Sparc抗炎活性及其用途的制作方法

专利名称：Sparc抗炎活性及其用途的制作方法
SPARC抗炎活性及其用途关于联邦资助研究开发的声明本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权 号K01-CA089689、HL74279和HL59699的政府资助进行。政府在本发明中拥有一定权利。与相关申请的交叉参照本发明要求于2008年4月14日提交的美国临时申请号61/044，609的利益，所述 美国临时申请在此整体引入作为参考。
背景技术：
炎性疾病和病状的特征在于过度炎症或过度免疫应答。炎性疾病的潜在病因学可 能是传染性、自身免疫、移植排斥或其他病理过程。某些常见炎性疾病包括例如腹膜炎、胸 膜炎(plueritis)、类风湿性关节炎、炎性关节病(例如强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎、莱特 氏(Reiter' s)综合征)、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森氏(Addison' s)病、强直性 脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、大疱性类天疱疮、乳糜泻、溃疡性结肠炎(两 类特发性炎性肠病“IBD”之一)、克罗恩(Crohns)病(两类特发性炎性肠病“ IBD”之一)、皮 肌炎、子宫内膜异位症、古德帕斯彻氏(Goodpasture' s)综合征、格雷夫斯氏(Graves') 病、格-巴二氏(Guillain-Barre)综合征(GBS)、桥本氏(Hashimoto ‘ s)病、川崎 (Kawasaki)病、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、多发性硬化症(MQ、重症肌 无力、寻常性天疱疮、牛皮癣、牛皮癣关节炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化(chirrosis)、硬 皮病、干燥综合征、僵人综合征、颞动脉炎(也称为“巨细胞动脉炎”)、脉管炎、白癜风、韦格 纳氏(Wegener' s)肉芽肿病等。尽管存在众多抗炎药，但仍需要开发用于炎性疾病的改善 疗法。腹膜炎是一种示例性炎性疾病。腹膜炎是腹腔内层的炎症。腹膜炎的最常见原因 是细菌感染和化学刺激。细菌性腹膜炎通常是伴随病症发生的细菌穿透通过腹部器官继 发性的，所述病症例如阑尾炎、急性胆囊炎、溃疡病、憩室炎、肠梗阻、胰腺炎、肠系膜血栓形 成、盆腔炎性疾病、肿瘤或穿透性创伤、或其组合。此外，特发性细菌性腹膜炎(SBP)可能在 没有明显污染来源的情况下发生，SBP通常与免疫抑制状态相关，例如肝硬化腹水或肾病综 合征。腹膜炎也是长期非卧床腹膜透析(CAPD)的常见并发症。尽管事实上每一种生物体都已牵涉细菌性腹膜炎，但最常见的生物体是大肠杆菌 (E. coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产气荚膜梭菌(C. perfingens)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhea)、沙目艮衣原 体(Chlamydia trachomatis)、链球菌和肠道球菌(enteroococci)。引起感染性腹膜炎的最 常见真菌因子是白色念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis) 和烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)。非感染性化学性腹膜炎可以起因于例如在手术过 程中或通过创伤引入腹膜内的异物，化学性腹膜炎也可以在病状例如急性胰腺炎中发展， 所述急性胰腺炎将刺激性内源材料例如消化酶或胆汁引入腹膜腔内。腹膜粘连和脓肿是腹膜炎的常见长期并发症。腹膜粘连是在腹膜内浆膜表面之间 的异常纤维组织连接。手术和腹部炎症是腹膜粘连的最常见原因。腹膜感染通常伴随腹膜炎症，包括纤维蛋白原和纤维蛋白渗出到腹腔内。纤维蛋白原和纤维蛋白的存在促进纤维 化和粘连形成。炎症也导致生长因子、细胞因子、蛋白酶和细胞外基质的腹膜内累积，这进一步促 成纤维化和粘连形成。在传染性腹膜炎中，纤维蛋白沉积物可能捕获传染原导致脓肿，这继 而可以引起更多纤维性粘连。腹膜粘连限制腹内器官的正常运动和作用，特别是胃肠道的 正常功能。腹膜粘连还可以导致骨盆痛、不育和缺血性肠梗阻。腹膜脓肿是微生物以及炎症细胞和介质(即“脓液”)的由“墙”隔开的集合。腹 膜脓肿难以治疗，因为它们被纤维囊隔开，使得难以在腹膜脓肿内达到抗生素治疗水平。腹 膜脓肿可以是远侧器官和脓毒症中的严重感染来源。因此，腹膜粘连和脓肿是发病率和死 亡率的主要原因。腹膜炎的有效治疗或预防可以显著减少发展腹膜内粘连和脓肿的危险。目前用于治疗或预防腹膜炎的方法是有限的。在一些案例中，化学性腹膜炎可以 对腹腔的冲洗有反应。已推荐用大量无菌盐水溶液的多重再探查和手术中灌洗的方法，以 降低手术后腹膜感染、腹膜炎和粘连的危险。然而，尽管使用无菌盐水反复灌洗，仍存在发 展腹膜炎和粘连的显著危险。还已测试了各种局部抗微生物剂，但由于缺乏功效或有严重 副作用(即硬化性腹膜炎)，无一已广泛接受用于来源控制。此外，通常需要全身性抗生素 疗法，即使病状在病因学中最初是化学性的。依赖于腹膜炎的类型和严重性，临床现象可以进展至急性全身性炎症应答综合征 (SIRS)、脓毒症或脓毒性休克。这些病状的病理生理学是复杂的，但它可以与感染和急性炎 症反应两者局部和全身地存在相关。因此，即使在早期阶段(即WRQ中，在腹膜腔和血液 中也存在促炎细胞因子的累积，它们促成多器官衰竭的建立和死亡。这些细胞因子，至少在 鼠类腹膜炎模型中是主要衍生自在腹膜腔中的激活肥大细胞。因此，需要治疗或预防腹膜炎的改善方法。本发明提供了此类方法。本发明的这 些和其他优点以及另外的发明特征由于本文提供的本发明说明书将是显而易见的。发明概述本发明提供了治疗患有炎性疾病或病状的哺乳动物的方法，其包括给患病哺乳动 物施用治疗有效量的SPARC多肽或编码SPARC多肽的经分离的多核苷酸和药物载体。本发明提供了治疗患有腹膜炎的哺乳动物的方法，其包括腹膜内施用治疗有效量 的SPARC多肽或编码SPARC多肽的经分离的多核苷酸和药物载体。本发明提供了减少哺乳动物中的腹膜粘连发生的方法，其包括腹膜内施用治疗有 效量的SPARC多肽或编码SPARC多肽的经分离的多核苷酸和药物载体。本发明提供了治疗患有子宫内膜异位症的哺乳动物的方法，其包括腹膜内施用治 疗有效量的SPARC多肽或编码SPARC多肽的经分离的多核苷酸和载体。附图简述

图1描绘了 SPARC对单独或与间皮细胞共培养的卵巢癌细胞的单核细胞趋化蛋 白-I(MCP-I)生产和迁移的作用。图2比较了在抗MCP-I抗体的存在或不存在下，表达或未表达SPARC的卵巢癌细 胞的增殖和侵袭力。图3比较了单独或与巨噬细胞和任选地腹膜间皮细胞共培养的，表达或不表达 SPARC的卵巢癌细胞的侵袭力和IL-6生产。
图4描绘了 SPARC对卵巢癌细胞和巨噬细胞的蛋白酶解活性的作用。图5描绘了单独或与间皮细胞和/或巨噬细胞共培养的，表达或不表达SPARC的 卵巢癌细胞中前列腺素E2 (PGE2)生产，并且描绘了 PGE2对表达或不表达SPARC的卵巢癌 细胞的增殖和侵袭力的作用。图6描绘了 SPARC对单独或与间皮细胞和/或巨噬细胞共培养的卵巢癌细胞中 8-异前列烷(8-isoprostane)生产的作用。图7比较了在单独或与巨噬细胞共培养的，表达或不表达SPARC的卵巢癌细胞中 的NF-κ B启动子活性。发明详述定义在下文说明书中，广泛地使用了许多术语，提供下述定义以促进本发明的理解。如本文使用的，“药剂”是可以施用于患者或测试受试者的、能够产生效应的组合 物。所述效应可以是化学、生物学或躯体的，并且患者或测试受试者可以是人或非人动物， 例如啮齿类或转基因小鼠。组合物可以包括合成制造、在自然界中发现或具有部分合成来 源的，具有独特分子组成的小的有机或无机分子。在这个组中包括有核苷酸、核酸、氨基酸、 肽、多肽、蛋白质、肽核酸或包含这些实体中至少一种的复合物。药剂可以单独包括该有效 组合物或还含有药学上可接受的赋形剂。如本文使用的，“药学上可接受的赋形剂”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分 散介质、包衣、抗菌剂、抗微生物剂或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可以适合于 静脉内、腹膜内、肌内、鞘内或经口施用。赋形剂可以包括无菌水溶液或分散系用于无菌可 注射溶液或分散系的临时制备。此类介质用于药剂制备的用途是本领域已知的。如本文使用的，药剂的“药理学有效量”指使用以此类浓度存在的药剂的量，以导 致所递送的药物在药物使用期间有治疗水平。这可能依赖于递送方式，用量的时间段，接受 药剂的受试者年龄、重量、一般健康、性别和饮食。何种剂量是“药理学有效量”的测定需要 常规最佳化，这在本领域普通技术人员的能力内。如本文使用的，术语“炎性疾病或病状”指特征在于炎症或过量免疫应答的任何疾 病或病状。炎性疾病的潜在病因学可能是传染性、自身免疫、移植排斥或其他病理过程。某 些常见炎性疾病包括例如但不限于腹膜炎、胸膜炎(Plueritis)、类风湿性关节炎、炎性 关节病(例如强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎、莱特氏综合征)、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、 阿狄森氏病、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、大疱性类天疱疮、乳糜 泻、克罗恩病(两类特发性炎性肠病“IBD”之一)、皮肌炎、子宫内膜异位症、古德帕斯彻氏 综合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征(GBS)、桥本氏病、川崎病、间质性膀胱炎、红斑狼 疮、混合性结缔组织病、多发性硬化症(MQ、重症肌无力、寻常性天疱疮、牛皮癣、牛皮癣关 节炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化(chirrosis)、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、颞动脉 炎(也称为“巨细胞动脉炎”)、溃疡性结肠炎(两类特发性炎性肠病“IBD”之一)、脉管炎、 白癜风和韦格纳氏肉芽肿病。如本文使用的，“抗炎药”是减少炎症的药物。例如，理想地这表现为炎症指示剂 下降约10 %或更多，例如约30 %、约40 %、约50 %、约60 %、约70 %、约80 %或更多，至约2 倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍或更多，所述炎症指示剂例如但不限于，CRP水平、沉降速率、白细胞计数、特异性抗体水平、在疾病部位处的炎症细胞等。应答 的监控可以通过如本文描述和本领域技术人员已知的众多病理学、临床和成像法来完成。示例性抗炎药包括糖皮质类固醇、免疫抑制剂包括环孢菌素和他克莫司、细胞毒 性嘌呤抗代谢物硫唑嘌呤、烷化剂、环磷酰胺、氨甲蝶呤、阿糖胞苷、更生霉素和硫鸟嘌呤。 非甾体抗炎药包括但不限于阿司匹林(Anacin, Ascriptin、Bayer、Bufferin、Ecotrin、 Excedrin)、胆碱和水杨酸镁(CMT、Tricosal、Trilisate)、水杨酸胆碱(Arthropan)、塞来 昔布(Celebrex)、双氯芬酸钾(Cataflam)、双氯芬酸钠(Voltaren、Voltaren XR)、含米索 前列醇的双氯芬酸钠(Arthrotec)、二氟尼柳(Dolobid)、依托度酸(Lodine、Lodine XL)、 非诺洛芬钙(Nalfon)、氟比洛芬(Ansaid)、布洛芬(Advil、Motrin、Motrin IB、Nuprin)、 吲哚美辛(Indocin, Indocin SR)、酮洛芬(Actron、Orudis、Orudis KT、Oruvail)、水杨 酸镁(Arthritab、Mobidin、Mobogesic)、甲率灭酸钠(Meclomen)、甲芬那酸(Ponstel)、 美洛昔康(Mobic)、萘丁美酮(Relafen)、萘普生(Naprosyn, Naprelan)、萘普生钠 (Aleve、Anaprox)、奥沙普秦(Daypro)、吡罗昔康(Feldene)、罗非昔布(Vioxx)、双水杨酯 (Amigesic、Anaflex 750、Disalcid、Marthritic、Mono-Gesic、Salflex、Salsitab)、7_K杨酸 钠(各种非专利的)、舒林酸(Clinoril)、托美丁钠(Tolectin)和伐地考昔(Bextra) 0针 对T细胞受体的单克隆抗体(莫罗单抗-CD!3)和针对白介素2受体的单克隆抗体(巴利昔 单抗和达可珠单抗)也是抗炎药。如本文使用的，术语“备选治疗方案”或“备选疗法”可以包括例如生物应答调节 剂(包括多肽、碳水化合物和脂质生物应答调节剂)、毒素、凝集素、抗血管生成因子等。特 别地，合适的备选治疗方案包括例如，此类抗体片段可以是完整或部分Fc结构域。“减少腹膜粘连发生”指临床试验或合适的动物模型系统中粘连发生的统计学上 显著的减少。“抗体”意指但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例 如，双特异性抗体)。抗体可以是鼠类、人、人源化、嵌合的或衍生自其他物种。抗体是通过 免疫系统产生的，能够识别且结合特异性抗原的蛋白质。靶抗原一般具有众多结合位点，也 称为表位，由多重抗体上的CDRs识别。与不同表位特异性结合的每种抗体具有不同结构。 因此，一种抗原可以具有超过一种相对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免 疫特异性地结合目的靶抗原或其部分的抗原结合位点的分子。靶包括产生与自身免疫疾病 相关的自身免疫抗体的癌细胞或其他细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何种类(例如，IgG, IgE, IgM, IgD和IgA)或亚类(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)。免疫球蛋白可以衍生 自任何物种。“抗体片段”包括全长抗体的维持所需生物活性的部分。“抗体片段”一般是抗原 结合或其可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段；双抗体；线性抗 体；通过Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体、CDR (互补决定区)，和上述任何 一种的与癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原免疫特异性结合的表位结合片段，单链抗体 分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。本文提及的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的部分与衍生自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相对应序列等同或同源，而所述链的其 余部分与衍生自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体中的相对应序列等同或 同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需生物活性即可(美国专利号4，816，567)。 本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类源化的(primatized) ”抗体，其包括衍生自非人灵长 类(例如，旧大陆猴或类人猿)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。如本文使用的，“敏化剂”是可以增强抗炎药的疗效的药剂。如果与在不存在此类 组合物或方法的情况下治疗敏感性或抗性相比较，治疗组合物或方法引起治疗敏感性提高 约10%或更多，例如约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%或更多，至约2倍、 约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍或更多，那么该治疗组合物或方法可以 使抗炎药致敏。对治疗性疗法的敏感性或抗性的测定是本领域常规的且在本领域技术人员 的技术内。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，并且指包括通过肽键或经修饰的肽 键共价连接的至少2个氨基酸残基的化合物，例如可以对肽提供另外所需性质例如增加的 半衰期的肽同电子排列体(经修饰的肽键)。肽可以包括至少2个氨基酸。如本文使用的，术语“多核苷酸”包括有义和反义链的RNA、cDNA、基因组DNA、合成 形式和混合聚合物，并且可以是化学或生物化学修饰的，或可以包含非天然或衍生的核苷 酸碱基，如本领域技术人员容易理解的。此类修饰包括例如标签、甲基化、一个或多个天然 存在的核苷酸由类似物的置换、核苷酸间修饰例如非荷电连键(例如，膦酸甲酯)、磷酸三 酯、亚磷酰胺(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)、荷电连键(例如，硫代硫酸酯、二硫代硫 酸酯等)、悬垂部分(例如，多肽)和经修饰的连键(例如，α异头多核苷酸等)。还包括在 其经由氢键合和其他化学相互作用与指定序列结合的能力方面模拟多核苷酸的合成分子。如本文使用的，术语“载体”指用于将外源或内源多核苷酸引入宿主细胞内的多核 苷酸化合物。载体包括可以编码一种或多种多肽分子的核苷酸序列。以天然状态或已经历 重组改造的质粒、粘粒、病毒和噬菌体是常用载体的非限制性例子，它们可提供包括至少一 种所需经分离的多核苷酸分子的重组载体。如本文使用的，“载体”或“药物载体”(其是可互换的)指适合用作用于将活性 药物成分(API)递送给合适的体外或体内作用部位的媒介物的任何物质。这样，载体可 以充当赋形剂用于配制包含API的治疗或实验试剂。优选载体能够使API维持能够与T 细胞相互作用的形式。此类载体的例子包括但不限于水、磷酸盐缓冲盐水、盐水、林格氏 (Ringer' s)溶液、右旋糖溶液、含血清溶液、汉克氏(Hank' s)溶液和其他含水生理平衡 溶液或细胞培养基。含水载体还可以包含接近接受者生理条件所需的合适辅助物质，例如 化学稳定性和等渗性增强。合适的辅助物质包括例如乙酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化 钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯，和用于产生磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和碳 酸氢盐缓冲液的其他物质。作为抗炎剂的SPARC富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白质(也称为骨结合素、BM40或SPARC)(下文 “SPARC”)是一种基质结合蛋白，其引发细胞形状的改变，抑制细胞周期进展，且影响细胞外 基质的合成(Bradshaw 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100 :6045-6050 (2003)) 鼠类 SPARC 基因在1986年得到克隆(Mason等人，EMBO J. 5 1465-1472 (1986))，并且全长人SPARCcDNA 在 1987 年得到克隆和测序(Swaroop 等人，Genomics 2:37-47(1988))。SPARC 表达 是受发育调控的，它在正常发育过程中或响应损伤而经历重塑的组织中占优势地表达。例 如，高水平的SPARC蛋白质在发育中的骨和牙齿中表达(参见例如，Lane等人，FASEB J.， 8,163173(1994) ；Yan & Sage，J. Histochem. Cytochem. 47 :1495-1505(1999))。全长SPARC蛋白质具有多个功能结构域，包括N末端酸性结构域、可以抑制细胞 增殖的滤泡抑素样结构域和以高亲和力结合钙离子且抑制细胞增殖的C末端细胞外结构 域。SPARC对于多种配体具有亲和力，所述配体包括阳离子(例如，Ca 2+、Cu 2+、Fe 2+)、 生长因子(例如，血小板衍生的生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF))、细胞外 基质(ECM)蛋白质(例如胶原IV和胶原IX、玻连蛋白和凝血酶敏感蛋白1)、内皮细胞、 血小板、白蛋白和羟磷灰石(参见例如，Lane等人，FASEBJ.，8，163173 (1994) ；Yan&Sage, J. Histochem. Cytochem. 47 1495-1505 (1999))。还已知 SPARC 可结合白蛋白(参见例如， Schnitzer,J.Biol.Chem.，269，6072(1994))。本发明人已惊奇地发现SPARC具有抗炎活性。尽管不希望受任何具体理论束缚， 但本发明人已发现在模型腹膜内系统中以及在体外，SPARC显著降低巨噬细胞趋化蛋白-1 的水平，并且抑制其巨噬细胞趋化效应。SPARC在细胞中的过表达还显著减弱巨噬细胞和间 皮细胞诱导的白介素-6、前列腺素类(前列腺素E2和8-异前列烷)以及基质金属蛋白酶 和尿激酶纤溶酶原激活物的生产和活性。SPARC的这些效应部分是通过核因子-κ B启动子 激活的抑制而介导的。这些结果指示SPARC可以减少巨噬细胞的召募和下调相关炎症。本发明提供了治疗患有炎性疾病的哺乳动物的方法，其包括给患病哺乳动物施用 治疗有效量的SPARC多肽和药物载体，包括其中所述SPARC多肽是SEQ ID NO :1或其片段。用于依照本发明治疗的合适炎性疾病和病状包括例如动脉粥样硬化，类风湿性关 节炎，脓毒症，急性、变应性或慢性支气管炎，慢性阻塞性支气管炎(COPD)，咳嗽，肺气肿，变 应性或非变应性鼻炎或窦炎，慢性鼻炎或窦炎，哮喘，肺泡炎，农夫(Farmer' s)病，气道反 应过度，传染性支气管炎或肺炎，儿科哮喘，支气管扩张，肺纤维化，ARDS (急性成人呼吸窘 迫综合征)，支气管水肿，肺水肿，支气管炎，由各种原因(例如吸气、毒性气体吸入或支气 管炎)触发的肺炎或间质性肺炎，由于心力衰竭、辐射、化学疗法、囊性纤维化或粘液粘稠 病导致的肺炎或间质性肺炎，或α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、胆囊炎症中的急性或慢性炎症性 改变，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，炎性假息肉，幼年性息肉，深层囊性结肠炎，肠壁囊样积 气症，胆管和胆囊疾病，例如胆结石和聚集物(conglomerates)，用于治疗关节的炎性疾病 例如类风湿性关节炎或皮肤和眼的炎性疾病。用于依照本发明治疗的特别合适的疾病和病状包括涉及细胞外基质降解的那些， 包括但不限于牛皮癣关节炎、幼年型关节炎、早期关节炎、反应性关节炎、骨关节炎、强直性 脊柱炎、骨质疏松症、肌肉骨骼疾病如肌腱炎和牙周病、癌症转移、气道疾病(C0PD、哮喘)、 肾和肝纤维化、心血管疾病如动脉粥样硬化和心力衰竭、和神经学疾病如神经炎症、多发性 硬化症、和涉及原发性关节退行性变的疾病，包括但不限于牛皮癣关节炎、幼年型关节炎、 早期关节炎、反应性关节炎和骨关节炎。用于依照本发明治疗炎性疾病的方法包括例如这样的方法，其进一步包括抗炎药 的施用和/或进一步包括抗微生物剂例如抗真菌剂、抗病毒剂或抗生素的施用。本发明提供了治疗患有腹膜炎的哺乳动物的方法，其包括腹膜内施用治疗有效量的SPARC多肽和药物载体，包括其中所述SPARC多肽是SEQID NO :1或其片段。依照本发明 的方法包括例如这样的方法，其进一步包括抗炎药的施用和/或进一步包括抗微生物剂例 如抗真菌剂、抗病毒剂或抗生素的施用。关于依照本发明治疗腹膜炎的合适原因的腹膜炎 包括例如自发性细菌性腹膜炎、化学性腹膜炎、阑尾炎、肠梗死、胰腺炎、胃破裂、穿孔性胃 溃疡或创伤。用于依照本发明治疗腹膜炎的方法包括例如这样的方法，其进一步包括抗炎 药的施用和/或进一步包括抗微生物剂例如抗真菌剂、抗病毒剂或抗生素的施用。本发明提供了减少哺乳动物中的腹膜粘连发生的方法，其包括腹膜内施用治疗有 效量的SPARC多肽和药物载体，包括其中所述SPARC多肽是SEQ ID NO :1或其片段。粘连 的合适原因包括例如创伤性腹部或盆腔手术和腹膜炎。本发明提供了治疗患有子宫内膜异位症的哺乳动物的方法，其包括腹膜内施用治 疗有效量的SPARC多肽和载体，包括其中所述SPARC多肽是SEQ ID NO :1或其片段。依照 本发明治疗子宫内膜异位症的方法包括例如这样的方法，其进一步包括抗炎药的施用和/ 或进一步包括抗微生物剂例如抗真菌剂、抗病毒剂或抗生素的施用。用于表达SPARC的核酸SPARC多肽可以由重组宿主细胞中表达且纯化，所述重组宿主细胞包括编码 SPARC多肽的多核苷酸，例如SEQ ID NO :2。重组宿主细胞可以是原核或真核的，包括但不 限于细菌例如大肠杆菌、真菌细胞例如酵母、昆虫细胞包括但不限于果蝇和蚕衍生的细胞 系、以及哺乳动物细胞和细胞系。本发明进一步提供了用于表达多肽或本文所述多肽的核酸构建体，其包括控制元 件和与所述控制元件(例如，合适启动子)可操作地连接的本文所述核酸分子。蛋白质表 达依赖于RNA转录水平，这依次经由DNA信号调节。类似地，mRNA的翻译最低限度地需要 AUG起始密码子，其通常位于信使5'末端的约10-约100个核苷酸内。已显示侧接AUG起 始密码子的序列影响其经由真核生物核糖体的识别，与导致最佳翻译的完美Kozak共有序 列一致(参见例如，Kozak，J. Molec. Biol. 196:947-950(1987))。此外，外源核酸在细胞中 的成功表达可以要求所得到的蛋白质的翻译后修饰。因此，本发明提供了编码多肽的质粒， 其中载体是例如P⑶NA3. 1或其衍生物。本文描述的核酸分子优选包括与合适启动子可操作地连接的编码区，所述启动子 优选在真核细胞中起作用。病毒启动子，例如但不限于RSV启动子和腺病毒主要晚期启动 子，可以用于本发明中。合适的非病毒启动子包括但不限于磷酸甘油激酶(PGK)启动子和 延伸因子Ia启动子。非病毒启动子理想地是人启动子。另外合适的遗传元件(其中许多 是本领域已知的)也可以与本发明核酸和构建体连接、附着或插入到其内，以提供另外的 功能、表达水平或表达模式。还可以使用用于表达SPARC家族基因的天然启动子，在这个事 件中，它们优选不在天然编码其的染色体中使用，除非通过实质上改变那个染色体的过程 进行了修饰。此类实质上改变的染色体可以包括通过逆转录病毒载体或相似过程转染且改 变的染色体。备选地，此类实质上改变的染色体可以包括人工染色体例如HAC、YAC或BAC。此外，本文描述的核酸分子可以与增强子可操作地连接，以促进转录。增强子是刺 激相邻基因转录的DNA的顺式作用元件。在来自许多物种的大量不同细胞类型中对所连接 基因赋予高转录水平的增强子的例子包括但不限于，来自SV40和RSV-LTR的增强子。此 类增强子可以与具有细胞类型特异性效应的其他增强子相组合，或任何增强子可以单独使本发明的核酸分子可以在核酸分子的编码区后进一步包 括多腺苷酸化位点。此外，优选地，所有合适的转录信号(合适时，和翻译信号)将恰当地 安排，以使得外源核酸将在它引入其内的细胞中正确地表达。需要时，外源核酸也可以掺入 剪接位点(即，剪接受体和剪接供体位点)内，以促进mRNA生产同时维持框内的全长转录 物。此外，本发明的核酸分子可以进一步包括合适序列用于加工、分泌、细胞内定位等。核酸分子可以插入任何合适载体内。合适载体包括但不限于病毒载体。合适病毒 载体包括但不限于，逆转录病毒载体、甲病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和 禽痘病毒载体。载体优选具有天然或经改造的能力，以转化真核细胞，例如CHO-Kl细胞。 此外，在本发明的背景中有用的载体可以是“裸”核酸载体(即没有或很少有蛋白质、糖和/ 或脂质封装的载体)例如质粒或附加体，或载体可以与其他分子复合。可以适当地与本发 明的核酸相组合的其他分子包括但不限于病毒衣、阳离子脂质、脂质体、聚胺、金颗粒、和靶 向部分例如配体、受体或靶向细胞分子的抗体。就上述核酸和蛋白质而言在本文中使用的核酸、肽或蛋白质的“对应性”的一种量 度是序列之间的相对“同一性”，在肽或蛋白质的情况下，或在根据编码肽或蛋白质限定的 核酸的情况下，对应性包括与指定肽或蛋白质具有至少约50%同一性、备选地至少约70% 同一性、备选地至少约90%同一性、或甚至约95%，并且还可以是至少约98-99%同一性。 作为核酸之间的同一性的优选量度与上文对于肽指定的相同，其中至少约90%或至少约 98-99%同一性是最优选的。如本文使用的，术语“同一性”指2个肽之间或2个核酸分子之间的序列同一性的 量度。同一性可以通过比较每个序列中的位置进行测定，为了比较目的所述序列可以是直 线。2个氨基酸或核酸序列如果它们共享至少约75%序列同一性、优选至少约90%序列同 一性且更加优选至少约95%序列同一性、并且最优选至少约98-99%同一性，则它们被视 为基本上相同。序列同一性可以通过BLAST算法进行测定，所述BLAST算法是目前使用的并且最 初在Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410中描述。BLAST算法可以与公开的缺 省设置一起使用。当被比较序列中的位置由相同碱基或氨基酸占据时，则所述分子被视为 在那个位置上具有共享的同一性。序列之间的同一性程度是由这些序列共享的匹配位置数 目的函数。核酸序列同一性的备选量度是测定在低严格并且优选高严格条件下，2个序列是 否彼此杂交。此类序列若在高严格条件下可杂交则是基本上等同的。在低严格条件下与 滤纸结合序列的杂交可以例如在65°C下在0. 5M NaHP04、7%十二烷基硫酸钠(SDS)UmM EDTA中执行，并且在42°C下在0. 2x SSC/0. ISDS中洗涤(参见Ausubel等人(编辑)1989， Current Protocols in Molecular Biology，第 1 卷，Green Publishing Associates, Inc.， and John Wiley & sons，he.，New York，在第2. 10. 3页上)。备选地，在高严格条件下与 滤纸结合序列的杂交可以例如在650C下在0. 5M NaHP04,7% (SDS)UmM EDTA中执行，并 且在68°C下在0. h SSC/0. SDS中洗涤(参见Ausubel等人(编辑)1989同上)。杂 交条件可以依照已知方法进行修改，这取决于目的序列(参见Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with NucleicAcid Probes,部分 I,第 2 章"Overview of Principles in Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Probe Assays" , Elsevier, New York)。 一般地，选择比在确 定的离子强度和PH下该特定序列的热解链温度低约50°C的严格条件。本领域普通技术人员将认识到，由于遗传密码的通用性，任何给定氨基酸序列 的了解允许本领域普通技术人员容易地设想有限数目的特异性多核苷酸序列，其可以编 码所述氨基酸序列的多肽。此外，普通技术人员可以容易地可经由“密码子最佳化”过 程测定编码所述氨基酸序列的多肽的最佳多核苷酸序列，用于在任何给定物种中表达， 所述“密码子最佳化”过程是本领域众所周知的(参见例如，VILLAL0B0S等人Gene Designer -.a synthetic biology tool for constructing artificial DNAsegments. BMC Bioinformatics. 2006 年 6 月 6 日；7 :285)。此外，本发明提供了编码SPARC多肽的经分离的核酸分子，其中所述经分离的核 酸分子在低严格条件下、优选在中等严格条件下、更加优选在高严格条件下与SEQ ID NO 3 杂交。“高严格条件”优选允许形成核酸序列的约25% -约5%错配、更优选约15% -约5% 错配、且最优选约10% -约5%错配。“中等严格条件”优选允许形成核酸序列的约40% -约 15%错配、更优选约30% -约15%错配、且最优选约20% -约15%错配。“低严格条件”优 选允许形成核酸序列的约60% -约35%错配、更优选约50% -约35%错配、且最优选约 40% -约错配。非特异性结合的不存在可以通过使用第二种靶进行测试，所述第二种靶甚至缺乏 部分互补性程度(例如，小于约30%同一性)；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不 与第二种非互补靶杂交。可以存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。部分互补序列 是至少部分抑制完全互补序列与靶核酸杂交的序列。完全互补序列与靶序列的杂交抑制可 以使用杂交测定法(DNA或RNA印迹、溶液杂交等)在低严格性的条件下进行检查。“基本 上同源的”序列或探针将在低严格性的条件下竞争且抑制完全同源序列与靶的结合(即杂 交)。这不是说低严格性的条件是允许非特异性结合的条件；低严格条件要求2个序列彼 此的结合是特异性(即选择性)相互作用。术语“同源性”指互补性程度。为了最佳化蛋白质生产，本发明的核酸分子可以在核酸分子的编码区后进一步包 括多腺苷酸化位点。此外，优选地，所有合适的转录信号(合适时，和翻译信号)将这样恰 当地安排，以使得外源核酸将在它引入其内的细胞中适当地表达。需要时，外源核酸也可以 掺入剪接位点(即剪接受体和剪接供体位点)内，以促进mRNA生产同时维持框内的全长转 录物。此外，本发明的核酸分子可以进一步包括合适序列用于加工、分泌、细胞内定位等。核酸分子可以插入任何合适载体内。合适载体包括但不限于病毒载体。合适病毒 载体包括但不限于，逆转录病毒载体、甲病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和 禽痘病毒载体。载体优选具有天然或经改造的能力，以转化真核细胞，例如CH0-K1细胞。此 外，在本发明的背景中有用的载体可以是“裸”核酸载体(即很少或没有蛋白质、糖和/或 脂质封装它们的载体)例如质粒或附加体，或载体可以与其他分子复合。可以适当地与本 发明的核酸相组合的其他分子包括但不限于病毒衣、阳离子脂质、脂质体、聚胺、金颗粒、和 靶向部分例如配体、受体或靶向细胞分子的抗体。因此，本发明提供了用本文所述本发明的核酸分子转化或转染的细胞。用外 源DNA分子转化或转染细胞的方法是本领域众所周知的。例如但不限于，使用本领域众所周知的标准转化或转染技术将DNA分子引入细胞内，例如磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导 的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体和显微注射(参见例如，Sambrook & Russell， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)，第1. 1-1. 162、15. 1-15.53、16. 1-16. 54页)。广泛使用的用于转化的方法是通 过磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。依赖于细胞类型，在任何一次都可以转染高达20% 的培养细胞群体。转化方法的另一个例子是原生质体融合方法，使衍生自携带高拷贝数目的质粒的 细菌的原生质体与经培养的哺乳动物细胞直接相混合。在细胞膜融合后(通常用聚乙二 醇)，将细菌的内容物递送到哺乳动物细胞的细胞质内，并且将质粒DNA转移至核。原生 质体融合不象用于通常用于瞬时表达测定法的许多细胞系的转染一样有效，但它对于其中 DNA的胞吞作用低效发生的细胞系是有用的。原生质体融合通常得到随机整合到宿主染色 体内的质粒DNA的多个拷贝。电穿孔，即将短暂的高压电脉冲施加于各种哺乳动物和植物细胞，导致在质膜中 形成纳米尺寸的孔。DNA通过这些孔或由于伴随孔关闭的膜组分再分布而直接摄取到细胞 胞质内。电穿孔可以是非常有效的，并且可以用于克隆基因的瞬时表达和用于建立携带目 的基因的整合拷贝的细胞系。脂质体转化涉及在脂质体内封装DNA和RNA，随后为脂质体与细胞膜的融合。此 外，用合成阳离子脂质包被的DNA可以通过融合引入细胞内。备选地，线性和/或分支聚乙 烯亚胺(PEI)可以用于转染中。DNA分子直接显微注射到核内具有使DNA分子不暴露于细胞区室例如低pH胞内体 的优点。因此，显微注射主要用作建立携带目的DNA的整合拷贝的细胞系的方法。此类技术可以用于真核细胞的稳定和瞬时转化。稳定转化细胞的分离要求可选标 记的引入与用目的基因的转化结合。此类可选标记包括赋予针对新霉素的抗性的基因和在 HPRT阴性细胞中的HPRT基因。选择可以要求在选择培养基中的延长培养，至少约2-7天， 优选至少约 1-5 周(参见例如，Sambrook & Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001),第 16. 1-16. 54 页)。在本发明中使用的核酸序列也可以部分或全部通过化学合成而产生，例如通 过由Beaucage，等人(Tetra. Letts. 22 :1859-1862(1987))描述的亚磷酰胺法，或可以 在商业自动化寡核苷酸合成仪上执行的三酯法(Matteucci等人，J.Am. Chem. Soc. 103 3185(1981))。双链片段可以得自化学合成的单链产物，通过合成互补链且使链一起在合适 条件下退火，或通过使用DNA聚合酶与合适引物序列合成互补链来实现。表达且纯化SPARC蛋白质在特定实施方案中，当表达且纯化SPARC多肽时，采用用于改善蛋白质可溶性的 技术，以预防包含体(其是不溶性级分)的形成，并且因此获得大量多肽。在包含体中聚集 的SPARC是不保留其生理活性的无活性类型的SPARC。纯化SPARC多肽的可溶性可以通过本领域已知的方法得到改善。例如，可溶性 还可以通过表达功能片段而不是全长SPARC多肽得到改善。此外，为了增加所表达蛋白 质(例如在大肠杆菌中)的可溶性，可以通过降低生长温度、使用较弱的启动子、使用较低 拷贝数的质粒、降低诱导剂浓度、改变生长培养基来降低蛋白质合成速率，如Georgiou &Valax (Current Opinion Biotechnol. 7 190-197 (1996))中所述。这将降低蛋白质合成速 率且通常获得更可溶的蛋白质。还可以加入蛋白质折叠或蛋白质稳定性所需的辅基或辅因 子，或加入缓冲剂以控制在生长过程中培养基中的PH波动，或加入葡萄糖以阻遏乳糖 对Iac启动子的诱导，所述乳糖存在于大多数丰富培养基中(例如LB、2xYT)。多元醇(例 如，山梨糖醇)和蔗糖也可以加入培养基中，因为由这些添加造成的渗透压的增加将导致 渗透保护剂在细胞中的累积，这能使天然蛋白质结构稳定。可以加入乙醇、低分子量硫醇和 二硫化物、以及NaCl。此外，可以将伴侣蛋白和/或折叠酶与所需多肽一起共表达。分子伴 侣蛋白通过与折叠中间体瞬时相互作用而促进正确异构化和细胞靶向。大肠杆菌伴侣蛋白 系统包括但不限于GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE、CIpB0折叠酶加速沿着折叠途径的限速步骤。3类折叠酶起重要作用肽基脯氨酰顺式 /反式异构酶(PPI ‘ S)、二硫化物氧化还原酶(DsbA)和二硫化物异构酶(DsbC)、蛋白质二 硫化物异构酶(PDI)，其是催化蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化的真核蛋白质。这些蛋 白质中的一种或多种与靶蛋白的共表达可以导致更高水平的可溶性靶蛋白。SPARC多肽可以作为融合蛋白产生，以便改善其可溶性和生产。融合蛋白包括在 框内融合在一起的SPARC多肽和第二种多肽。所述第二种多肽可以是本领域已知的改善 它与之融合的多肽的可溶性的融合配偶体，例如NusA、细菌铁蛋白(BFR)、GrpE、硫氧还蛋 白(TRX)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。Novagen Inc. (Madison, Wis.)提供了允许形成 NusA-靶融合物的pET 43. 1载体系列。当用作融合配偶体时，DsbA和DsbC也已显示对表 达水平的正面效果，因此可以用于与SPARC多肽融合以实现更高可溶性。在一个实施方案中，SPARC多肽作为包括SPARC多肽和融合配偶体硫氧还蛋白的 融合多肽产生，如美国专利号6，387，664中描述的，该专利在此通过引用整体合并入本文。 硫氧还蛋白-SPARC融合物可以在大肠杆菌中作为易于配制的可溶性蛋白质大量产生而不 丧失生理活性。尽管美国专利号6，387，664提供了 SPARC与硫氧还蛋白的C末端融合的融 合SPARC蛋白质，但应当理解，为了本发明的目的，SPARC多肽可以与第二种多肽的N末端 或C末端融合，只要它的致敏功能得到保留即可。除增加可溶性外，可以构建包括SPARC多肽的融合蛋白以便容易地检测SPARC多 肽在细胞中的表达。在一个实施方案中，与SPARC多肽融合的第二种多肽是报道多肽。当 充当此类检测目的时，报道多肽不必与SPARC多肽融合。它可以由也编码SPARC多肽的相 同多核苷酸(例如，载体)编码，并且在靶细胞中共引入且共表达。定量参数例如平均荧光强度和方差可以通过细胞群体的荧光强度谱进行测定 (Shapiro, H.，1995，Practical Flow Cytometry，217-228)。在本发明中有用的报道分子的 非限制性例子包括萤光素酶(来自萤火虫或其他物种)、氯霉素乙酰转移酶、半乳糖苷 酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、和dsRed。SPARC多肽(单独地或作为融合蛋白)的表达也可以通过免疫测定法例 如ELISA (酶联免疫吸附测定法)(参见例如，美国专利号5，962，320 ；6, 187，307 ；和 6，194，205)、蛋白质印迹或通过本领域常规的其他方法直接进行测定。SPARC多肽的表达可 以通过检测蛋白质的转录物(例如通过杂交分析，例如RNA印迹或DNA微阵列，或通过PCR) 间接进行检测。在一个实施方案中，通过编码接头多肽的间插接头序列，使编码第二种多肽的多核苷酸与编码SPARC多肽的多核苷酸融合。在另一个实施方案中，接头多肽包括包含肽键的蛋白酶切割位点，所述肽键可通 过蛋白酶水解。因此，SPARC多肽在表达后可以通过蛋白酶解与第二种多肽分开。接头可以 在蛋白酶的催化位点也与之结合的键的任一侧包含一个或多个另外的氨基酸(参见例如， Schecter & Berger，Biochem. Biophys. Res. Commun. 27,157—62(1967))。备选地，接头的切 割位点可以与蛋白酶的识别位点分开，并且2个切割位点和识别位点可以通过一个或多个 (例如，2-4个)氨基酸分开。在一个方面，接头包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、约10、约20、 约30、约40、约50个或更多个氨基酸。更优选地，接头长度是约5-约25个氨基酸，并且最 优选地，接头长度是约8-约15个氨基酸。根据本发明有用的一些蛋白酶在下述参考文献中讨论=Hooper等人， Biochem. J. 321 :265-279 (1997) ；fferb, Cell 91 :439-442(1997) ；Wolfsberg 等人， J.Cell Biol. 131 :275-278 (1995) ；Murakami & Etlinger， Biochem. Biophys.Res. Comm. 146 :1249-1259(1987) ；Berg 等人，Biochem. J. 307 :313-326 (1995) ；Smyth 和 Trapani, Immunology Today 16 :202-206 (1995) ；Talanian 等 人’ J. Biol. Chem. 272 9677-9682 (1997)；和 Thornberry 等人，J. Biol. Chem. 272 :17907-17911 (1997)。根据本发 明，细胞表面蛋白酶也可以与可切割接头一起使用，其包括但不限于氨肽酶N;嘌呤霉素 敏感性氨肽酶；血管紧张素转化酶；焦谷氨酰肽酶II ；二肽基肽酶IV ；N-精氨酸二碱性转 换酶；内肽酶15 ；内肽酶16 ；淀粉样蛋白前体蛋白分泌酶α、β和Y ；血管紧张素转 化酶分泌酶；TGF α分泌酶；TNF分泌酶；FAS配体分泌酶；TNF受体-I和-II分泌酶；⑶30 分泌酶；KLl和KL2分泌酶；IL6受体分泌酶；CD43、CD44分泌酶；CD 16-1和CD 16-11分 泌酶；L-选择素分泌酶；叶酸(盐)受体分泌酶譯1、2、3、7、8、9、10、11、12、13、14和15 ； 尿激酶纤溶酶原激活物；组织纤溶酶原激活物；纤溶酶；凝血酶；BMP-I (前胶原蛋白C-肽 酶)；ADAM 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 和 11 ；以及颗粒酶 A、B、C、D、E、F、G 和 H。依赖于细胞结合蛋白酶的一个备选方案是使用自切割接头。例如，口蹄疫病毒蛋 白酶(FMDV) 2A可以用作接头。这是一种17个氨基酸的短多肽，其在2A/2B连接处切割FMDV 多蛋白。FMDV 2A前肽的序列是NFDLLKLAGDVESNPGP。切割在最后的甘氨酸-脯氨酸氨基 酸对处在肽的C末端上发生，并且不依赖于其他FMDV序列的存在，并且甚至在有异源序列 的存在时也发生切割。将这个序列插入在2个蛋白质编码区之间(即本发明融合蛋白的SPARC多肽和第 二种多肽之间)将导致自切割嵌合体的形成，这将其自身切割成在其N末端携带2A蛋白酶 的C末端脯氨酸的C末端片段，和在其C末端携带2A蛋白酶肽的其余部分的N末端片段 (参见例如，de Felipe等人，Gene Therapy 6:198-208(1999))。自切割接头和另外的蛋 白酶-接头组合在PCT公开WO 01/20989中进一步描述，该申请整体通过引用合并入本文。编码上述接头序列的多核苷酸可以从编码合适蛋白酶的天然底物的序列进行克 隆，或可以使用本领域常规的方法进行化学合成。依照本发明，采用SPARC配体和抗SPARC抗体的亲和层析也可以用于纯化SPARC 多肽。亲和层析可以单独使用，或与离子交换、分子排阻或HPLC层析技术结合使用。此类 层析方法可以使用柱或以批形式执行。此类层析纯化方法是本领域众所周知的。样品中SPARC蛋白质的表达可以通过本领域已知的任何合适方法进行检测和定量。蛋白质检测和定量的合适方法包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、银染 色法、BCA测定法(Smith等人，Anal. Biochem. 150，76-85 (1985))、其为基于蛋白质-铜络 合物的量热测定法的劳瑞(Lowry)蛋白质测定法(在例如Lowry等人，J. Biol. Chem. 193， 265-275(1951)中描述)、和依赖于在蛋白质结合后考马斯蓝G-250吸光度的改变的 Bradford蛋白质测定法(在例如Bradford等人，Anal. Biochem. 72,248(1976)中描述)。肿 瘤活组织检查可以通过前述任何方法进行分析，或它可以通过免疫组织化学法进行分析， 使用结合的抗SPARC抗体，例如抗SPARC多肽抗体(单克隆或多克隆的)并结合合适显现 系统(即HRP底物和HRP缀合的二级抗体)进行。施用SPARC蛋白质或多核苷酸SPARC蛋白质一般与载体一起施用。组合物可以进一步包括特别用于增强组合物 的稳定性和/或其最终用途的任何其他合适组分。因此，存在本发明组合物的多种的合适 制剂。下述制剂和方法仅是示例性的并且决不是限制性的。载体一般是液体，但也可以是固体，或液体和固体组分的组合。载体理想地是生理 学上可接受的(例如药学上或药理学上可接受的)载体(例如赋形剂或稀释剂)。生理学 上可接受的载体是众所周知的且容易获得的。载体的选择将至少部分由靶组织和/或细胞 的位置、和用于施用组合物的具体方法来决定。一般地，此类组合物可以制备为注射物，其可以是液体溶液或悬浮液形式；还可以 制备适合于在注射前在加入液体后制备溶液或悬浮液的固体形式；并且制剂也可以是乳化 的。适合于注射用途的药物制剂包括无菌水溶液或分散系；包含已知蛋白质稳定剂和冷冻 保护剂的制剂；包括芝麻油、花生油或含水聚乙二醇的制剂，和用于无菌可注射溶液或分散 系的临时制备的无菌粉剂。在所有情况下，制剂必须是无菌的并且必须具有足够的流动性 以便能够容易注射。它在制造和贮存条件下必须是稳定的，并且必须针对微生物例如细菌 和真菌的污染作用进行防腐。作为游离碱或药理学上可接受盐的活性化合物的溶液可以在 水中与表面活性剂例如羟基纤维素适当地相混合进行制备。分散系也可以在甘油、液体聚 乙二醇及其混合物中以及在油中进行制备。在常规贮存和使用条件下，这些制剂包含防腐 剂以预防微生物的生长。SPARC蛋白质可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成 盐(由蛋白质的游离氨基形成)和由无机酸例如盐酸或磷酸或有机酸如乙酸、草酸、酒石 酸、扁桃酸等形成的那些。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱例如氢氧化钠、钾、铵、 钙或铁，和有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。组合物可以进一步包括任何其他合适组分特别是用于增强组合物的稳定性和/ 或其最终用途的组分。因此，本发明组合物有多种合适制剂形式。下述制剂和方法仅是示 例性的并且决不是限制性的。适合于经由吸入施用的制剂包括气溶胶制剂。气溶胶制剂可以置于增压可接受推 进剂内，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。它们还可以配制为不加压制剂，用于由喷雾器或雾 化器递送。适合于肠胃外施用的制剂包括含水和非水的等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧 化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及含水和非水无菌 悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以在单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和小瓶中提供，并且可以贮存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临 用前加入无菌液体赋形剂例如水用于注射。临时注射溶液和悬浮液可以由先前描述种类的 无菌粉剂、粒剂和片剂进行制备。在这点上，制剂理想地适合于在炎症部位处施用，因此也 可以配制用于静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射等。适合于肛门施用的制剂可以通过使活性成分与各种基质相混合而制备为栓剂，所 述基质例如乳化基质或水溶性基质。适合于阴道施用的制剂可以呈现为阴道药栓、卫生棉 条、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，其除活性成分外还包含如本领域已知合适的此类 载体。此外，本发明的组合物可以包括另外的治疗剂或生物活性剂。例如，可以存在在具 体适应症治疗中有用的治疗因子。控制炎症的因子例如布洛芬或类固醇可以是组合物的部 分，以减少与药物组合物的体内施用相关的肿胀和炎症以及生理学痛苦。SPARC多肽或编码SPARC的经分离的多核苷酸可以与一个或多个另外的治疗剂结 合施用，例如选自下述的一种或多种化合物抗感染剂(例如抗菌剂(例如抗生素)、抗真 菌剂和抗病毒剂)、抗炎剂、重组蛋白质或抗体、一种或多种合成药物及其组合。与SPARC 多肽或编码SPARC的经分离的多核苷酸结合施用此类治疗剂，可以包括例如在ORP水溶液 施用之前、之时(例如同时，通过共施用或与之组合)或之后施用一种或多种此类另外的试 剂。合适的抗生素可以包括但不限于青霉素、头孢菌素类或其他内酰胺类、大环 内酯类(例如，红霉素、6-0-甲基红霉素和阿奇霉素)、荧光喹诺酮类、磺胺类、四环素类、氨 基糖苷类、克林霉素、喹诺酮类、甲硝唑、万古霉素、氯霉素、其抗菌有效的衍生物及其组合。 合适的抗感染剂还可以包括抗真菌剂例如两性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、酮康唑、咪康唑、 其衍生物及其组合。合适的抗炎剂可以包括例如一种或多种抗炎药，例如一种或多种抗炎 甾体或一种或多种非甾体抗炎药(NSAIDs)。示例性抗炎药可以包括例如亲环素类、Π(结合 蛋白、抗细胞因子抗体(例如，抗TNF)、甾体类和NSAIDs。依照本发明，SPARC多肽或编码SPARC的经分离的多核苷酸可以单独施用或与一 种或多种药学上可接受的载体组合施用，所述药学上可接受的载体例如媒介物、佐剂、赋形 剂、稀释剂、其组合等。本领域技术人员可以容易地决定用于施用依照本发明使用的SPARC 多肽或编码SPARC的经分离的多核苷酸的合适制剂和方法。例如，包含OPR水溶液的基于 凝胶的制剂可以用于维持腹膜腔的水合，同时提供针对微生物的屏障。合适凝胶制剂例如 在美国专利申请公开号2005/0142157中描述。考虑到一种或多种临床相关因子，例如副作 用、患者总体情况中的改变等，通过技术人员可以容易地作出剂量的任何必需调整，以解决 待治疗病状的性质和/或严重性。SPARC基因治疗基因治疗是涉及修饰活细胞的遗传材料以对抗疾病的医学干预。基因治疗正在关 于许多不同癌症类型和其他疾病的临床试验(对于人的调查研究)中进行研究。因此，本 发明进一步提供了适合于在“基因治疗”中使用的编码SPARC多肽的经分离的核酸分子(参 见例如，Patil 等人，AAPS J. 7(1) :E61_77 (2005))。基因治疗可以离体(exvivo)进行和在体内执行。一般地，在离体基因治疗临床试 验中，从患者的血液或骨髓中取出细胞并且在实验室中生长。使细胞暴露于携带所需基因的病毒。该病毒进入细胞，并且所需基因变成细胞DNA的部分。细胞在实验室中生长，并且 随后通过注射到静脉内送回给该患者。使用体内基因治疗时，载体例如病毒或脂质体可以 用于将所需基因递送给患者体内的细胞。本发明进一步提供了编码适合于在“基因治疗”中使用的SPARC多肽的经分离的 核酸分子。合适的核酸包括但不限于如本文所述的包括SEQID NO :2的核酸或其修饰和同 系物。基因治疗的目的之一是提供具有改变基因的细胞，所述改变基因例如编码SPARC多 肽的经分离的核酸分子。基因治疗还正在研究作为改变细胞如何起作用的方法；例如，通过 刺激免疫系统细胞以攻击癌细胞。—般而言，使用“载体”例如本文公开的那些载体将基因递送给细胞。在基因治疗 中使用的最常见类型的载体是病毒。在基因治疗中用作载体的病毒是遗传上无能的；它们 无法复制其自身。大多数基因治疗临床试验依赖于小鼠逆转录病毒以递送所需基因。用作 载体的其他病毒包括腺病毒、腺伴随病毒、痘病毒和疱疹病毒。合适的病毒基因治疗载体及 其体内和离体施用方式是本领域已知的。基因治疗可以离体和在体内完成。一般地，在离体基因治疗临床试验中，从患者的 血液或骨髓中取出细胞并且在实验室中生长。使细胞暴露于携带所需基因的病毒。该病毒 进入细胞，并且所需基因变成细胞DNA的部分。细胞在实验室中生长，并且随后通过注射到 静脉内送回给患者。在体内基因治疗中，载体例如病毒或脂质体用于将所需基因递送给患 者体内的细胞。SPARC蛋白质的修饰包括本文描述的肽或蛋白质的氨基酸还可以通过天然过程例如翻译后加工或通 过本领域众所周知的化学修饰技术进行修饰。修饰可以在肽中的任何地方发生，包括肽主 链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在 于给定肽中的数个位点上。对于肽的修饰的例子可以包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共 价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物 的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形 成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐(酯)的形成、甲酰化、Y-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟 基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、 硫酸化、转移RNA介导的氨基酸对蛋白质的添加例如精氨酰化和遍在蛋白化。参见例如， Proteins-Structure and Molecular Properties,第 2 版，Τ· Ε· Creighton, W. H. Freeman and Company, New York,1993and Wold F, Posttranslational Protein Modifications Perspectives and Prospects, Posttranslational Covalent Modification of Proteins 中的第 1-12 页，B. C. Johnson,编辑，Academic Press, New York, 1983 ；Seifter ^Α Analysis forprotein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. (1990)182 :626-646 禾口 Rattan 等人(1992)， Protein Synthesis =Posttranslational Modifications and Aging, “ Ann NY Acad Sci 663 :48_62。基本上相似的序列是如本文讨论的仅因一个或多个保守置换而不同于参考序列 的氨基酸序列。此类序列可以例如与另一种基本上相似的序列在功能上同源。本领域技术 人员应当理解在本发明的肽中可以置换的个别氨基酸方面。
氨基酸序列相似性或同一性可以通过例如使用BLASTP和TBLASTN程序进行计算， 所述BLASTP和TBLASTN程序采用BLAST (基本局部比对搜索工具)2. 0算法。用于计算氨 基酸序列相似性或同一性的技术是本领域技术人员众所周知的，并且BLAST算法的使用在 ALTSCHUL 等人 1990，J Mol. Biol. 215 :403-410 和 ALTSCHUL 等人(1997)，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 中描述。在其上执行比对的序列可以从众多数据库中进行收集。蛋白质数据库的例 子包括SWISS-PR0T，其还提供与蛋白质功能、其结构域结构、翻译后修饰、变体有关的 高水平注释(Bairoch A.和 Apweiler R. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1) :45-48; Bairoch Α.和 Apweiler R. (1997) J. Mol. Med. 75(5) :312-316 Junker VX.等人(1999) Bioinformaticsl5(12) :1066-1007), TrEMBL 对 SWISS-PROT 的计算机注释补充，其包 含EMBL核苷酸序列条目的所有说明(Bairoch Α.和Apweiler R. (2000)Nucleic Acids Res. 28(1) :45-48),以及nr数据库，其比较所有非冗余GenBank CDS说明加上来自其他数 据库例如PDB、SwissProt、P^* PRF的蛋白质序列。蛋白质序列的比对可以使用现有算法在数据库中搜索与查询序列相似的序列来 进行。一种比对方法是 Smith-Waterman 算法(Smith, T. F.和 Waterman，M. S. 1981. Journal of Molecular Biology 147(1) :195-197)，其可用于测定如何可以产生查询序列和数据库 序列之间的最佳比对。此类比对通过测定查询序列将需要经历何种转化以匹配数据库序列 来获得。转化包括用一种字符取代另一种，并且插入或缺失字符串。对于每个字符与字符比 较指定得分-对于精确匹配和某些置换为正分，对于其他置换和插入/缺失为负分。得分得 自统计上衍生的评分矩阵。导致最高得分的转化组合用于产生查询序列和数据库序列之间 的比对。Needleman-Wunsch (Needleman, S. B.禾口 Wunsch, CD. 1970. Journal of Molecular Biology 48(3) :443-453)算法类似于Smith-Waterman算法，但序列比较是总体的，不是局 部的。总体比较促成整个查询序列针对整个数据库序列的比对。局部比对总是从匹配开始 并且以匹配结束，而总体比对则可能从插入或缺失(插入缺失(indel))开始或结束。对于 给定的查询序列和数据库序列，由于在末端上的插入缺失，总体得分将小于或等于局部得 分。作为上述算法的备选方法，Hidden Markov Model (HMM)搜索(Eddy，S. R. 1996. Current Opinion in Structural Biology 6(3) :361-365)可以用于产生蛋白质序列比对。HMM 评 分权衡匹配后跟随插入/缺失或反之亦然的概率。此外，HMMs允许插入至缺失转变(并且 反之亦然)，并且对开始和结束状态进行评分，以控制搜索是总体还是局部运行。上述算法中的一种或多种可以用于比对程序中，以产生蛋白质序列比对。本领 域技术人员具有掺入各种不同算法的众多序列比对程序可以挑选。比对程序的一个例子 是。其他比对程序是 BLASTP(Altschul，S.F.，等人(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402)。来自BLASTP运行的标准输出包含足够信息，可进行如下所述的进一步插入缺 失分析。氨基酸可以描述为例如极性、非极性、酸性、碱性、芳香族或中性的。极性氨基酸是 在生理学或近中性pH下可以通过氢键合与水相互作用的氨基酸。氨基酸的极性是在生理 学或近中性PH下氢键合程度的指示。极性氨基酸的例子包括丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、半胱 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和谷氨酸。非极性氨 基酸的例子包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。酸性氨基酸在中性PH下具有净负电荷。酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸和谷氨酸。碱性 氨基酸在中性PH下具有净正电荷。碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。芳香 族氨基酸一般是非极性的，并且可以参与疏水性相互作用。芳香族氨基酸的例子包括苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。酪氨酸还可以通过芳香族侧链上的羟基参与氢键合。中性的脂肪 族氨基酸一般是非极性和疏水的。中性氨基酸的例子包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸和甲硫氨酸。氨基酸可以归于超过一个描述范畴。共享共同描述范畴的氨基酸在肽中可 以彼此置换。用于描述本发明的肽化合物的命名法遵循常规实践，其中氨基存在于每个氨基酸 残基的左侧，并且羧基存在于右侧。在代表本发明所选择的一些具体实施方案的序列中，尽 管未具体显示，但氨基和羧基末端基团应理解为以它们在生理学PH值下将采取的形式，除 非另有说明。在氨基酸结构式中，每个残基一般可以由单字母或三字母命名法表示，如本领 域普通技术人员已知的。氨基酸的亲水性指数是指示氨基酸搜寻出含水环境(负值)或疏水环境(正值) 的趋势的量表(KYTE & D00LITTLE 1982. J MoI Bioll57 :105-132)。标准氨基酸的亲水 性指数包括丙氨酸(1.8)、精氨酸(-4. 5)、天冬酰胺(-3. 5)、天冬氨酸(-3. 5)、半胱氨酸 (2. 5)、谷氨酰胺(-3. 5)、谷氨酸(-3. 5)、甘氨酸(-0. 4)、组氨酸(-3. 2)、异亮氨酸(4. 5)、 亮氨酸(3. 8)、赖氨酸(-3. 9)、甲硫氨酸(1.9)、苯丙氨酸O. 8)、脯氨酸(-1.6)、丝氨酸 (-0. 8)、苏氨酸(-0. 7)、色氨酸(-0. 9)、酪氨酸(-1. 3)、和缬氨酸(4. 2)。具有相似亲水性 指数的氨基酸在肽中可以彼此置换。本文描述的肽中包括的氨基酸应理解为L-或D-构型。在本发明的肽和拟肽中， D-氨基酸可以置换L-氨基酸。在本发明的肽内且特别是在羧基或氨基末端上包含的氨基酸可以通过甲基化、酰 胺化、乙酰化或由其他化学基团置换进行修饰，这可以改变肽的循环半衰期而不会不利地 影响其生物活性。此外，二硫键在本发明的肽中可以存在或不存在。非标准氨基酸可以在自然界中出现，并且可以是或不是遗传编码的。遗传编码的 非标准氨基酸的例子包括有时在UGA密码子上掺入某些蛋白质内的硒代半胱氨酸，所述 UGA密码子通常可以是终止密码子，或有时在UAG密码子上掺入某些蛋白质内的吡咯赖氨 酸，所述UAG密码子通常可以是终止密码子。并非遗传编码的某些非标准氨基酸可能起因 于已掺入肽中的标准氨基酸的修饰，或例如可以是代谢中间产物或前体。非标准氨基酸的 例子包括4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、Y-羧基谷氨酸、锁链素、硒代半胱 氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、羊毛硫氨酸、ι-氨基环丙烷-ι-羧酸、Y -氨基丁酸、肉毒碱、肌氨酸 或N-甲酰甲硫氨酸。标准和非标准氨基酸的合成变体也是已知的，并且可以包括化学衍生 的氨基酸、被标记用于鉴定或追踪的氨基酸、或在α碳上具有各种侧链基团的氨基酸。此 类侧链基团的例子是本领域已知的，并且可以包括脂肪族、单个芳香族、多环芳香族、杂环、 异核、氨基、烷基氨基、羧基、甲酰胺、羧基酯、胍、脒、羟基、烷氧基、巯基、烷基巯基或其他含 杂原子侧链。其他合成氨基酸可以包括α-亚氨酸、非α氨基酸例如β-氨基酸、脱羧基 或脱氨基酸。氨基酸的合成变体可以使用本领域已知的一般方法进行合成，或可以购自商 业供应商，例如 RSP Amino Acids LLC (Shirley, ΜΑ) 为了进一步例示保守氨基酸置换的含义，下文列出了 A-F组。下述组的一个成员由相同组的另一个成员的替换被视为保守置换。组A包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨 酸、和具有下述侧链的经修饰的氨基酸乙基、异丁基、-CH2CH20H、-CH2CH2CH20H、-CH2CH0H CH3 和 CH2SCH3。组B包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、和具有乙基侧链的 经修饰的氨基酸。组C包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、环己基甲基、和具有取代的苄基 或苯基侧链的经修饰的氨基残基。组D包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸的取代或未取代的脂肪族、芳香族 或苄基酯(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、环己基、苄基或取代苄基酯)、谷氨酰胺、天冬 酰胺、CO-NH-烷基化谷氨酰胺或天冬酰胺(例如，甲基、乙基、正丙基和异丙基)、和具有侧 链-(Cffi)3C00H的经修饰的氨基酸、及其酯(取代或未取代的脂肪族、芳香族或苄基酯)、其 酰胺、及其取代或未取代的N-烷基化酰胺。组E包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸、N-硝基精氨酸、对环精氨酸、g-羟基精氨酸、 N-脒基瓜氨酸、2-氨基胍基丁酸、赖氨酸同系物、精氨酸同系物和鸟氨酸。组F包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、和具有由-OH或-SH取代的C1-C5直链或支 链烷基侧链的经修饰的氨基酸。组A-F是示例性的，并且不意欲限制本发明。此类保守突变和氨基酸改变可以通过本领域普通技术人员已知用于定点诱变的 任何合适方法引入。下述实施例证实了在各种体外模型系统中SPARC对癌症相关炎症的作用，所述各 种体外模型系统是本领域普通技术人员众所周知反映卵巢癌的病理生理学的。这些实施例 用于举例说明本发明，但不应解释为以任何方式限制其范围。实施例1这个实施例证实SPARC抑制MCP-I生产。人卵巢癌细胞系(SK0V3和0VCAR3)和人腹膜间皮细胞系(MesO301)如先前所述 获得且维持(Said等人，Am J Pathol, 170 :1054-63(2007)和 Said等人，Am J Pathol, 167 1739-52(2005))。人单核细胞样细胞系(U937)购自ATCC(Manassas，VA)，并且在包含10% FBS ^ RPMI1640 (Atlanta Biologicals, Norcross, GA)巾会H胃。如先前所述产生在巨细胞病毒启动子控制下表达SPARC或绿色荧光蛋白(GFP) 的复制缺陷型腺病毒(Said等人，Am J Pathol，170 :1054-63 (2007))。卵巢癌细胞系用 表达GFP的腺病毒(Ad-GFP)或表达GFP和SPARC的腺病毒(Ad-GFP-SPARC)在完全生长 培养基中以15-25的感染复数转导M小时，如先前所述(Said等人，Am J Pathol, 170 1054-63 (2007))。在 Ad-GFP-SPARC 转导后，但不在 Ad-GFP 转导后，在 SK0V3 和 0VCAR3 卵 巢癌细胞系的细胞裂解物和条件培养基中检测SPARC蛋白质。在SPARCdOy g/ml)的存在和不存在下，野生型(WT)人卵巢癌细胞系SK0V3或 0VCAR3的汇合单层( 106个细胞，血清饥饿过夜)用50 μ M溶血磷脂酸(LPA)刺激M小 时。类似地，腺病毒转导的SK0V3和0VCAR3用50 μ M LPA刺激Μ-48小时。备选地，将腺 病毒转导的SK0V3和0VCAR3种植在汇合单层上或与Meso301共培养M-48小时。在SK0V3和0VCAR3的条件培养基(CM)中分泌的MCP-I蛋白质通过ELISA进行测定，使用商购试剂 盒(RayBioTech, Inc.，Norcross, GA)。对照包括未用LPA刺激(NS)的细胞。图1中所示 的结果是3次独立实验的代表的平均值士SEM，每次实验一式两份地执行。*P < . 05，与匹 配的未刺激或Ad-GFP条件相比较。#P < . 05，与未刺激的WT或Ad-GFP细胞相比较。在LPA刺激后存在通过SK0V3和0VCAR3细胞系的MCP-I生产的时间依赖性增加 (在M禾口 48小时后分别增加约3和9倍)。外源SPARC以及在SK0V3和0VCAR3细胞系中 腺病毒表达的SPARC，显著抑制基础( % -64% )和LPA诱导的MCP-I生产(在SK0V3中在 24和48小时时分别为54%禾口 43%的抑制；在0VCAR3中在24和48小时时分别为59%和 30%的抑制)。腹膜间皮细胞Meso301与卵巢癌细胞的共培养进一步以时间依赖性方式增 强MCP-I生产。增加水平对于SK0V3来说在M和48小时时分别是16-21倍，对于0VCAR3 来说在M和48小时时分别是14-20倍。SPARC的超表达在SK0V3中在M和48小时时使共 培养物中增强的MCP-I生产分别显著减弱 -36%，在0VCAR3中在M和48小时时分 别显著减弱36% 。这个实施例证实了卵巢癌细胞的MCP-I分泌通过LPA刺激和在与 腹膜间皮细胞的共培养物中得到增强，并且SPARC在卵巢癌细胞中的超表达可减弱MCP-I 生产。实施例2这个实施例证实SPARC对经由卵巢癌细胞诱导的巨噬细胞迁移的抑制作用。使用3- μ m孔径聚碳酸酯插入物(Corning Costar)进行巨噬细胞趋化测定法。卵 巢癌细胞转导如实施例1中所述执行。将转导M小时的SK0V3和0VCAR3细胞以h 105 个细胞/孔接种在M孔平板中的600 μ 1无血清培养基(SFM)中，并且生长至汇合，或接 种在M孔平板中生长的Meso301汇合单层上。将U937巨噬细胞(在ΙΟΟμ 1 SFM中的 105个细胞)加入transwells的顶室中。在某些实验中，中和性抗MCP-I抗体(25 μ g/ml) (Chemicon，Temecula，CA)包括在Ad-GFP转导的卵巢癌细胞Meso 301共培养物中。在37°C 下温育90分钟后，抽吸上层室的内容物，用磷酸盐缓冲盐水(PBQ洗涤且用DAPI(Sigma) 染色。U937迁移通过在6个高倍视野/孔中计数与膜的下表面附着的细胞数目进行评估， 其中使用配备Q-成像数码相机的荧光显微镜(LeicaMicrosystemsJetzlar，德国)。图1 中所示的结果是3次独立实验的代表的平均值士 SEM，每次实验一式三份地执行。*P<. 05， 与未刺激(NS)或Ad-GFP转导的细胞相比较。< · 05，与Meso301和Ad-GFP转导的卵 巢癌细胞相比较。SK0V3和0VCAR3的单层刺激U937巨噬细胞朝向肿瘤细胞的迁移。这种趋化效应 在超表达SPARC的SK0V3和0VCAR3细胞中显著减弱。相对于通过单独的卵巢癌细胞发挥 的效应而言，卵巢癌-间皮细胞的共培养使对巨噬细胞的趋化效应增加5倍。趋化活性通 过在卵巢癌细胞中超表达SPARC或通过存在MCP-I中和抗体而被显著取消。实施例3这个实施例证实SPARC对MCP-I诱导的卵巢癌细胞增殖和侵袭的抑制作用。根据制造商的说明书，使用商购可得的CellTiter 96试剂盒(ftOmega)评估如实 施例1中所述用或未用Ad-GFP或Ad-GFP-SPARC转导的SK0V3和0VCAR3响应于MCP-I的增 殖。在加入3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯基)-2H-四
唑「盐(MTS) 3小时后，通过测量溶解甲[■产物在590nm处的吸光度(0D590)比色测定增殖细胞的数目。如先前所述(Mid等人，Am J Pathol, 167 :1739-52(2005))评估如实施例1中所 述用或未用Ad-GFP或Ad-GFP-SPARC转导的SK0V3和0VCAR3响应于MCP-I的侵袭力。在 MCP-I的存在和不存在下，将1x105细胞/100 μ 1 SFM加入聚碳酸酯插入物(8-_孔径， Corning Costar，Corning，NY)的上层室，所述聚碳酸酯插入物用在SFM中1 3稀释的生 长因子减少的Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA)在冰上进行包被。在某些实验中， 在刺激前细胞用MCP-I抗体05 □ g/ml)或其同种型对照(50 μ g/ml)预处理30分钟。底 部室包含完全生长培养基。测定法在37°C下在5%C02增湿温箱中执行6小时。迁移细胞 在用hemacolor 3染剂(SOURCE ？)染色后在6个视野中进行计数，使用配备DFC 320数 码相机的倒置显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，德国)在200x放大率下进行。图2中所示的结果是以一式四份(增殖)或一式三份(侵袭)执行的3次独立实 验的平均值士SEM。*P < . 05，与对照NS细胞相比较。#P < . 01，与匹配的WT或Ad-GFP转 导细胞相比较。SPARC在卵巢癌细胞中的超表达消除了其对MCP-I的促有丝分裂(对于SK0V3和 0VCAR3分别为17% -23%和15% -27%的抑制)和促侵袭(对于SK0V3和0VCAR3分别为 15% 和30% -43%的抑制)效应的应答。这个实施例证实了 MCP-I对卵巢癌细胞发 挥促有丝分裂和促侵袭的作用，并且SPARC在卵巢癌细胞中的表达可减弱MCP-I对增殖和 侵袭的作用。实施例4这个实施例证实SPARC对巨噬细胞诱导的卵巢癌细胞侵袭的抑制作用。将如实施例1中所述用或未用Ad-GFP或Ad-GFP-SPARC转导的SK0V3和0VCAR3 细胞接种在Matrigel包被的插入物的上层室中(IO5细胞/100 μ 1 SFM/孔)。将U937巨 噬细胞OxlO6细胞/600 μ 1 SFM)接种在下层室中。如实施例3中所述测定侵袭细胞数目。 图3中所示的结果是一式三份执行的3次独立实验的平均值士SEM。*Ρ < . 05，与在底部室 中使用完全生长培养基(CGM)在单细胞培养物中的对照SK0V3和0VCAR3细胞相比较。U937巨噬细胞与肿瘤细胞的共培养显著增加了 SK0V3( 50% )和0VCAR3 (约3 倍)细胞系在单细胞培养物上的侵袭力。SPARC在卵巢癌细胞系中的表达使巨噬细胞诱导 的SK0V3和0VCAR3的侵袭力分别显著消除48%和50%。这个实施例证实了巨噬细胞对卵巢癌细胞侵袭发挥刺激作用，所述作用被SPARC 在卵巢癌细胞中的表达所削弱。实施例5这个实施例证实SPARC抑制卵巢癌细胞与巨噬细胞或与巨噬细胞和间皮细胞的 共培养物中的IL-6生产。用或未用Ad-GFP或Ad-GFP-SPARC转导的SK0V3和0VCAR3细胞、以及U937细胞个 别地、在共培养中、或在与MesO301细胞的三重培养中培养M小时，并且如实施例1中所述 通过ELISA就IL-6测定条件培养基。图3中所示的结果代表3次独立实验之一的平均值 士SEM，每次实验一式两份地执行。*P < . 05，与匹配的WT或Ad-GFP相比较。< . 05， 与不存在间皮细胞的情况下的双重培养物相比较。在卵巢癌细胞和巨噬细胞的共培养物中，IL-6水平显著增强超过SK0V3(17倍)、0VCAR3 (17. 6倍)或U937 (25-28倍)的基础分泌。恢复卵巢癌细胞中的SPARC表达使在 与SK0V3和0VCAR3的共培养物中的IL-6生产分别显著减少39%和55%。在三重培养物 中掺入Meso301导致IL-生产的显著增加(超过U937-SK0V3和U9370VCAR3共培养物2. 5 倍)。这种增加通过恢复SK0V3和0VCAR3细胞中的SPARC表达得到减弱(分别为44%和 观％ )。在U937中，外源SPARC和SPARC的超表达对IL-6水平都不具有任何作用。这个实 施例证实，卵巢癌细胞的IL-6分泌通过与巨噬细胞的共培养和与巨噬细胞和间皮细胞的 三重培养得到增强，并且SPARC在卵巢癌细胞中的表达减弱这些培养物中的IL-6分泌。实施例6这个实施例证实SPARC对卵巢癌细胞和巨噬细胞的蛋白酶解活性的抑制作用。用或未用Ad-GFP或Ad-GFP-SPARC转导的卵巢癌细胞的亚汇合单层在6孔平板中 单独培养或在与间皮细胞单层的共培养中生长，并且在SFM中血清饥饿过夜。U937巨噬细 胞(2x106 细胞 /ml SFM)在 0. 22-μ mtranswell 室(Corning，Costar)中单独地、在与卵 巢癌细胞无直接细胞间接触的共培养中、或在与卵巢癌细胞和间皮细胞的三重培养中培养 另外24小时。LPA(50 μ M)或外源SPARC(20 μ g/ml) (SOURCE ？)包括在某些实验中。收 集细胞培养物条件培养基(CM)，通过离心澄清，并且使用Centricon离心滤器(Millipore， Bedford, ΜΑ)浓缩5倍。将在上层和下层室中的细胞收获在裂解缓冲液(20mM Tris, pH 7. 4,150mM NaClUmM EDTA、50mM NaF、0. 5%脱氧胆酸钠、NP_40、lmM Na3V04 和 Ix 蛋白 酶抑制剂鸡尾酒(cocktail)混合物)中。裂解产物通过在12，OOOg下在4°C下离心20分 钟得到澄清，并且通过BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。相当于200 μ g 卵巢癌细胞和/或U937细胞的CM通过明胶酶谱法如先前所述(Said等人，Am J Pathol, 167 :1739-52(2005))进行分析。SK0V3、0VCAR3和/或U937细胞的细胞裂解物(50 μ g)通 过10% SDS-PAGE拆分，转移到聚偏氟乙烯膜(BioRad，Hercules，CA)上，并且用针对β-微 管蛋白的单克隆抗体探测，以确保相等的蛋白质上样。蛋白质检测使用HRP缀合的二级抗 体禾口 SuperSignal West Dura Chemiluminescence 试剂盒(Pierce, Rockford, IL)进行。图4中所示的结果证实，虽然0VCAR3的CM具有几乎无法检测的前体和活性MMP_9 的基础活性，但SK0V3的CM显示前体和活性MMP-9以及前体MMP-2的显著活性。在WT和 Ad-GFP转导的卵巢癌细胞之间这些明胶酶的酶促活性中不存在差异。Ad-GFPSPARC转导降 低了 0VCAR3中前体和活性MMP-9的水平，而在SK0V3中，它降低MMP-2和MMP-9活性而不 影响前体MMP-2或MMP-9水平。LPA刺激显著增加0VCAR3中的活性MMP-9水平以及SK0V3 中的前体和活性MMP-9水平。Ad-GFP-SPARC转导明显降低0VCAR3和SK0V3中LPA诱导的 MMP-9活性。卵巢癌细胞系与Meso301的共培养导致MMP-2和MMP-9的前体和活性形式的 水平和活性的最显著增加。 与SK0V3或0VCAR3相比较，U937的CM显示出MMP-2和MMP-9的最高基础活性水 平(图4)。LPA显著增加MMP-2和MMP-9活性。外源SPARC(20 μ g/ml)明显降低LPA诱导 的MMP-2和MMP-9活性。U937与SK0V3或0VCAR3的共培养导致前体和活性MMP-9和MMP-2 水平的明显增加。两者都被卵巢癌细胞的Ad-SPARC转导显著减弱。来自包括Meso301细胞 的三重培养物的CM显示出前体和活性MMP-2和MMP-9的水平和活性的显著增加。在SK0V3 和0VCAR3中，Ad-SPARC转导的抑制作用对MMP-9水平和活性比对MMP-2更明显。
这个实施例证实了，卵巢癌中MMP-2和MMP-9的蛋白酶解活性不仅归于通过卵巢癌细胞和巨噬细胞的组成性生产，还归于其通过卵巢癌细胞与间皮细胞和巨噬细胞的相互 作用的激活。这个实施例进一步证实了，这些相互作用差别性地调节SK0V3、0VCAR3和U937 巨噬细胞中的MMP-2和MMP-9水平和活性，并且MMP-9的改变响应于LPA在共培养物中的 刺激效应和SPARC腺病毒基因转移的抑制效应而更显著。MMP-2和MMP-9活性的诱导模式 及其被Ad-SPARC抑制指示SPARC在下调这些MMPs的活性水平方面可能有作用。实施例7这个实施例证实SPARC减弱尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)活性。通过使用TOPO位点将在巨细胞病毒启动子控制下的人SPARC开放读码框克隆 到 pcDNA3. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)内，制备 SPARC 质粒(pSPARC)。与萤光素酶报 道物连接的uPA启动子的质粒和半乳糖苷酶参考质粒是本领域众所周知的(uPA: Dr. Shuang Huang(MedicalCollege of Georgia, Augusta, GA))。 使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)，卵巢癌细胞系 6χ104Λ4 孔平板的 / 孔)用 1. 5 □ g uPA启动子萤光素酶报道质粒、0.5yg pSPARC和0.2yg β -半乳糖苷酶质粒共转染M小 时，并且随后饥饿另外M小时。根据制造商的说明书，使用商购可得的Luciferase Assay Solution, Bright Glo (Promega)，在 LPA (10-50 μ Μ)刺激 6 小时后或在 0. 22-μ m 插入物中 与U937细胞共培养后测定萤光素酶活性。使用商购可得的feilacto-Mar System (Applied Biosystems，Bedford，ΜΑ)，在细胞裂解(Glo Lysis Buffer, Promega, Madison, WI)后测量 β -半乳糖苷酶活性，以便将萤光素酶活性标准化且计算相对萤光素酶单位(RLU)。图4中 所示的结果是以一式三份执行的3次独立实验的平均值士SEM。*Ρ < . 05，与NS对照相比 较。**Ρ < .05，与无pSPARC共转染的匹配的实验条件相比较。用pSPARC转染卵巢癌细胞显著降低了 uPA启动子在SK0V3 (42 % )和 0VCAR3 ( 43 % )中的基础活性。uPA启动子活性的LPA刺激在SK0V3 (6% -115% )和 0VCAR3(38% -325% )中是浓度依赖性的。用pSPARC的共转染显著减弱SK0V3(40% -43% 抑制)和0VCAR3(51%-63% )中LPA诱导的uPA启动子活性。SK0V3或0VCAR3细胞与U937 巨噬细胞的共培养导致uPA启动子活性的显著刺激(在SK0V3和0VCAR3中分别为69%和 170%的增加)，所述增加尽管显著地，但也只是部分地被pSPARC共转染所减弱(在SK0V3 和0VCAR3中分别为沈％和36%的抑制)在SPARC (10 μ g/ml)的存在和不存在下，血清饥饿型SK0V3和0VCAR3的汇合单层 ( IO6细胞)的CM中的uPA活性在用LPA(50 μ Μ)刺激M小时的WT细胞中进行测量。 还测量在用或未用LPA刺激、或与Meso301单层、U937巨噬细胞(在0. 22-μ m transwell 插入物中加入)共培养、或在三重培养系统中腺病毒转导的SK0V3和0VCAR3中的uPA活 性。根据制造商的说明书，使用商购可得的比色测定试剂盒(Chemicon)，测量在CM中的 uPA活性。图4中所示的结果显示了 uPA活性，表示为未刺激(NS)相比于对照WT SK0V3 或0VCAR3(其指定值为1)的改变倍数。结果是3次独立实验的代表的平均值士SEM，每次 实验一式两份地执行。*P < . 05，与未刺激的WT或Ad-GFP细胞相比较。**P < . 05，与匹 配的WT或Ad-GFP条件相比较。#P < .05，与双细胞培养系统中卵巢癌细胞与Meso301或 U937的共培养物相比较。SK0V3和0VCAR3的CM中的组成性uPA活性被外源SPARC或Ad-SPARC转导所显著 减弱(在SK0V3和0VCAR3中分别为40%禾口 29% )。外源SPARC显著抑制SK0V3 (76% )和0VCAR3 (36% )中LPA诱导的uPA活性。LPA在未经转导的WT和Ad-GFP转导的SK0V3和 0VCAR3对照中分别诱导uPA活性的4-4. 5倍增加，这受到Ad-SPARC转导的显著抑制(对于 SK0V3和0VCAR3分别为38%禾Π的抑制)。SK0V3或0VCAR3与Meso301的共培养导致 其CM中uPA活性的增加，与LPA刺激的结果相当。Ad-SPARC转导导致在SK0V3和0VCAR3 中uPA活性分别显著减少160%和60%。此外，U937与SK0V3或0VCAR3的共培养使CM中 的uPA活性增加1. 7-2倍，这被SK0V3 (110% )和0VCAR3 (70 % )的Ad-SPARC转导减弱。 此外，包括Meso301与卵巢癌细胞和U937巨噬细胞的三重培养物导致在其CM中显著增强 的uPA活性(对于SK0V3和0VCAR3分别为6. 2和5. 6倍)，并且显示在SK0V3 (160% )和 0VCAR3(120% )中被Ad-SPARC转导减弱。这个实施例证实SPARC抑制卵巢癌细胞中LPA 诱导的uPA活性。实施例8这个实施例证实SPARC减弱单独或在与间皮细胞和/或巨噬细胞的共培养物中培 养的卵巢癌细胞中的PGE2生产和活性。SK0V3和0VCAR3细胞如实施例6中所述进行处理，并且根据制造商的说明书，使用 商购可得的酶免疫测定试剂盒(Cayman Inc.)测定CM中的PGE2水平。结果显示于图5中。 *P < . 05，与未刺激的WT或Ad-GFP细胞相比较。< . 05，与匹配的WT或Ad-GFP条件 相比较。#P < .05，与共培养系统中卵巢癌细胞与MesO301或U937的共培养物相比较。血清饥饿的SK0V3 ( 7pg/ml)和0VCAR3 ( 5pg/ml)中PGE2基线生产被外源和 Ad-SPARC转导分别降低高达30% -50%。SK0V3和0VCAR3的LPA刺激导致PGE2生产的 14倍增加，这通过任一细胞系的外源或Ad-SPARC转导分别抑制^^-δδ^οΡΟΕ〗生产通过 Meso301与SK0V3和0VCAR3的共培养分别增强22-30倍。SK0V3和0VCAR3被Ad-SPARC转导 导致了 PGE2生产的显著)降低。在SK0V3或0VCAR3与U937巨噬细胞的共培养物中 观察到PGE2生产的相似增强。Ad-SPARC转导在涉及SK0V3 (50%)而不是与0VCAR3 (14% ) 的共培养物中导致PGE2生产的显著降低。在三重培养物中观察到PGE2生产的进一步增加 (80-100倍)，并且被SK0V3而不是0VCAR3的Ad-SPARC转导显著减弱。如实施例3中所述测定响应于PGE2，用或未用Ad-GFP或Ad-GFP-SPARC转导的 SK0V3和0VCAR3细胞的增殖和侵袭力。图5中所示的结果表示为以一式四份(增殖)或 一式三份(侵袭)执行的3次独立实验的平均值士SEM。*P < . 05，与匹配的WT细胞或 Ad-GFP转导细胞相比较。**P < . 05，与NS对照细胞相比较。PGE2刺激的SK0V3和0VCAR3增殖是浓度依赖性的。Ad-SPARC转导使SK0V3 和0VCAR3对PGE2诱导的增殖的应答在SK0V3和0VCAR3中分别显著减弱28 % -38 %和 32% -49% ο PGE2对SK0V3和0VCAR3的促侵袭作用是浓度依赖性的，并且通过Ad-SPARC显 著抑制(在SK0V3和0VCAR3中分别为12% -35%和20% -45% ) 这个实施例证实SPARC 减弱单独或在与间皮细胞和/或巨噬细胞的共培养中培养的卵巢癌细胞中的PGE2生产和 活性。实施例9这个实施例证实SPARC对单独或在与间皮细胞和/或巨噬细胞的共培养中培养的 卵巢癌细胞中的8-异前列烷生产的抑制作用。SK0V3和0VCAR3细胞如实施例6中所述进行处理，并且根据制造商的说明书，使用商购可得的酶免疫测定试剂盒(Cayman he.)测定CM中的8-异前列烷水平。结果显示 于图6中。*P < .05，与未刺激的WT或Ad-GFP细胞相比较。**P < . 05，与匹配的WT或 Ad-GFP条件相比较。#P < . 05，与双细胞培养系统中卵巢癌细胞与MesO301或U937的共培 养物相比较。§ P < . 05，在0VCAR3-Meso和0VCAR3-U937的共培养物之间。已显示与对照相比较，在SPARC敲除小鼠中鼠类腹膜卵巢癌扩散中增加的8-异 前列烷生产与增强的肿瘤生长、增加的肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤浸润巨噬细胞、以及增强 水平的促有丝分裂和炎症细胞因子和生长因子正相关(Said等人，MoI Cancer Res, 5 1015-30(2007))。图6中的结果显示，如由血清饥饿的SK0V3 (52pg/ml)和0VCAR3 (38pg/ ml)中8-异前列烷所衡量的，活性氧(R0Q生产的基础水平被外源SPARC和Ad-SPARC分 别降低70% -90%。SK0V3和0VCAR3的LPA刺激导致8-异前列烷生产的增加(分别为 2. 2-2. 5倍)，这在任一细胞系中被外源SPARC的添加或Ad-SPARC的转导分别抑制高达 26% -55%。8-异前列烷的生产在Meso301与SK0V3和0VCAR3的共培养物中分别增加至 约7禾口 4倍。用Ad-SPARC转导SK0V3和0VCAR3导致在Meso301与SK0V3和0VCAR3的共 培养物中ROS分别显著抑制48%和74%。相似地，SK0V3或0VCAR3与U937巨噬细胞的共 培养导致8-异前列烷生产的增加，这在任一卵巢癌细胞系中又被Ad-SPARC转导所显著降 低( 50%)。8-异前列烷生产的进一步增加(5-8倍)在三重培养物中观察到，并且通过 SK0V3(45% )和0VCAR3(52%)的Ad-SPARC转导显著减弱。这个实施例证实了，SPARC抑 制单独培养或在与间皮细胞和/或巨噬细胞的共培养物中培养的卵巢癌细胞系中的8-异 前列烷生产。实施例10这个实施例证实SPARC对NF-kB启动子活性的抑制作用。用0. 5μ g 3 4此、包含与萤光素酶报道物连接的野生型顺-1^8(111- 顺-1 -1^(；) 或突变NF- κ B (Mut-pNF- κ B-Luc)结合位点的2个拷贝的NF- κ B质粒(NF_kB 由 Dr. Jinsong Liu 友情提供(The University of Texas Μ. D. Anderson Cancer Center, Houston, TX)、和0. 2μ g β -半乳糖苷酶质粒转染SK0V3和0VCAR3，并且无直接细胞间接触 地与U937共培养，或用LPA或PGE2刺激。相对萤光素酶活性如实施例7中所述进行测定。 图7中所示的结果代表以一式三份执行的3次独立实验的相对萤光素酶活性(对β -gal 活性校正)的平均值士 SEM。*P < . 05，与单细胞培养中的SK0V3和0VCAR3相比较，或与不 含pSPARC共转染的匹配NS和LPA-或PGE2刺激的细胞相比较。< . 05，在无pSPARC 转染的卵巢癌细胞的共培养物之间。**P < .05，与NS且在PGE2的测试浓度之间相比较。 ***P < . 05，与NS且在LPA刺激的每个浓度之间相比较。通过介导大多数促炎细胞因子、趋化因子、生长因子、胶原酶和抗细胞凋亡蛋白质 的生产，在大多数癌细胞中可见的NF-K B激活在肿瘤起始、进展、转移和化学抗性中起关 键作用。图7中所示的结果显示，与未共培养的卵巢癌细胞相比较，U937巨噬细胞与SK0V3 和0VCAR3的共培养导致NF- κ B激活的显著增加(在SK0V3和0VCAR3中分别为5和3. 5 倍增加)。卵巢癌细胞用pSPARC瞬时转染使SK0V3和0VCAR3中巨噬细胞诱导的NF- κ B激 活分别减弱40%和53%。在SK0V3和0VCAR3中LPA诱导的NF- κ B激活(40% -50% ) pSPARC对SK0V3和0VCAR3的共转染导致2种细胞系中LPA诱导的NF- κ B激活减弱 50 %。 SK0V3和0VCAR3的PGE2处理导致高达5ηΜ的浓度依赖性NF- κ B激活(约3倍)。卵巢癌细胞被PSPARC的共转染导致2种细胞系中PGE2诱导的NF- κ B激活的显著(30% -50% ) 减弱。SK0V3或0VCAR3被pSPARC的瞬时转染显著降低了(40% )其NF- κ B的基础活性。 这个实施例证实了 SPARC可减弱卵巢癌细胞中NF- κ B启动子的活性。实施例11这个实施例证实SPARC负面调节促炎基因的表达。使用稳定编码对照绿色荧光蛋白(GFP)或SPARC-GFP的人卵巢癌细胞(0VCAR3)。 将2-虹106细胞植入裸鼠的腹膜腔内，并且监控肿瘤发展共4周。从实体瘤中分离出总RNA， 并且制备cDNA用于使用Agilent Human Whole Genome 4x44K单色GE芯片的微阵列分析。SPARC在腹膜内植入的卵巢癌细胞中的过表达导致几种炎症途径的下调，包括 白介素(IL) IL-1、IL-2/IL-4和TNF-α途径。相对于表达对照GFP的肿瘤而言，在表达 SPARC-GFP的腹膜内肿瘤中其表达明显改变的IL-I途径中的基因的例子包括IL-I β (下 调2. 57倍)和IL-I受体(下调1. 82倍)。在先天性和适应性免疫应答中起基本作用的 ΜΑΡ3Κ7,也称为TGF- β激活的激酶1或TAKl，下调7. 44倍。响应IL-I的NF- κ B激活和 IL-8表达所需的Pellinol，也称为PELI1，下调6. 09倍。促成IL-I作用的拮抗的IL-I受 体辅助蛋白质，也称为IL1RAP，上调3. 48倍。相对于表达对照GFP的肿瘤而言，IL-2/IL-4途径中的几种基因在表达SPARC-GFP 的腹膜内肿瘤中显著改变。其是血管炎症的关键调节剂并且是发动有效的1型免疫应答所 需的ETS-I，下调5. 835倍。上调炎症相关基因的表达的ATF-2，下调5. 51倍。作为细胞因 子信号传导抑制剂的S0CS3，上调9. 35倍。相对于表达对照GFP的肿瘤而言，TNF- α途径中的几种基因在表达SPARC-GFP的 腹膜内肿瘤中显著改变。作为IkB蛋白质家族成员的NF-κΒΙΒ，上调3.53倍，所述I κΒ 蛋白质家族通过在细胞质中捕获NF-κ B而将其灭活。其抗炎作用包括抑制巨噬细胞激活 的经典途径的I κ B激酶β，也称为ΙΚΒΚΒ，上调2. 97倍。在介导促炎NF- κ B激活中起重 要作用的GSK3i3，下调2. M倍。这个实施例证实了 SPARC在人卵巢癌细胞中的过表达导致IL-1、IL_2/IL_4和 TNF-α途径的下调。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通过引用合并入本 文中，其程度与每个参考文献个别且特别指出通过引用合并且在本文中整体阐述相同。在描述本发明的背景中(特别是在下述权利要求的背景中)使用的术语“a”和 “an”和“the”以及相似指代词应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明 显冲突。术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”应解释为开放术语(即，意指“包括但不限 于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，本文中记载数值范围仅仅是作为一种各个指出落 入此范围内的每个单独值的简便方法，并且每个单独值均引入说明书内，如同其在本文中 单个叙述一样。本文描述的所有方法可以以任何合适次序执行，除非本文另有说明或与上 下文另有明显冲突。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅 意欲更好地举例说明本发明，并且不对本发明的范围造成限制，除非另有说明。说明书中的 语言不应解释为指示任何未请求保护的要素是本发明实践必需的。在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知用于执行本发明的最 佳方式。在阅读前述说明书后，这些优选实施方案的变异对于本领域普通技术人员可以变得显而易见的。本发明人预计技术人员在合适时可采用此类变异，并且本发明人预期本发 明可以按照除本文具体描述方式之外的其他方式实践。因此，本发明包括如由适用法律允 许的，在与所附权利要求书中叙述的主题的所有修饰和等价物。此外，上述要素以其所有可 能变异的任何组合均包括在本发明中，除非本文另有说明或与上下文另有明显冲突。
权利要求
1.一种治疗患有炎性疾病或病状的哺乳动物的方法，其包括给所述患病哺乳动物施用 治疗有效量的SPARC多肽和药物载体。
2.权利要求1的方法，其中所述SPARC多肽由SEQID NO 1组成。
3.权利要求1的方法，其中所述炎性疾病或病状是腹膜炎、胸膜炎、类风湿性关节炎、 炎性关节病、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫 性内耳病、大疱性类天疱疮、乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肌炎、子宫内膜异位症、古 德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏病、川崎病、间质性膀胱炎、 红斑狼疮、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常性天疱疮、牛皮癣、牛皮癣 关节炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、颞动脉炎、脉管 炎、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、脓毒症、急性支气管炎、肺气肿、鼻炎、窦炎、哮喘、肺泡 炎、农夫肺病、气道反应过度、支气管炎、肺炎、儿科哮喘、支气管扩张、肺纤维化、ARDSJi 炎、间质性肺炎、支气管炎、辐射诱导损伤、囊性纤维化、α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、炎性假息 肉、深层囊性结肠炎、肠壁囊样积气症、胆结石、肾结石、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、幼 年型关节炎、早期关节炎、反应性关节炎、骨关节炎、肌腱炎、牙周病、纤维化、神经炎症、多 发性硬化症、浆膜炎、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病、或动脉粥样硬化、脓毒症、急性、变应性或 慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、咳嗽、肺气肿、变应性或非变应性鼻炎或窦炎、慢性鼻 炎或窦炎、哮喘、肺泡炎、农夫肺病、气道反应过度、传染性支气管炎或肺炎、儿科哮喘、支气 管扩张、肺纤维化、急性成人呼吸窘迫综合征、支气管水肿、肺水肿、支气管炎、肺炎、间质性 肺炎、或支气管炎、由于心力衰竭的肺炎、辐射肺炎、化学疗法诱导的肺炎、囊性纤维化、或 α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、急性胆囊炎或慢性胆囊炎。
4.权利要求1的方法，其进一步包括抗炎药的施用。
5.权利要求1的方法，其进一步包括抗微生物剂的施用。
6.权利要求5的方法，其中所述抗微生物剂是抗真菌剂、抗病毒剂或抗生素。
7.一种治疗患有腹膜炎的哺乳动物的方法，其包括腹膜内施用治疗有效量的SPARC多 肽和药物载体。
8.权利要求7的方法，其中所述腹膜炎是自发性细菌性腹膜炎。
9.权利要求7的方法，其中所述腹膜炎是化学性腹膜炎。
10.权利要求7的方法，其中所述腹膜炎是阑尾炎所致。
11.权利要求7的方法，其中所述腹膜炎是肠梗死所致。
12.权利要求7的方法，其中所述腹膜炎是胰腺炎所致。
13.权利要求7的方法，其中所述腹膜炎是胃破裂所致。
14.权利要求7的方法，其中所述腹膜炎是穿孔性胃溃疡所致。
15.权利要求7的方法，其中所述腹膜炎是创伤所致。
16.权利要求7的方法，其进一步包括抗炎药的施用。
17.权利要求7的方法，其进一步包括抗微生物剂的施用。
18.权利要求7的方法，其中所述抗微生物剂是抗真菌剂、抗病毒剂或抗生素。
19.权利要求7的方法，其中所述SPARC多肽由SEQID NO 1组成。
20.一种减少哺乳动物中的腹膜粘连发生的方法，其包括腹膜内施用治疗有效量的 SPARC多肽和药物载体。
21.权利要求20的方法，其中所述SPARC多肽由SEQID NO 1组成。
22.权利要求20的方法，其中所述腹膜粘连起因于创伤。
23.权利要求20的方法，其中所述腹膜粘连起因于腹部和/或盆腔手术。
24.权利要求20的方法，其中所述腹膜粘连起因于腹膜炎。
25.一种治疗患有子宫内膜异位症的哺乳动物的方法，其包括腹膜内施用治疗有效量 的SPARC多肽和载体。
26.权利要求25的方法，其中所述SPARC多肽由SEQID NO 1组成。
27.权利要求25的方法，其进一步包括抗炎药的施用。
28.权利要求25的方法，其进一步包括抗微生物剂的施用。
29.权利要求观的方法，其中所述抗微生物剂是抗真菌剂、抗病毒剂或抗生素。
30.一种治疗患有炎性疾病或病状的哺乳动物的方法，其包括给所述患病哺乳动物施 用治疗有效量的编码SPARC多肽的经分离的多核苷酸和药物载体。
31.权利要求30的方法，其中所述编码SPARC多肽的经分离的多核苷酸包括SEQIDNO 2
32.权利要求30的方法，其中所述炎性疾病或病状是腹膜炎、胸膜炎、类风湿性关节 炎、炎性关节病、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身 免疫性内耳病、大疱性类天疱疮、乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肌炎、子宫内膜异位 症、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏病、川崎病、间质性膀 胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常性天疱疮、牛皮癣、牛 皮癣关节炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、颞动脉炎、脉 管炎、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、脓毒症、急性支气管炎、肺气肿、鼻炎、窦炎、哮喘、肺 泡炎、农夫肺病、气道反应过度、支气管炎、肺炎、儿科哮喘、支气管扩张、肺纤维化、ARDSJi 炎、间质性肺炎、支气管炎、辐射诱导损伤、囊性纤维化、α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、炎性假息 肉、深层囊性结肠炎、肠壁囊样积气症、胆结石、肾结石、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、幼 年型关节炎、早期关节炎、反应性关节炎、骨关节炎、肌腱炎、牙周病、纤维化、神经炎症、多 发性硬化症、浆膜炎、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病、或动脉粥样硬化、脓毒症、急性、变应性或 慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、咳嗽、肺气肿、变应性或非变应性鼻炎或窦炎、慢性鼻 炎或窦炎、哮喘、肺泡炎、农夫肺病、气道反应过度、传染性支气管炎或肺炎、儿科哮喘、支气 管扩张、肺纤维化、急性成人呼吸窘迫综合征、支气管水肿、肺水肿、支气管炎、肺炎、间质性 肺炎、或支气管炎、由于心力衰竭的肺炎、辐射肺炎、化学疗法诱导的肺炎、囊性纤维化、或 α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、急性胆囊炎或慢性胆囊炎。
33.权利要求30的方法，其进一步包括抗炎药的施用。
34.权利要求30的方法，其进一步包括抗微生物剂的施用。
全文摘要
本发明提供了SPARC作为抗炎药、特别是作为用于腹膜炎的治疗的用途。
文档编号A61P29/00GK102131547SQ200980117855
公开日2011年7月20日 申请日期2009年4月14日 优先权日2008年4月14日
发明者K·莫塔米德, V·特里鲁 申请人:阿布拉西斯生物科学有限责任公司