附加了糖链的glp-1肽的制作方法

专利名称：附加了糖链的glp-1肽的制作方法
附加了糖链的GLP-1肽
技术领域：
本发明涉及附加了糖链的GLP-I肽。背景技术：
GLP-I (胰高血糖素样肽-1 :gluCag0n-like ρ印tide-1)是与糖的稳态控制深 度相关的肠起源的肽。GLP-I通过作为胰高血糖素前体的前原胰高血糖素的组织特异 性的翻译后加工而在肠的L细胞中合成，与餐食反应而放出到循环中。此肽是肠胰岛轴 (enteroinsular axis)的主要介质，通过结合特定的受体来发挥作用。已知GLP-I主要在胰腺作用，葡萄糖浓度依赖性地促进由β细胞的胰岛素放出。 另外提示了，抑制胰高血糖素的分泌，延迟胃的空洞化，提高末梢的葡萄糖处理的可能性。通过GLP-I的施用使得胰岛素非依赖型糖尿病患者中餐后的葡萄糖水平正常化， 提示了作为GLP-I的治疗药的可能性。另外，GLP-I有改善胰岛素依赖型糖尿病患者中血 糖控制的作用。再，由于GLP-I的胰岛素放出促进作用依存于血浆葡萄糖浓度，在低血浆葡 萄糖浓度，GLP-I介导的胰岛素放出低，有不导致重度低血糖症的优点。因此，根据需要，通 过控制血中GLP-I量，认为安全性高的糖尿病治疗是可能的。但是，GLP-I的血中的半衰期 是2 6分钟，极其短，有其作为治疗剂的可能性受限的问题。作为解决这样的问题的手段，进行了改变GLP-I的尝试。例如，专利文献1中公开 了，包括共价结合到至少1个聚乙二醇(PEG)分子的GLP-I化合物的聚乙二醇化GLP-I化 合物。所述聚乙二醇化GLP-I化合物是，各PEG用Cys或Lys氨基酸，或者用羧基末端氨基 酸键合到GLP-I化合物。所述聚乙二醇化GLP-I化合物有至少1小时的排出半衰期。根据专利文献1，可得到相比非聚乙二醇化(imPEGylated)肽，半衰期被延长，清 除延迟的生理活性肽。另外公开了，这些聚乙二醇化(PEGylated)GLP-I化合物及组合物降 低糖尿病，肥胖，过敏性肠综合征，以及血糖，抑制胃及/或肠运动性，及，抑制胃及/或肠内 容物排出，或抑制食物摄取等，对于健康状态的治疗有用(例如，非专利文献1)。但是，PEG由于是在体内不被代谢的化合物，如果持续聚乙二醇化GLP-I化合物的 施用，则PEG在体内蓄积，有给活体带来不良药物反应的危险性(非专利文献1)。另外，为了延长半衰期，也提出了 GLP-I或其修饰体附加糖链的方法(例如，专利 文献3及4)。专利文献3中记载着，向GLP-I的沈位，34位，及/或37位导入附加了糖链 的氨基酸的方法等，无法断言糖链的种类或糖链附加位置肯定最适。另一方面，专利文献4 中记载着使分子量200KDa左右的透明质酸修饰物结合到GLP-I类似物的方法。但是，大量 制备如此巨大的透明质酸分子时，使长度或结构均一是困难的，实际上认为各透明质酸的 结构或长度发生大大的偏差。作为药品使用时，长度或结构均一的附加了糖链的肽是必要 的。另外，作为类似于GLP-I的结构，有同样的活性，并且血中稳定性高的化合物，从 蜥蜴(Heloderma)的唾液中发现的毒蜥外秘肽_4 (毒蜥外秘肽_4)(非专利文献幻在美国 上市，但毒蜥外秘肽-4是非人型序列，想得到长期施用所致的中和抗体的出现或与之伴随的药效的减弱(非专利文献3 5)。另一方面，越来越明了糖链在体内发挥各种各样的作用，虽然已认识到其研究的 重要性，但由于结构的复杂性或多样性而研究被延缓。虽然也尝试了用于得到组成一定的 糖肽的方法(专利文献幻，但从简便性或大量生产的观点来看，不认为是足够好的制备方 法，另外，尤其对于在体内存在的长糖链而言，无法断言是实用的制备方法。专利文献1特表2006-520818号公报专利文献2再表2005-095331号公报专利文献3再表2006-095775号广报专利文献4国际公开第2007/063907号单行本非专利文献1lexicological Science，42，152-157 (1998)。非专利文献2J Biol Chem. 267,402-5(1992)非专利文献3Vascular Health and Risk Management 2,69-77(2006)非专利文献4] JAMA. 298,194-206(2007)非专利文献5Endocrine Reviews 28,187-218(2007)

发明内容发明要解决的技术课题本发明的课题在于提供，相比GLP-1，血中稳定性增大，再优选为，显示高血糖值抑 制活性的，附加了糖链的GLP-I肽。解决课题的技术方案为了解决以上的课题，本发明有以下的特征。S卩，本发明是有GLP-I活性的、附加 了糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置 换(a) GLP-I ；(b)GLP-I中缺失，置换或添加了 1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-l 的类似物。另外，本发明是有GLP-I活性的、附加了糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的 至少2个氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换(a) GLP-I ；或(b) GLP-I中缺失，置换或添加了 1或数个氨基酸，且有GLP-I活性的肽。另外，本发明是有GLP-I活性的、附加了糖链的GLP-I肽，其是(a)GLP-I中，2个以上的氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换的附加了糖链的 GLP-I肽，至少1个置换位置是18，20，22，26，30，34或36位的附加了糖链的GLP-I肽；或(b) (a)中定义的附加了糖链的GLP-I肽中，缺失，置换或添加了附加了糖链的氨 基酸之外的氨基酸的1或数个氨基酸的附加了糖链的GLP-I肽。另外，本发明是有GLP-I活性的、附加了糖链的GLP-I肽，其是(a)GLP-I中，2个以上的氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换的附加了糖链的 GLP-I肽，任何置换位置均选自18，20，22，26，30，34或36位的附加了糖链的GLP-I肽；或(b) (a)中定义的附加了糖链的GLP-I肽中，缺失，置换或添加了附加了糖链的氨
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Ac表示乙酰基]。
基酸之外的氨基酸的1或数个氨基酸的附加了糖链的GLP-I肽。本发明中，附加了糖链的氨基酸，根据实施方式，优选为附加了糖链的Asn或附加 了糖链的Cys，但不限于此。另外，本发明中，与附加了糖链的GLP-I肽结合的多个附加了糖链的氨基酸，可为 糖链或氨基酸的种类相同的氨基酸，也可为不同的氨基酸。另外，本发明中，附加了糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸可经接头结合，也可不经 接头结合。根据实施方式，优选为，不经接头(直接)结合。另外，本发明中，糖链一般优选为由4个以上的糖构成的糖链。再，根据实施方式， 有时优选为由5个 11个糖构成的糖链。另外，本发明中，糖链，根据实施方式，优选为双链复合型糖链。另外，根据实施方 式，有时优选选自二唾液酸糖链，单唾液酸糖链，无唾液酸糖链，二 N-乙酰葡萄糖胺糖链及 二甘露糖糖链的糖链，但不限于此。另外，本发明中，糖链，根据实施方式，有时优选为以下的式所示的糖链，但不限于 此。化1
权利要求
1.有GLP-I活性的、附加了糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨基酸 被附加了糖链的氨基酸所置换(a)GLP-I；(b)GLP-I中缺失，置换或添加了1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-l的类似物。
2.有GLP-I活性的、附加了糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨基酸 被附加了糖链的氨基酸所置换(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失，置换或添加了1或数个氨基酸的肽。
3.有GLP-I活性的、附加了糖链的GLP-I肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨基酸 被附加了糖链的氨基酸所置换(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失，置换或添加了1或数个氨基酸，且有GLP-I活性的肽。
4.权利要求1 3中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述附加了糖链的 氨基酸是附加了糖链的Asn及/或附加了糖链的Cys。
5.权利要求1 4中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述附加了糖链的 氨基酸中，糖链与氨基酸不经接头结合。
6.权利要求1 5中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为由4 个以上的糖构成的糖链。
7.权利要求1 6中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为双链 复合型糖链。
8.权利要求7中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为独立地选自二唾液 酸糖链，单唾液酸糖链，无唾液酸糖链，二 N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链。
9.权利要求1 8中任一项所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为独立地 以下示表示的糖链
10.权利要求1 9中任 一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链基本上均一。
11.有GLP-I活性的、附加了糖链的GLP-I肽，其为(a)GLP-I中2个以上的氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换的附加了糖链的GLP-I 肽，且为至少1个置换位置是18，20，22，沈，30，34或36位的附加了糖链的GLP-I肽；或(b)(a)中定义的附加了糖链的GLP-I肽中，缺失，置换或添加了所述附加了糖链的氨 基酸之外的氨基酸的1或数个氨基酸的附加了糖链的GLP-I肽。
12.权利要求11中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述附加了糖链的氨基酸是附 加了糖链的Asn及/或附加了糖链的Cys。
13.权利要求11或12中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述附加了糖链 的氨基酸中，糖链与氨基酸不经接头结合。
14.权利要求11 13中任一项所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为由4 个以上的糖构成的糖链。
15.权利要求11 14中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为双 链复合型糖链。
16.权利要求15中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为独立地选自二唾 液酸糖链，单唾液酸糖链，无唾液酸糖链，二 N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链。
17.权利要求11 16中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链均为独 立地以下示表示的糖链化3
18.权利要求11 17中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链99% 以上均一。
19.权利要求11中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中，所述附加了糖链的氨基酸是附加了糖链的Asn，所述附加了糖链的氨基酸中，糖链与氨基酸不经接头结合，所述糖链是由4个以上的糖构成的糖链，所述糖链均为独立地选自二唾液酸糖链，单唾液酸糖链，无唾液酸糖链，二 N-乙酰葡 萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链，且所述糖链基本上均一。
20.权利要求1 19中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其相比GLP-I具有增 大的血中稳定性。
21.权利要求1 20中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其相比GLP-I具有10 倍以上的0GTT( 口服葡萄糖耐量试验)中血糖值抑制活性。
22.权利要求1 20中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其相比GLP-I具有30 倍以上的DPP-IV抗性。
23.药物组合物，其含权利要求1 22中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽作为 有效成分。
24.权利要求23中所述的药物组合物，其用于GLP-I关联疾病的治疗或预防。
25.权利要求对中所述的药物组合物，其中所述GLP-I关联疾病是糖尿病。
26.GLP-I关联疾病的治疗或预防方法，其包括施用有效量的权利要求1 22中任一项 中所述的附加了糖链的GLP-I肽。
27.附加了糖链的GLP-I肽，其为下列肽中的至少1个氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换的有GLP-I活性的、附 加了糖链的GLP-I肽(a)GLP-I ；(b)GLP-I中缺失，置换或添加了1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-l的类似物，其中所述糖链是寡透明质酸。
28.附加了糖链的GLP-I肽，其为下列肽中的至少1个氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换的有GLP-I活性的、附 加了糖链的GLP-I肽(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失，置换或添加了 1或数个氨基酸的肽， 其中所述糖链是寡透明质酸。
29.权利要求27或观中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述寡透明质酸是以由 N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸构成的单元作为1个单元的2个单元0糖)以上，8个单元 (16糖)以下的糖链。
30.权利要求27或观中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述寡透明质酸是以由 N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸构成的单元作为1个单元的2个单元G糖)的糖链。
31.权利要求27 30中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述附加了糖链 的氨基酸是附加了糖链的Cys。
32.附加了糖链的GLP-I肽，其为下列肽中的至少1个氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换的有GLP-I活性的、附 加了糖链的GLP-I肽(a)GLP-I；(b)GLP-I中缺失，置换或添加了1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-l的类似物，其中所述附加了糖链的氨基酸中，糖链与氨基酸经接头结合。
33.附加了糖链的GLP-I肽，其为下列肽中的至少1个氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换的有GLP-I活性的、附 加了糖链的GLP-I肽(a)GLP-I ；或(b)GLP-I中缺失，置换或添加了 1或数个氨基酸的肽， 其中所述附加了糖链的氨基酸中，糖链与氨基酸经接头结合。
34.权利要求32或33中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中与所述接头结合的氨基酸 是 Lys0
35.权利要求32 34中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述接头在所述 糖链侧的末端含氨基酸。
36.权利要求35中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述接头中所含的氨基酸是Asn0
37.权利要求27 36中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽，其中所述糖链基本上均一。
38.药物组合物，其含权利要求27 37中任一项中所述的附加了糖链的GLP-I肽作为 有效成分。
39.权利要求38中所述的药物组合物，其中所述糖链90%以上均一。
40.权利要求38或39中所述的药物组合物，其用于GLP-I关联疾病的治疗或预防。
全文摘要
本发明以提供相比GLP-1，血中半衰期长，且优选显示高血糖值抑制活性的附加了糖链的GLP-1肽为课题。本发明提供有GLP-1活性的、附加了糖链的GLP-1肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换(a)GLP-1；(b)GLP-1中缺失，置换或添加了1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-1的类似物。本发明还提供附加了糖链的GLP-1肽，其为所述(a)，(b)或(c)中的至少1个氨基酸被附加了糖链的氨基酸所置换的有GLP-1活性的、附加了糖链的GLP-1肽，其中所述糖链是包括寡透明质酸的糖链。对于附加了糖链的氨基酸而言，糖链与氨基酸也可经接头结合。
文档编号A61P3/10GK102083854SQ20098012266
公开日2011年6月1日 申请日期2009年6月15日 优先权日2008年6月17日
发明者南部由利, 坂本泉, 手塚克成, 朝井洋明, 林直宏, 梶原康宏, 深江一博, 石井一之, 辻孝 申请人:大塚化学株式会社