包含PRFA^*突变体李斯特菌的组合物及其使用方法

专利名称：包含PRFA^*突变体李斯特菌的组合物及其使用方法
技术领域：
本发明的领域总体涉及用于表达包括异源多肽在内的多肽的新型重组李斯特菌 (Listeria)。尤其是，本发明涉及可用于疫苗组合物的在I^rfA中含有突变的重组细菌。
背景技术：
对基于重组单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)疫苗与其 它重组疫苗平台相比的优点的认识，有助于它们当前的开发和在早期临床试验中的通行评 价。这些优点包括实用性考虑因素诸如用于生产的直接发酵法，以及诸如即使在保护性Lm 特异性免疫的存在下反复施用的能力等其它理想特征(Bower，H. G.等(1999) Infection and Immunity 67 :253-258 ；Starks,H.等(2004)J Immunol 173 :420-427,Stevens,R.等 人O005)Vaccine 23:1479-1490)。该疫苗平台的一个主要原理是基于小鼠李斯特菌病模 型中保护的公知关联响应于以单核细胞增生性李斯特菌进行的单免疫而诱导的长寿的功 能性 CD4+ 和 CD8+ 记忆 T 细胞(Harty, J. T.等人(2000) Ann Rev Immunol 18 :275-308 ； Pamer，E. G. (2004) Nat. Rev. Immunol. 4 :812-823)。现在有大量公开文件可证实重组单核细 胞增生性李斯特菌疫苗由于强健的先天和适应性细胞免疫而在数种动物模型中的显著功 效(Brockstedt, D. G.等人(2004)Proc Natl Acad Sci U S A 101 :13832-13837 ；Bruhn, K. W.等人 Q007)Microbes Infect 9 :1226-1235 ；Paterson,Y.和Maciag，P.C. (2005) Curr Opin Mol Ther 7 =454-460) 0已报道了将重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗用于治疗癌 症和肿瘤(例如见 Brockstedt 等人 Q004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :13832-13837 ； Brockstedt 等人(2005)Nature Med. 11 :853-860) ；Starks 等人(2004)J.Immunol. 173 420-427 ；Shen 等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :3987-3991)。例如，美国专利公开 号 2005/(^81783、2005/0249748、2004/0228877 和 2004/0197343 中也报道了基于李斯特菌 的疫苗，将各篇上述文件通过引用整体并入本文。因此，基于重组Lm的疫苗代表了解决对 可引发功能性细胞免疫从而预防或治疗感染如HIV、HCV、结核和疟疾以及癌症的有效疫苗 的急迫全球性需求的新兴方法。未来几年的结果将表明在临床前研究中观察到的强力活性 是否能转变为对人体的有效性。由于单核细胞增生性李斯特菌是在免疫受损的个体中具有增加毒力的食物传 播病原体，因此减毒疫苗平台是在人中进一步评估的先决条件(Lorber，B. (1997)Clin Infect Dis 24 1-9)0衍生于野生型株10403S的活减毒疫苗平台和光化学失活疫苗平台 都已有描述(Brockstedt, D. G.等人(2005)Nat Med 11 :853-860 ；Brockstedt, D. G.等人 (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101 :13832-13837)。活减毒疫苗株缺失acU和 inlB毒 力基因(单核细胞增生性李斯特菌AactA/AinlB)，所述毒力基因缺失联合限制了在肝脏
8中的生长，肝脏正是野生型生物体感染的主要靶器官。这种联合缺失阻断了经由MlB肝细 胞生长因子受体相互作用的直接肝细胞感染(Dramsi，S.等人(1995)Mol Microbiol 16: 251-261)以及从被感染的肝存留Kupffer细胞经由ActA介导的细胞至细胞的传播而在肝 细胞中的间接传播。与静脉内注射(IV)野生型Lm的小鼠相比，静脉内注射(IV)单核细胞 增生性李斯特菌AactA/AinlB的小鼠中的肝毒性显著降低，所述肝毒性通过血清肝功检 测(LFTs)谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)测定。此外，在给予逐增剂量的基于单核 细胞增生性李斯特菌AactA/Δ inlB株的食蟹猴中进行的2种GLP毒性研究中，肝毒性最 小并且无剂量限制(数据未公开)。单核细胞增生性李斯特菌AactA/AinlB疫苗株构成 了 2项正在对患晚期癌症的成年对象进行的FDA批准的1期临床试验的基础。第二种疫苗 平台称为杀死但具有代谢活性(Killed But Metabolically Active，KBMA)，源于单核细胞 增生性李斯特菌Δ actA/ Δ inlB,并且还同时携带了 uvrA和uvrB的缺失，uvrA和uvrB是 编码核苷酸切除修复(NER)途径的DNA修复酶的基因。KBMA疫苗(单核细胞增生性李斯特 菌Δ actA/ Δ inlB/ Δ uvrAB)对通过合成补骨脂素、S_59和长波UV光的联合处理进行光化 学失活非常敏感。在被杀死时，KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗能够瞬时表达其基因产 物，从而使其逃避吞噬溶酶体并诱导功能性细胞免疫和针对野生型单核细胞增生性李斯特 菌与疫苗病毒侵袭的保护(Brockstedt, D. G.等人(2005)Nat Med 11 :853-860)。是充当中心毒力调节物的细胞内激活转录因子，其作用是能够使单核细胞 增生性李斯特菌在哺乳动物内或作为腐生生物的生长生活方式如“化身博士”(Dr. Jekyll and Mr. Hyde)所述那样二元化(Gray, M.J.等人 Q006nnfect Immun 74:2505-2512)。 PrfA敲除株不具毒力(Vazquez-Boland，J. A.等人 Q001)Clin Microbiol Rev 14: 584-640)。在野生型Lm中，PrfA在感染宿主细胞时表达，并进而诱导包括分别编码李斯特 溶素O(LLO)和磷脂酶C的hly和plcA基因的prfA调节子的表达。组合时，这些基因产物介 导该细菌由吞噬溶酶体的严酷微环境中逃逸。PfrA还调节内化素基因(例如，inlA和inlB) 的转录，所述内化素基因编码有助于受体介导的非吞噬细胞的感染的配体(kortti，Μ.等 人Q007)Microbes Infect) 0通过将异源基因与hly或actA启动子连接，所述I^rfA依 赖启动子能够用于驱动重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗中的Ag表达(Gurm，G. R.等 人 O001)J Immunology 167 :6471-6479 ；Shen, H.等人(199 Proc Natl Acad Sci 92 3987-3991)。可导致I^rfA依赖基因的组成型激活的I^rfA中的氨基酸取代物统称为I^rfA* 突变体(Ripio, M.T.等人(1997) J Bacteriol 179 :1533-1540 ；Scortti, M.等人(2007) Microbes Infect)。多种具有超溶血表型的野生型单核细胞增生性李斯特菌株具有prfA中 的突变，最常见为G145S，与实验室获得株如10403S相比，G145S可产生增加的毒力(Ripio， Μ. Τ.等人(1997) J Bacteriol 179:1533-1540)。类似地，通过化学诱变法选择的I^rfA依 赖基因表达增加的其它prfA突变体也具有对小鼠增加的毒力(Sietron-Rama，L. Μ.等人 (2003) Mol Microbiol 48 :1537-1551)。免疫之前对I^rfA依赖基因的诱导可通过多种机制 增强疫苗的功效，所述机制包括在宿主细胞胞质溶胶中增加吞噬溶酶体逃逸和I^rfA依赖 编码抗原的表达，产生更强力的⑶4+和⑶8+T细胞应答。对于开发具有增加功效的疫苗，理想的是改善用于异源抗原向受感染细胞(特别 是抗原递呈细胞)的胞质溶胶中的李斯特菌介导的输送方法。还继续需要可增强基于Lm 的疫苗的效能或降低基于Lm的疫苗的毒性的进一步改进，从而有助于其最终临床开发。

发明内容
本发明提供了包含可用作异源抗原输送载体的毒力基因的组成型突变体激活剂 的李斯特菌。在一些实施方式中，通过PrfA调节子的组成型激活，可增强李斯特菌的异源 多肽和/或多核苷酸向受感染细胞的胞质溶胶中的输送。提供了含有李斯特菌的组合物如 药物组合物和疫苗。还提供了利用李斯特菌诱导免疫应答，或者治疗或预防治疗哺乳动物 疾病的方法。在一方面，本发明提供了包含编码突变体多肽的多核苷酸的重组李斯特菌 属细菌；和包含PrfA应答调控元件和编码异源多肽的多核苷酸的重组多核苷酸。编码异源 多肽的多核苷酸可操纵地连接于PrfA应答调控元件。在一些方面，异源多肽是非细菌的。 在本发明的一些方面，PrfA*突变体多肽包含选自Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S和S183A 的突变。在一些方面，I^fA*突变体多肽是G155S突变。在本发明的一些方面，所述重组多 核苷酸编码包含信号肽和异源多肽的融合蛋白。在本发明的一些方面，PrfA应答调控元件 选自hly启动子、plcA启动子、plcB启动子、mpl启动子、hpt启动子、inlC启动子、inlA启 动子、inlB启动子、prfA启动子和actA启动子。在一些方面，prfA应答调控元件是actA启 动子。在本发明的一些方面，所述信号肽是选自单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽、 单核细胞增生性李斯特菌的LLO信号肽、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的^φ45信号 肽、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的保护抗原信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的p60 信号肽、枯草杆菌(Bacillus subtilis)的WioD信号肽、secA2信号肽和Tat信号肽的信 号肽。在一些方面，所述信号肽是单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽。在一些方面， 所述融合蛋白包含ActA的前100个氨基酸。在本发明的一些方面，重组李斯特菌属细菌包含含有抗原的异源多肽，所述抗原 选自肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原衍生的多肽、传染病抗原和传染病抗原衍生的多肽。在一 些方面，所述传染病抗原来自病毒或异源传染病病原体，该病毒或异源传染病病原体选自 肝炎病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、巨 细胞病毒、结核分枝杆菌、恶性疟原虫或沙眼衣原体。肝炎病毒的实例包括，但不限于甲肝 病毒、乙肝病毒或丙肝病毒。在本发明的一些方面，包含毒力基因的组成型突变体激活剂的李斯特菌属于物种 单核细胞增生性李斯特菌。在一些方面，重组李斯特菌属细菌是减毒的；例如对于细胞至细 胞的传播、进入非吞噬细胞、增殖或DNA修复中的一种或多种方面。在一些情况下通过actA 突变、inlB突变、uvrA突变、uvrB突变、uvrC突变、核酸靶向的化合物或uvrAB突变和靶向 核酸的化合物中的一种或多种使李斯特菌减毒。在一些情况下，靶向核酸的化合物是补骨 脂素。在一些方面，本发明提供了重组I^rfA*李斯特菌属细菌，其中该菌的核酸通过与可直 接与核酸反应的靶向核酸的化合物进行反应而得到修饰，从而使该菌在增殖方面被减弱。 在一些情况下，该菌包含可使被修饰的菌在增殖方面减弱的核酸交联物。在一些情况下，该 菌包含使菌在增殖方面被减弱的补骨脂素-核酸加合物。在一些情况下，该菌还包含可减 弱该菌修复其被修饰核酸的能力的遗传突变。在本发明的一些方面，该菌包含actA、inlB、 uvrA和uvrB中的失活突变；并且该菌的增殖已通过补骨脂素_核酸交联物被减弱。在本 发明的一些方面，PrfA*李斯特菌被杀死但具有代谢活性(KBMA)。
本发明提供了包含重组李斯特菌属细菌，以及药学上可接受的赋形剂、佐剂 和共刺激分子中的一种或多种的药物组合物。在一些方面，所述组合物还包含治疗剂。本发明提供了诱导宿主的针对非李斯特菌抗原的免疫应答的方法，所述方法包 括对宿主施用有效量的组合物，所述组合物包含编码I^fA*突变体多肽的重组李斯特菌属 细菌；和包含PrfA应答调控元件以及编码异源多肽的多核苷酸从而编码可操纵地连接于 prfA应答调控元件的抗原的重组多核苷酸。在一些方面，本发明提供了增强非李斯特菌抗 原在宿主中的免疫原性的方法。在一些方面，本发明提供了预防或治疗宿主中的非李斯特 菌的传染病症或癌性病症的方法。在一些方面，所述抗原选自肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原 衍生的多肽、传染病抗原和传染病抗原衍生的多肽。在一些方面，所述免疫应答是先天免疫 应答；在一些方面所述免疫应答是适应性免疫应答。在本发明的一些方面，所述宿主是人。 在本发明的一些方面，本发明的重组李斯特菌增大响应于I^rfA*重组李斯特菌的施用而引 起的对所编码抗原特异性的T细胞功能。本发明提供了诱导或增强宿主中的免疫应答的方法，其中重复施用本发明的重组 PrfA*李斯特菌属细菌。在一些方面，首先施用本发明的重组I^rfA*李斯特菌属细菌，然后 一次或多次施用非李斯特菌免疫原性组合物。在一些情况下，首先施用非李斯特菌免疫原 性组合物，然后一次或多次施用本发明的重组I^fA*李斯特菌属细菌。在本发明的一些方面，与其中编码异源多肽的多核苷酸的表达受野生型I^rfA多 肽控制的重组李斯特菌属细菌诱导的抗原的免疫原性相比，抗原的免疫原性得到增强。在 一些情况下，增强的免疫原性包括MCP-I、IL-6、IFN- y , TNFa或IL_12p70中的一种或任 意组合的表达增加。本发明提供了重组李斯特菌属细菌的制备方法。例如，将在I^rfA-应答调控元件 控制下的编码异源多肽的重组多核苷酸稳定地引入到I^rfA*李斯特菌属细菌中。在一些情 况下所述异源多肽与信号序列融合。在一些方面，编码异源多肽的重组多核苷酸整合在李 斯特菌染色体中。在一些情况下，编码异源多肽的重组多核苷酸整合在李斯特菌染色体的 tRNAarg基因中或actA基因中。在一些方面，将编码I^rfA*突变体多肽的重组多核苷酸稳定 地引入到含有非功能性PrfA等位基因的李斯特菌属细菌中。


图1显示了对单核细胞增生性李斯特菌prfA*疫苗株的表征。(A)利用pPL2位点 特异性整合载体构建表达四个疫苗病毒T细胞表位(AMR、C4L、K3L和B8R)和以连接物序 列间隔并与ActA的前100个氨基酸(ActANlOO)融合的卵清蛋白SL8表位的单核细胞增生 性李斯特菌Quadvac株。(B)异源蛋白在酵母提取肉汤中的表达。(C)受感染J774巨噬细 胞中感染后7小时时异源Ag的表达。(D)受感染DC2. 4树突细胞中感染后2. 5小时时异源 ^Vg的表达。(E)J774巨噬细胞中同基因型单核细胞增生性李斯特菌疫苗株的细胞内生长。图2显示了由疫苗株诱导的改善的先天免疫和适应性免疫。(A)单静脉内施 用 5 X IO6Cfu 的单核细胞增生性李斯特菌 Δ actA/ Δ inlB/WT prfA、PrfA*G155S、PrfA*G145S 和ft~fA*Y63C株后8小时确定的血清细胞因子/趋化因子水平。细胞因子/趋化因子通过 流式微球阵列(CBA)确定。各符号表示单个动物。数据为至少2次实验中具有代表性的一 次实验的数据。(B，C)活减毒疫苗株诱导更高量级的抗原特异性免疫。以5X106cfu的单核细胞增生性李斯特菌 Δ actA/ Δ inlB/WTprfA、PrfA*G155S、PrfA*G145S 和 PrfA*Y63C 株对C57BL/6小鼠进行静脉内免疫。抗原特异性T细胞应答通过接种后7天的应答峰的细 胞内细胞因子染色来确定。(B)显示了各组代表性动物的点印迹。(C)显示了各组5只动 物的平均值士标准差。图3显示增强的KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫原性。(A)单静脉 内施用1 X IO8颗粒的KBMA单核细胞增生性李斯特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA、PrfA*G155S、 PrfA*G145S和ft~fA*Y63C株后8小时确定的血清细胞因子/趋化因子水平。细胞因子/趋 化因子通过流式微球分析(CBA)确定。各符号表示单个动物。(B，C)KBMA单核细胞增生性 李斯特菌I^fA*株诱导更高量级的抗原特异性免疫。以1 X IO8颗粒的KBMA单核细胞增生 性李斯特菌 Δ actA/ Δ inlB/WT prfA、PrfA*G155S、PrfA*G145S 和 PrfA*Y63C 株对 C57BL/6 小鼠进行静脉内免疫。通过接种后7天的应答峰的细胞内细胞因子染色确定抗原特异性T 细胞应答。(B)显示了各组代表性动物的点印迹。(C)显示了各组5只动物的平均值士标 准差。图4显示了通过KBMA单核细胞增生性李斯特菌I^rfA*株引起的T细胞应答的改善 的效能。(A，B)以HBSS (左图)或1 X IO8颗粒的KBMA单核细胞增生性李斯特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA,PrfA*G155S,PrfA*G145S 和 PrfA*Y63C 株对 C57BL/6 小鼠进行静脉内或肌 肉内(如图指明)免疫两次(相隔2周)。7天后，通过以gB2(对照；中间峰)、A24R负载 的靶(右峰)或B8R负载的靶(左锋)侵袭小鼠而确定体内细胞溶解活性。(A)显示了各 组代表性动物的直方图。(B)显示了静脉内或肌肉内接种的小鼠对A42R和B8R特异性的体 内细胞溶解活性。各符号表示个体动物。(C)显示了以各种剂量的KBMA单核细胞增生性李 斯特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA或ft~fA*G155S相隔2周接种2次后对B8R特异性的体内 细胞溶解活性。显示了各具有5只动物的组的平均值士标准差。(D)显示了对通过野生 型单核细胞增生性李斯特菌进行的2XLD5(I侵袭的保护性免疫。以IXlO8颗粒的KBMA单 核细胞增生性李斯特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA或ft~fA*G155S对Balb/c小鼠进行静脉内 免疫一次。HBSS用作对照。侵袭后3天收集脾脏并铺板用于CFU。通过学生T检验确定， WT prfA和prfA*G155S之间的log-保护具有统计学显著性差异。(E)以1 X 107pfu的疫 苗病毒进行腹膜内侵袭后卵巢内的病毒滴度。以IX IO8颗粒的KBMA单核细胞增生性李斯 特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA或prfA*G155S对C57BL/6小鼠进行2次静脉内接种。疫苗 病毒侵袭后5天确定病毒滴度。各符号表示个体动物。通过学生T检验确定，WT 和 PrfA*G155S之间的log-保护具有统计学显著性差异。图5显示I^rfA*增强了编码HPV E7的KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫 原性。在最后接种后7天，在应答峰处通过细胞内细胞因子染色确定HPV E7特异性T细胞 应答。㈧以活李斯特菌进行的单接种的数据。⑶以KBMA进行的初免-加强接种的数据。图6显示I^rfA*增强了编码HPV E7的KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫 原性。在最后接种后7天，在应答峰处通过细胞内细胞因子染色确定LLO特异性T细胞应 答。(A)以活李斯特菌进行的单接种的数据。(B)以KBMA进行的初免-增强接种的数据。图 7 显示 PrfA、PrfA*G155S, PrfA*G145S 和 PrfA*Y63C 的氨基酸序列。
具体实施例方式I 导言本发明部分基于以下发现当抗原在李斯特菌的毒力基因的组成型突变体激活剂 的控制下表达时，可增强对该抗原的免疫应答。单核细胞增生性李斯特菌的二元生活方式 被比作“化身博士”(Dr. Jekyll and Mr. Hyde)。作为腐生生物，李斯特菌在环境中以无害的 生命形式存活。然而，在感染哺乳动物宿主时，李斯特菌通过表达多种可使李斯特菌在哺乳 动物生理条件下生长和繁衍的毒力基因而变得有害。在从无害的腐生生物生活方式到有害 的毒力生活方式的转变中，PrfA蛋白发挥了关键作用。I^rfA响应于包括温度、pH、铁浓度、 糖浓度和活性氧簇在内的多种刺激而激活。通过I^rfA依赖基因的组成型表达，已经部分鉴 定了 I^rfA的突变体。所述组成型I^rfA突变体被称为突变体。在一些情况下，已表 明组成型PrfA*突变体多肽表现出李斯特菌的超毒力表型，例如G155S PrfA*突变体。本发明提供了用于刺激针对抗原的免疫应答的重组李斯特菌属细菌。在本发明的 一些方面，所述重组李斯特菌属细菌包含PrfA等位基因突变从而I^rfA蛋白组成型表达。重 组李斯特菌还包含多肽；例如在I^rfA应答调控元件控制下的抗原。在一些情况下，所述多 肽可以是融合蛋白，其中信号序列与该多肽连接。PrfA应答调控元件的实例包括，但不限于 act A启动子、hly启动子、plcA启动子、inlA启动子、inlB启动子和prfA启动子。在本发明的一些方面，异源多肽是肿瘤抗原；在本发明的一些方面，多肽是与传染 病相关的抗原。在本发明的一些方面，异源多肽是非李斯特菌的多肽；在本发明的一些方 面，异源多肽是非细菌多肽。在本发明的一些方面，所述李斯特菌是单核细胞增生性李斯特菌。在一些情况下， 李斯特菌被减毒以用于细胞至细胞的传播和/或进入非吞噬细胞。在一些情况下，李斯特 菌包含actA和/或inlB的失活突变。在一些情况下，李斯特菌是actA inlB双缺失突变 体。在一些情况下，李斯特菌包含至少一个核酸修复基因如uVrA、uVrB、uVrC或重组修复基 因的失活突变。例如，所述李斯特菌可以是uvrAB缺失突变体。在一些情况下，所述细菌还 包含核酸交联剂(例如补骨脂素)。在本发明的一些方面，李斯特菌被灭活，但具有代谢活 性(KBMA)。还提供了包含上述方面的李斯特菌的药物组合物、免疫原性组合物和/或疫苗。 在一些方面，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。在本发明的一些方面，所述李斯 特菌还包含佐剂。在本发明的一些方面，本发明的李斯特菌与治疗剂联合使用。在一些情况下，将李 斯特菌与治疗剂一起施用；在一些情况下，将李斯特菌在治疗剂之前施用。在一些情况下， 李斯特菌在治疗剂之后施用。本发明提供了使用本发明的重组李斯特菌的方法。在一些情况下，本发明提供了 诱导针对抗原的免疫应答的方法。在一些情况下，本发明提供了增强抗原的免疫原性的方 法。在一些情况下，与在野生型I^rfA多肽控制下在李斯特菌中表达的抗原的免疫原性相 比，抗原的免疫原性得到增强。增强的免疫原性可以通过本领域中已知的方法测定。在一 些方面，可以通过测定已知由免疫应答诱导的细胞因子、趋化因子和多肽提高的表达，从而 测定增强的免疫原性。例如，MCP-I、IL-6、IFN-Y、TNF α和/或IL-12 ρ70。在本发明的 一些方面，所述已知由免疫应答诱导的细胞因子、趋化因子和多肽提高的表达可以是，与由
权利要求
1.一种重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌包含(a)编码I^fA*突变体多肽的多核苷酸；和(b)重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含(i) PrfA应答调控元件；和( )编码异源多肽的多核苷酸，其中所述编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于所 述prfA应答调控元件，并且其中所述异源多肽是非细菌的多肽或者是异源传染病病原体 的抗原。
2.如权利要求1所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述I^rfA*突变体多肽包含选自 Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S 和 S183A 的突变。
3.如权利要求2所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述I^rfA*突变体多肽包含G155S突变。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述重组多核苷酸编码 融合蛋白，该融合蛋白包含信号肽和所述异源多肽。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述prfA应答调控元 件选自hly启动子、plcA启动子、plcB启动子、mpl启动子、hpt启动子、inlC启动子、inlA 启动子、inlB启动子、prfA启动子和actA启动子。
6.如权利要求5所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述prfA应答调控元件是actA启 动子。
7.如权利要求4所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述信号肽是选自单核细胞增生 性李斯特菌的ActA信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的LLO信号肽、乳酸乳球菌的Usp45 信号肽、炭疽杆菌的保护抗原信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的P60信号肽、枯草杆菌的 PhoD信号肽、secA2信号肽和Tat信号肽的信号肽。
8.如权利要求7所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述信号肽是单核细胞增生性李斯 特菌的ActA信号肽。
9.如权利要求4所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述融合蛋白包含ActA的前100个氨基酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述异源多肽包含选 自肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原衍生的多肽、传染病抗原和传染病抗原衍生的多肽的抗原。
11.如权利要求10所述的重组李斯特菌，其中所述异源多肽是选自K-Ras、H-Ras, N-Ras、12-K-I as、间皮素、PSCA、NY-ESO-U WT-1、存活素、gplOO、PAP、蛋白酶 3、SPAS-U B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α 甲胎蛋白、乳腺珠 蛋白、hTERT (端粒酶)、PSA和CEA的抗原，或包含选自K_I as、H-I as、N-I as、12-K_I as、间皮 素、卩50々、附450-1、111-1、存活素4 100、？4 、蛋白酶3、5 45-1、8-位厂酪氨酸激酶、111(1111-2、 MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α 甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT (端粒酶)、PSA 和CEA的抗原所衍生的多肽。
12.如权利要求10所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述传染病抗原来自病毒或异源 传染病病原体，该病毒或异源传染病病原体选自肝炎病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、 乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、巨细胞病毒、结核分枝杆菌、恶性疟原虫或 沙眼衣原体。
13.如权利要求12所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述传染病抗原来自甲肝病毒、 乙肝病毒或丙肝病毒。
14.如权利要求1-13中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述李斯特菌属细菌 属于单核细胞增生性李斯特菌种。
15.如权利要求1-14中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌 在细胞至细胞的传播、进入非吞噬细胞、增殖或DNA修复的一个方面或多个方面减弱。
16.如权利要求15所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述李斯特菌通过以下方式中的 一种或多种方式被减毒a.actA 突变；b.inlB 突变；c.uvrA 突变；d.uvrB 突变；e.uvrC 突变；f.核酸靶向的化合物；或g.uvrAB突变和靶向核酸的化合物。
17.如权利要求16所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述靶向核酸的化合物是补骨脂ο
18.如权利要求1-14中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌的核酸通过 与和该核酸直接反应的靶向核酸的化合物反应而得到修饰，从而减弱所述细菌的增殖。
19.如权利要求1-14中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌包含减弱经 修饰细菌增殖的核酸交联物。
20.如权利要求1-14中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌包含减弱所 述细菌增殖的补骨脂素-核酸加合物。
21.如权利要求18-20中任一项所述重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌还包含减弱 所述细菌修复其经修饰核酸能力的基因突变。
22.如权利要求21所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌包含actA、inlB、uvrA 和uvrB中的失活突变；并且其中已通过补骨脂素-核酸交联物减弱所述细菌的增殖。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-22中任一项所述的重组李斯特 菌属细菌以及药学上可接受的赋形剂、佐剂和共刺激分子中一种或多种。
24.如权利要求23中所述的药物组合物，其中所述组合物还包含治疗剂。
25.一种在宿主中诱导针对非李斯特菌抗原的免疫应答的方法，所述方法包括对所述 宿主施用有效量的组合物，所述组合物含有重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌包含(a)编码I^fA*突变体多肽的多核苷酸；和(b)重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含(i) PrfA应答调控元件；和( )编码异源多肽的多核苷酸，其中所述编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于所述PrfA应答调控元件，并且其中所述异源多肽包含所述抗原。
26.一种在宿主中增强非李斯特菌抗原的免疫原性的方法，所述方法包括对所述宿主 施用有效量的组合物，所述组合物含有重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌包含(a)编码I^fA*突变体多肽的多核苷酸；和(b)重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含(i) PrfA应答调控元件；和( )编码异源多肽的多核苷酸，其中所述编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于所述PrfA应答调控元件，其中所述异源多肽包含所述抗原。
27.一种预防或治疗宿主中非李斯特菌的传染病症或癌性病症的方法，所述方法包括 对所述宿主施用有效量的组合物，所述组合物含有重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特 菌属细菌包含(a)编码I^fA*突变体多肽的多核苷酸；和(b)重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含(i) PrfA应答调控元件；和( )编码异源多肽的多核苷酸，其中所述编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于所 述PrfA应答调控元件。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述I^rfA*突变体多肽包含选自 Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S 和 S183A 的突变。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述I^rfA*突变体多肽包含G155S突变。
30.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸编码融合蛋白，该 融合蛋白包含信号肽和所述异源多肽。
31.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述prfA应答调控元件选自hly启 动子、PlcA启动子、plcB启动子、mpl启动子、hpt启动子、inlC启动子、inlA启动子、inlB 启动子、PrfA启动子和actA启动子。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述prfA应答调控元件是actA启动子。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述信号肽是选自单核细胞增生性李斯特菌的 ActA信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的LLO信号肽、乳酸乳球菌的Usp45信号肽、炭疽杆 菌的保护抗原信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的P60信号肽、枯草杆菌的W10D信号肽、 secA2信号肽和Tat信号肽的信号肽。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述信号肽是单核细胞增生性李斯特菌的ActA信 号肽。
35.如权利要求30所述的方法，其中所述融合蛋白包含ActA的前100个氨基酸。
36.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述异源多肽是非细菌的。
37.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述异源多肽包含选自肿瘤相关抗 原、肿瘤相关抗原衍生的多肽、传染病抗原和传染病抗原衍生的多肽的抗原。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述异源多肽是选自K-Ras、H-Ras、N-Ras、 12-K-I as、间皮素、PSCA、NY-ESO-U WT-1、存活素、gplOO、PAP、蛋白酶 3、SPAS-U B-raf, 酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-I、bcr/abl、Her-2/neu、α 甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT (端粒酶)、PSA和CEA的抗原，或者包含选自K_I as、H-I as、N-I as、12-K_I as、间皮素、 PSCA, NY-ESO-U WT-1、存活素、gplOO、PAP、蛋白酶 3、SPAS-U B_raf、酪氨酸激酶、mdm_2、 MAGE、RAGE、MART-I、bcr/abl、Her-2/neu、α 甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT (端粒酶)、PSA 和CEA的抗原衍生的多肽。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述传染病抗原来自病毒或异源传染病病原体， 该病毒或异源传染病病原体选自肝炎病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒、单 纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、巨细胞病毒、结核分枝杆菌、恶性疟原虫或沙眼衣原体。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述传染病抗原来自甲肝病毒、乙肝病毒或丙肝 病毒。
41.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述李斯特菌属细菌属于单核细胞 增生性李斯特菌种。
42.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述李斯特菌在细胞至细胞的传播、 进入非吞噬细胞、增殖或DNA修复的一个方面或多个方面减弱。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述李斯特菌通过以下方式中的一种或多种方式 被减毒a.actA 突变；b.inlB 突变；c.uvrA 突变；d.uvrB 突变；e.uvrC 突变；f.核酸靶向的化合物；或g.uvrAB突变和靶向核酸的化合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述靶向核酸的化合物是补骨脂素。
45.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述细菌的核酸通过与该核酸直接 反应的靶向核酸的化合物反应而得到修饰，从而减弱所述细菌的增殖。
46.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述细菌包含减弱经修饰细菌增殖 的核酸交联物。
47.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述细菌包含减弱所述细菌增殖的 补骨脂素-核酸加合物。
48.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述细菌还包含减弱所述细菌修复 其经修饰核酸能力的基因突变。
49.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述细菌包含actA、inlB、uvrA和 uvrB的失活突变；并且其中已通过补骨脂素-核酸交联物减弱所述细菌的增殖。
50.如权利要求25或沈所述的方法，其中所述免疫应答包括先天免疫应答。
51.如权利要求25或沈所述的方法，其中所述免疫应答包括适应性免疫应答。
52.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌属细菌与佐剂和/ 或共刺激分子一起施用。
53.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌属细菌与治疗剂 联合施用。
54.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌属细菌的施用反 复进行。
55.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中在所述李斯特菌属细菌的第一次施 用之后约2周后，重复所述重组李斯特菌属细菌的第二次施用。
56.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中在所述重组李斯特菌属细菌施用后， 施用疫苗，该疫苗不含有活的、具有代谢活性的李斯特菌并且编码所述非李斯特菌抗原。
57.一种增强哺乳动物中针对非李斯特菌抗原的免疫应答的方法，所述方法包括对所 述哺乳动物施用有效加强剂量的编码所述非李斯特菌抗原的权利要求1-22中任一项所述 的重组李斯特菌，其中所述哺乳动物此前已被施用有效初免剂量的提供所述非李斯特菌抗 原的疫苗，其中(a)所述疫苗不含有活的、具有代谢活性并且编码所述非李斯特菌抗原的李斯特菌；和(b)所述疫苗含有编码所述非李斯特菌抗原的裸露DNA。
58.如权利要求沈所述的方法，其中针对所述抗原的免疫原性相对于下述抗原的免疫 原性得到增强该抗原由含有所述编码异源多肽的多核苷酸的重组李斯特菌属细菌诱导， 其中所述编码异源多肽的多核苷酸的表达受到野生型I^rfA多肽的控制。
59.如权利要求沈所述的方法，其中增强的免疫原性包括MCP-I、IL-6、IFN-Y ,TNFa 或IL-12p70的一种或任意组合的表达增加。
60.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述宿主是人。
61.一种制备重组李斯特菌属细菌的方法，所述方法包括在李斯特菌属细菌中稳定地 引入编码异源多肽的重组多核苷酸，其中所述李斯特菌属细菌包含编码I^fA*突变体多肽的多核苷酸；和，其中所述异源多肽是非细菌的；和，其中在引入到所述李斯特菌属细菌中之后，所述编码异源多肽的重组多核苷酸可操纵 地连接于I^fA应答调控元件。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述重组多核苷酸包含与所述异源多肽可操纵地 连接的所述I^rfA-应答调控元件。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述重组多核苷酸编码融合蛋白，该融合蛋白包 含信号多肽和所述异源多肽。
64.如权利要求61所述的方法，其中所述编码异源多肽的重组多核苷酸整合在所述李 斯特菌染色体中。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述编码异源多肽的重组多核苷酸整合在所述李 斯特菌染色体的因中。
66.如权利要求63所述的方法，其中所述信号多肽是ActA信号多肽，并且其中，所述编 码异源多肽的重组多核苷酸被引入所述李斯特菌的actA基因中。
67.一种制备重组李斯特菌属细菌的方法，其中将(a)编码突变体多肽的重组多核苷酸，和(b)编码异源多肽的重组多核苷酸，稳定地引入李斯特菌属细菌中，其中所述李斯特菌属细菌包含非功能性PrfA等位基因，并且其中在引入所述编码异源多肽的重组多核苷酸之后所述核酸可操纵地连接于I^rfA 应答调控元件。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述编码异源多肽的重组多核苷酸可操纵地连接 于ft^A-应答调控元件。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述重组多核苷酸编码融合蛋白，该融合蛋白包 含信号多肽和所述异源多肽。
70.如权利要求67所述的方法，其中所述编码I^rfA*突变体多肽的重组多核苷酸整合 在所述李斯特菌染色体中。
71.如权利要求67所述的方法，其中所述编码异源多肽的重组多核苷酸整合在所述李 斯特菌染色体中。
72.如权利要求70所述的方法，其中可操纵地连接于I^rfA-应答调控元件的所述编码 异源多肽的重组多核苷酸整合在所述李斯特菌染色体的tRNA"g基因中。
73.如权利要求69所述的方法，其中所述信号多肽是ActA信号多肽，并且其中将编码 异源多肽的所述核酸引入到所述李斯特菌的actA基因中。
全文摘要
本发明提供了重组李斯特菌，所述重组李斯特菌组成型表达PrfA并且包含编码例如肿瘤或传染剂抗原的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操纵地连接于PrfA应答调节剂。本发明提供了用于诱导或加强免疫应答和/或疾病治疗的利用李斯特菌的方法和其组合物。本发明还提供了所述细菌的制备方法。
文档编号A61K39/12GK102076843SQ200980123864
公开日2011年5月25日 申请日期2009年5月18日 优先权日2008年5月19日
发明者D·G·布洛克斯泰德, J·斯库伯, P·M·劳尔, T·W·小杜本斯盖, W·S·小卢科特, W·汉森 申请人:艾杜罗生物科技公司