘤相关；人类乳头瘤病毒(例如， HPV6、HPVll、HPV16、HPV18或其组合)与子宫颈癌、肛门癌和生殖器疣相关；嗜人T淋巴细 胞病毒(human T-Iymphotrophic virus，HTLV)与T细胞白血病或淋巴瘤相关。癌包括源自 以下器官系统的癌胃肠器官系统(例如，食道、结肠、小肠、回肠、直肠、肛门、肝、胰、胃)、 泌尿生殖器官系统(例如，膀胱、肾、前列腺)、肌肉骨骼器官系统、神经器官系统、肺器官系 统(例如肺)或生殖器官系统(子宫颈、卵巢、睾丸)。干扰素(IFN)是天然存在的类激素蛋白，具有抗病毒性、抗增殖性和免疫增强性。 它们由身体响应于病毒感染或其它诱导剂以低水平产生。ALFER0N LDO 中存在α干扰 素的至少 7 种不同的蛋白亚型IFN-α 2、IFN-α 4、IFN-α 7、IFN-α 8、IFN-α 10,FN-α 16 和 IFN-α 17。ALFER0NLDO (低剂量的口服干扰素α-n3 (源自人白细胞))是ALFER0NN 干扰素α_η3的不同制剂(含有5X106IU/ml的可注射溶液)，是目前唯一由FDA批准并 且可商购的天然干扰素。与含有单一亚型IFN-α的重组IFN-α产品不同，干扰素α _n3 含有至少7种IFN-α。它们与干扰素α -2b结合相同的受体。ALFERON-LDO 干扰 素α-η3由长度为约166个氨基酸、分子量为16Kda 27Kda的α干扰素蛋白组成。它们 至少包括 IFN- α 2、IFN- α 4、IFN- α 7、IFN- α 8、IFN- α 10、IFN- α 16 禾P IFN- α 17。干扰素 α -η3的特异性活性为至少约2Χ 108IU/mg蛋白。IFN-α混合剂可以从汇集的人类血液单位制造。制造方法包括分离淡黄层白细 胞(buffy coat leukocytes)、通过用仙台病毒不完全感染进行诱导、用针对多种IFN-α的 鼠单克隆抗体执行免疫亲和色谱、在4°C酸化(PH2) 5天以使可能的污染性感染原失活和/ 或清除可能的污染感染原(例如，用于诱导的仙台病毒或诸如HIV-I、HTLV-I、HBV、HSV-U hCMV和EBV等血液携带病毒)，和执行凝胶过滤色谱。作为另一种选择，混合剂中的至少一 些IFN-α可以分离自人血液产品(例如，全血或血清)或培养基(例如，条件培养基)，在 所述培养基中哺乳动物细胞产生具有天然来源序列和糖基化模式的人IFN-α蛋白。纯化的混合剂可用于配制药物。口服施用的制剂包括水性溶液、糖浆剂、酏剂、散剂、颗粒剂、片剂和胶囊剂，其可 以含有赋形剂，例如粘合剂、填料、稳定剂、崩解剂、润湿剂、悬浮剂、乳化剂、防腐剂、缓冲 盐、调味剂、着色剂、甜味剂或其任意组合。所述制剂可以是液体、气雾化溶液、气溶胶喷雾 剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂或锭剂。口服施用制剂可以含有乳酸钠作为缓冲剂、甘油和/或木 糖醇作为稳定剂、苯甲酸钠作为防腐剂、人白蛋白作为载体以及水作为载剂。可以以涉及口腔、鼻和/或颊粘膜的任何途径施用IFN-α混合剂。优选不以经肠、 胃肠外或吸入途径施用所述混合剂。应该意识到优选剂量会随着受试对象的状况和年龄、 感染性疾病或赘生性疾病的性质以及所选择的IFN-α种类而变化。优选使用不同人干扰 素的高纯度的混合物(例如混合剂中至少80%或85%或90%或95%的蛋白是IFN-α，不 包括有意添加的载体蛋白)。IFN-α混合剂的活性可以是至少106IU/mg蛋白、至少IO7IU/ mg蛋白或至少108IU/mg蛋白。所述IFN-α混合剂的剂量取决于治疗感染或所负荷的肿瘤期间受试对象的临床 状态和医师或兽医师的经验。该混合剂可以以水溶液形式按5IU/磅体重/天 1000IU/ 磅体重/天施用(作为另一种选择，按25IU/磅体重/天 200IU/磅体重/天施用)。当 基于体重为150磅的人计算时，该剂量为750IU/天 1.5Χ IO5IU/天。经验表明，在α干 扰素超过750IU/天的剂量水平(即大于5IU/磅体重/天)时可获得有益结果。实施例实施例1研究A 通过每天口服施用500IU或1，oooiu的ALFERON 的水性缓冲液来 治疗CD4水平> 400的无症状HIV感染受试对象10天，所述水性缓冲液通过稀释注射用 ALFERON 制成。使用RNA分离用Paxgene技术从治疗前、治疗期间和治疗后收集的血 液中分离外周血白细胞的RNA。使用cDNA微阵列分析鉴定因ALFERON 口服给药而受 调节的基因。研究B:以类似方式研究的正常健康志愿者。结果表明，口服(粘膜)施用500IU或1，000IU的源自人类的多种天然白细胞 α-干扰素后，在外周血白细胞中诱导了 α-干扰素相关基因的活性和分化基因的调节。研究中所用的ALFERON 以水溶液形式供应，包装在密封的衬有聚丙烯的箔 的袋中。各袋含有1.0ml的ALFERON (500IU或1，000IU)或安慰剂。每天口服溶液， 持续10天。施用前30分钟至施用后30分钟期间不进食或进水，以避免对多肽混合物的酶 促破坏。给药和血液采样示于表1。表1 研究天数和事件
权利要求
一种治疗被细菌或原生动物感染的受试对象的方法，所述方法包括对所述受试对象施用由至少3种不同的人α干扰素蛋白的纯化混合物组成的药物组合物，所述人α干扰素蛋白具有天然氨基酸序列和糖基化模式，所述施用的量足以减少或消除由细菌或原生动物引起的所述受试对象的感染，其中所述药物组合物以5IU/磅体重/天～1000IU/磅体重/天的剂量经口咽施用。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试对象被细菌感染。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试对象被原生动物感染。
4.一种治疗带有肿瘤或其它转化细胞的受试对象的方法，所述方法包括对所述受试对 象施用由至少3种不同的人α干扰素蛋白的纯化混合物组成的药物组合物，所述人α干 扰素蛋白具有天然氨基酸序列和糖基化模式，所述施用的量足以减少或消除所述受试对象 中肿瘤或其它转化细胞的增殖，其中所述药物组合物以5IU/磅体重/天 1000IU/磅体重 /天的剂量经口咽施用。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述受试对象具有由病毒感染引发的癌症。
6.一种治疗被细菌或原生动物感染的受试对象或受致病性疾病过程影响的受试对象 的方法，所述致病性疾病过程对由α干扰素蛋白调节的特定基因的治疗易感，所述方法包 括对受试对象施用由至少3种不同的人α干扰素蛋白的纯化混合物组成的药物组合物，所 述人α干扰素蛋白具有天然氨基酸序列和糖基化模式，所述施用的量足以增加受所述感 染或疾病过程负调节的基因的表达或足以减少受所述感染或疾病过程正调节的基因的表 达，其中所述药物组合物以5IU/磅体重/天 1000IU/磅体重/天的剂量经口咽施用。
7.如权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，所述受试对象是人。
8.如权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，所述药物组合物是ALFERON LDO 干扰素α -η3。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述药物组合物是ALFERON LDO干扰素 α -η30
10.如权利要求1 9中任一项所述的方法，其中，由导致受试对象中的自身免疫或神 经退行性病变的微生物或过程引发的至少细胞因子生成或共刺激性分子信号传导受到所 述不同人α干扰素蛋白的混合物再调节。
11.至少3种不同的人α干扰素蛋白的纯化混合物在制备用于治疗细菌感染、原生动 物感染或癌症的药物上的应用，所述人α干扰素蛋白具有天然氨基酸序列和糖基化模式， 而所述药物以5IU/磅体重/天 1000IU/磅体重/天的剂量经口咽施用。
全文摘要
一种α干扰素(IFN-α)的混合物在体外或体内被用作抗微生物剂或抗癌剂。可以将该混合物通过局部施用于口腔粘膜、鼻腔粘膜和/或颊粘膜而施用，以抗击由细菌或原生动物引起的感染、癌、或其他致病性疾病过程(例如自身免疫疾病或神经退行性疾病)导致的影响。
文档编号A61P33/02GK101990438SQ200980112630
公开日2011年3月23日 申请日期2009年2月17日 优先权日2008年2月15日
发明者大卫·斯特雷耶, 威廉·A·卡特 申请人:海米斯费克斯生物制药公司