损伤组织的功能性再生促进药物的制作方法

专利名称：损伤组织的功能性再生促进药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及损伤组织的功能性再生促进药物。
背景技术：
近年来，已明了损伤组织的修复过程中有各种干细胞参与，通过将大量的干细胞 动员到损伤部位来诱导功能性组织再生的新的再生医疗技术的开发也在不断地进行。为了 使该新的再生医疗技术成为现实，需要1)体内存在丰富的可动员到损伤部位的干细胞、2) 将干细胞动员到损伤部位的因子得以分离、鉴定。可动员到损伤部位的干细胞有存在于损伤部位或其附近组织的组织干细胞和存 在于末梢血中的骨髓来源的干细胞。近年来，不断报告了骨髓来源的细胞参与多种损伤组 织的再生，但对于将骨髓来源的细胞动员到损伤组织的机制并不清楚。这里所说的骨髓来 源的细胞与具有分化为血液细胞(白细胞、红细胞)的能力的造血系干细胞不同，其包括目 前以被称为骨髓间充质干细胞的细胞为代表的干细胞或者存在于骨髓中的组织祖细胞团。 骨髓间充质干细胞是具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力的未分化干细胞，还 能够分化为成纤维细胞、肌肉细胞、基质细胞、肌腱细胞等其他的间充质的细胞。近年来已 证明骨髓间充质干细胞能够分化为神经细胞、以及能够分化为上皮细胞(皮肤角质形成细 胞等)或血管内皮细胞(非专利文献1)。组织祖细胞被定义为具有单方向性地分化为除血 液系统以外的特定组织细胞的能力的未分化细胞，包括具有分化为上述间充质组织、上皮 组织、神经组织、实质器官、血管内皮的能力的未分化细胞。已知SlOO蛋白质家族包括约20种蛋白质，这些蛋白质主要存在于细胞质内，但其 中一部分被分泌到细胞外，在组织损伤时或皮肤癌、炎症时担负着各种各样的功能。另外， 这些蛋白质在皮肤的表皮细胞的分化方面也担负着重要的作用。特别是S100A8和S100A9 已知其表达在皮肤损伤约1周后被强烈地诱导(非专利文献2)。S100A8/A9 ( = MRP-8/14) 异源二聚体与肝素具有亲和性(非专利文献幻。S100A8、S100A9和S100A8/A9异源二聚体 具有诱导中性粒细胞迁移到炎症部位的活性(非专利文献4)。以往一直认为，脑或脊髄的中枢神经细胞一旦受到伤害就无法再生。但是，近年来 神经干细胞的存在及其诱导成为可能。另外，正常神经系统中的神经干细胞生态位也得以 鉴定。因此，已可期待一直认为不可能恢复的损伤中枢神经系统细胞能够恢复。目前，已开 展了关于针对脑脊髄损伤、退行性疾病等的神经再生的研究。脑组织(细胞)损伤的原因主要是外伤引起的脑挫伤、脑缺血性疾病。作为其他 的原因，可列举出以脑肿瘤摘除手术为代表的脑外科手术所造成的损伤。特别是完全摘除 例如从脑实质细胞发生的神经胶质瘤是因难的，为了避免运动或语言功能障碍，不得不选 择部分地进行摘除。另外，恶性神经胶质瘤的生存预后不良，从化学疗法或放射疗法到近年 来研究热门的免疫、基因治疗均没有显示充分的效果。因此，理想的是有能够摘除尽可能多 的肿瘤细胞并使其所导致的脑功能损伤恢复的治疗。现有技术文献
3
非专利文献非专利文献1非专利文献2非专利文献3 2001 Nov 26.非专利文献4 :Ryckman 等、J Immunol. 2003 Mar 15 ； 170 (6) :3233-42.

发明内容
本发明所要解决的课题本发明的课题在于提供分离、鉴定将分化为损伤组织的细胞动员到损伤部位的因 子、利用了该因子的发明。用于解决课题的手段如果清楚了分化为损伤组织的细胞的动员因子，则通过将该因子给药到体内，即 能够将存在于末梢血中的能够分化为损伤组织的细胞或存在于局部组织的分化为损伤组 织的细胞大量地动员到损伤部位，从而能够开发出促进功能性组织再生的新的再生医疗技 术。本发明的发明人研究了在移植皮片植入活体组织的过程中骨髓来源的细胞从皮 肤外组织被动员到移植皮片中并参与皮肤组织再生的可能性，并在世界上首次阐明了 1)骨髓来源的细胞被大量地动员到移植皮肤内；幻被动员的骨髓来源的细胞在移植皮片 内能够分化为真皮成纤维细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、血管内皮细胞、表皮角化细胞，被动 员的骨髓来源的细胞中包括骨髓来源的间充质干细胞；；3)将骨髓来源的间充质干细胞从 末梢血动员到植皮片中的是从移植皮肤的坏死组织释放出的S100A8、S100A9 ；4)纯化的 S100A8、S100A9能够促进从骨髓中分离、培养的间充质干细胞的迁移。本申请基于这些认 识，提供以下的发明。〔1〕一种骨髓细胞的诱导剂，其含有以下的(a) (f)中的任一项记载的成分；(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。〔2〕一种组织再生促进剂，其含有以下的(a) (f)中的任一项记载的成分；(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。〔3〕一种将骨髓细胞诱导到损伤的组织中的方法，其包含将以下的(a) (f)中的
:ffu Y 等、Stem Cells. 200725(10) :2648-2659.
=Eckert RL 等、J Invest Dermatol. 2004 Jul; 123(1) :23-33.
=Robinson MJ等、J Biol Chem. 2002 Feb 1 ；277(5) :3658-65. Epub任一项记载的物质给予所述组织受到损伤的对象的工序；(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。〔4〕一种促进损伤的组织再生的方法，其包含将以下的(a) (f)中的任一项记载 的物质给予所述组织受到损伤的对象的工序；(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。〔5〕以下的(a) (f)中的任一项记载的物质在制造骨髓细胞的诱导剂中的用 途；(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。〔6〕以下的(a) (f)中的任一项记载的物质在制造组织再生促进剂中的用途；(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。〔7〕以下的(a) (f)中的任一项记载的物质，其用在将骨髓细胞诱导到损伤的组 织的方法中；(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。〔8〕以下的(a) (f)中的任一项记载的物质，其用在促进损伤的组织再生的方法
5中；(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。


图1为表示GFP骨髓移植小鼠的制作方法的图。图2为表示在GFP骨髓移植小鼠背部进行皮肤移植后观察到的移植皮片的GFP荧 光聚集的照片。左照片(A)使用DAPI对核进行了染色。中央的照片(B)的绿色荧光色表 示植皮部位聚集的GFP阳性骨髓来源的细胞。右照片(C)是将照片(A)与照片(B)重叠后 得到的图。骨髓来源的细胞重构了皮肤组织。图3为表示从切除皮片提取再生诱导因子的方法的图。图4为表示使用了 boyden小室测定的皮肤提取液的骨髓来源的间充质干细胞迁 移能力的活性测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行染色而得到的图 像，所述骨髓间充质干细胞从boyden小室的上槽内通过具有8 μ m的微孔的聚碳酸酯膜的 微孔迁移到含有皮肤提取液的下槽侧并附着于膜下槽侧。向下层中加入从2日龄小鼠和6 周龄小鼠采集的皮肤的提取液。图5为用Wfestern blot法确认皮肤提取液中的S100A8、S100A9蛋白质的存在情 况的照片。图6为表示从肝素亲和层析柱Ofeparin affinity column)利用NaCl浓度梯度 将皮肤提取液中的Heparin结合蛋白洗脱的结果的照片。将各级分的蛋白质用SDS-PAGE 进行分离并用银染色进行检测。图7为表示使用了 boyden小室测定的皮肤提取液的骨髓来源的间充质干细胞迁 移能力的活性测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行染色而得到的图 像，所述骨髓间充质干细胞从boyden小室的上槽内通过膜上的微孔迁移到皮肤提取液的 肝素结合的各分级(下槽侧)中并附着于膜下槽侧。图8为表示使用Western blot法检测皮肤提取液的肝素结合的各分级中的 S100A8、S100A9蛋白质的存在情况的结果的照片。图9为S100A8、S100A9表达载体的图。图10为表示使用了 boyden小室测定的皮肤提取液的骨髓来源的间充质干细胞迁 移能力的活性测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行染色而得到的图 像，所述骨髓间充质干细胞从boyden小室的上槽内通过膜上的微孔迁移到分别含有重组 GST-S100A8、GST-S100A9、皮肤提取液的下层侧并附着于膜下槽侧。图IlA为从小鼠的尾静脉给予GST-S100A8、GST-S100A9，然后对12小时后末梢血 中的CD45阴性细胞的级分进行CD44、PDGFRa、PDGFR3的FACS而得到的图。另外，图IlB 为用柱形图表示CD45阴性细胞群中的各细胞群的比例的图，左图表示CD44阳性、PDGFRa
6阳性的细胞群，右图表示⑶44阳性、PDGFRii阳性的细胞群。图12为表示S100A8对正常小鼠的皮肤溃疡治疗效果的图。图13为表示S100A8对糖尿病小鼠的皮肤溃疡治疗效果的图。
具体实施例方式本发明提供一种骨髓细胞的诱导剂，其含有以下的(a) (f)中记载的成分中的 至少一种成分。(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。通过使用该诱导剂，能够将骨髓来源的细胞诱导到局部(上述成分的给予、添加 部位或其附近、或者损伤部位)从而促进组织的功能性再生，因此该诱导剂能够用作用来 开发再生医疗技术、再生诱导药物的基础研究和临床研究所需的试剂。例如，能够研究将 骨髓来源的细胞动员到实验动物的需要的活体组织中以进行组织修复、组织功能再建的程 度。另外，还能够在试管内研究骨髓来源的细胞的动员所产生的组织再生诱导。另外，通过使用上述诱导剂，能够促进损伤组织的再生。另外，对于上述诱导剂，不 仅能够期待其作为功能性组织再生诱导、促进剂的用途，还能够期待其预防组织干细胞的 减少所造成的组织、器官功能降低的、即作为所谓的预防药物的用途、或者延缓年龄增长性 变化的进行的、即作为抗衰老药物的用途。本发明的诱导剂含有用来将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂，所述药剂含 有以下的(a) (f)中的任一项记载的成分。(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。将上述药剂给予血管或肌肉。用来将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中的药剂的特征在于，通过给予到血管或肌 肉，将骨髓细胞从骨髓动员到末梢血中。被动员到末梢血中的骨髓细胞从末梢血中被诱导 到损伤组织。因此，通过使用该药剂，能够将骨髓细胞诱导到损伤部位，从而促进组织的功能性 再生，因此该药剂能够用作用来开发再生医疗技术、再生诱导药物的基础研究和临床研究 所需的试剂。另外，通过使用上述药剂，能够促进损伤组织的再生。特别是通过将上述药剂给予 血管或肌肉从而将骨髓来源的细胞诱导到损伤部位，使得能够在从外部难以直接给予药剂的脑的组织损伤或心脏的组织损伤中促进组织的功能性再生。本发明还提供一种组织再生促进剂或组织再生促进用试剂盒，其含有以下的 (a) (f)中记载的成分中的至少一种成分。(a)S100A8 蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9 蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。该组织再生促进剂或组织再生促进用试剂盒的特征在于，通过将其给予损伤组织 部位或其附近、血管或者肌肉，从而将在血液中循环的骨髓来源的细胞从末梢血中诱导到 该损伤组织(局部诱导)。另外，作为组织再生促进用试剂盒，可例示出含有(1)溶解在纤维蛋白原中的上 述成分和(2)凝血酶的组织再生促进用试剂盒、或者含有(1)上述成分、( 纤维蛋白原 和( 凝血酶的组织再生促进用试剂盒。在本发明中，可以使用市售的纤维蛋白原和凝 血酶。例如，可列举出纤维蛋白原 HT-Wf (Benesis-Mitsubishi Pharma)、Beriplast (ZLB Behring)、Tisseel (Baxter)、Bolheal (化血研)、TachoComb (ZLB Behring)，但并不限定于 这些。作为可再生的组织，没有特殊限制，只要是损伤的组织，则任何组织均可，例如可 例示出活体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾 脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸或血液等)。特别是由于本发明的药剂可使从体外难以直接给予 药剂的组织(脑、心脏等)再生，因此可有效地被利用。被动员到损伤组织的骨髓来源的细胞通过分化为各种细胞来参与损伤组织的功 能性再生和功能维持、功能强化。在本发明中，作为损伤组织，可列举出由引起缺血、灌注不 足/缺氧状态的各种病理状态、外伤、烧伤、炎症、自身免疫、基因异常等而导致的损伤的组 织，但并不限定于这些原因。另外，损伤组织也包括坏死组织。作为本发明的组织，只要是骨髓来源的细胞能够分化的组织，则没有特殊限制，例 如可例示出皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织、脂肪组织、心肌组织、神经系统组织、肺 组织、消化道组织、肝/胆/胰组织、泌尿/生殖器等生物体内的所有组织。另外，通过使用 上述组织再生促进剂，难治性皮肤溃疡、皮肤创伤、水疱症、脱发症等皮肤疾病就不用说了， 在脑梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、胃溃疡、肠炎等组织损伤中，诱导功能性组织再生的治 疗也是可能的。作为可给予上述组织再生促进剂的动物种，可列举出人或非人动物，例如可 例示出人、小鼠、大鼠、猴、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠等，但并不限定于这些。另外，本发明的药剂还可以给予糖尿病患者。已知作为糖尿病的皮肤并发症的难 治性皮肤溃疡比正常人的皮肤溃疡更难以治愈，但本发明的药剂可有效地用于这样的糖尿 病患者。本发明的骨髓细胞为除造血系干细胞和其来源的白细胞、红细胞、血小板以外的 细胞，目前包括以被称为骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的细 胞为代表的干细胞或者存在于骨髓中的组织祖细胞团。作为本发明的骨髓细胞，为能够通CN 102076351 A
说明书
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过骨髓采集(骨髓细胞采集)或者末梢血采集来进行分离的细胞。造血系干细胞为非附 着细胞，本发明的骨髓细胞可以以附着细胞的形式如下获得通过对从骨髓采集(骨髓细 胞采集)、末梢血采集获得的血液中的单核细胞级分进行培养而获得。另外，本发明的骨髓 细胞包括间充质干细胞，并优选具有分化为成骨细胞(诱导分化可通过观察钙的沉积来识 别)、软骨细胞(可通过阿辛蓝染色阳性、番红-ο染色阳性等来识别)、脂肪细胞(可通过 苏丹III染色阳性来识别)，进一步优选具有分化为成纤维细胞、平滑肌细胞、基质细胞、肌 腱细胞等间充质细胞，更进一步优选具有分化为神经细胞、上皮细胞(例如表皮角化细胞、 肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、血管内皮细胞的能力，分化后的细胞并不限定于上述 细胞，也包括分化为肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞的能力。在本发明中，骨髓来源的间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞 是指存在于骨髓内的细胞，其能够从骨髓直接采集或者从其他组织(血液、皮肤、脂肪或其 他组织)间接地采集并作为附着于(塑料或者玻璃制)培养皿的细胞进行培养、增殖，其为 具有分化为骨、软骨、脂肪等间充质组织(间充质干细胞)、或者分化为骨骼肌、心肌、甚至 分化为神经组织、上皮组织(多能干细胞)的能力这样的特征的细胞，其可以通过骨髓血采 集、末梢血采集、甚至通过采集脂肪等间充质组织、皮肤等上皮组织、脑等神经组织来获得。 另外，骨髓来源的间充质干细胞或骨髓来源的多能干细胞或骨髓多能干细胞还具有下述特 征通过将一度附着于培养皿的这些细胞给予生物体的损伤部位，具有分化为例如构成皮 肤的角质形成细胞等上皮组织、构成脑的神经系统的组织的能力。本发明的骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞除了具有 分化为成骨细胞(诱导分化可通过观察钙的沉积等来识别)、软骨细胞(可通过阿辛蓝染色 阳性、番红-0染色阳性等来识别)、脂肪细胞(可通过苏丹III染色阳性等来识别)的能力 外，优选具有分化为例如成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充 质细胞、神经细胞、色素细胞、表皮细胞、毛囊细胞(表达细胞角蛋白家族、毛发角蛋白家族 等)、上皮细胞(例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族等)、内皮细胞，并 进一步优选具有分化为肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞的能力，但分化后的细胞并不限定 于上述细胞。另外，人骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞可例示出可 通过骨髓采集(骨髓细胞采集)、末梢血采集、脂肪采集直接获得或者通过将单核细胞级分 分离后进行培养而以附着细胞的形式获得的细胞，对此并没有限制。作为人骨髓间充质干 细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的标记，可例示出Lin阴性、CD45阴性、CD44 阳性中的全部或一部分，但并不限定于这些。另外，小鼠骨髓间充质干细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞可例示出 例如可通过实施例中记载的方法获得的细胞，但对此并没有限制。作为小鼠骨髓间充质干 细胞或骨髓间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的标记，可例示出CD44阳性、PDGFRα阳性、 PDGFRii阳性、⑶45阴性、Lin阴性、Sca-I阳性、c_kit阴性中的全部或一部分，但并不限定 于这些。组织祖细胞被定义为具有单方向性地分化为除血液系统以外的特定组织细胞的 能力的未分化细胞，包括具有分化为上述的间充质组织、上皮组织、神经组织、实质器官、血 管内皮的能力的未分化细胞。
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在本发明的诱导剂和本发明的组织再生促进剂中，作为除上述(a) (f)中记载 的成分中的至少一种成分以外的成分，只要不阻碍骨髓来源的细胞的诱导或组织再生促 进，则没有特殊限制。例如，本发明的组织再生促进剂中除了上述(a) (f)中记载的成分 中的至少一种成分以外，还可以含有强化S100A8或S100A9的功能性组织再生诱导功能的 相关分子(群)，抑制除S100A8或S100A9的期待的效果以外的作用的分子(群)，控制骨 髓来源的细胞的增殖或分化的因子，强化、维持这些因子或细胞的功能的其他因子。作为本发明的诱导剂或组织再生促进剂中的S100A8或S100A9蛋白质的来源的动 物种，可列举出人或非人动物，可例示出例如人、小鼠、大鼠、猴、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠等，优 选为与上述成分所给予的动物种相同的动物种。作为本发明的诱导剂或组织再生促进剂中的S100A8蛋白质，可例示出包含序列 号1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的S100A8蛋白质中 也包括与包含序列号1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为 这样的蛋白质，可列举出例如1)由在序列号1、3或5中记载的氨基酸序列中替换、缺失、 插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成，且与包含序列号1、3或5中 记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2)为由与包含序列号2、 4或6中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质，且与包含序列 号1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。作为本发明的诱导剂或组织再生促进剂中的S100A9蛋白质，可例示出包含序列 号7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的S100A9蛋白质 中还包括与包含序列号7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。 作为这样的蛋白质，可列举出例如1)由在序列号7、9或11中记载的氨基酸序列中替换、 缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成，且与包含序列号7、9 或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2、为由与包含序 列号8、10或12中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质，且与 包含序列号7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。与包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经 分离的蛋白质可以为包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质的同源物 或者旁系同源物。对于与包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功 能上等同的蛋白质，本领域技术人员可通过公知的方法(実験医学别册·遺伝子工学〃 > K ” ”，ppM6-251、羊土社、1991年発行)来分离。作为与包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同 的蛋白质，可列举出具有骨髓来源的细胞的诱导活性的蛋白质。由在序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加 1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨 基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质包括天然存在的蛋白质。一般来说，如通过干扰 素基因等所已知的，真核生物的基因具有多态性(polymorphism)。根据该多态性所产生的 碱基序列的变化的不同而不同，有时1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加。属 于这样自然存在的蛋白质且具有在序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列中替换、 缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、并且与由序列号1、3、5、7、9
10或11中记载的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等同的蛋白质也包括在本发明的S100A8 或S100A9蛋白质中。另外，只要是与由序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列构成的蛋白质在 功能上等同的蛋白质，则人为制作的变异蛋白质也包括在本发明中。作为对给定的碱基序 列施加随机变异的方法，已知例如通过DNA的亚硝酸处理的碱基对的替换(Hirose，S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,79 :7258-7260,1982) 该方法中，通过对欲导入变异的片 段进行亚硝酸处理，能够在特定的片段中随机地导入碱基对的替换。或者另外，作为在任意 位点导入目标变异的技术，有 gapped duplex 法等(Kramer W. andFritz HJ.，Methods in Enzymo 1.，154 :350-367,1987)。将克隆要导入变异的基因而得到的环状双链载体分成单 链，使其与在目标部位具有变异的合成寡核苷酸杂交。使被限制性内切酶切断而形成线状 的载体来源的互补单链DNA与上述环状单链载体黏着(anneal)，用DNA聚合酶填充该载体 与上述合成核苷酸之间的间隙，进而通过连接形成完整的双链环状载体。所改变的氨基酸的数目典型地为50个氨基酸以内、优选为30个氨基酸以内、进一 步优选为5个氨基酸以内(例如1个氨基酸)。在人为地替换氨基酸的情况下，如果替换为性质相似的氨基酸，则容易维持原蛋 白质的活性。本发明的蛋白质包括在上述氨基酸替换中进行保守性替换而得到的蛋白质， 且与包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。 在替换对于蛋白质活性来说重要的区域的氨基酸等情况下，保守性替换是重要的。这样的 氨基酸的保守性替换对于本领域技术人员来说是熟知的。作为相当于保守性替换的氨基酸的组，可列举出例如碱性氨基酸(例如赖氨酸、 精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性氨基酸(例如甘 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏 氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等。另外，通过非保守性替换也能够使蛋白质的活性等进一步提高(包括例如恒定的 活化型蛋白质(constitutively activated proteins)等)。作为获得与包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上 等同的蛋白质的其他方法，可列举出利用杂交反应的方法。即，将编码如序列号2、4、6、8、 10或12所示的本发明的S100A8或S100A9蛋白质的DNA或其断片制成探针，分离能够与其 杂交的DNA。若在严格的条件下实施杂交反应，则能够选择同源性高的DNA作为碱基序列， 其结果是分离的蛋白质含有与S100A8或S100A9蛋白质在功能上等同的蛋白质的可能性增 加。同源性高的碱基序列是指能够显示例如70%以上、优选90%以上的相同性。另外，严格的条件具体地是指例如在6XSSC、40%甲酰胺、25°C下进行杂交、且在 1XSSC、55°C下进行洗涤的条件。严格性受盐浓度、甲酰胺的浓度或温度等条件的影响，但 只要是本领域技术人员，就能够设定这些条件以获得所需的严格性。通过利用杂交，能够将编码例如除包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸 序列的蛋白质以外的S100A8或S100A9蛋白质的同源物的DNA分离。与包含序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋 白质通常与序列号1、3、5、7、9或11中记载的氨基酸序列具有高的同源性。高的同源性是
11指至少30%以上、优选50%以上、进一步优选80%以上(例如95%以上)的序列具有相同 性。关于碱基序列或氨基酸序列的相同性，可以利用使用了网络的同源性检索网站来进行 [例如在日本DNA数据库(DDBJ)中，可以利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST和SSEARCH等同源 性检索[例如日本DNA数据库(DDBJ)网站上的同源性检索Search and Analysis)的网 页:http://www. ddbj. nig. ac. jp/E-mail/homology-j. html]。另夕卜，在 National Center for Biotechnology Information (NCBI)中，还可以进行使用了 BLAST 的检索(例如 NCBI 的 主页网站的 BLAST 网页http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ ；Altschul，S. F. et al.， J. Mol. Biol.，1990，215 (3) :403-10 ；Altschul，S. F. & Gish，W. ,Meth. Enzymo 1.，1996，266 460-480 ；Altschul,S.F.et al.，Nucleic Acids Res.，1997，25 :3389-3402)]。例如，在使用Advanced BLAST 2. 1中的氨基酸序列的相同性的计算中，相同性 (identity)的值(％)可以如下进行检索来得到程序使用blastp，将Expect值设定为10、 将 Filter 全部设定为 0FF，Matrix 使用 BL0SUM62，并将 Gap existence cost,Per residue gap cost 和 Lambda ratio 分别设定为 11、1、0. 85 (缺省值)(Karlin，S. and S. F. Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-68 ；Karlin, S. and S. F. Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-7)。本发明的蛋白质或在功能上与其等同的蛋白质可以是进行了糖链等生理性修饰、 荧光或放射性物质等标记或者与其他蛋白质的融合等各种修饰而得到的蛋白质。特别是在 后文所述的基因重组体中，糖链的修饰可能因用于表达的宿主的不同而产生差异。但是，即 使在糖链的修饰方面存在差异，只要显示与本说明书中公开的S100A8或S100A9蛋白质相 同的性状，则均属于本发明的S100A8或S100A9蛋白质或在功能上等同的蛋白质。S100A8或S100A9蛋白质不仅可以从活体材料获得，而且可以通过将对其进行编 码的基因整合入适当的表达体系并制成基因重组体(recombinant)来获得。为了通过基因 工程技术获得S100A8或S100A9蛋白质，可以将上文所述的编码S100A8或S100A9蛋白质 的DNA整合入适当的表达体系并使之表达。作为本发明中可应用的宿主/载体体系，可举出 例如表达载体PGEX和大肠杆菌。由于pGEX可以使外来基因以与谷胱甘肽S-转移酶(GST) 的融合蛋白质的方式表达(Gene，67 :31_40，1988)，因此通过热激将整合了编码S100A8或 S100A9蛋白质的基因的pGEX导入BL21等大肠杆菌株中，在适当培养一段时间后，添加iso propylthio- β -D-galactoside (IPTG)以诱导 GST 融合 S100A8 或 GST 融合 S100A9 蛋白质 的表达。本发明的GST由于吸附于谷胱甘肽琼脂糖4B，因此表达产物能够容易地通过亲和 Mi/rfe (affinity column chromatography) j^M^^ito此外，作为用于获得S100A8或S100A9蛋白质的重组体的宿主/载体体系， 还可以采用下述的体系。首先，当利用细菌作为宿主时，市售的有利用了组氨酸标签 (hiStidine-tag)、HA标签(HA-tag)、FLAG(FLAG-tag)等的融合蛋白质的表达用载体。关于 酵母，已公知Pichia属酵母对于具有糖链的蛋白质的表达是有效的。从糖链的添加的角度 出发，还可以采用利用了以昆虫细胞为宿主的杆状病毒载体的表达体系(Bio/Technology， 6 :47-55,1988)。此外，还利用哺乳动物的细胞可以进行利用了 CMV、RSV或SV40等启动子 的载体的转染，这些宿主/载体体系均能够用作S100A8或S100A9蛋白质的表达体系。另 外，还可以利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等病毒载体来导入基因。得到的本发明的蛋白质可以从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，然后纯化成实质上纯且均一的蛋白质。蛋白质的分离、纯化可以使用在通常的蛋白质纯化中使用的 分离、纯化方法，没有任何限定。例如，可以适当选择、组合色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂 沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等 以对蛋白质进行分离、纯化。作为色谱法，可列举出例如亲和层析法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过 滤法、逆相色谱法、吸附层析法等(Marshak et al. ,Strategies forProtein Purification and Characterization :A Laboratory Course Manual. EdDaniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。这些色谱法可以使用液相色谱法例如HPLC、FPLC等液相色谱法 来进行。另外，本发明的蛋白质优选是实质上经纯化的蛋白质。这里，“实质上经纯化”是 指本发明的蛋白质的纯化度(本发明的蛋白质在蛋白质成分总体中的比例)为50%以上、 60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、100%或者接近100%。接近100%的 上限依赖于本领域技术人员的纯化技术和分析技术，例如为99. 999%,99. 99%,99. 9%,
99% 等。另外，只要是具有上述纯化度的蛋白质，则可以是通过任何纯化方法进行了纯化 的蛋白质，包括实质上经纯化的蛋白质。例如，可例示出通过适当选择或组合上述色谱柱、 过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳、透析、重结晶等方法而实质上纯化得到的蛋白质，但并不限定于这些。作为释放或分泌本发明的诱导剂或组织再生促进剂中的S100A8或S100A9蛋白质 的细胞，基本上体内所有的组织来源的细胞均可以。作为容易采集和培养的细胞，可例示出 成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和其来源的细胞株)，但并不限定于这些。另外，分 泌S100A8或S100A9蛋白质的细胞也可以通过将下述载体导入成纤维细胞(例如正常皮肤 成纤维细胞和其来源的细胞株)等哺乳类细胞、昆虫细胞或其他细胞来制作，所述载体是 通过将编码310(^8或510(^9蛋白质的0嫩、或者通过将编码分泌信号的0嫩仏16 CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTACTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC ；序列号 15)结合到编码S100A8或S100A9蛋白质的DNA上而得到的DNA插入公知的表达载体或基 因治疗用载体而制作的。作为编码分泌信号的DNA，可例示出具有上述序列的DNA，但并不 限定于此。另外，这些细胞所来源的动物种没有特别限制，优选使用进行组织再生的对象动 物种的细胞、对象自身的细胞、或者与进行组织再生的对象具有血缘关系的动物来源的细 胞。编码本发明的诱导剂或组织再生促进剂中的S100A8或S100A9蛋白质的DNA只要 编码S100A8或S100A9蛋白质，则可以是CDNA、也可以是基因组DNA，另外，还可以是天然的 DNA或是人工合成的DNA。编码S100A8或S100A9蛋白质的DNA通常以插入到载体(例如 基因治疗用载体)的状态包含在本发明的诱导剂或组织再生促进剂中。作为本发明中的基因治疗用载体，可例示出质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载 体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体、仙台病毒包膜载体、乳头状瘤病毒载体 等，但并不限定于这些。该基因治疗用载体中还可以包括有效地诱导基因表达的启动子DNA 序列、控制基因表达的因子以及对于维持DNA的稳定性所需的分子。另外，本发明的诱导剂和本发明的组织再生促进剂中也含有属于S100A8或
13S100A9蛋白质的部分多肽且具有诱导骨髓来源的细胞的活性的多肽、分泌该部分多肽的细 胞或插入有编码该部分多肽的DNA的载体。关于本发明的诱导剂或组织再生促进剂的给予方法，可列举出经口给予法或非经 口给予法，作为所述的给予方法，具体地可列举出注射给予、经鼻给予、经肺给予、经皮给予 等。例如，可以通过血管内注射(动脉内注射、静脉内注射等)、肌肉内注射、腹腔内注射、皮 下注射等来全身(血中或肌肉中)或局部(例如皮下、皮内、皮肤表面、眼球或眼睑结膜、鼻 腔粘膜、口腔内和消化管粘膜、阴道/子宫内粘膜或者损伤部位等)地给予本发明的诱导剂 或组织再生促进剂。另外，可以根据患者的年龄、症状来选择适当的给予方法。当给予S100A8或 S100A9蛋白质时，例如每次给予可以在每Ikg体重在0. OOOOOOlmg IOOOmg的范围中选择 给予量。或者，可以例如在每位患者0. 00001 lOOOOOmg/body的范围内选择给予量。当 给予分泌S100A8或S100A9蛋白质的细胞或插入有编码S100A8或S100A9蛋白质的DNA的 基因治疗用载体时，可以按照S100A8或S100A9蛋白质在损伤组织中的量达到上述范围内 的方式给予。但是，本发明的诱导剂或组织再生促进剂并不限于这些给予量。本发明的诱导剂或组织再生促进剂可以按照常规方法制成制剂(例如 Remington' s Pharmaceutical Science， latest edition， Mark Publishing Company, Easton, U. S. A)，还可以同时含有医药上可容许的载体或添加物。可列举出例如表面活性 齐U、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑 剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并不限于这些，还可以适当使用其他常用的载体。具体而 言，可列举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素 钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、 明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯固化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机 盐类等。另外，上述的S100A8或S100A9蛋白质、分泌S100A8或S100A9蛋白质的细胞、插 入有编码S100A8或S100A9蛋白质的DNA的载体、S100A8或S100A9蛋白质的部分多肽、分 泌该部分多肽的细胞或者插入有编码该部分多肽的DNA的载体的用途还可以表示为下述 (1) ⑶。(1) 一种促进损伤的组织再生的方法，其包含将S100A8或S100A9蛋白质、分泌该 蛋白质的细胞、插入有编码该蛋白质的DNA的载体、该蛋白质的部分多肽、分泌该部分多肽 的细胞或者插入有编码该部分多肽的DNA的载体给予所述组织受到损伤的对象的工序。(2) 一种将骨髓细胞诱导到损伤的组织的方法，其包含将S100A8或S100A9蛋白 质、分泌该蛋白质的细胞、插入有编码该蛋白质的DNA的载体、该蛋白质的部分多肽、分泌 该部分多肽的细胞或者插入有编码该部分多肽的DNA的载体给予所述组织受到损伤的对 象的工序。(3) S100A8或S100A9蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、插入有编码该蛋白质的DNA的 载体、该蛋白质的部分多肽、分泌该部分多肽的细胞或者插入有编码该部分多肽的DNA的 载体在制造骨髓细胞的诱导剂或组织再生促进剂中的用途。(4) S100A8或S100A9蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、插入有编码该蛋白质的DNA的 载体、该蛋白质的部分多肽、分泌该部分多肽的细胞或者插入有编码该部分多肽的DNA的
14载体，其用于将骨髓细胞诱导到损伤的组织的方法中。(5)S100A8或S100A9蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、插入有编码该蛋白质的DNA的 载体、该蛋白质的部分多肽、分泌该部分多肽的细胞或者插入有编码该部分多肽的DNA的 载体，其用于促进损伤的组织再生的方法中。作为上述组织受到损伤的对象，可列举出人或非人动物，可例示出例如人、小鼠、 大鼠、猴、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠等，但并不限于这些。需要说明的是，本说明书中引用的全部现有技术文献被引入本说明书中以作为参 照。
实施例以下通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。〔实施例1〕目的评价体内移植皮肤组织功能性再生时的骨髓来源的细胞的参与情况方法为了上述目的通过以下的方法进行研究。1)利用植入GFP骨髓移植小鼠的活体皮肤移植系统，对移植皮片功能性再生时的 骨髓来源的细胞的参与程度进行研究。具体地，对C57BL/6雄性小鼠(6 8周龄)照射致 死量的放射线(IOGy)，随后通过尾静脉移植GFP(green fluorescent protein)转基因小鼠 来源的骨髓细胞(5 X IO6个/0. Iml生理性磷酸缓冲溶液pH7. 4)(图1)。2)待移植骨髓细胞植入(6周时间)后，在得到的GFP骨髓移植小鼠的背部皮肤上 移植新生小鼠皮肤(雌性)。3)待移植皮片植入和充分地皮肤组织再生G周时间)后，利用荧光立体显微镜观 察移植皮片区域的GFP荧光的聚集程度。4)通过活检在吸入麻醉下采集移植皮片，使用带冷却装置的切片机制作皮肤冷冻 切片(6μπι)，用4%多聚甲醛固定(30分钟)，将组织内细胞核用DAPI染色，使用含有荧光 漂白防止剂的封固剂将组织封固，然后利用激光共聚焦显微镜研究GFP阳性骨髓来源的细 胞是否存在。结果在植入GFP骨髓移植小鼠的活体皮肤移植系统中，再生的皮肤组织的表皮 角化细胞、真皮成纤维细胞、以及平滑肌细胞和脂肪细胞大多显示GFP荧光，其显示这些细 胞是骨髓来源的细胞(图幻。即，移植皮肤的功能性再生时所需的上皮和间充质细胞中很 多是通过骨髓来源的干细胞供给的。讨论以上结果启示，在皮肤损伤时骨髓细胞聚集到损伤部位，通过分化为构建皮 肤的各种器官来参与皮肤的功能性再生。另外，可以推测植皮皮片中存在使能够分化为各 种器官的骨髓细胞聚集的物质。据报告骨髓内存在造血系干细胞和间充质干细胞这两种干细胞系统。本次的研 究显示，很难推测出被大量动员到移植皮肤内的骨髓来源的上皮细胞和间充质细胞是由骨 髓来源的造血系干细胞供给的，其强烈启示骨髓来源的间充质干细胞可能参与移植组织的 功能性再生。即，推测从植皮后即处于灌注不足、坏死方向的移植皮肤组织释放出骨髓来源 的间充质干细胞动员因子，将来自骨髓的间充质干细胞通过末梢血液循环动员到移植皮片 内，从而诱导功能性皮肤组织再生。
〔实施例2〕目的皮肤组织提取液内存在的骨髓来源的组织干细胞诱导因子的鉴定方法为了鉴定被推测是从处于灌注不足状态的切除皮肤释放的骨髓间充质干细 胞动员因子，按照以下的方法进行研究。1)为了获得小鼠骨髓来源的间充质干细胞，从C57BL/6小鼠的大腿骨或下腿骨采 集小鼠的骨髓细胞，将含10%胎牛血清的D-MEM(Nacalai公司制)作为细胞培养培养基加 入细胞培养皿中，在37°C、二氧化碳气体浓度为5%的条件下进行培养。当细胞增值到其所 占的面积相对于培养皿底面积为70 100%时，用0. 25%胰蛋白酶ImMEDTA(Nacalai公司 制)将细胞从培养皿上剥离下来，再在相同的条件下进行传代培养。传代操作至少重复5 次以上。然后，将这些附着细胞分离培养，用流式细胞仪对细胞表面抗原进行分析，确认为 Lin阴性、⑶45阴性、⑶44阳性、Sca-I阳性、c-kit阴性。确认这些细胞能够分化为骨细 胞、脂肪细胞且具有骨髓间充质干细胞的性质。2)将从5只新生小鼠O日龄)获得的游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液 pH7.4(PBS) 5ml内，在4°C下进行M小时的孵育后，为了除去组织，在4°C的条件下以440G 离心10分钟，回收上清液，从而制作皮肤提取液。另外，同样地将从1只6周龄小鼠获得的 游离皮片浸渍到生理性磷酸缓冲液PH7. 4 (PBS) 5ml内，在4°C下孵育M小时后，为了除去组 织，在4°C的条件下以440G离心10分钟，回收上清液，从而制作皮肤提取液。3)为了确认获得的皮肤提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性，本发明人等使 用boyden小室对已形成细胞株的C57BL6小鼠骨髓来源的间充质干细胞迁移活性进行了研 究。具体而言，在boyden小室的下槽(容量为25 μ 1)中加入2日龄或6周龄小鼠的皮肤 提取液(5μ 1)与DMEMQOy 1)的混合液，置于具有8 μ m微孔的聚碳酸酯膜上，然后与该碳 酸酯膜相接地置于boyden小室上槽(容量为50 μ 1)，向其中加入骨髓来源的间充质干细 胞悬浮液(5Χ IO4个/50ml培养液DMEM/10%胎牛血清)，在(X)2培养箱内、在37°C下培养 4 M小时。培养后，将小室的上槽拿开，取出有机硅树脂薄膜，利用染色定量地研究通过 所述微孔迁移到小室下槽的骨髓来源的间充质干细胞的数量(图4)。4)各采集约2cm2的2日龄小鼠、6周龄小鼠的皮肤，在液氮中快速冷冻后，用研钵 粉碎。使用RNeasHQiagen)从这些样品中提取并纯化RNA。使用纯化的RNA利用微阵列技 术筛选在2日龄小鼠中更多地表达的mRNA。2日龄小鼠的2倍以上的得分高的基因有767 个。从这些基因中，研究与肝素亲和性高的蛋白质、具有分泌可能性的蛋白质、2日龄小鼠的 6倍以上的得分高的基因，结果存在上游第57个的基因即S100A9。这里，用Western blot 法检测S100A9和已知与S100A9形成异源二聚体的S100A8在2日龄皮肤提取液中的存在 情况。即，将2日龄皮肤提取液5μ1与SDS-PAGE sample buffer 5 μ 1 (Bio-fcid)混合， 在98°C下用加热块加热5分钟，然后冷却至25°C。将该样品施于12. 5%丙烯酰胺凝胶的 e-PAGEL(ATTO)上，用电泳装置(ATTO)以40mA电泳75分钟。回收电泳后的凝胶，用印迹装 置(blotting device) (ATTO)，将凝胶中的蛋白质转印到预先用100%甲醇处理的长7cm、 宽9cm的PVDF膜(Millipore)上。转印在120mA下进行75分钟。转印结束后回收PVDF 膜，在含4%脱脂乳的PBSfcacalai)中室温下振荡30分钟。然后，将回收的PVDF膜浸渍到 将抗S100A8抗体(R&D)或抗S100A9 (R&D) 5 μ 1用IOmL的含4%脱脂乳的PBS稀释得到的 液体中，室温下振荡60分钟。除去抗体液后，用30mL的含0. 1 % Tween 20的PBS将膜在室温下振荡洗涤5分钟。洗涤重复5次。洗涤后，将膜加入将HRP标记抗goat IgG抗体(GE healthcare) 5 μ 1用IOmL的含4%脱脂乳的PBS稀释而得到的液体中，在室温下振荡45分 钟。在除去抗体液后，用30mL的含0. 1% Tween 20的PBS将膜在室温下振荡洗涤5分钟。 洗涤重复5次。用ECL检测试剂盒(GE healthcare)使膜发光从而使胶片感光。利用显影 装置对胶片进行显影，得到S100A8和S100A9的蛋白质的信号(图5)。5)进行肝素亲和层析柱·色谱法以对皮肤提取液内的具有骨髓来源的间充质干 细胞动员活性的因子进行纯化。以下操作使用FPLC装置(GEhealthcare)进行。首先，将2 日龄小鼠皮肤提取液用4°C的9倍容积的20mM磷酸缓冲液pH7. 5稀释到10倍(稀释液A)。 预先使 20mM 磷酸缓冲液 pH7. 5 (300ml)流到 HiPr印 16/10 Heparin FF (GE Healthcare) 中使对柱平衡。然后，使稀释液A与柱结合。然后，用20mM磷酸缓冲液pH 7.5(300ml)对 柱进行洗涤。为了将吸附的蛋白质洗脱，制作(A液)20mM磷酸缓冲液pH 7. 5、IOmMNaCl与 (B液)20mM磷酸缓冲液pH 7. 5、500mMNaCl。起始以A液100%/B液为0%进行送液、缓缓 地增加B液的比例并最终以A液0% /B液为100%进行送液。总送液量为150mL。将洗脱 液每个3mL地分级到有机硅树脂涂覆的试管中。将分级的样品各5 μ 1与SDS-PAGE sample buffer 5 μ 1 (Bio-Rad)混合，在98°C下用加热块加热5分钟，然后冷却至25°C。将该样品 施于(5-20% graduent)丙烯酰胺凝胶的e-PAGEL (ATTO)上，用电泳装置(ATTO)以40mA电 泳75分钟。电泳后用Dodeca silver stain kit (Bio-Rad)检测电泳后的蛋白质(图6)。分别与上文同样地使用boyden小室评价经分级的样品的迁移活性(图7)。分别与上文同样地使用Wfestern blot法检测经分级的样品中S100A8和S100A9 蛋白质的存在情况(图8)。6)使用Trizol (invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用Superscript III cDNA synthesis kit (Invitrogen)合成 cDNA。将该 cDNA 作为模板，使用 PCR(聚合 酶链反应)法对S100A8和S100A9的cDNA进行扩增，将这些cDNA插入到哺乳类细胞的表 达蛋白质的质粒载体PCAGGS中，以使在氨基酸序列的N末端添加有GST tag的序列(序 列号13(氨基酸序列)、序列号14(DNA序列))的蛋白质表达(图9)。使用脂转染试 剂(Invitrogen)将 pCAGGS-GST_S100A8 或 pCAGGS-GST_S100A9 转染到人胎肾细胞来源的 HEK293培养细胞株中，48小时后回收细胞和培养上清液。将细胞和培养上清液在4°C下 以4400g离心5分钟，使上清液(上清液A)与细胞分离，分别进行回收。向细胞中加入含 0. 1% Tween20的PBS在冰冷却下对其进行30秒的超声处理，破坏细胞膜。然后，在4°C下 以4400g离心5分钟以回收上清液(上清液B)。将上清液A和上清液B混合，添加到预先 用 30mL 的 PBS 替换了缓冲液的 HiTrap GST FF column (GE healthcare, 5mL)中。添加后 用PBSlOOmL对柱进行洗涤，用含有还原型谷胱甘肽的20mM磷酸缓冲液(pH. 8)将吸附的蛋 白质洗脱。研究使用了重组S100A8和S100A9的boyden小室的骨髓间充质干细胞迁移活 性。将纯化的S100A8和S100A9蛋白质的浓度调整到0. Ing/ μ L且溶解于DMEM而得到的 样品或用4倍容积的DMEM稀释2日龄小鼠皮肤提取液而得到的样品加入到boyden小室的 下层。阴性对照同样地使用从转染了未插入S100A和S100A9 cDNA的对照载体的细胞提 取蛋白质、并从HiTrap GST FF column洗脱而得到的级分。将样品加入下层后，置于具有 8 μ m的微孔的聚碳酸酯膜上，然后与该聚碳酸酯膜相接地置于boyden小室上槽(容量为 50 μ 1)，向其中加入骨髓来源的间充质干细胞悬浮液(5 X IO4个/50ml培养液DMEM/10%胎牛血清)，在(X)2培养箱内、在37°C下培养4 M小时。培养后，将小室的上槽拿开，取 出聚碳酸酯膜，利用染色定量地研究通过其微孔迁移到小室下槽的骨髓来源的间充质干细 胞的数量(图10)。7)从8周龄雄性小鼠的尾静脉注入上述纯化的GST-S100A8和S100A9重组蛋白质 250yL(lng/yL)。12小时后在异氟醚吸入麻醉下，用肝素涂覆的ImL的注射器从小鼠的 心脏采集末梢血lmL，与3mL的PBS混合，然后轻轻地层置(overlaid)于3mL的Ficol (GE healthcare)的上部。用离心机在25°C下以400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的 细胞作为单核细胞级分。向回收的细胞中加入ImL的溶血剂HLB溶液(免疫生物研究所)， 在室温下孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入IOmL的PBS，在25°C下以440g离心5分 钟以除去上清液，从而回收细胞。将该细胞1，000, 000个与分别用PBS稀释100倍的抗小鼠 PE 标记 PDGFR α 抗体(e-Bioscience)、ΡΕ 标记抗小鼠 PDGFR β 抗体(e-Bioscience)、FITC 标记抗小鼠 CD45 抗体(BD biosciences)、PerCy5 标记抗小鼠 CD44 抗体(BDbiosciences) 在室温下孵育20分钟。其后，将该细胞在25°C以440g离心5分钟以除去上清液。加入 含多聚甲醛的PBS 400yL，作为流式细胞分析的样品。抗体使用(I)PDGFRa /⑶45/ ⑶44(II)PDGFβ/⑶45/⑶44的组合。分析结果为研究PDGFRα (或β)和⑶44的表达细胞 与CD45弱阳性-阴性细胞的比例(图11Α、图11Β)。结果通过研究切除的2日龄小鼠皮肤和6周龄小鼠皮肤的骨髓间充质干细胞迁 移活性，结果可见与6周龄小鼠相比2日龄小鼠的皮肤提取液具有更强的活性。根据DNA 微阵列分析的结果可见，S100A9在2日龄小鼠皮肤中强烈地表达。可见将皮肤提取液用肝 素柱进行粗纯化得到的样品的间充质干细胞迁移活性与含有S100A9和S100A8相关。制作 了这些蛋白质的表达载体，并使用ΗΕΚ293生产、纯化了重组蛋白质。在使用了 boyden小室 的分析中证明这些S100A8、S100A9纯化品具有骨髓间充质干细胞迁移活性。另外可见，通 过小鼠静脉给予，这些蛋白质表现出了将PDGFRa、CD44阳性细胞群动员到末梢血中的活 性(图11)。讨论这次本发明的发明人在世界上首次发现了游离皮片产生S100A8和S100A9， 所产生的S100A8和S100A9具有强的使骨髓来源的间充质干细胞迁移的活性。另外，骨髓间 充质干细胞已知是能够分化为骨组织、脂肪组织、软骨组织、成纤维细胞等的多能干细胞， 最近也指出，骨髓来源的细胞中存在能够分化为心肌、神经细胞、表皮细胞等组织的多能干 细胞。这次植皮片的表皮细胞、毛囊细胞、皮下组织的成纤维细胞等由骨髓来源的细胞构 成，因此认为S100A8或S100A9能够将骨髓来源的组织干细胞动员到植皮片中，从而诱导损 伤组织的功能性修复。由于S100A8和S100A9通过静脉注射给予能够将骨髓间充质干细胞 动员到末梢血中，从而使得难以局部给予的深部组织(脑、心脏、脊髄等)也能够通过末梢 循环来进行给予。相信通过利用本发明技术来制造药品，能够在损伤组织再生时将包含间 充质干细胞的骨髓来源的组织干细胞动员到局部，从而不仅能够使皮肤组织的组织损伤愈 合，而且期待在脑、肌肉、骨等各种组织损伤愈合过程中也能够缩短愈合时间、使损伤组织 功能性再生等效果。〔实施例3〕目的确认S100A8对正常小鼠和糖尿病小鼠的皮肤溃疡治疗效果方法将重组S100A8蛋白质给予小鼠皮肤溃疡模型，从而对溃疡治疗效果进行
18研究。受验小鼠使用移植了表达GFP的骨髓细胞的C57/B16小鼠或糖尿病模型小鼠BKS. Cg-m+/+L印rdb/J(db小鼠)。在小鼠皮肤上制作直径为6mm的皮肤溃疡。在小鼠制作的皮 肤溃疡的皮肤缺损部分周围的皮肤迅速收缩。本实验中，为了制作缺损皮肤不收缩而通过 再生皮肤覆盖来进行治疗的模型，在皮肤缺损部将外径为10mm、内径为6mm、厚度为0. 5mm 的硅橡胶制的圆盘用皮肤手术用粘接剂(Aron alpha Α)和尼龙线固定到溃疡周围的皮肤。 然后将重组S100A8蛋白质以1. 5 μ g/天、连续7天直接给予溃疡面。另外，为了防止溃疡 面干燥，用膜敷料剂Tegaderm(3M)保护表面。为了确认治疗效果，测定经时的溃疡面积。结果和讨论在正常小鼠中可见，从治疗开始第7天以后，S100A8治疗组比对照组 的溃疡面积显著地缩小(图12)。另外，在糖尿病小鼠中也可见，从治疗开始第7天以后， S100A8治疗组比对照组的溃疡面积显著地缩小(图13)。即，确认在正常小鼠、糖尿病小鼠 中皮肤溃疡均显著地缩小的效果。从该结果确认，S100A8不仅对正常小鼠而且对糖尿病小 鼠也具有皮肤溃疡的治疗效果。产业上的可利用性根据本发明，能够提供含有S100A8或S100A9的骨髓来源的细胞诱导剂或组织再 生促进剂。通过将S100A8或S100A9开发成骨髓来源的细胞动员药物，使得促进难治性损 伤组织的功能性再生的新的再生医疗技术成为可能。S100A8或S100A9由因供血不足而陷 于缺氧状态并处于坏死方向的组织细胞释放，其具有将骨髓来源的细胞或其来源的各种细 胞动员到其局部的作用。被动员的骨髓来源的细胞通过分化为各种组织所需的细胞谱系， 从而促进了因灌注不足、坏死而丧失的功能恢复，即促进了所谓的功能性组织再生。例如， 通过将S100A8或S100A9给予由皮肤的血流障碍引起的难治性皮肤溃疡部，能够将骨髓来 源的细胞动员到溃疡面，被动员的细胞分化为血管内皮细胞，从而改善了局部的血流。同时 通过分化为成纤维细胞、神经细胞、毛囊细胞、甚至分化为表皮细胞，从而不再是纤维性瘢 痕愈合，而是诱导、促进了具有必要的皮肤附属器官的功能性皮肤再生。即使在心肌梗塞或 脑梗塞等其他器官的灌注不足性坏死状态中，也可期待S100A8、S100A9作为其功能性组织 再生诱导剂同样地有效。
权利要求
1.一种骨髓细胞的诱导剂，其含有以下的(a) (f)中的任一项记载的成分；(a)S100A8蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。
2.—种组织再生促进剂，其含有以下的(a) (f)中任一项所记载的成分；(a)S100A8蛋白质(b)分泌S100A8蛋白质的细胞(c)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(d)S100A9蛋白质(e)分泌S100A9蛋白质的细胞(f)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体。
全文摘要
本发明的发明人研究了在移植皮片植入活体组织的过程中骨髓来源的细胞从皮肤外组织被动员到移植皮片并参与皮肤组织再生的可能性，并在世界上首次阐明了1)骨髓来源的细胞被大量地动员到移植皮肤内；2)被动员的骨髓来源的细胞在移植皮片内能够分化为真皮成纤维细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、血管内皮细胞、表皮角化细胞，被动员的骨髓来源的细胞中包括骨髓来源的间充质干细胞；3)将骨髓来源的间充质干细胞从末梢血动员到植皮片中的是从移植皮肤的坏死组织释放的S100A8、S100A9；4)纯化的S100A8、S100A9能够促进从骨髓中分离、培养的间充质干细胞的迁移。
文档编号A61K31/7088GK102076351SQ20098012524
公开日2011年5月25日 申请日期2009年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者山崎尊彦, 玉井克人, 知野刚直, 金田安史 申请人:吉诺米克斯股份有限公司, 国立大学法人大阪大学