包括含有peg化的gla-结构域的蛋白质的低粘度组合物的制作方法

专利名称：包括含有peg化的gla-结构域的蛋白质的低粘度组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括含有PEG化的GLA-结构域的蛋白质的组合物。更特别地，本发明 涉及具有低粘度的液体组合物。本发明特别涉及选自下述凝血因子的组合物的制备因子 X多肽(FX/FXa)、因子IX多肽(FIX/FMa)、因子VII多肽(FVII/FVIIa)和抗凝蛋白C，特 别是因子VII多肽。
背景技术：
包含GLA-结构域的蛋白质也称为维生素K依赖性蛋白质，其通过共有在它们的分 子氨基末端部分中的共同结构特征而与其他蛋白质相区别。这些蛋白质的N-末端，也称为 Gla-结构域，富含稀有氨基酸Y-羧基谷氨酸，该氨基酸是在由Y-谷氨酰羧化酶(enzyme Y -glutamyl carboxylase)催化的维生素K依赖性反应中从谷氨酸合成的。因为存在约 2至12个Gla残基，Gla-结构域的特征是能够结合二价阳离子比如Ca2+。当结合金属离子 时，这些蛋白质经历可以通过多种技术(比如圆二色性(circular dichroism)和荧光发 射)测量的构象变化。通常期望具有适于贮存和递送的包含GLA-结构域的蛋白质的高浓度组合物。通 常，所述药物产品作为液体贮存和给药。可选地，冻干，即冷冻干燥的所述药物产品，然后通 过在患者使用前加入合适的稀释剂重构。然而，当这样的包含GLA-结构域的蛋白质结合PEG部分时，当浓缩所述药物产品 时，这样的组合物的粘度增加。因此，本发明的目的是提供低粘度组合物，其包括高浓度的包含PEG化的GLA结构 域的蛋白质。美国专利申请20050175603涉及具有降低粘度的浓缩蛋白质制剂。发明简述本发明人发现了包括PEG化的维生素K依赖性蛋白质与至少一种二价金属阳离子 的组合物，与不含二价阳离子的这些组合物相比，其显示出降低的粘度。因此，在一个宽的方面，本发明涉及包括所需的维生素K依赖性蛋白质的组合物， 其中所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的，其中所 述组合物包括浓度高于IOmM的二价金属阳离子。在第二个方面，本发明涉及包括浓度为至少25mg/ml的所需维生素K依赖性蛋白 质的组合物，所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的， 所述组合物包括浓度高于IOmM的二价金属阳离子，其中按照如本文描述的“流变仪粘度测 定(Rheometer Viscosity Assay) ”测量的粘度低于30毫帕斯卡X秒(mPa · s).本发明的第三个方面涉及包括浓度为至少25mg/ml的所需维生素K依赖性蛋白 质的液体、水性药物组合物，所述所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇 (PEG)部分官能化的，所述组合物包括浓度高于IOmM的二价金属阳离子，其中按照如本文 描述的“流变仪粘度测定”测量的粘度低于30毫帕斯卡X秒(mPa · s)；其用作药物。本发明的第四个方面涉及包括浓度为至少25mg/ml的所需维生素K依赖性蛋白质 的液体、水性药物组合物用于制备用于治疗因子VII-应答性综合征(syndrome)的药物的用途，所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的，所述组 合物包括浓度高于IOmM的二价金属阳离子，其中按照如本文描述的“流变仪粘度测定”测 量的粘度低于30毫帕斯卡X秒(mPa*s)；其中所需的维生素K-依赖性蛋白质为因子VII 多肽。本发明的第五个方面涉及用于治疗因子VII应答性综合征的方法，所述方法包括 向需要其的受试者给药有效量的液体、水性药物组合物，该组合物包括浓度为至少25mg/ ml的所需维生素K依赖性蛋白质，所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇 (PEG)部分官能化的，所述组合物包括浓度高于IOmM的二价金属阳离子，其中按照如本文 描述的“流变仪粘度测定”测量的粘度低于30毫帕斯卡X秒(mPa*s)，其中所需的维生素 K-依赖性蛋白质为因子VII多肽。本发明的第六个方面涉及降低组合物的粘度的方法，所述组合物包括浓度为至少 25mg/mL的所需维生素K依赖性蛋白质，所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙 二醇(PEG)部分官能化的，其中按照如本文描述的“流变仪粘度测定”测量的粘度低于30毫 帕斯卡X秒(mPa · s)，所述方法包括加入二价金属阳离子至最终浓度高于IOmM的步骤。发明详述如上所述，本发明在于新的组合物的开发，所述组合物包括浓度为至少25mg/ml 的所需维生素K依赖性蛋白质，所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇 (PEG)部分官能化的，所述组合物包括浓度高于IOmM的二价金属阳离子，其中按照如本文 描述的“流变仪粘度测定(Oleometer Viscosity Assay) ”测量的粘度低于30毫帕斯卡X 秒(mPa · s)。如本文使用的术语“所需的维生素K依赖性蛋白质”指包含GLA结构域的蛋白 质。维生素K依赖性蛋白质包括，但不限于下述蛋白质GAS-6、蛋白S、因子II (凝血酶 原(prothrombin))、凝血酶、因子XAa、因子IX/IXa、蛋白C、因子VII/VIIa、蛋白Z、跨膜 Y-羧基谷氨酸蛋白1、跨膜Y-羧基谷氨酸蛋白2、跨膜Y-羧基谷氨酸蛋白3、跨膜γ-羧 基谷氨酸蛋白4、基质Gla蛋白和骨钙蛋白。在一个实施方案中，所述二价金属阳离子选自下列Ca2+、&i2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、 Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+。在一个特定的实施方案中，所述二价金属阳离子 为 Ca2+。在不同的实施方案中，所述PEG部分具有的分子量为至少300Da，比如至少500Da， 比如至少lOOODa，比如至少5kDa，比如至少lOKDa。在不同的实施方案中，所述PEG部分具有的分子量为40KDa。在不同的实施方案中，所需的维生素K-依赖性蛋白质为因子VII多肽，比如人因 子 Vila。在不同的实施方案中，所述因子VII多肽为因子VII序列变体。在不同的实施方案中，当在如本文描述的“体外蛋白水解测定”中试验时，因子VII 多肽的活性和天然人因子Vila(野生型FVIIa)的活性之间的比率为至少1.25。在不同的实施方案中，所述因子VII多肽的存在浓度为至少30mg/mL、比如至少 35mg/mL,比如至少40mg/mL、比如在20_50mg/mL的范围内、比如在20_40mg/mL的范围内、比 如在20-30mg/mL的范围内。
在不同的实施方案中，根据本发明的组合物具有的pH范围为约4. 0至约8. 0。在不同的实施方案中，所述二价金属阳离子的存在浓度为至少20mM、比如至少 30mM、比如至少40mM、比如至少50mM、比如至少60mM、比如IO-IOOmM的范围内。在不同的实施方案中，根据本发明的组合物进一步包括选自下述的缓冲剂MES、 PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、甘氨酰胺(glycinamide)、磷酸、乙酸、乳酸和琥珀酸的 酸和盐。在一个实施方案中，该缓冲剂的浓度为1-lOOmM。在不同的实施方案中，根据本发明的组合物进一步包括选自下述的非离子表面活 性剂聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamers)、聚氧乙烯烷基醚、乙烯/聚丙烯嵌段共聚物、聚 乙二醇(PEG)、聚氧乙烯硬脂酸酯和聚氧乙烯蓖麻油。在不同的实施方案中，根据本发明的组合物进一步包括张力调节剂(tonicity modifying agent) 0在一个实施方案中，张力调节剂为选自下述的至少一种中性盐、氨基 酸、2-5个氨基酸残基的肽、单糖、二糖、多糖和糖醇。在一个实施方案中，至少一种张力调节剂为选自钠盐、钾盐、钙盐和镁盐的中性
Τττ . ο在一个实施方案中，张力调节剂的存在浓度为至少ImM。在不同的实施方案中，根据本发明的组合物进一步包括抗氧剂。在一个实 施方案中，抗氧剂选自L-蛋氨酸、D-蛋氨酸、蛋氨酸类似物、包含蛋氨酸的肽、蛋氨酸 同系物、抗坏血酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽(gluthatione)、胱氨酸和胱硫醚 (cysstathionine)。在一个实施方案中，抗氧剂的存在浓度为0. 1-5. 0mg/mL。在不同的实施方案中，根据本发明的组合物进一步包括防腐剂。在一个实施 方案中，防腐剂选自苯酚、苯甲醇、邻甲酚(orto-cresol)、间甲酚、对甲酚、羟苯甲酸甲 酯(methyl paraben)、羟苯甲酸丙酯、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)和苄索氯铵 (benzaethonium chloride)。在不同的实施方案中，根据本发明的组合物为液体、水性药物组合物。在不同的实施方案中，根据本发明的组合物包括的所需维生素K依赖性蛋白质选 自下列因子XII/XIIa、因子XI/XIa、因子X/Xa、因子IX/IXa、因子VII/VIIa、凝血酶和蛋 白C。在不同的实施方案中，根据本发明的组合物具有的按照如本文描述的"流变仪粘 度测定"测量的粘度低于25毫帕斯卡X秒(mPa -s)、比如低于20毫帕斯卡X秒(mPa -s)、 比如低于15毫帕斯卡X秒(mPa · s)、比如低于10毫帕斯卡X秒(mPa · s)、比如低于5 毫帕斯卡X秒(mPa · s)。在一个特定的实施方案中，所述二价金属阳离子为钙(Ca2+)，所述试剂的浓度为至 少 10mM。如本文使用的术语“因子VII多肽”包括野生型因子VII(即，具有在美国专利 No. 4，784，950中公开的氨基酸序列的多肽)，以及显示出相对于野生型因子VII基本上相 同的或提高的生物活性的因子VII的变体。术语“因子VII”包括其未切割(酶原)的形式 的因子VII多肽，以及已经经蛋白水解加工而产生其相应生物活性形式的那些，其可称为 因子Vila。通常，因子VII在残基152和153之间切割而得到因子Vila。术语“因子VII 多肽”也包括其中因子VIIa生物活性相对于野生型因子VIIa的活性实质上修饰、或稍微降低的多肽，包括变体。这些多肽包括，但不限于这样的因子VII或因子Vila，其中已经引入 了修饰或破坏该多肽的生物活性的特定的氨基酸序列改变。因子VIIa在血液凝固上的生物活性得自其下述能力(i)结合组织因子(TF)，和 ( )催化因子IX或因子X的蛋白酶切割，以产生活化的因子IX或x(分别为因子DCa或 Xa)。为了本发明的目的，如在例如美国专利No. 5，997，864或W092/15686中，或如在本 说明书的测定(ASSay)4中描述的(见下文)，可以通过使用因子VII缺乏的血浆和促凝血 酶原激酶(thromboplastin)测量促进血液凝固的制剂的能力来量化因子VII多肽的生物 活性(“因子VII生物活性”)。可选地，因子VIIa生物活性可以通过下述方式量化(i)在 包括嵌入类脂膜的TF和因子X的系统中，测量因子VIIa或因子VII相关多肽产生活化的 因子 X(因子 Xa)的能力(Persson 等人，J. Biol. Chem. 272 19919-19924，1997) ； (ii)在 水性体系中，测量因子X水解(“h Vitro Proteolysis Assay (体外蛋白水解分析)”，下 文的测定幻；(iii)利用基于表面等离子体共振的装置测量因子VIIa或因子VII-相关多 肽与 TF 的物理结合(Persson, FEB S Letts. 413 :359-363,1997) ； (iv)测量因子 Vila 和 /或因子VII相关多肽导致的合成底物的水解(“h Vitro Hydrolysis Assay (体外水解 测定)”，下文的测定1)；或(ν)在TF-非依赖性的体外系统中，测量凝血酶的产生(下文的 测定3)。相对于野生型因子VIIa具有基本上相同或提高的生物活性的因子VII变体包括， 当在如上所述的一种或多种凝固测定、蛋白水解测定或TF结合测定中试验时，显示在相同 细胞类型中产生的因子VIIa的特异活性的至少约25%，优选至少约50%，更优选至少约 75%和最优选至少约90%的的那些。相对于野生型因子VIIa具有基本上降低的生物活性 的因子VII变体包括，当在如上所述的一种或多种凝固测定、蛋白水解测定或TF结合测定 中试验时，显示低于约25%，例如低于约10%，或低于约5%的在相同细胞类型中产生的野 生型因子VIIa的特异活性的那些。具有相对于野生型因子VII实质上地修饰的生物活性 的因子VII变体包括，但不限于，显示TF-非依赖性因子X蛋白分解活性的因子VII变体及 结合TF但不会切割因子X的因子VII变体。因子VII的变体，不论是否显示与野生型因子VII实质上相同或更好的生物活性， 或，可选择地，显示相对于野生型因子VII实质上修饰或降低的生物活性，包括但不限于， 通过一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代而具有不同于野生型因子VII序列的氨基酸序 列的多肽。具有与野生型因子VII基本上相同生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括 S52A-FVIIa, S60A_FVIIa(Lino 等人，Arch. Biochem. Biophys. 352 182-192，1998)；显示增 加的蛋白水解稳定性的FVIIa变体，如在美国专利No. 5，580，560所公开的；在残基290和 291之间或残基315和316之间被蛋白水解切割的因子Vila(Mollerup等人，Biotechnol. Bioeng. 48 :501-505,1995)；因子 VIIa 的氧化形式(Kornfelt 等，Arch. Biochem. Biophys. 363 =43-54,1999)；如在PCT/DK02/00189中公开的FVII变体；和显示增加的蛋白 水解稳定性的FVII变体，如在W002/38162中公开的(Scripps Research Institute)；如 在 WO 99/20767 中公开的(Universityof Minnesota)具有修饰的 Gla 结构域(domain)并 显示增强的膜结合的FVII变体；和如在WO 01/58935中公开的(Maxygen ApS)FVII变体。
具有与野生型FVIIa相比增加的生物活性的因子VII变体的非限制性实例 包括如在 WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO 03/27147、WO 03/37932、WO 02/38162 (Scripps Research Institute)中公开的 FVII 变体；和如在 JP 2001061479 (Ch emo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中公开的具有增强活性的FVIIa变体。具有相对于野生型因子VII实质上降低或修饰的生物活性的因子VII变体的非限 制性实例包括 R152E-FVIIa (ffiIdgoose 等人，Biochem29 :3413-3420,1990)。因子VII多肽的明显实例包括，但不限于野生型因子VII、L305V-FVII、L305V/ M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII, V158D/ E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、 V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/ L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、 V158D/M298K-FVII、andS336G_FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/ E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/ K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/ M298Q-FVII、 L305V/V158D/E296V-FVII、 L305V/V158T/M298Q-FVII、 L305V/V158T/ E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/ E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V 158T/E296V/K337A-FVII、 L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、 L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、 L305V/V158D/ E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/ E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/ K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/ V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/ E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/ L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/ V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/ L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/ M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/ L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、 S314E/L305V/V158D/ E296V/M298Q-FVII、 S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、 S314E/L305V/V158T/ K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/ K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/ E296V/M298Q/K337A-FVII、 S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、 K316H/ L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/ M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/ K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/ M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/ L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/ K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/ E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/ L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/ M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/ K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、 K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/ M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/ L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/ V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/ K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/ M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII、F374Y/ S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII、 F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/ L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/ M298Q-FVII、 F374Y/K337A/E296V-FVII、 F374Y/K337A/V158D-FVII、 F374Y/V158D/ S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/ S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/ S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/ V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/ L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/ E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/ L305V/E296V/M298Q-FVII、 F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、 F374Y/L305V/E296V/ S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/ L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/ M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/ K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/ E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/ V158D/S314E/M298Q-FVII、 F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、 F374Y/V158D/M298Q/ E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/ V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/ S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/ S314E-FVII、 F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、 F374Y/L305V/E296V/M298Q/ S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/ S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/ S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、 F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、 F374Y/V158T/E296V/M298Q/ S314E-FVII、 F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、 F374Y/V158T/M298Q/K337A/ S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII、 F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、 F374Y/L305V/V158T/E296V/ S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/ M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/ E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/ L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-因子 VII、 S60A-因子VII ；R152E-因子VII、S344A_因子VII、缺失Gla结构域的因子VIIa ；和PllQ/ K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G29IN-FVII、 R315N/V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列 中具有取代、添加或缺失的FVII，在304Arg到329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加或缺 失的FVII，及在氨基酸序列Ilel53-Arg223中具有取代、缺失或添加的FVII。在某些实施方案中，所述因子VII多肽为人因子VIIa(hFVIIa)，优选重组 (recombinant)制备的人因子 Vlla(rhVIIa)。在其它的实施方案中，所述因子VII多肽为因子VII序列变体。在某些实施方案中，所述因子VII多肽具有不同于野生型人因子VII的糖基化。在多个实施方案中，例如其中所述因子VII多肽为因子VII相关多肽或因子VII 序列变体的那些，当在如本说明书描述的“体外蛋白水解测定”中试验时，因子VII多肽的 活性和天然人因子(native human factor) Vila(野生型FVIIa)的活性之间的比例为至少 约1. 25、优选的至少约2. 0或4. 0、最优选的至少约8. 0。在某些实施方案中，所述因子VII多肽为因子VII相关多肽，特别是变体，其中当 在如所述的"体外水解测定"(参见下文的测定)中试验时，所述因子VII多肽的活性和 天然人因子Vila(野生型FVIIa)的活性之间的比例为至少约1. 25 ；在其它的实施方案中， 所述比例为至少约2. 0 ；在进一步的实施方案中，所述比例为至少约4. 0。用一种或多种聚乙二醇(PEG)部分官能化的所需维生素K依赖性蛋白质(其中 所需的维生素K依赖性蛋白质为因子VII多肽)包括，但不限于如公开在WO 03/31464 和美国专利申请 US 20040043446、US20040063911、US 20040142856, US 20040137557、 US 20040132640、W02007022512 和 US 20070105755 (Neose Technologies, Inc.)中的糖 PEG化FVII衍生物；如公开在WO 01/04287、美国专利申请20030165996、WO 01/58935、 WO 03/93465 (Maxygen ApS)和 WO 02/02764、美国专利申请 20030211094 (University of Minnesota)中的PEG化的FVII结合物(conjugate)。因子Vila的浓度方便地表示为mg/ mL 或 IU/mL，Img 通常代表 43000-56000IU 或更高。为了使所述液体、水性药物组合物用于直接肠胃外(parenteral)给药至哺乳动 物比如人类，通常需要所述组合物的PH值保持在一定的限度内，比如约4. 0至约9. 0。为了在给定条件下确保合适的PH值，所述药物组合物还包括适于保持pH在约4. 0至约9. 0范 围内的缓冲剂(ii)。术语“缓冲剂”包括保持溶液pH在约4. 0至约9. 0的可接受范围的那些试剂或试 剂的组合。该术语进一步包括具有合适的限制的结合稳定二价金属离子的能力(即，限制 的与根据本发明的氧化态+11的第一族过渡金属形成金属络合物)的试剂或试剂的组合。 在一个实施方案中，在组合物中的缓冲剂或试剂的组合与二价金属离子显示出相对于该二 价金属离子对因子VII多肽的结合亲和力的约或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，缓冲剂(ii)为至少一种选自下述的组分MES、PIPES、ACES、 BES, TES, HEPES, TRIS、甘氨酰胺、组氨酸(例如L-组氨酸)、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、 戊二酸、柠檬酸(例如柠檬酸钠或柠檬酸钾)、酒石酸、苹果酸、马来酸、磷酸(例如磷酸钠或 磷酸钾)、乙酸(例如乙酸铵、乙酸钠或乙酸钙)、乳酸和琥珀酸的酸和盐。应当理解所述缓 冲剂可以包括两种或多种组分的混合物，其中该混合物能够提供在特定范围内的PH值。作 为实例，可以提及乙酸和乙酸钠、乙酸和组氨酸等。选择缓冲剂的浓度以便保持溶液的优选的pH。在多个实施方案中，缓冲剂的浓度 为 I-IOOmM ； l-50mM ;l-25mM ；或 2_20mM。在一个实施方案中，所述组合物的pH保持从约4. 0至约9. 0 ；比如从约5. 0至约 9. 0、从约4. 0至约8. 0、从约4. 0至约7. 5、从约4. 0至约7. 0 ；从约4. 5至约7. 5 ；从约4. 5 至约7. 0 ；从约5. 0至约7. 5 ；从约5. 0和约7. 0 ；从约5. 0至约6. 5 ；从约5. 0至约6. 0 ；从 约5. 5至约7. 5 ；从约5. 5至约7. 0 ；从约5. 5至约6. 5 ；从约6. 0至约7. 5 ；从约6. 5至约 7. 5 ；或从约6. 0至约7. 0 ；从约6. 4至约6. 6或约6. 5、从约5. 2到约5. 7或约5. 5。所述药物组合物还可包括非离子表面活性剂。“表面活性剂”(也称为“洗涤剂”) 通常包括保护所述蛋白质避免空气/溶液界面诱导应力和溶液/表面诱导应力(例如引起 蛋白质聚集)的那些试剂。典型类型的非离子表面活性剂为聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamers)、聚氧乙烯 烷基醚、聚乙烯/聚丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯硬脂酸酯和聚氧乙烯蓖麻 油。非离子表面活性剂的说明性的实例为Tween 、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、 Brij-35(聚氧乙烯十二烷基醚)、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、PEG8000、PlurOniC 多元醇、 聚氧 23 月桂基醚、Brij-;35、Myrj 49 和 Cremophor A。在一个实施方案中，所述非离子表面活性剂的存在量为0. 005-2. 0%重量。除了四种必须的组分之外，所述液体、水性药物组合物还可以包括对于所述组合 物制备、制剂(formulation)、稳定性、或给药有利的其它组分。而且，所述组合物进一步包括张力调节剂(tonicity modifying agent) (ν)。如本文使用的术语“张力调节剂”包括有助于所述溶液重量克分子渗透浓度 (osmolality)的试剂。所述张力调节剂(ν)包括选自下述的至少一种中性盐、氨基酸、2_5 个氨基酸残基的肽、单糖、二糖、多糖和糖醇。在某些实施方案中，所述组合物包括两种或多 种这样的试剂的组合。“中性盐”指当溶于水溶液中时既不是酸性也不是碱性的盐。在一个实施方案中，至少一种张力调节剂(V)为选自下述的中性盐钠盐、钾盐、钙盐和镁盐，比如氯化钠、氯化钾、氯化钙、醋酸钙、葡糖酸钙、乙酰丙酸钙(calcium laevulate)、氯化镁、乙酸镁、葡糖酸镁和乙酰丙酸镁。在进一步的实施方案中，所述张力调节剂(V)包括氯化钠与选自氯化钙、乙酸钙、 氯化镁和乙酸镁的至少一种的组合。在更进一步的实施方案中，所述张力调节剂(V)为选自氯化钠、氯化钙、蔗糖、葡 萄糖和甘露醇的至少一种。在不同的实施方案中，所述张力调节剂(ν)的存在浓度为至少ImM、至少5mM、至少 10mM、至少 20mM、至少 50mM、至少 100mM、至少 200mM、至少 400mM、至少 800mM、至少 lOOOmM、 至少 1200mM、至少 1500mM、至少 1800mM、至少 2000mM 或至少 2200mM。在一系列的实施方案中，所述张力调节剂(ν)的存在浓度为5_2200mM，比如 25-2200mM、50-2200mM、100-2200mM、200-2200mM、400-2200mM、600-2200mM、800-2200mM、 1000-2200mM、1200-2200mM、1400-2200mM、1600-2200mM、1800-2200mM 或 2000_2200mM ； 5-1800mM、25-1800mM、50-1800mM、100-1800mM、200-1800mM、400-1800mM、600-1800mM、 800-1800mM、1000-1800mM、1200-1800mM、1400-1800mM、1600-1800mM；5_1500mM、 25-1400mM、50-1500mM、100-1500mM、200-1500mM、400-1500mM、600-1500mM、800-1500mM、 1000-1500mM,1200-1500mM ；5-1200mM、25-1200mM、50-1200mM、100-1200mM、200-1200mM、 400-1200mM、600-1200mM 或 800_1200mM.在一个实施方案中，至少一种张力调节剂(ν)为离子强度调节剂(ionic strength modifying agent)(v/a)0如本文使用的术语“离子强度调节剂”包括有助于溶液离子强度的试剂。所述试 剂包括，但不限于中性盐、氨基酸、2至5个氨基酸残基的肽。在某些实施方案中，所述组合 物包括两种或多种这样的试剂的组合。离子强度调节剂(v/a)的非限制性实例是中性盐，比如氯化钠、氯化钾、氯化钙和 氯化镁。在一个实施方案中，优选的试剂(v/a)是氯化钠。术语“离子强度”是溶液的离子强度(P)，其由如下等式定义μ = 1/2 Σ ([i] (Zi2)),其中μ是离子强度，[i]是离子的毫摩尔浓度，&是所述离子的电荷(+或_)(参 见，例如，Solomon，Journal of Chemical Education, 78 (12) : 1691—92，2001 James Fritz and George Schenk Quantitative Analytical Chemistry,1979)。在本发明的不同的实施方案中，所述组合物的离子强度为至少50mM，比如至少 75mM、至少lOOmM、至少150mM、至少200mM、至少邪臓、至少400mM、至少500mM、至少650mM、 至少 800mM、至少 lOOOmM、至少 1200mM、至少 1600mM、至少 2000mM、至少 2400mM、至少 ^OOmM 或至少3200mM。在某些特定的实施方案中，张力调节剂(ν)和离子强度调节剂(v/a)的总浓度 为 I-IOOOmM 的范围，比如 l-500mM、l-300mM、10-200mM 或 20-150mM ；或比如 lOO-lOOOmM、 200-800mM或500-800mM，取决于任何其他成分可能对张力和离子强度的影响。在一个实施方案中，所述组合物为等渗的；在另一个实施方案中，其为高渗的。术语“等渗的”指“与血清等渗”，S卩，约300士50毫渗透分子/kg。张力指在给药 前溶液的重量克分子渗透浓度的测量值。术语“高渗的”指高于血清生理性水平的重量克 分子渗透浓度的指定水平，比如高于300士50毫渗透分子/kg的水平。
在一个进一步实施方案，所述组合物进一步包括(Vi)抗氧剂。在不同的实施方案 中，抗氧剂选自L-蛋氨酸、D-蛋氨酸、蛋氨酸类似物、包含蛋氨酸的肽、蛋氨酸同系物、抗坏 血酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱氨酸和胱硫醚。在优选的实施方案中，抗氧剂是L-蛋氨酸。所述抗氧剂的浓度通常为0. 1-5. Omg/mL,比如 0. 1-4. 0mg/mL、0. 1-3. Omg/mL、 0. 1-2. Omg/mL 或 0. 5-2. 0mg/mLo尽管上述抗氧剂的实例应用于在本发明中，但是应当预期许多具体化合物，例如 蛋氨酸可以与含金属试剂(iii)的金属离子形成复合物。这可以引起含金属试剂(iii)的 稍微降低的有效浓度。为此，在特定的实施方案中，所述组合物不包括抗氧剂；作为代替，通过排除大气 来控制因子VII多肽对氧化的敏感性。当然，抗氧剂的使用也可以与大气的控制排除相结
合O因此，本发明还提供包含如本文定义的液体、水性药物组合物及任选的惰性气体 的气密容器(例如小瓶或药筒(cartridge)(比如用于笔样施用器的药筒或注射器组件))。惰性气体可以选自氮气、氩气等。所述容器(例如小瓶或药筒)通常由玻璃或塑 料特别是玻璃制成，任选的用橡胶隔片(s印turn)或允许穿透的其它密闭装置密封，以维护 药物组合物的完整性。在其中一个特别的实施方案中，所述组合物不包括抗氧剂(vi)。在 进一步的实施方案中，所述容器是封入密封袋的小瓶或药筒，所述密封袋为例如密封的塑 料袋，比如层压的(例如金属(比如铝)层压塑料袋)。除了必须的组分之外，所述药物组合物可以进一步包括防腐剂(Vii)。在所述组合物中可以包括防腐剂以抑制微生物生长，并从而允许所述FVII多肽 的“多用途”包装。防腐剂的实例包括苯酚、苯甲醇、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、羟苯甲酸甲酯、 羟苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和苄索氯铵。防腐剂通常以0. l-20mg/mL的浓度包括，取决于防腐 剂的PH范围和种类。更进一步，所述组合物还可包括一种或多种能够抑制脱酰胺作用和异构化的试 剂。如本文使用的如“约”规定的pH值应理解为士 0. 1，例如约pH 8.0包括pH 8. O 士 0. 1。当提及溶于溶液的固体和混合到溶液中的液体时，百分数为(重量/重量)。例 如，对于吐温，其为100%储备溶液的重量/溶液的重量。根据本发明的因子VII多肽的药物组合物可作为稳定并优选即用型组合物使用。 此外，据信本文给出的原理、指导和特定的实施方案同样适用于因子VII多肽的大量贮存， 已作必要的修正(mutatis mutandis)。当在2°C到8°C的温度范围内贮存时，所述组合物通 常稳定至少6个月，优选地至多36个月。当在2°C到8°C贮存至少6个月时，所述组合物是 化学和/或物理稳定的，特别是化学稳定的。术语“稳定”意味着表示，(i)在2°C至8°C贮存6个月后，例如按照如在本说明书 的测定4中描述的一阶段凝血测定(one-stage clot assay)来测量，组合物保留其初始生 物活性的至少50%，或(ii)在2°C至8°C贮存6个月后，重链降解产物的含量增加最多为因 子VII多肽的初始含量的40% (w/w) 0术语“初始含量”指当制备组合物时，加入到组合物中的因子VII多肽的量。在多个实施方案中，在2°C至8°C贮存6个月后，所述稳定的组合物保持至少70%、 比如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%的其初始生物活性。在多个实施方案中，基于因子VII多肽的初始含量计，稳定的组合物中的重链降 解产物的含量增加不超过约30% (w/w)、不超过约25% (w/w)、不超过约20% (w/w)、不超 过约15% (w/w)、不超过约10% (w/w)、不超过约5% (w/w)或者不超过约3% (w/w)。为了测定重链降解产物的含量的目的，在专用的4. 5X250mm 丁基键合的二氧化 硅柱上进行反相HPLC，所述柱具有5 μ m的颗粒尺寸和300人的孔径。柱温70°C。A-缓冲 液0. ν/ν三氟乙酸。B-缓冲液0.09% ν/ν三氟乙酸，80% ν/ν乙腈。在30分钟内， 利用从Χ%Β到(Χ+13) % B的线性梯度洗脱柱。调节X，以使FVIIa洗脱的保留时间为约 26分钟。流速1. OmL/分钟。检测:214nm。填充量:25μ g FVIIa0术语因子VII多肽的“物理稳定性”涉及因子VII多肽的二聚体、低聚物和聚合物 形式的不溶性和/或可溶性聚集体(aggregates)的形成以及该分子的任何结构变形和变 性。物理稳定的组合物包括保持视觉上(visually)澄清的组合物。通常在将所述组合物贮 存在不同温度多个时间期间之后，利用目测检查和浊度评价所述组合物的物理稳定性。组 合物的目测检查是用黑暗背景以强聚焦光(sharp focused light)进行的。当组合物显示 可见的浊度时，将其归类为物理不稳定的。术语“化学稳定的”指包括在2至8°C贮存6个月之后，保持至少50%的其初始 生物活性的组合物，例如基本上通过如在本说明书的测定4中描述的一阶段凝固测定来测量。术语“化学稳定性”指涉及当在加速条件(accelerated conditions)下贮存在溶 液中时，因子VII多肽中的任何化学变化的形成。实例为水解、脱酰胺和氧化以及酶促降解 (enzymatic degradation)引起因子VII多肽片段(fragments)的形成。特别地，含硫氨基 酸易于氧化形成相应的亚砜。根据本发明的组合物不仅适合于药物制剂，而且也可以是在所需的维生素K依赖 性蛋白质的制备过程期间，比如制备过程的纯化步骤期间获得的组合物。使用方法如应当理解的，本文定义的液体、水性药物组合物可用于药物领域。因此，本发明 特别地提供用作药物、更特别地用作治疗因子VII-应答性综合症的药物的本文定义的液 体、水性药物组合物。因此，本发明还提供如本文定义的液体、水性药物组合物用于制备用于治疗因子 VII应答性综合症的药物的用途，以及用于治疗因子VII应答性综合症的方法，所述方法包 括向需要其的受试者给药有效量的如本文定义的液体、水性药物组合物。本发明的制剂可用于治疗任何因子VII应答性综合症，比如例如出血病症 (bleeding disorders),包括由于凝血因子缺乏(clotting factor deficiencies)弓|起的 那些(例如，血友病A、血友病B、凝血因子XI不足、凝血因子VII缺乏(coagulation Factor XI deficiency))；血小板减少症或维勒布兰德病或者由凝血因子抑制剂(clotting Factor inhibitors)引起的那些；以及脑内出血(intracerebral haemorrhage),或任何原 因的大量出血。所述制剂也可以给药外科手术或其它创伤相关联的病人或接受抗凝治疗疗(anticoagulant therapy)入。术语“有效量”是由有资格的执业医师确定的有效剂量，该医师可以调整 (titrate)剂量以获得期望的应答。关于剂量需要考虑的因素包括功效(potency)、生物利 用度、期望的药物代谢动力学/药效学特征、治疗的病症(condition of treatment)、患者 相关因素(体重、健康、年龄等)、共同给药的药物(例如，抗凝剂)的存在、给药时间或执业 医生已知的其他因素。术语“治疗”被定义为为了抗击疾病、病症或障碍(disorder)，对受试者(例如哺 乳动物，特别是人)的处置和护理，并包括给药因子VII多肽以预防症状或并发症的发作， 或减轻症状或并发症，或消除疾病、病症或障碍。包含因子VII多肽的根据本发明的药物组 合物可以肠胃外给药至需要这样的治疗的受试者。肠胃外给药可以利用注射器、任选的笔 样注射器，通过皮下、肌肉或静脉注射进行。另外，肠胃外给药可以利用输液泵(infusion pump)进行。在重要的实施方案中，所述药物组合物适合于现有技术中根据已知的方法皮下、 肌肉或静脉注射。本文定义的药物组合物中的可能高浓度的盐也许对于一些患者群是不利的。因 此，本发明还提供用于降低液体、水性药物组合物中的盐浓度的预先使用(prior-to-use) 方法，其中所述方法包括用离子交换物质(用于脱盐的合适的物质)接触本文定义的液体、 水性药物组合物的步骤和/或稀释该组合物的步骤。本文定义的药物组合物中的可能高浓度的金属离子也许对于一些患者群是不利 的。因此，本发明还提供用于降低液体、水性药物组合物中的金属离子浓度的预先使用方 法，其中所述方法包括用阳离子交换物质接触本文定义的液体、水性药物组合物的步骤。阳离子交换物质的实例是Chelex-100 (Fluka-Riedel/Sigma-Aldrich)。所述阳离 子交换物质，例如Chelex-100，优选地包含在无菌容器中，例如玻璃或塑料药筒中。预期用阳离子交换物质接触所述液体、水性药物组合物，例如在使用前立即穿过 包含阳离子交换物质的药筒。在一个特定的实施方案中，预期所述药筒是注射器组件的组 成部分。试验一般方法适于测定因子VII多肽的生物活性的测定可以通过合适的测定选择根据本发明有用的因子VII多肽，所述测定可以作为简 单的初步体外试验进行。因此，本说明书公开了用于因子VII多肽的活性的简单试验(称 为“体外水解测定”)。体外水解测定(测定1)可以测定天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(两者以下都称为“因子 Vila")的特异活性。也可平行测定它们以直接比较它们的特异活性。所述分析在微量滴定 板(MaxiSorp，Nunc, Denmark)中进行。将最终浓度ImM的显色底物D-Ile-Pro-Arg-对硝 基苯胺(S-2288, Chromogenix, Sweden)加入到在包含 0. IM NaCl、5mM CaCl2 和 lmg/mL 牛 血清白蛋白的50mM HEPES, pH 7. 4中的因子Vila(最终浓度IOOnM)中。在SpectraMax 340平板阅读器(plate reader) (Molecular Devices,USA)中连续地测量在405nm的吸收率。在20分钟培养期间发展的吸收率，在减去不含酶的空白孔的吸收率后，用于计算因子 VII多肽和野生型因子VIIa的活性之间的比例比例=(A405nm因子VII多肽)/(A405nm野生型因子Vila).基于此，可以鉴定出与天然因子Vila相比活性更低、相当或更高的因子VII多肽， 比如，例如，其中因子VII多肽的活性与天然因子VII (野生型FVII)的活性之间的比例为 约1. 0对高于1. 0的因子VII多肽。因子VII多肽的活性还可以使用生理底物比如因子X来测量(“体外蛋白水解测 定”)，合适地以IOO-IOOOnM的浓度，其中在加入合适的显色底物(例如S-276Q之后测量 产生的因子fe。此外，可以在生理温度下进行所述活性测定。体外蛋白水解测定(测定2)对天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(两者以下都称为“因子Vila”)进行 平行测定以直接比较它们的特异活性。所述测定在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark) 中进行。将在包含0. IM NaCl、5mMCaCl2禾口 lmg/mL牛血清白蛋白的100 μ L 50mM HEPES，pH 7. 4中的因子VIIa(IOnM)和因子X(0.8 μ Μ)培养15分钟。然后通过加入包含0. IM NaCl， 20mM EDTA和lmg/mL牛血清白蛋白的50 μ L 50mMHEPES,pH 7. 4来终止因子X切割。通过 加入最终浓度0. 5mM的显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺(S-2765，Chromogenix, Sweden)来测量产生的因子Xa的量。在SpectraMax 340平板阅读器(Molecular Devices, USA)中连续地测量在405nm的吸收率。在10分钟期间发展的吸收率，在减去不含FVIIa 的空白孔的吸收率后，用于计算因子VII多肽和野生型因子VIIa的蛋白水解活性之间的比 例比例=(A405nm因子VII多肽)/(A405nm野生型因子Vila)基于此，可以鉴定出与天然因子Vila相比活性更低、相当或更高的因子VII多肽， 比如，例如，其中因子VII多肽的活性与天然因子VII (野生型FVII)的活性之间的比例为 约1.0对高于1. 0的因子VII多肽。还可以在包括生理浓度的所有相关凝血因子和抑制剂(当模拟血友病A病症时减 去因子VIII)和活化的血小板的测定(测定；3)中测量因子VIIa或因子VII多肽产生凝血 酶的能力(如描述在Monroe等人(1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547的第M3页，将其 引入本文作为参考)。还可以使用一阶段凝固测定(测定4)测量因子VII多肽的生物活性。为此目的， 将待测样品稀释在50mM Pipes-缓冲液(pH7. 5)、0. 1 % BSA中，并将其40 μ 1与40 μ 1的 因子VII缺乏的血浆以及80 μ 1的包含IOmM Ca2+和合成磷脂的人重组组织因子进行培养。 测量凝固时间，并且与在平行线测定中使用参考标准的标准曲线进行比较。因子VII多肽的制备和纯化适用于本发明的纯化的人因子VIIa优选地通过DNA重组技术制备，例如描述在 Hagen 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :2412-2416,1986，或描述在欧洲专利 No. 0 200 421 (ZymoGenetics, Inc.)中。因子VII还可以按照以下描述的方法产生=Broze和Majerus，J. Biol. Chem. 255(4) 1242-1247，1980 以及 Hedner 和 Kisiel, J.Clin. Invest. 71 :1836-1841, 1983。这些方法产生因子VII而没有可检测数量的其它凝血因子。可以通过包括另外的凝胶过滤作为最终纯化步骤获得甚至进一步纯化的因子VII制品(pr印aration)。然后通过 已知的方法，例如通过几种不同的血浆蛋白，比如因子Xlla、DCa或)Ca，将因子VII转化为 活化的因子Vila。可选地，如Bjoern等人所述(Research Disclosure，洸9，1986年9月， 第564-565页)，可以通过将因子VII穿过离子交换色谱柱，比如如Mono Q (Pharmacia fine Chemicals)等，或通过在溶液中的自体活化来活化因子VII。可以通过野生型因子VII的修饰或通过重组技术产生因子VII相关多肽。通过已 知的方法，例如通过位点特异性诱变(mutagenesis)，通过在编码天然因子VII的核酸中改 变氨基酸密码子或者去除一些氨基酸密码子来修饰(modify)编码野生型因子VII的核酸 序列，可以产生与野生型因子VII相比具有改变的氨基酸序列的因子VII相关多肽。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在对因子VIIa分子的功能关键的区 域以外进行取代，并仍然得到活性多肽。可以根据本领域已知的方法，比如定点诱变 (site-directed mutagenesis)或丙氨酸扫描诱变(参见，例如，Cunningham and Wells, 1989，Science 244 :1081-1085)，鉴定对因子VII多肽活性所必需的并因此优选不进行取 代的氨基酸残基。在后一技术中，对分子中每个带正电荷的残基引入突变(mutation)，然 后对得到的突变分子进行凝结、分别交联活性检测(tested for coagulant,respectively cross-linking activity)以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。利用核磁共振分析、结 晶学或光亲和标记(photoaffinity labelling)(参见，例如，de Vos 等人，1992，Science 255 :306-312 ;Smith 等人，1992，Journal of Molecular Biology 224 :899-904 ；Wlodaver 等人，1992，FEBS Letters 309 :59-64)的这样的技术测定，通过分析三维结构还可以确定 底物-酶相互作用的位点。可以使用本领域已知的任何方法，通过定向诱变实现将突变引入核酸序列以将一 种核苷酸替换成另一种核苷酸。特别有用的是以下方法，利用具有所需的插入物的超螺旋 双链DNA载体和两条包含期望的突变的合成引物。所述寡核苷酸引物，每条与载体的相反 链(opposite strand)互补，利用Pfu DNA聚合酶在温度循环期间延伸。在结合引物时，产 生包含交错切口(staggered nick)的突变质粒。在温度循环之后，用DpnI (其对于甲基化 和半甲基化的DNA是特异的)处理产物以消化亲代DNA模板，并选择包含突变的合成DNA。 还可以使用本领域已知用于产生、鉴定和分离变体的其它方法，比如，例如，基因改组(gene shuffling)或UMlii体展示技术(phage display techniques)。从多肽的细胞来源分离多肽可以通过本领域已知的任何方法实现，所述方法包 括，但不限于从粘附的(adherent)细胞培养物中除去包含期望的产物的细胞培养基；离心 或过滤以除去非粘附细胞；等。任选地，因子VII多肽可以被进一步纯化。纯化可以使用本领域已知的任何方法 实现，所述方法包括，但不限于亲和色谱法，比如例如，在抗因子VII抗体柱上(参见，例 如，Wakabayashi 等人，J. Biol. Chem. 261 :11097,1986 ；和 Thim 等人，Biochem. 27 :7785, 1988)；疏水性相互作用色谱法；离子交换色谱法；尺寸排阻色谱法；电泳方法(例如，制 备式等电聚焦(IEF))、差异溶解性(例如，硫酸铵沉淀)或萃取等。一般地参见，Scopes, Protein Purification， Springer-Verlag, New York，1982 ；禾口 Protein Purification， J. C. Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers, New York，1989。纯化后，按重量 计，所述制品包含的源自宿主细胞的非因子VII多肽优选地低于10%，更优选的低于5%和最优选的低于1%。因子VII多肽可以通过蛋白水解切割活化，使用具有胰蛋白酶样特异性的因子 XIIa或其它蛋白酶，比如，例如，因子IXa、激肽释放酶、因子fci和凝血酶。参见，例如， Osterud 等人，Biochem. 11 :2853(1972) ；Thomas，美国专利 No. 4，456，591 ；和 Hedner 等人， J.Clin. Invest. 71 :1836 (1983)。可选地，可以通过将其穿过离子交换色谱柱，比如Mono Q (Pharmacia)等，或通过在溶液中的自体活化，来活化因子VII多肽。然后，可以如在本 申请中描述制剂和给药得到的活化的因子VII多肽。下列实施例阐述本发明的实施。包括这些实施例只是用于示例性目的，而不意味 着以任何方式限制本发明所要求的范围。附图简述

图1. PEG化的因子VII (在IOmM L-组氨酸、IOmM CaCl2, pH 5. 75缓冲液中的0、 10、23和38mg/mL PEG基的因子VII)的粘度对在包含IOOmM或IOmM CaCl2的样品中的蛋 白质浓度。图2 :PEG化的因子 VII (在 IOmM L-组氨酸、IOmM CaCl2、0. 07mg/mL聚山梨醇酯80、 0. 5mg/mL L-蛋氨酸、40mg/mL 甘露醇、10mg/mL 蔗糖、pH 5. 75 缓冲液中的 0、6、21 和 4Img/ mL PEG化的因子VII)的粘度对在包含IOOmM或IOmM CaCl2的样品中的蛋白质浓度。
实施例NN7U8 粘度专利(patent)样品的制备首先，使用NAP-25 柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala，Sweden)将 PEG 化的因子VII样品缓冲交换到相应的缓冲液中。接着，使用Amicon Ultra_15离心过滤器 装置(Millipore Corporation，Bi 11 erica，MA，USA)浓缩样品至期望的蛋白质浓度。流变仪粘度测定使用 C501 StressTech Rheometer (Rheologica Instruments, Lund, Sweden)测 量蛋白质溶液的粘度。通过使用移液管将给定样品的550 μ L溶液转移到同心圆筒式系统 来开始每次测量。在相当于0-10 的剪切应力的扭矩范围下进行粘度测量。所有的量度 都是在20°C下进行。在样品的比较中，使用在IOOiT1的剪切速率下测量的粘度。以毫帕斯 卡·秒(mPa · s)记录所有的粘度。实施例1如上所述测量PEG化的因子VII的粘度对蛋白质浓度。制备两组PEG化的因子VII 样品。一组包括下述样品在IOmM L-组氨酸、10mMCaCl2、pH 5. 75缓冲液中的0、10、23和 38mg/mL PEG化的因子VII。另一组包括在IOmM L-组氨酸、IOOmM CaCl2, pH 5. 75缓冲液 中的0、llJ6*47mg/mL PEG化的因子VII。图1显示两组样品的粘度对蛋白质浓度。令 人惊奇地是，观察到如果PEG化的因子VII的浓度高于 23mg/mL，则包含IOOmM CaCl2的 样品的粘度显著地低于包含IOmMCaCl2的样品的粘度。实施例2如上所述测量PEG化的因子VII的粘度对蛋白质浓度。制备两组PEG化的因子 VII样品。一组包括下述样品在IOmM L-组氨酸、10mMCaCl2、0. 07mg/mL聚山梨醇酯80、0. 5mg/mL L-蛋氨酸、40mg/mL甘露醇、10mg/mL蔗糖、pH 5. 75缓冲液中的0、6、21 和41mg/mL PEG化的因子VII。另一组包括在IOmM L-组氨酸、IOmM CaCl2、0. 07mg/mL聚山梨醇酯80、
0.5mg/mL L-蛋氨酸、40mg/mL 甘露醇、10mg/mL 蔗糖、pH 5. 75 缓冲液中的 0、7、22 和 42mg/ mL PEG化的因子VII。图2显示两组样品的粘度对蛋白质浓度。令人惊奇地是，规察到如 果PEG化的因子VII的浓度高于 23mg/mL，则包含IOOmMCaCl2的样品的粘度显著地低于 包含IOmM CaCl2的样品的粘度。本发明的优选的方案1.组合物，其包括浓度为至少25mg/ml的所需维生素K依赖性蛋白质，所需的维生 素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的，所述组合物包括浓度高 于IOmM的二价金属阳离子，其中按照如本文描述的“流变仪粘度测定”测量的粘度低于30 毫帕斯卡X秒(mPa · s)。2.根据项1的组合物，其中所述PEG部分具有的分子量为至少300Da、比如至少 500Da、比如至少lOOODa、比如至少5kDa、比如至少lOKDa。3.根据项1或2中任一项的组合物，其中所述二价金属阳离子选自Ca2+、Zn2+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+ 和 Sm2+。4.根据前述项中任一项的组合物，其中所需的维生素K依赖性蛋白质为因子VII 多肽，比如人因子Vila。5.根据项4的组合物，其中所述因子VII多肽为因子VII序列变体。6.根据前述项5的组合物，其中当在如本文描述的“体外蛋白水解测定”中试 验时，因子VII多肽的活性和天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比例为至少
1.25ο7.根据前述项中任一项的组合物，其中所述因子VII多肽的存在浓度为至少 30mg/mL、比如至少35mg/mL、比如至少40mg/mL、比如在20_50mg/mL的范围内、比如在 20-40mg/mL的范围内、比如在20_30mg/mL的范围内。8.根据前述项中任一项的组合物，其具有的pH范围为约4. 0至约8. 0。9.根据前述项中任一项的组合物，其中所述二价金属阳离子的存在浓度为至少 20mM、比如至少30mM、比如至少40mM、比如至少50mM、比如至少60mM、比如在IO-IOOmM的范 围内。10.根据前述项中任一项的组合物，其中所述组合物进一步包括选自下述的缓冲 剂MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、甘氨酰胺、磷酸、乙酸、乳酸和琥珀酸的酸和盐。11.根据项10的组合物，其中所述缓冲剂的浓度为1-lOOmM。12.根据前述项中任一项的组合物，其中所述组合物进一步包括选自下述的非离 子表面活性剂聚山梨醇酯、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、乙烯/聚丙烯嵌段共聚物、聚乙二 醇(PEG)、聚氧乙烯硬脂酸酯和聚氧乙烯蓖麻油。13.根据前述项中任一项的组合物，其进一步包括张力调节剂。14.根据项13的组合物，其中所述张力调节剂为选自下述的至少一种中性盐、氨 基酸、2-5个氨基酸残基的肽、单糖、二糖、多糖和糖醇。15.根据项13的组合物，其中至少一种张力调节剂为选自钠盐、钾盐、钙盐和镁盐 的中性盐。
16.根据项13的组合物，其中所述张力调节剂的存在浓度为至少ImM。17.根据前述项中任一项的组合物，其进一步包括抗氧剂。18.根据项17的组合物，其中所述抗氧剂选自L-蛋氨酸、D-蛋氨酸、蛋氨酸类似 物、包含蛋氨酸的肽、蛋氨酸同系物、抗坏血酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱氨酸和 胱硫醚。19.根据项17-18中任一项的组合物，其中所述抗氧剂的存在浓度为0. 1-5. Omg/
mLo20.根据前述项中任一项的组合物，其进一步包括防腐剂。21.根据项20的组合物，其中所述防腐剂选自苯酚、苯甲醇、邻甲酚、间甲酚、对甲 酚、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和苄索氯铵。22.根据前述项中任一项的组合物，其为液体、水性药物组合物。23.根据前述项中任一项的组合物，其中所需的维生素K依赖性蛋白质选自以下 的列表因子XII/XIIa、因子XI/XIa、因子X/Xa、因子IX/IXa、因子VII/VIIa、凝血酶和蛋 白C。24.根据前述项中任一项的组合物，其中按照如本文描述的"流变仪粘度测定" 测量的粘度低于25毫帕斯卡X秒(mPa · s)，比如低于20毫帕斯卡X秒(mPa · s)，比如 低于15毫帕斯卡X秒(mPa · s)，比如低于10毫帕斯卡X秒(mPa · s)，比如低于5毫帕 斯卡X秒(mPa · s)。25.如项22限定的液体、水性药物组合物，用作药物。26.如项22中限定的液体、水性药物组合物的用途，其中所需的维生素K依赖性蛋 白质为用于制备用于治疗因子VII应答性综合征的药物的因子VII多肽。27.用于治疗因子VII应答性综合征的方法，所述方法包括向需要其的受试者给 药有效量的如在项22中限定的液体、水性药物组合物，其中所需的维生素K依赖性蛋白质 为因子VII多肽。28.降低组合物的粘度的方法，所述组合物包括浓度为至少25mg/ml的所需维生 素K依赖性蛋白质，所述所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇(PEG)部 分官能化的，其中按照如本文描述的“流变仪粘度测定”测量的粘度低于30毫帕斯卡X秒 (mPa · s)，所述方法包括加入二价金属阳离子至最终浓度高于IOmM的步骤。
权利要求
1.组合物，该组合物包括浓度为至少25mg/ml的所需维生素K依赖性蛋白质，所述所需 的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的，所述组合物包括 浓度高于IOmM的二价金属阳离子，其中按照如本文描述的“流变仪粘度测定”测量的粘度 低于30毫帕斯卡X秒(mPa · s)。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述PEG部分具有的分子量为至少300Da、比如至少 500Da、比如至少lOOODa、比如至少5kDa、比如至少lOKDa。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述PEG部分具有的分子量为40KDa。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述二价金属阳离子选自Ca2+、Zn2+, Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+ 和 Sm2+。
5.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述所需的维生素K依赖性蛋白质为因 子VII多肽，比如人因子Vila。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述因子VII多肽为因子VII序列变体。
7.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述因子VII多肽的存在浓度为至 少30mg/mL、比如至少;35mg/mL、比如至少40mg/mL、比如在20_50mg/mL的范围内、比如在 20-40mg/mL的范围内、比如在20_30mg/mL的范围内。
8.根据前述权利要求中任一项的组合物，其具有的pH范围为约4.0至约8. 0。
9.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述二价金属阳离子的存在浓度为至少 20mM、比如至少30mM、比如至少40mM、比如至少50mM、比如至少60mM、比如在IO-IOOmM的范 围内。
10.根据前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包括张力调节剂，其中所述张力调 节剂为选自下述的至少一种中性盐、氨基酸、2-5个氨基酸残基的肽、单糖、二糖、多糖和糖醇。
11.根据权利要求10的组合物，其中至少一种张力调节剂为选自钠盐、钾盐、钙盐和镁 盐的中性盐。
12.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述所需的维生素K依赖性蛋白质选 自以下列表因子XII/XIIa、因子XI/XIa、因子X/Xa、因子IX/IXa、因子VII/VIIa、凝血酶 和蛋白C。
13.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中按照如本文描述的"流变仪粘度测 定"测量的粘度低于25毫帕斯卡X秒(mPa · s)、比如低于20毫帕斯卡X秒(mPa · s)， 比如低于15毫帕斯卡X秒(mPa · s)，比如低于10毫帕斯卡X秒(mPa · s)，比如低于5 毫帕斯卡X秒(mPa · s)。
14.如权利要求22限定的液体、水性药物组合物，用作药物。
15.降低组合物的粘度的方法，所述组合物包括浓度为至少25mg/ml的所需维生素K 依赖性蛋白质，所述所需的维生素K依赖性蛋白质是用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分 官能化的，其中，按照如本文描述的“流变仪粘度测定”测量的粘度低于30毫帕斯卡X秒 (mPa · s)，所述方法包括加入二价金属阳离子至最终浓度高于IOmM的步骤。
全文摘要
本发明涉及用于降低包括维生素K-依赖性蛋白质的组合物的粘度的方法。
文档编号A61K38/48GK102083459SQ200980118803
公开日2011年6月1日 申请日期2009年5月22日 优先权日2008年5月23日
发明者A·D·尼尔森, T·奥斯特加尔德 申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司