生物活性剂的囊封方法

专利名称：生物活性剂的囊封方法
生物活性剂的囊封方法
背景技术：
很多药物在大脑或眼中的靶标处具有活性，为了使这些药物到达它们的靶标，它们必须穿过生物屏障，如血脑屏障。虽然一些分子能够通过生物屏障，但是还有一些不能有效或事实上根本不能穿过这些屏障的其它分子。许多药物也仅仅当直接进入靶标组织时才有效，且如果不能到达这个靶标组织，药物实际上也不能起作用。因此，由于不能穿过这样的生物屏障，很多可能有效的药物不能在临床上使用。

现有技术中已记述了很多方法以增强药物穿透这些生物屏障的能力。一种方法是改变屏障本身的功能。例如，渗透剂或拟胆碱药物槟榔碱类 (cholinomimetic arecolines)，其能打开血脑屏障或者改变血脑屏障的穿透性(Saija A 等人，J Pharm. Pha. 42 135-138 (1990))。其它的方法是修饰药物分子本身。例如，修饰蛋白以试图穿过血脑屏障，包括使这些蛋白糖基化或者形成前药(W0/2006/029845)。还有另一方法是植入可控制释放的聚合物，其从基质系统直接将活性成分释放进入神经组织。然而，如果直接植入大脑或骨髓，这种方法是浸入性的且需要外科手术介入 (sable等人，美国专利4，833，666)，这存在的问题是需要病人的同意，且通常仅仅是在大脑内随给予的药物一起进行定位输送，通常很快被排出(W0/2006/029845)。为了克服这些局限，人们使用了药物载体系统，然而，靶标的药物传输的主要问题是通过网状内皮系统(RES)尤其是通过肝和脾的巨噬细胞的注射的载体的快速调理 (opsonisation)禾口摄取。因此，仍然需要一种有效的方法，以将大分子(如蛋白质)输送到大脑和眼中。具体而言，需要找到一种将大分子穿过血脑屏障的方法，所述大分子在进入大脑时仍能保留活性，以及还能提供所需要的释放动力学，保持蛋白质的稳定和活性，且能够回避清除机制。


图1所示为通过动态光散射(DLS)获得的粒度数据，表明悬液中纳米粒子的存在。图1 (a)所示为通过动态光散射对纳米粒子悬液分析之后获得的相关图。图1(b)所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。图1(c)所示为所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。图1(d)所示为所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。图2所示为用HIP方法获得的囊封的亮啡肽类似物(Dalargin)的量与通过普通方法在粒子表面吸收得到的量的对比。图3所示为在输送HIP-PBCA纳米粒子之后脑中的亮啡肽类似物水平。仅当使用HIP方法在微粒中囊封时所述肽是可测量的。图4所示为使用HIP方法在PBCA纳米粒子中对亮啡肽类似物的囊封。测定水相的PH对囊封效率的影响。图5所示为使用HIP方法在PBCA纳米粒子中对抗鸡蛋溶菌酶结构域抗体的囊封。 通过Edman测序分析纳米粒子。图6所示通过SDS-PAGE分析以确认在HIP-PBCA纳米粒子中的dAb壳体化。将纳米粒子离心分离以除去任何游离的dAb并用SDS-PAGE分析颗粒以观察壳体化的dAb。图 7 所示为通过 SDS-PAGE 分析以确认 VEGA dAb (D0M15-26-593)载入 HIP-PBCA 纳米粒子。将纳米粒子制剂与dAb标准进行比较，以便确定在纳米粒子中存在的dAb的量。 起始输入的12mg中总计3. 31mg dAb已经在纳米粒子中壳体化。因此，载入效率为27. 6%。 dAb载入率为3. 31% w/w。图8所示为小鼠中含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子通过静脉途径将它们载入的蛋白输送到脑中的能力的体内评估结果。在给药后10分钟，纳米粒子中的dAb形成可检测的脑吸收物，其量为8. Ong/mL·游离的dAb在脑中也可以检测到，其浓度较低，为3. 3ng/ ml (初始数据)。因此，纳米粒子似乎少量增加蛋白的脑吸收(初始数据)。在60分钟时， 观察到相反的现象，因为游离的dAb似乎聚集在脑中，导致其脑水平进一步增加到13 . 5ng/ ml。校正了脑水平。图9所示为通过静脉途径从含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子的体内评估中得到的dAb在脑和血液中的比例。结果显示，当和纳米粒子一起给予与给予在溶液中的游离dAb 相比时，脑中存在的dAb比血液中存在的dAb的比例高。图10所示为小鼠中含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子通过静脉途径将它们载入的蛋白输送到大脑中的能力的体内评估结果。给药后10分钟，纳米粒子组中的dAb在脑中显示出高水平的dAb，平均值为627. 60ng/ml。图11所示为通过颈动脉途径从含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子的体内评估中得到的dAb在脑和血液中的比例。纳米粒子组中的dAb显示了在两个时间点(在10和60分钟分别为1. 569和1. 845)处，脑与血液的比例大于1，表明大多数制备的dAb已成功地到达脑。图12所示为通过光学显微镜对产生的微球体的确认。所有的微球体制剂都使用聚己酸内酯通过HIP方法生成。(a)维生素E TPGS 2%表面活性剂4000rpm 2分钟20x mag(b)维生素E TPGS 2%表面活性剂7500rpm 2分钟20x mag(c)维生素 E TPGS 2%表面活性剂 7500rpm 2 分钟+dAb 1 20x mag(d)维生素 E TPGS 2%表面活性剂 7500rpm 2 分钟+dAb2 20x mag图13所示为所示为通过激光衍射对产生的微球体的确认。所有的微球体制剂都使用聚己酸内酯通过HIP方法形成。(a)维生素E TPGS 2%表面活性剂4000rpm 2分钟20x mag(b)维生素E TPGS 2%表面活性剂7500rpm 2分钟20x mag(c)维生素 E TPGS 2%表面活性剂 7500rpm 2 分钟+dAb 1 20x mag(d)维生素 E TPGS 2%表面活性剂 7500rpm 2 分钟+dAb2 20x mag
图14所示为通过SDS-PAGE分析对进入HIP-PC微球体的dAb壳体化的确认。过滤微球体，(F)离心过滤(3k或13k rpm)以除去游离的dAb和上清液⑶，以及小球⑵， 并通过SDS-PAGE分析，以观察壳体化的dAb。 图15所示为通过SDS-PAGE分析对壳体化的dAb从HIP-PC微球体中的释放的确认。清洗微球体，接着在56°C下加热处理0、20、40或60分钟，以释放dAb、碎片小球(5分钟@5k)和上清液(S)，通过SDS-PAGE进行分析，以观察壳体化的dAb。分子标记-参见Blue Plus 2预染色标准(invitrogen)，分子量(kd)，凝胶确认了已经有dAb释放出来。凝胶还确认了 dAb是完整的，且由于释放方法，它们没有片段化。

发明内容
在本发明的一个方面中，提供一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，如在纳米粒子中，或纳米粒子中和上，或用纳米粒子囊封蛋白和/或肽的方法，和通过在纳米粒子中，或纳米粒子中和上，或用纳米粒子囊封以输送蛋白和/或肽穿过血脑屏障的方法，以及通过在微粒载体中，或微粒载体中和上，或用微粒载体囊封以将蛋白和/或肽输送到眼中的方法。在本发明的另一实施方式中，提供一种微粒载体，其包括粒子形成物质和生物活性剂如蛋白和/或肽，以将蛋白和/或肽从血液穿过血脑屏障输送到脑或输送到眼中。在本发明的再一实施方式中，提供纳米粒子的组合物以及它们在治疗中枢神经系统和/或眼的疾病或病症中的用途。发明详述本发明提供包括粒子形成物质和生物活性剂的微粒载体，以及所述微粒载体的制备方法。在一个实施方式中，本发明提供一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤a)在疏水离子配对(HIP)试剂存在下使生物活性剂在有机溶剂中溶解；b)使聚合物形成物质的单体和/或寡聚体溶解于(a)中的有机相中；c)在连续水相中形成在(b)中形成的有机相的乳液，以使单体聚合；以及d)得到从乳液中形成的微粒载体。在本发明的另一个实施方式中，本发明提供一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤a)使在水相中的生物活性剂与在有机溶剂相中的疏水离子配对(HIP)试剂混合， 以形成生物活性剂-HIP复合物；b)从水相中分离复合物；c)除去水相，并使复合物与有机相均化；d) (i)使聚合物溶解于(C)中形成的有机相，然后在连续水相中形成有机相的乳液；或者(ii)使聚合物形成物质的单体或寡聚物溶解于(C)中形成的有机相，然后在连续水相中形成有机相的乳液，以允许单体或寡聚体聚合形成聚合物；以及e)得到从步骤(d)中的乳液中形成的微粒载体。
使用疏水离子配对试剂的这种方法允许生物活性剂如蛋白(如亲水蛋白)在疏水聚合物粒子的中心中囊封。疏水离子配对允许萃取出蛋白进入有机介质，因此，这种方法能用单乳液制备微粒载体。在另一个实施方式中，本发明的微粒载体包含生物活性剂如蛋白或肽。所述蛋白可以是抗原结合分子，本文中使用的抗原结合分子是指抗体、抗体片段和能够结合靶标的其它蛋白结构。抗原结合分子可包括域(domain)。“域”是折叠的蛋白结构，具有独立于余下的蛋白的三级结构。一般地，域负责蛋白的离散的功能特性，在很多的情况下可加入、移除或转移到其它的蛋白上，而不会损失该蛋白和/或域的余下部分的功能。“单抗体可变域”是折叠的多肽域，其包括抗体可变域的序列特征。因此，它包括完整的抗体可变域和修饰的可变域，例如， 其中的一个或多个环已经被非特征性的抗体可变域的序列取代，或者被截短或包括N或C 末端延伸部分的抗体可变域取代，以及被可变域的折叠片段取代，所述折叠片段至少保留全长域的结合活性和特异性。抗原结合分子可包括至少一个免疫球蛋白可变域，例如，这些分子可包括抗体、域抗体、 Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv、ScFv、双特异抗体、异源结合抗体。这些抗原结合分子能结合单个的靶标，或可以是多特异性的，即结合多个靶标，如它们可以是双特异性的或三特异性的。在一个实施方式中，所述抗原结合分子是抗体。在另一实施方式中，所述抗原结合分子是域抗体(dAb)。在又一实施方式中，所述抗原结合分子可以是抗体和抗原结合片段的组合物，例如连接到单克隆抗体的一个或多个dAb和/或一个或多个ScFv。在又一实施方式中，所述抗原结合分子可以是抗体和肽的组合物。抗原结合分子可包括至少一个非Ig 结合域，例如特异性地结合独立于不同V区或域的抗原或表位的域，这可以是dAb，例如人、 骆驼或鲨鱼的免疫球蛋白单可变域，或者它可以是这样的域，其选自以下的支架的衍生物 CTLA-4 (Evibody)、脂笼蛋白(Lipocalin)、蛋白A衍生的分子如蛋白A的Z-域(亲和蛋白体，SpA)、A-域(Avimer/Maxibody)、热休克蛋白如GeoEI和GroES、转铁蛋白(穿膜抗体)、 锚蛋白重复蛋白(DARPin)、肽适体、C型凝集素域(四连接素)、人晶体蛋白和人泛素(亲和物)、PDZ域、人蛋白酶抑制剂的的蝎毒kimitz型域、以及纤连蛋白(adnectin)；其已经用于蛋白工程，以便使其与配体而非与天然的配体结合。CTLA_4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在⑶4+T细胞上表达的⑶28家族受体。它的胞外域是可变域状的Ig折叠。对应于抗体的CDR的环可用异源序列取代，以赋予不同的结合特性。业已知道，经工程改造成具有不同结合特性的CTLA-4分子是Evibody。 进一步详细的内容请参见免疫学方法杂志248 (1-2)，31-45 (2001)。脂笼蛋白是转运小疏水分子如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质的胞外蛋白家族。它们具有刚性折叠的二极结构，其在圆锥形结构的开始端具有很多的环，可以经工程改造以结合不同的靶标抗原。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间，并源自脂笼蛋白。进一步详细的内容参见 Biochim Biophys Acta 1482 :337_350 (2000)，US7250297B1 和 US20070224633。亲和体是源自能经工程改造以结合抗原的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架。该域由三螺旋束的约58个氨基酸组成。通过表面残基的随机化产生库。进一步详细的内容参见 Protein Eng. Des. Sel. 17，455-462 (2004)和 EP1641818A1。
Avimer是源自A-域支架家族的多域蛋白。约35个氨基酸的天然域采用限定的二硫化物键合结构。通过慢慢移动由A域家族展现的天然变异可产生多种变化。进一步详细的内容参见 Nature Biotechnology 23 (12)，1556-1561 (2005)和 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909—917(2007 年 6 月)。 转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。通过在允许的表面环中插入肽序列，转铁蛋白可以经工程改造以结合不同的靶标抗原。工程改造的转铁蛋白支架的例子包括穿膜抗体 (trans-body)。进一步详细的内容参见 J. Biol. Chem 274，24066-24073 (1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)源自锚蛋白，其为一种蛋白家族，用于将整合膜蛋白的附属部分介导至细胞骨架上。单个的锚蛋白重复是由双螺旋和a转角组成的33个残基基序。通过随机化每个重复的第一螺旋和转角中的残基，它们可经改造以结合不同的靶标蛋白。通过增加单元的数量(亲和力成熟的方法)，可增加结合界面。进一步详细的内容参见 J. Mol. Biol. 332，489-503 (2003)，PNAS 100 (4)，1700-1705 (2003)和 J. Mol. Biol. 369，1015-1028(2007)以及 US20040132028A1。纤连蛋白是一种能改造以结合抗原的支架。Adnectin由 人的III型纤连蛋白 (FN3)的15个重复单元的第十域的天然氨基酸序列的主链组成。夹心结构的一端的三个环可改造成使Adnectin特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步详细的内容参见Protein Eng. Des. Sel. 18，435-444 (2005)、US2008013979U W02005056764 和 US6818418B1。肽适体是由连续的支架蛋白组成的组合识别分子，一般是含有在活性位点插入的限制性的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步详细的内容参见ExpertOpin. Biol. Ther. 5，783-797(2005)。微体源自天然生成的长度为25-50个氨基酸的微蛋白，包含3-4个半胱氨酸桥，微蛋白的例子包括KalataBl和芋螺毒素(conotoxin)和结蛋白(knottins)。微蛋白具有能够改造成包括多达25个氨基酸的环，且不影响微蛋白的整体折叠。改造的结蛋白域的进一步详细内容，参见W02008098796。其它的非Ig结合域包括已用作支架以改造不同靶标抗原结合特性的蛋白，包括人晶体蛋白和人泛素(亲和结合体)，人蛋白酶抑制剂的kimitz型域、Ras-结合蛋白AF-6 的PDZ域、蝎毒素(北非蝎毒素)，C型凝集素域(四连蛋白)，其在Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007， Stefan Dubel 编辑)的第 7 章禾口 Protein Science 15:14-27(2006)中有综述。本发明的非Ig结合域可源自任意的这些可替代的蛋白域。在本发明的一个实施方式中，所述抗原结合分子结合到在中枢神经系统中发现的靶标中，例如脑或脊髓中或者例如神经组织中。在本文描述的本发明的再一实施方式中，抗原结合分子特异性地结合到已知与神经疾病或病症相关的靶标中，例如MAG (髓鞘相关糖蛋白)、N0G0 (神经突起生长抑制蛋白) 或淀粉样蛋白。这些抗原结合分子包括能够结合N0G0 (如抗-N0G0抗体)的抗原结合分子。用于本发明的的抗-N0G0抗体的一个例子是由SEQ ID NO 1的重链和SEQ ID NO 2的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗体的⑶R的抗-N0G0抗体或其抗原结合片段。该抗体(H28L16)的进一步详细的内容可在PCT申请W02007068750中找到，其内容纳入本文
中作为参考。这种抗原结合分子包括能够结合MAG (如抗-MAG抗体)的抗原结合分子。用于本发明的抗-MAG抗体的一个例子是由SEQ ID NO 11的重链可变区和SEQ ID NO 12的轻链可变区限定的抗体，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗体的⑶R的抗-MAG抗体或其抗原结合片段。该抗体(BvHICvLl)的进一步详细的内容可在PCT申请W02004014953中找到，其内容纳入本文中作为参考。这种抗原结合分子包括能够结合β -淀粉样蛋白(如抗β _淀粉样蛋白抗体)的抗原结合分子。用于本发明的抗淀粉样蛋白抗体的一个例子是由SEQ ID NO 5的重链和/或SEQ ID NO 6的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 5和6所示的抗体的⑶R的抗-β-淀粉样蛋白抗体或其抗原结合片段。该抗体(H2L1)的进一步详细的内容可在PCT 申请W02007113172中找到，其内容纳入本文中作为参考。用于本发明的可替代的抗β -淀粉样蛋白抗体是由SEQ ID NO 7的重链和/或SEQ ID NO 8的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 7和8所示的抗体的⑶R的抗_淀粉样蛋白抗体或其抗原结合片段。这种抗体的CDR序列可由以下方法确定Kabat编号系统(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)、Chothia 编号系统(Al-Lazikani 等人，(1997) JMB 273,927-948)、接触定义方法(MacCallum R. Μ.，和 Martin Α. C. R.和 Thornton J. Μ, (1996)，Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745)或本领域的技术人员已知的对抗体的残基编号并确定CDR的任何其它确定的方法。

在本发明的一个实施方式中，该抗原结合蛋白结合到眼中的靶标中，例如TNF、 TNFr-l、TNFr-2、TGF3 受体-2、VEGF、N0G0、MAG、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL_17、CD20、β -淀粉样蛋白、FGF-2、IGF-U PEDF, PDGF 或补体因子，如 C3、C5、C5aR、CFD、CFH、CFB、CFI、sCRl 或C3。在本发明的另一实施方式中，该抗原结合蛋白结合VEGF。在本发明的另一个可替代的实施方式中，该抗原结合蛋白结合淀粉样蛋白。在本发明的一个实施方式中，所述微粒载体可以是微球体或纳米粒子。在一个这样的实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂是蛋白。在另一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂是肽。在又一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂包含抗原结合分子，如域抗体或抗体。在又一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂包含域。在另一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂是蛋白。在又一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂是肽。在又一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂包含抗原结合分子，如域抗体或抗体。在再一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂包含域。在本发明的一个实施方式中，其提供包括本发明所述的方法制备的纳米粒子的组合物。在另一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90%的纳米粒子在约 Inm-约IOOOnm之间的范围内。在又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90%的纳米粒子在约Inm-约400nm之间，或约Inm-约250nm之间，或约Inm-约150nm 之间，或约40nm-约250nm之间，或约40nm_约150nm之间，或约40nm_约IOOnm之间的范围内。
在本发明的又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90%的纳米粒子在约40nm-约250nm之间的范围内。在本发明的又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90%的纳米粒子在约40nm-约150nm之间的范围内。在本发明的又一实施方式中，其提供一种包括本发明的纳米粒子的组合物，其中当用动态光散射技术测量时，组合物中的纳米粒子的粒径中间值小于约lOOOnm，例如粒径小于约400nm，例如粒径小于约250nm，例如粒径小于约150nm。在另一实施方式中，组合物中的纳米粒子的粒度中间值为约40nm-约250nm。在另一实施方式中，组合物中的纳米粒子的粒度中间值为约40nm-约150nm。在本发明的一个实施方式中，其提供包括本发明所述的任一种方法制备的微球体的组合物。在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90%的微球体的直径在约1 μ m-约100 μ m之间的范围内。在又一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90%的粒子在约1 μ m-约80 μ m之间，或在约1 μ m-约60 μ m之间，或在约1 μ m-约40 μ m之间，或在约1 μ m_约30 μ m之间，或在约1 μ m_约10 μ m之间的范围内。在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90%的微球体在约1 μ m-约60 μ m之间的范围内。在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90%的微球体在约1 μ m-约30 μ m之间的范围内。在本发明的又一实施方式中，其提供一种包括本发明的微球体的组合物，其中当用小角激光光散射技术测量时，组合物中的微球体的粒径中间值小于约100 μ m,例如粒径小于约80 μ m,例如粒径小于约60 μ m,例如粒径小于约40 μ m。在另一实施方式中，组合物中微球体的粒度中间值为约1 μ m-约6 μ m或1 μ m-约 30 μ m0在本发明的另一实施方式中，所述微粒载体在超过至少3个月或更长的时间内， 或长达6个月或更长的时间或者长达12个月或更长的时间内持续释放治疗量的活性生物分子。在一个实施方式中，在没有疏水离子配对试剂存在时，所述生物活性剂不溶于有机相。在本文所述的本发明的一个实施方式中，当蛋白是阴离子时，疏水离子配对试剂是阳离子HIP试剂。在另一实施方式中，当蛋白是阳离子时，疏水离子配对试剂是阴离子 HIP试剂。在又一实施方式中，阴离子HIP试剂选自烷基季铵盐阳离子，优选烷基溴化铵，更优选四丁基溴化铵、四己基溴化铵、四辛基溴化铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、油酸钠或多库脂钠(aka Aerosol 0T )，且HIP试剂以化学计量等于或大于蛋白上的净正电荷的数量的的量存在。在另一实施方式中，阳离子HIP试剂选自二甲基二(十八烷基)溴化铵 (DDAB18)、1，2-二油酰基氧基-3-三甲铵丙烷(DOTAP)、或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)， 且HIP试剂以化学计量的量等于或大于蛋白上的净负电荷的量存在。在进一步的实施方式中，任何疏水阳离子或阴离子可潜在地用作HIP试剂以溶解蛋白。疏水离子配对(HIP)包含带有类似电荷种类，但是不容易被溶剂化的极性平衡离子的化学计量取代。如本文所述，本发明提供一种使用HIP改变蛋白溶解性的方法，这允许萃取蛋白进入有机溶剂中，例如二氯甲烷中。多库脂钠(双(2-乙己基)琥珀酸酯磺酸钠) 是合适的离子配对试剂的一个例子。在一个实施方式中，使含有多库脂钠的二氯甲烷与水性蛋白溶液混合。这导致多库酸酯离子与蛋白形成离子对，并随后隔开蛋白进入油相。蛋白分散于二氯甲烷中使得蛋白被囊封在通过单水包油乳化法制备的纳米粒子或微球体中。在本文所述的本发明的一个实施方式中，当蛋白是阴离子型，而HIP试剂是阳离子型时，连续水相的pH为约7. 0或更高，例如，pH可以是至少约8. 0或至少约10. 0或至少约 12. 0。在本文所述的本发明的另一个替代性的实施方式中，当蛋白是阳离子型，而HIP 试剂是阴离子型时，连续水相的PH为约7. 0或更低，例如，pH可以是小于约6. 0或小于约 4. 0或小于约2. 0。在这样的一个实施方式中，蛋白与聚合物的重量/重量比(w/w)可以是 0. 5% -90%,例如是至少约0.5%，或至少约1 %，或至少约2%，或至少约2.5%，或至少约 5 %，或至少约9 %，或至少约10 %，或至少约15 %，或至少约20 %，或至少约40 %，或至少约 50%，或至少约60%，或至少约70 %，或至少约80 %或至少约90%。例如，当蛋白是肽时， 该肽与聚合物的比率可以是至少约9%，当蛋白是抗体时，该抗体与聚合物的比率可以至少是约2%，或当蛋白是域抗体时，该域抗体与聚合物的比率可以至少是约2. 5%。在本发明的一个实施方式中，蛋白与总制剂(聚合物+HIP和可选的表面活性剂) 的w/w比可以是0. 5% -50%，例如是至少约5%，或至少约9%，或至少约15%，或至少约 16%，或至少约20%或至少约25%。例如，当蛋白是肽时，该肽与总制剂的重量比可以是至少约16%，或蛋白是抗体时，抗该体与聚合物的重量比可以是至少约1%，或当蛋白是域抗体时，该域抗体与总制剂的重量比可以是至少约9%。在本发明的一个实施方式中，粒子的囊封效率是至少约1 %，或至少约2 %，或至少约10%，或至少约20%，或至少约40%，或至少约50%，或至少约60%，或至少约70%， 或至少约80 %，或至少约90 %，或至少约95 %，或至少约97 %，或至少约99 %。例如，当蛋白是肽时，囊封效率可以是至少约90%，当蛋白是抗体时，囊封效率可以是至少约1%，或当蛋白是域抗体时，囊封效率可以是至少约70 %。在本发明的一个实施方式中，单体或寡聚体选自甲基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸烷基酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺、N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-二甲胺乙酯。在进一步的实施方式中，该单体是氰基丙烯酸烷基酯，如氰基丙烯酸丁酯(BCA)。在又一实施方式中，用于本文所述的任一方法中的聚合物选自但不限于以下物质聚-L-交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)、聚交酯、聚己酸内酯、聚羟基丁酸酯和/或其共聚物。合适的粒子形成物质包括但不限于聚二烯烃如聚丁二烯等；聚烯烃类如聚乙烯、聚丙烯等；聚丙烯酸类如聚丙烯酸等；聚甲基丙烯酸类如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯等；聚乙烯醚类、聚乙烯醇类、聚乙烯酮类、聚乙烯基卤化物如聚氯乙烯等；聚乙烯腈类；聚乙烯酯类如聚乙酸乙烯酯等、聚乙烯吡啶类如聚(2-乙烯基-吡啶)、聚(5-甲基-2-乙烯吡啶)等；聚苯乙烯类；聚碳酸酯类；聚酯类；聚原酸酯类；聚酯酰胺类(polyesterarnides)；聚酸酐类；聚氨酯类；聚酰胺类；纤维素醚类如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等；纤维素酯类如醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、 醋酸丁酸纤维素等；多糖、蛋白质、凝胶、淀粉、胶、树脂等等。这些材料可单独使用，作为物理混合物(共混物)或作为共聚物使用。还共混聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁基氰基丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚芳基酰胺、聚酸酐、聚原酸酯、N，N-L-赖氨酸二基对苯二甲酸酯、聚酸酐、去溶剂化的生物活性剂或碳水化合物、多糖、聚丙烯醛、聚戊二醛及其衍生物、共聚物和聚合物。适合用于本发明的方法的有机溶剂的例子包括但不限于不溶于水的酯如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、异丁酸异丁酯、2-乙基乙酸己酯、乙二醇二乙酸酯；不溶于水的酮如甲基乙基酮、甲基异丁基酮、甲基异戊基酮、甲基正戊基酮、 二异丁基酮；不溶于水的醛如乙醛、正丁醛、巴豆醛、二乙基己醛、异丁醛和丙醛；不溶于水的醚酯如3-乙氧基丙酸乙酯；不溶于水的芳香烃如甲苯二甲苯和苯；不溶于水的卤代烃如 1，1，1_三氯乙烷；不溶于水的乙醇醚酯如丙二醇单甲醚醋酸酯、乙二醇单乙醚醋酸酯、乙二醇单丁醚醋酸酯、二乙二醇单丁醚醋酸酯；不溶于水的邻苯二甲酸增塑剂如邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二辛酯、对苯二甲酸二辛酯、辛基邻苯二甲酸丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸烷基苄酯；不溶于水的增塑剂如己二酸二辛酯、乙二醇二-2-乙基己酸三乙烯酯、偏苯三酸三辛酯、三醋酸甘油酯、甘油基/三丙酸菌素(glyceryl/tripropionin)、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二异丁酸酯、二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亚砜、四氯化碳、氯仿、环己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、庚烷、己烷或其它的烃；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4_三甲基戊烷、1-辛醇及其异构体或苯甲醇。在本发明的一个实施方式中，用于本发明的方法的溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亚砜、四氯化碳、氯仿、环己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、 庚烷、己烷或其它的烃；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4-三甲基戊烷、1-辛醇及其异构体或苯甲醇。本文所述的本发明的所有方面的微粒载体、包含它们的组合物或它们的制备方法可进一步包括加入表面活性剂，其例如但不限于胆酸钠、泊洛沙姆188(p0l0Xamer) (pluronic F68 ，或F127)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80、葡聚糖、泊洛沙姆、 poloxamines、多功能醇的羧酸酯类、烷氧基化醚类、烷氧基酯类、烷氧基化甘油单、二、三酯类、烷氧基酚类以及联苯酚类、乙氧基醚类、乙氧基酯类、乙氧基甘油三酸酯类、GenapolR 和BaukiR 系列的物质、脂肪酸的金属盐、羧酸的金属盐、醇硫酸金属盐以及脂肪醇硫酸金属盐和磺基琥珀酸金属盐以及两种或更多种上述物质的混合物。在又一实施方式中，所述表面活性剂选自胆酸钠、泊洛沙姆188(plUronic F68 )、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80和葡聚糖。在本发明的一个实施方式中，其提供包含生物活性剂的微粒载体，其可由本文所述的本发明的任意方法制备。囊封在本发明的微粒载体和/或组合物内的生物活性剂在它从微粒载体释放时保留至少一些生物活性，例如，当药剂是结合的药剂并对生物活性剂从粒子中释放产生生物应答时，该组合物中的一定比例的分子可保留至少一些结合它们的靶标的能力。可用合适的生物结合测定测量这样的结合，合适的测定的例子包括但不限于ELISA或Biacore 。在另一实施方式中，当通过生物活性测定对粒子的释放进行测量时，例如在一个实施方式中通过ELISA、Biacore测量时，组合物保留至少50 %它对靶标的亲和力，或对靶标保留至少70%或至少90%的亲和力(Kd)。在一个实施方式中，组合物能够在给药的对象中引出治疗效果。本发明的组合物的生物活性可通过任意合适的测定进行测量，其测量的是囊封的生物活性分子的活性，例如当生物活性分子是VEGF dAb时，可使用实施例18记载的测定。在另一个实施方式中，其提供一种包含囊封在本文所述的本发明的微粒载体中的生物活性剂的药物组合物。在另一个实施方式中，其提供一种包含囊封在本文所述的本发明的纳米粒子中的蛋白的药物组合物。在另一个实施方式中，本发明的组合物可用来治疗和/或预防涉及微粒载体穿过血脑屏障的疾病或病症。在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防中枢神经系统的疾病或病症，例如可用来治疗和/或预防阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、牛海绵状脑病、西尼罗河病毒性脑炎、神经艾滋病、脑损伤、脊髓损伤、转移性脑癌、多发性硬化、中风。在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗MAG-抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤。在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗-NOGO-抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤，或者例如治疗或预防神经退化性疾病如阿尔茨海默病。在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗-β -淀粉样蛋白抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤，或者例如治疗或预防神经退化性疾病如阿尔茨海默病。在本文所述的本发明的一个实施方式中，所述微粒载体可通过肠胃外注射或输注、静脉或动脉给药的方式给予患者。在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防眼睛疾病或病症。在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防疾病， 其例如但不限于年龄相关的黄斑变性(新生血管/湿的)、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞症、葡萄膜炎、角膜新生血管形成或青光眼。在另一个实施方式中，所述组合物可用来治疗和/或预防AMD (年龄相关的黄斑变性)，例如湿性AMD或干性AMD。在本发明的另一个实施方式中，其提供一种囊封在本文所述的纳米粒子和/或微球体中的生物活性剂，用作药物。在本发明的一个实施方式中，其提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/ 或预防中枢神经系统疾病的药物中的用途。在另一个实施方式中，本发明提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病的药物中的用途。在又一个实施方式中，本发明提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/或预防中风或神经损伤的药物中的用途。在本发明另一个实施方式中，提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗或预防眼病的药物(如在制备治疗和/或预防AMD的药物)中的用途。本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防中枢神经系统疾病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗阿尔茨海默病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防中风或神经损伤的方法。本发明还提供使用本发明的组合物治疗和/或预防眼病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防AMD的方法。定义本文使用的术语“粒子形成的物质”用来描述任意的能够聚合的单体和/或寡聚体，或能形成不溶于水性环境中的粒子的聚合物，如PBCA、PLGA。在未聚合时，该粒子形成物质可溶于有机溶剂中。本说明书全文使用的术语“微粒载体”用于包含纳米粒子和微球体。“微球体”是由直径大于ι μ m的各种天然和合成的材料组成的粒子，而本文使用的“纳米粒子”是亚微米级的粒子，如l-1000nm。在一个实施方式中，本文使用的术语微粒载体、纳米粒子和微球体具有载体结构， 其具有生物相容性且足以抵抗使用环境导致的化学和/或物理损坏，以至于在给药进入人或动物体之后，足量的粒子基本上保持完整，并能保持足够的时间，以便能够到达所需要的靶器官或组织，如脑或眼睛。本文所使用的术语“生物活性剂”是用于表示当到达它们应到的靶标时，该分子必须能够至少部分具有生物活性的术语。为避免术语“生物活性剂”和“生物活性分子”在本说明书全文中重复使用表示歧义，两个术语表示相同的含义，且能够互换。术语“溶解”定义为形成溶剂中的单独分子形式的溶液，或形成液体悬液中的固体，其形式为分子微小固体聚集块悬浮于液体中。溶解过程也可以得到完全溶解的分子和悬浮的固体聚集块的混合物。整份说明书中所使用的用于在微粒载体中囊封的术语“蛋白”包括分子量至少为 llkDa、或至少12kDa、或至少50kDa、或至少lOOkDa、或至少150kDa或至少200kDa的蛋白。 囊封用的蛋白也可以有很长的长度，例如至少为70个氨基酸的长度或至少为100个氨基酸的长度或至少为150个氨基酸的长度或至少为200个氨基酸的长度。整份说明书中所使用的用于在微粒载体中囊封的术语“肽”包括较短序列的氨基酸，其分子量不大于约lOkDa、或不大于约8kDa、或不大于约5kDa、或不大于约2kDa或不大于约IkDa或小于lkDa。囊封用的肽的长度不超过70个氨基酸的长度或不超过50个氨基酸的长度或不超过40个氨基酸的长度、或不超过20个氨基酸的长度、或小于10个氨基酸的长度。术语“眼周，，是指局部给药至眼外周的位置，其包括但不限于“结膜下，，-结膜的下面-在巩膜上覆盖整个眼球的的清澈的黏液膜；“筋膜下”-包裹眼睛的筋膜的下面但在巩膜外面；“眼球周围”-眼球下的空间，其中眼球位于眼框中；“眼球后”-眼球正后方的空间，邻近视神经；“脉络膜上层”-巩膜的下面，但在脉络膜进入脉络膜上层空间的外部；“经巩膜”-该术语也用来指输送通过，即从巩膜的外部通过。短语“免疫球蛋白单可变域”是指特异性地结合到独立于不同V区或域的抗原或表位的抗体可变域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白单可变域可以与其它不同的可变区或可变域的形式(例如同源或异源多聚体)存在，其中，通过单个免疫球蛋白可变域的抗原结合不需要所述的其它的区或域(即免疫球蛋白单可变域独立于其它的可变域结合抗原)。“域抗体”或“dAb”与本文所使用的术语能够结合抗原的“免疫球蛋白单可变域” 一致。免疫球蛋白单可变域可以是人抗体可变域，但是也包括其它物种的单抗体可变域，如啮齿目动物(例如在WO 00/29004中揭示的铰口鲨和骆驼Vhh dAbs)。骆驼Vra是源自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和骆马的物种的免疫球蛋白单可变域多肽，其产生天然地缺少轻链的重链抗体。这种Vhh域可根据本领域中的标准技术进行人源化处理，根据本发明，这种域仍然被认为是“域抗体”。本文使用的“Vh包括骆驼Vhh域”。本文使用的术语“抗原结合分子”是指抗体、抗体片段和能够结合到靶标的其它蛋白结构。“域”是折叠蛋白结构，具有独立于余下的蛋白的三级结构。一般地，域负责蛋白的离散的功能特性，在很多的情况下可加入、移除或转移到其它的蛋白上，而不损失该蛋白和 /或域的余下部分的功能。“单抗体可变域”是折叠的多肽域，其包括抗体可变域的序列特征。因此，它包括完整的抗体可变域和修饰的可变域，例如，其中的一个或多个环已经被非特征性的抗体可变域的序列取代，或者被截短或包括N或C末端延伸部分的抗体可变域，以及可变域的折叠片段取代，所述折叠片段至少保留结合活性和全长域的特异性。本文使用的术语“光散射技术”是指用来确定溶液中的小粒子的粒度分布特征的方法-光散射技术的一个例子是可用来测量纳米粒子的动态光散射，光散射的另一例子是可用于测量微球体的静态光散射或小角度光散射。本位使用的术语“动态光散射”(DLQ是使用通过粒子分散利用散射光以得出粒度的信息的方法。动态光散射取决于这样的事实，即当在液体悬液中时，粒子的Browian运动依赖粒度，且粒子的Browian运动使来自粒子样品的散射光的强度产生波动。通过相关的函数分析这些波动，以得出粒径。接着利用斯托克斯-爱因斯坦方程算出粒子的平均流体力学直径。“多指数分析”可得出粒度分布，可确定不同样品内部的不同物种的存在。DLS通常可用于纳米粒子的分析。整份说明书中可换用的术语“静态光散射”或“小角度激光光散射”有时是指激光衍射。激光衍射依赖的是衍射角与粒度成反比的事实。该方法使用全米氏理论，其完全解答了光与物质的相互作用的方程。激光衍射可用来分析纳米粒子和微粒子(直径为 0. 02-2000 微米)。本文使用的术语“血脑屏障”(BBB)是指主要保护脑不受血液中的化学物质影响， 但仍允许基础代谢功能的膜结构。它由脑微血管内皮细胞组成，其在脑毛细血管中紧密聚集。与身体其它任何部位的毛细血管的内皮细胞相比，这种较高的密度更能限制物质从血流通过。在整篇说明书中，药物载入的百分比定义为在粒子制剂中使用的每份物料的重量 (聚合物重量)中含有的药剂的重量百分比w/V。药物载入(药物重量/粒子制剂中使用的物料重量)XlOO %。在整篇说明书中，参考多个实施方式以清楚简洁的语言描述了本发明。应该理解的是，在不脱离本发明的范围内实施方式可有多种组合或者分开使用。
实施例
实施例1通过HIP方法制备PBCA纳米粒子通过在含有溶解的HIP离子(在Iml 二氯甲烷中的多库酯钠，3. 058-6. 116% w/v) 的有机相中加入ΙΟΟμΙ BCA单体以制备纳米粒子。将得到的溶液经移液器移入水相(1% w/v 葡聚糖，0.2% pluronic F68, IOml, ρΗ7· 0)中，使用 Silveron L4RT 均化器以 7000 的速度进行均化处理。接触中性PH的水相使BCA单体快速聚合形成PBCA聚合物。将形成的乳液均化处理45秒，接着在通风橱中孵育3小时，使有机相蒸发并形成纳米粒子。将得到的纳米粒子悬液在4°C下储存。实施例2通过动杰光散射确认纳米粒子形成使用动态光散射(DLQ通过测量粒度来确认经HIP方法形成的PBCA纳米粒子。使用Broolihaven仪器公司微粒粒度分析仪(BIC 90plus)来分析粒子。图1所示为经DLS得到的粒度数据，表明悬液中有纳米粒子存在。通过DLS得到的粒度表明形成了平均流体力学直径为的纳米粒子(图la)。也发现粒子群是相对单分散的，而测量样品中的粒度范围有多宽的多分散指数为O.M2(图la)。这低于粒子制剂的最大的可接受值0.300。 一般而言，该相关图确认了粒子制备方法已经成功地产生了高质量的PBCA纳米粒子悬液。得到的数据表明大多数的粒子是小的(图lb-d)。结果表示，约96. 3%的粒子群的直径为210. 37nm或更小(图lb)。还发现悬液似乎也没有大的聚集块，且不含有直径大于732. 05nm的任何粒子，大多数的粒子群显然更小(图Ic)。此外，该制剂看来还不含直径小于143. 38nm的任何粒子(图Id)。因此，大多数粒径在143. 38nm_210. 37nm之间，一种静脉给药的安全粒度，但不是非常的小，以至于减小药物加载的效率。图1(a)-通过动态光散射对纳米粒子悬液分析后获得的相关图。根据得到的数据，粒子的平均流体力学直径为4nm，多分散指数为0. 2420图1(b)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量) 相对于粒度范围的分布。数据表明96. 3%的粒子群的直径似乎为201. 37nm或更小。图1(c)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量) 相对于粒度范围的分布。数据表明96. 3%的直径为201. 37nm或更小，100%的粒子样品的直径为732.05nm或更小。因此，悬液中没有发现大的聚集块，且因而认为对静脉给药是安全的。图1(d)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量) 相对于粒度范围的分布。数据表明6. 2%的粒子样品直径为143. 38nm或更小。当制备不同的纳米粒子制剂时，还发现该方法得到了相似的纳米粒子粒度。表1 总结了一系列的从6个不同的组合物制剂得到的粒度数据
1权利要求
1.一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤a)在疏水离子配对(HIP)试剂存在下使生物活性剂在有机溶剂中溶解以形成有机相；b)使聚合物形成物质的单体或寡聚体溶解于(a)中形成的有机相中；c)在连续水相中形成在(b)中形成的有机相的乳液，以使单体聚合；以及d)得到从乳液中形成的微粒载体。
2.一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤a)使在水相中的生物活性剂与在有机溶剂相中的疏水离子配对(HIP)试剂混合，以形成生物活性剂-HIP复合物；b)从水相中分离复合物；c)除去水相，并使复合物与有机相均化；d)(i)使聚合物溶解于(c)中形成的有机相，然后在连续水相中形成有机相的乳液；或者( )使聚合物形成物质的单体或寡聚体溶解于(c)中形成的有机相中，然后在连续水相中形成有机相的乳液，以允许单体或寡聚体聚合形成聚合物；以及e)得到从步骤(d)中的乳液中形成的微粒载体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的单体包含氰基丙烯酸烷基酯 (ACA)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的单体包含氰基丙烯酸丁酯(BCA)。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚-L-交酯 (PLA)、聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)或聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)或聚己酸内酯、聚羟基丁酸酯和/或其共聚物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚己酸内酯。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚(丙交酯-乙交酯) 共聚物(PLG)。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚-L-交酯(PLA)。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述连续水相的pH为约6或更高。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，所述的微粒载体是纳米粒子。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂是蛋白或肽。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂是抗原结合分子。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原结合分子包括域。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原结合分子是抗体。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原结合分子是域抗体。
16.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂在没有疏水离子配对试剂存在的条件下不溶于有机相中。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，当生物活性剂是阳离子时， 所述的HIP试剂是阴离子HIP试剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的HIP试剂是多库酯钠。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，当生物活性剂是阴离子时，所述的HIP试剂是阳离子HIP试剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的HIP试剂是二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB18)、1，2-二油酰基氧基-3-三甲铵丙烷(DOTAP)、或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
21.一种微粒载体，其特征在于，该微粒载体包括由前述任意一项权利要求所述的方法可得到的囊封的生物活性剂。
22.根据权利要求21所述的微粒载体，其特征在于，所述的蛋白与聚合物的比例至少是约1. 0% w/w，或至少约2. 5% w/w或者至少是约5% w/w。
23.根据权利要求21所述的微粒载体，其特征在于，所述的肽与聚合物的比例至少是约5% w/w,或至少约9% w/w。
24.根据权利要求21所述的微粒载体，其特征在于，所述的抗体与聚合物的比例至少是约w/w，或至少约2. 5% w/w。
25.根据权利要求21所述的微粒载体，其特征在于，纳米粒子中所述的域抗体与聚合物的比例至少是约5% w/w。
26.—种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求21-25中任一项所述的微粒载体。
27.根据权利要求26所述的药物组合物在治疗或预防疾病中的用途。
全文摘要
本发明提供使用Hip试剂将生物活性剂(如蛋白)囊封在微粒载体(如纳米粒子)中的多种方法。本发明还提供包括利用这些方法可得到的微粒载体的组合物以及这些组合物在治疗中的用途。
文档编号A61K9/51GK102215830SQ200980126814
公开日2011年10月12日 申请日期2009年5月5日 优先权日2008年5月6日
发明者I·帕帕尼科劳乌 申请人:葛兰素集团有限公司