视网膜细胞存活的HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HIF1α调节的制作方法

专利名称：视网膜细胞存活的HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HIF1α调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经变性性疾病，例如，视网膜变性。
背景技术：
由于视网膜细胞死亡导致的视力下降和失明是一个严重的问题。在2004年的公报中，世界卫生组织(WHO)估计，全球失明和视障的人口超过3亿，在美国几乎有1千万 (WHO Bulletin 82pp844-851-Global Data on Visual Impairment November，2004)。 $ 发达国家，老人失明的主要原因是年龄相关性黄斑变性(AMD)，据估计其造成美国全部失明病例的一半。AMD逐渐破坏清晰的中心视力(sharp central vision)，后者是诸如驾驶和阅读的活动所需要的。AMD是以软和硬的玻璃疣(drusen)的存在、视网膜色素上皮(RPE) 的改变的色素沉着、RPE萎缩和脉络膜新生血管(CNV)为特征的一组不同的疾病。AMD通常分为两种形式，即干性和湿性AMD。干性AMD包括碎片的积聚和在外视网膜中的沉积，伴随 RPE中、特别是中心视网膜之下的萎缩和肥大性变化。湿性AMD是一种病理过程，继发于在大约20%的AMD患者中发生的血管新生血管变化(例如，CNV)。目前还不清楚这两种形式 (湿性和干性)是相同病症的不同表现形式，还是具有截然不同的起源和病理的不同的疾病。最近，已经开发出了湿性AMD的治疗。例如，抗血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如来自 Genentech(South San Francisco, CA)的AVASTIN 和LUCENTIS ,表现出在某些情况下对治疗确定的AMD的益处。除了 AMD，还描述了其他视网膜疾病。色素性视网膜炎(RP)由损害视杆感光细胞 (视杆)并导致其死亡的突变造成。一些突变导致视杆细胞迅速死亡，而另外一些导致这些细胞缓慢损失。但是，不管机制如何，一个共同的特征是视杆光感受器的损失。由于这种损失，患者变得在昏暗的照明下无法看清，但保留在光线充足的时候阅读和驾驶的能力。这些其余的活动是由视锥光感受器介导的，直到大部分视杆已经死亡视锥光感受器仍然保持完整，然后它们开始死亡。因此，视杆和视锥感光细胞死亡的预防作为一种治疗或预防RP的方法是可取的。青光眼是另一种常见致盲疾病。它涉及视网膜的输出神经元神经节细胞的损失。 在许多情况下，这种死亡伴随着增加的眼内压，而在其他情况下，压力处于正常范围内。在所有情况下，神经节细胞死亡和失明是其结果。使用多种小鼠模型来研究视网膜细胞死亡和视网膜疾病。特别地，由于极少有视杆细胞死亡在正常发育过程中发生，因此普遍在视网膜变性模型中研究视网膜细胞存活。 在视杆特异性基因磷酸二酯酶6 β (PDE 6β亚基)中的突变导致几种类型的动物以及人类中的光感受器变性。在小鼠中，这种突变也被称为rdl突变(Bowes等人(1990)Nature 347 677 ；McLaughlin ^ 人(1993) Nat. Genet. 4 :130-4 ；Rakoczy ^ 人(2006) Exp. Eye Res. 82(5) 741，Epub 2005Decl)。Rdl/rdl小鼠对于Pde6 β基因的外显子7中的无义突变是纯合的，这完全扰乱了视杆磷酸二酯酶的β亚基的产生(Carter-Dawson等人，1978)。 视杆发育，但随后在出生后第(P) 12天和P21之间经历迅速变性。因此，携带突变的小鼠是有用的视网膜细胞疾病、特别是关于视杆细胞的光感受器变性的模型。例如，rdl小鼠用作人类色素性视网膜炎(RP)的模型(Komeima 等人(2007) J. Cell Physiol. 213 :809)。Rdl 小鼠也用作年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。(Rohrer等人(2007)Exp. Eye Res. 84(1) 82，Epub 20060ct 25)。失明的分子机理仍不清楚。因为细胞死亡是导致失明的重要方面，与通过控制DNA 调控细胞存活有关的分子和过程正处于积极研究中。关键的细胞存活机制是通过组蛋白蛋白质的赖氨酸乙酰化对基因表达的调控。赖氨酸乙酰化是乙酰基由乙酰辅酶A(CoA)向赖氨酸残基的氨基的转移。乙酰化是可逆的，且在体内通过去除乙酰基的乙酰转移酶和脱乙酰酶的竞争作用来控制。早期的研究确定组蛋白蛋白质为赖氨酸乙酰化的主要底物，后来的研究确定许多蛋白质为组蛋白乙酰化或组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的底物。因为组蛋白蛋白质参与调控基因表达，HDAC已经主要作为催化组蛋白脱乙酰化的转录辅阻遏物 (corepressor)进行研究(Nagy 等人，1997 ；Strahl 和 Allis，2000)。存在几类HDAC (参见，Yang 和 Gr6goire (2005)Mol. Cell. Biol. 25 :2873)。IIA 类组蛋白脱乙酰酶，其包括HDAC4、-5、-7、-9，共有几个特点。它们结合MEF2并抑制其活性，并且它们经受细胞质和细胞核之间的细胞内运输。这种运输受信号诱导的磷酸化调控(Miska 等人(1999)Embo. J. 18 :5099)。例如，HDAC4可以被钙/钙调蛋白依赖的激酶IV(CaMKIV) 磷酸化(Zhao等人(2001) J. Biol. Chem. 276 :35042)。磷酸化募集磷酸结合蛋白14-3-3，由此产生的复合物有效地从核输出(Wang和Yang(2001)Mol.Cell.Biol.21 :5992)。HDAC4在去磷酸化和与14-3-3解离后，可以随后重新进入核(Grozinger和khreiber (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA doilO. 1073)。本领域需要用于预防、治疗、诊断和预测由于一种或多种视网膜疾病或一个或多个自然事件引起的视网膜细胞功能下降所导致的视力丧失的疗法。

发明内容
本发明部分地基于以下发现HDAC4、HDAC5和HDAC6各自在神经(例如，视网膜) 细胞存活中发挥重要作用。已发现HDAC7在视网膜细胞中具有与HDAC4、5和6类似的分布，且由于其与其他IIa类HDAC的高度同源性和类似的分布情况，它还参与神经(例如，视网膜)细胞的存活。本发明进一步部分地基于以下发现=HIFlci也在神经(例如，视网膜) 细胞存活中发挥重要作用。在某些示例性的实施方式中，提供了一种抑制视网膜细胞死亡的方法，包括以足以抑制视网膜细胞死亡的量在一种或多种视网膜细胞中表达外源性HDAC4和/或外源性 HIFl α。在某些方面，视网膜细胞是，例如，双极细胞、视杆感光细胞、视锥感光细胞及其组合。视网膜细胞死亡可以自然发生或由诸如年龄相关性黄斑变性或色素性视网膜炎的视网膜疾病引起。在某些方面，编码外源性HDAC4和/或外源性HIFl α的核酸序列通过体内电穿孔和/或通过病毒载体被递送到视网膜细胞。在某些方面，外源性HDAC4在细胞质中表达。 外源性HDAC4可以包括导致外源性HDAC4定位于神经元细胞的细胞质中的突变，例如，对于 HDAC4-L175A观察到的表型。在某些方面，外源性HIFl α没有被ARDl乙酰化，没有被泛素化和/或没有经受蛋白酶体降解。在某些方面，外源性HIFl α包括导致外源性HIFl α具有组成型活性的(constitutively active)突变。在某些示例性的实施方式中，提供了一种抑制视网膜细胞死亡的方法，包括抑制视网膜细胞中的内源性HDAC4的降解，以抑制视网膜细胞死亡。在某些示例性的实施方式中，提供了一种抑制视网膜细胞死亡的方法，包括防止 ARDl乙酰化视网膜细胞中的HIFl α，以抑制视网膜细胞死亡。在某些方面，抑制HIFl α泛素化。在某些示例性的实施方式中，提供了一种抑制双极细胞死亡的方法，包括以足以抑制双极细胞死亡的量在双极细胞中表达外源性HDAC6。在另一方面，本发明提供了抑制神经元细胞死亡的方法。该方法包括将细胞与一种增强HDAC4或HIFl α的表达和/或活性的试剂接触，从而抑制视网膜细胞的死亡。在再另一方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者的神经变性性疾病的方法。 该方法包括向受试者施用一种增强HDAC4或HIFl α的表达和/或活性的试剂，从而治疗或预防该受试者的所述神经变性性疾病。适用于本发明方法的细胞包括视网膜细胞，诸如双极细胞、视杆感光细胞或视锥感光细胞。用于本发明方法的试剂包括核酸分子。合适的核酸分子可能在细胞的细胞质中表达。例如，在一个实施方式中，核酸分子包括包含突变的HDAC4基因，所述突变导致外源性 HDAC4定位于细胞的细胞质中，诸如HDAC4-L175A。在本发明的其他实施方式中，核酸分子包括没有被ARDl乙酰化的HIFl α基因。在一个实施方式中，核酸分子包括没有被泛素化的 HIFla基因。在再另一实施方式中，核酸分子包括没有被蛋白酶体降解的HIFl α基因。在另一实施方式中，核酸分子包括包含导致外源性HIFl α具有组成型活性的突变的HIFl a 基因。神经元细胞死亡可以自然发生或由诸如年龄相关性黄斑变性或色素性视网膜炎的神经变性性疾病引起。在其他方面，本发明提供了抑制神经元细胞死亡的方法。该方法包括将细胞与一种抑制细胞中HDAC4降解的试剂或防止ARDl乙酰化所述细胞中的HIFl α的试剂接触。在一个实施方式中，抑制HIFl α泛素化。在另一方面，本发明提供了抑制双极细胞死亡的方法。该方法包括将细胞与一种增强所述细胞中HDAC6的表达和/或活性的试剂接触，从而抑制所述双极细胞的死亡。在一个实施方式中，核酸分子包含在载体中，例如，逆转录病毒、腺病毒、腺病毒/ 逆转录病毒嵌合体、腺伴随病毒(AAV)、单纯疱疹病毒I或II、细小病毒、网状内皮组织增殖病毒(reticuloendotheliosis virus)、脊髓灰质炎病毒、乳头瘤病毒、痘苗病毒和慢病毒。在一个特定的实施方式中，载体是AAV载体，例如，AAV 2/5或AAV 2/8载体。


图1A-1D说明HDAC4在发育中的和成熟的小鼠视网膜中的表达。(A，B)分别为在 Pl和P21的视网膜切片的HDAC4免疫组织化学。(C，D)抗-HDAC4抗体与阻断肽的预温育导致在Pl和P21染色缺乏。箭头(B，D)，由小鼠抗体标记的血管。图2A-I说明HDAC4对于视网膜细胞的存活是必不可少的。使用在PO通过体内电穿孔导入野生型小鼠视网膜的RNAi，在P6(A-C)或P5(D-J)经分析，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)或HDAC4蛋白质水平降低。(A)具有GAPDH RNAi的视网膜的冷冻切片(Cryosection)。(B)具有HDAC4 RNAi的视网膜的冷冻切片。(C)具有HDAC4 shRNA和 RNAi抗性HDAC4表达构建体的视网膜的冷冻切片。(D-F)利用末端尿苷脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析检测凋亡性细胞死亡。(D)具有GAPDH RNAi的视网膜的冷冻切片。箭头表示TUNEL+细胞。(E)具有HDAC4 RNAi的视网膜的冷冻切片。箭号表示 TUNEL+GFP-细胞。箭头(arrowhead)表示 TUNEL+GFP+细胞。(F)具有 HDAC4 RNAi 的视网膜的冷冻切片，来自非电穿孔区域。箭号表示TUNEL阳性细胞。(G-J)活化的胱天蛋白冬酶-3(caspase-3)免疫组织化学。(G) GAPDHRNAi视网膜切片。_DAC4 RNAi切片。 箭号表示活化的胱天蛋白酶-3+GFP+细胞。(I)没有GFP覆盖的(G)中的图像。(J)没有 GFP覆盖的(H)中的图像。(K)在P3、P4、P5和P6，对于每次处理的3个电穿孔视网膜的每 10(^111切片，计数在!104(4 shRNA或GAPDHshRNA电穿孔之后的GFP+细胞数。在具有HDAC4 shRNA的视网膜中观察到的GFP+细胞数表示为由GAPDH shRNA电穿孔的细胞中GFP+细胞数的百分比。图3A-3F说明HDAC4过度表达使双极(BP)细胞免于自然发生的细胞死亡。由 pCAG-GFP(A)或pCAG-HDAC4(B)电穿孔的视网膜的冷冻切片，BP细胞位于INL的上半部分， 它们的突起(process)延伸到IPL。(C)示意图，表明视网膜克隆如何由自然发生的BP死亡成形，以及HDAC4防止死亡。(D)在P21使用在PO注射的不能复制的逆转录病毒LIA或 LIA-HDAC4进行的克隆分析。LIA-HDAC4克隆显示含有BP细胞的克隆的百分比增加，而一视杆克隆(one rodclone)的百分比减少。对3个由LIA或LIA-HDAC4感染的视网膜中的每一个分析800-1000个克隆。经乂11如时t-检验广*p< 0.05。(E)显示典型的一视杆克隆的视网膜切片，其包括大多数克隆类型。(F)显示典型的一视杆加一 BP克隆的视网膜切片，它是增加最多的由LIA-HDAC4标记的克隆类型。图 4A-4K 说明 HDAC4 防止视网膜变性。(A-D)在 PO，用 pCAG_GFP 和 pCAG_HDAC4 (B， D)或pCAG-HDAC6(A，C)对rdl视网膜电穿孔，并在P50使用抗视紫红质对铺片视网膜 (flat-mountretinas)分析视杆光感受器的存活(C和D中的中灰色)。GFP标记电穿孔的面积(A 和 B 中的浅灰色和中灰色)(E-J)。pCAG-GFP 和 pCAG_HDAC6 (Ε, F, G)或 pCAG_HDAC4 (H, I，J)和视紫红质启动子的报告构建体(Mio-DsRed(Il))在PO共电穿孔，在P70分析抗视紫红质(F，I)或报告活性。(K)在P70，rdl小鼠中HDAC4介导的拯救(rescue)的量化。计数电穿孔区域中每100 μ m切片的liho-DsRed+细胞数。从3个独立的电穿孔对5个视网膜评分。 图5A-5N说明，HDAC4可稳定HIFl α蛋白质，且HDAC4拯救光感受器需要HIFl α。(A-F) HDAC4稳定野生型视网膜中的HIFl α。在PO用pCAG_HDAC4和pCAG_GFP或 PCAG-HDAC6和pCAG_GFP对野生型视网膜电穿孔，并在P14通过抗HIFl α免疫组织化学对视网膜切片进行分析。㈧在HDAC4电穿孔的视网膜中，只在HDAC4电穿孔区域(C，D)，通过抗-HIFl α (B)在光感受器OS中检测到HIFl α蛋白质。(E)在HDAC6电穿孔的区域， 没有检测到HIFl α的免疫反应性(F)。(G-J)HDAC4稳定rdl视网膜中的HIFl α。在PO 用 pCAG-HDAC4 和 pCAG_GFP(G，H)或 pCAG_HDAC6 和 pCAG_GFP(I，J)对 rdl 视网膜共电穿孔，并在P22通过抗-HIFl α免疫组织化学进行分析。(K_N) HDAC4拯救光感受器需要稳定的 HIFl α。在 PO 用 pCAG-HDAC4(K，L)或 pCAG_HDAC4 加上显性阴性(dn)形式的 HIFl α、 pCAG-dnHIFl α (Μ, N)和pCAG_GFP对rdl视网膜共电穿孔，并在P70通过视紫红质免疫组织化学分析杆光感受器的存活。图6A-6D显示转染的细胞中的HDAC4 RNAi筛选。HDAC4传感器 HDAC4-IRES-GFP与shRNA至HDAC4或shRNA至GAPDH共转染进入293T细胞。在转染后24 小时分析HDAC4传感器的减少(knockdown)。共转染pCAG-HcRed以监测转染效率。(A) HDAC4-IRES-GFP被HDAC4 RNAi减少而不被GAPDH RNAi减少(B)，而转染数量相当的细胞 (C，D)。图7A-7B显示HDAC6的过度表达拯救BP细胞免受在野生型视网膜中自然发生的细胞死亡。来自视网膜的P14冷冻切片在PO被pCAG-GFP(A)或pCAG_HDAC6 (B)电穿孔，而 BP细胞位于INL的上半部分。图8A-8I显示HIFl α乙酰化突变体救治视网膜变性。(A-H)在Ρ0，用pCAG_GFP、 Rho-DsRed和 pCAG-wt HIFl α (B, F)、pCAG_HIFlα K532R(C, G)或 pCAG_HDAC4(D,H)对 rdl 视网膜电穿孔，并在P70分析光感受器的存活。(I)在P70，rdl小鼠中的光感受器存活的量化。在电穿孔的区域，计数每IOOym切片的I^ho-DsRed+细胞数。每次处理对3个视网膜评分。根据Student t-检验，***ρ < 0. 05。图9A-9C显示HDAC4主要在发育的小鼠视网膜的细胞质中。对于HDAC4 (A)和 1^x6 (B)，Pl视网膜切片进行双免疫染色，在(C)中覆盖。图10显示AAV2/5 HDAC4的注射导致视锥存活。将编码GFP (对照)或HDAC4的 AAV 2/5注入PO的rdl小鼠眼睛的视网膜下间隙。在P60，对视网膜切片，并对于HDAC4 (浅灰色)或视锥抗原(PNA，中灰色)进行免疫组织化学染色。通过DAPI对细胞核染色。在具有HDAC4的视网膜中，如PNA和HDAC4染色的细胞数所显示，更多的视锥存活。在对照感染中很少有视锥细胞存活。
具体实施例方式本发明部分地基于以下发现HDAC4、HDAC5和HDAC6各自在神经(例如，视网膜) 细胞存活中发挥重要作用。已发现HDAC7在视网膜细胞中具有与HDAC4、5和6类似的分布， 且由于它与其他IIa类HDAC的高度同源性和类似的分布情况，它还参与神经(例如，视网膜)细胞的存活。本发明进一步部分地基于以下发现=HIFlci也在神经(例如，视网膜)细胞存活中发挥重要作用。因此，本发明提供抑制神经元(例如，视网膜)细胞死亡的方法。 这种方法一般包括将神经元(例如，视网膜)细胞与诸如本文所述的HDAC4、HDAC6、HDAC7 或HDAC5和/或HIFlα核酸分子等试剂接触。本发明还提供治疗患有视网膜神经变性性疾病的受试者的方法。这种方法一般包括向受试者施用有效量的诸如本文所述的HDAC4、 HDAC6、HDAC7或HDAC5和/或HIFl α核酸分子等试剂。在本发明的某些实施方式中，核酸分子包含在载体中，诸如逆转录病毒、腺病毒、 腺病毒/逆转录病毒嵌合体、腺伴随病毒(AAV)、单纯疱疹病毒I或II、细小病毒、网状内皮组织增殖病毒、脊髓灰质炎病毒、乳头瘤病毒、痘苗病毒和慢病毒。在一个实施方式中，载体是AAV载体。在一个实施方式中，AAV载体是AAV 2/5或AAV2/8载体。在本发明的其他实施方式中，核酸分子不包含在载体中。本发明的原理具有独特优势，可以用于通过增加神经元(例如，视网膜)细胞中表达的一种或多种蛋白质或蛋白质部分的水平来治疗、预防和/或延迟神经元(例如，视网膜)细胞损失。在某些方面，改变(即增加)生物体中的一种或多种HDAC蛋白质(例如，HDAC4、 HDAC5、HDAC7、HDAC9和/或HDAC6)或其部分和/或HIFl α蛋白质或其部分的水平，以治疗、预防和/或延缓神经元(例如，视网膜)细胞的损失。本发明的原理也可适用于通过降低神经元(例如，视网膜)细胞中表达的一种或多种蛋白质或蛋白质部分的水平，来促进和/或加速神经元(例如，视网膜)细胞的损失。 在某些方面，改变(即降低)生物体中的一种或多种HDAC蛋白质(例如，HDAC4、HDAC5、 HDAC7、HDAC6和/或HDAC9)或其部分和/或HIFl α蛋白质或其部分的水平，以通过促进和/或加速神经元(例如，视网膜)细胞的损失治疗神经元(例如，视网膜)细胞的异常增殖。在本发明的一个方面，通过表达HDAC4的细胞质突变体来提高视网膜细胞的存活。在某些方面，细胞质突变体是HDAC4突变体，与野生型蛋白质相比，它更大程度地存在于细胞质内，更小程度地存在于细胞核中。一些细胞质突变体是本领域已知的；例如， HDAC4-L175AfPHDAC4-A118(WangfPYang(2001)Mol. Cell. Biol. 21 :5992)。在某些方面， 理想的是细胞质HDAC4突变体主要存在于细胞质中，而只有很少存在于细胞核中。细胞质 HDAC4突变蛋白可能根本不存在于细胞核中。细胞质HDAC4的增多也可以通过激活或过度表达已知促进HDAC4在细胞质中的存在提高的蛋白质来完成；例如，CaM激酶I、II、IV、 14-3-3蛋白等(参见，Yang和Gr6goire25(8) :2873. (2005)及其中的参考文献)。增加HIFl α的蛋白水平可以防止rdl小鼠中的视杆感光细胞的损失。因此，在本发明的某些方面，神经细胞中的增加的HIFl α水平是需要的。增加的HIFl α水平可以通过稳定内源性表达的蛋白质实现，例如，通过HDAC4的过度表达。在某些示例性的实施方式中，增加的HIFl α水平可以通过其他方法实现，例如HIFl α蛋白的过度表达。过度表达可以通过本领域已知的任何适当的方法来实现，包括本文所述的关于增加HDAC4蛋白的水平的方法。当检测到高于内源性水平的HIFl α蛋白时，实现增加的HIFl α水平。在其他示例性的实施方式中，可以提供具有组成型活性的HIFl α蛋白质。在再另一方面，本发明人已经提供了通过增加HDAC4和/或HDAC6的水平来改善双极(BP)细胞的存活的方法。可以实现向BP细胞的祖细胞递送核酸，例如，通过逆转录病毒感染。通过增加祖细胞中HDAC4和/或HDAC6的表达水平，实现双极细胞的数目增加。双极细胞的数目增加可以是大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍或更大。在某些方面，外源性HDAC(例如，HDAC4和/或HDAC6)、和/或外源性HIFl α、和/或其部分在神经元(例如，视网膜)细胞中表达或接触该细胞，使得外源性HDAC(例如，HDAC4和/或HDAC6)或外源性HIFl α表达后的细胞中的总HDAC (例如，HDAC4和/或 HDAC6)或总HIFl α水平与外源性HDAC或外源性HIFl α表达前的总HDAC(例如，HDAC4 和/或HDAC6)或总HIFl α水平相比提高。在外源性HDAC(例如，HDAC4和/或HDAC6)和 /或HIFl α表达后的总HDAC(例如，HDAC4和/或HDAC6)或总HIFl α水平可以比外源性HDAC (例如，HDAC4和/或HDAC6)或外源性HIFl α表达前的总HDAC (例如，HDAC4和/ 或 HDAC6)或总 HIFl α 水平提高大约 5 %、10 %、15 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%,90% ,100%, 150 %,200 %,250 %,300 %,350 %Α00 %>450 %,500 550%,600%, 650 700%,750%, 800 %、850 %、900 %,950%,1000% 或更多。在其他方面，神经元(例如，视网膜)细胞与本文所述试剂接触，与接触该试剂前的总HDAC (例如，HDAC4和/或HDAC6)或总HIFl α水平相比，该试剂降低细胞中的 HDAC (例如，HDAC4和/或HDAC6)或HIFl α水平。在与试剂接触之后，HDAC (例如，HDAC4 和/或HDAC6)或HIFl α水平可以降低至与该试剂接触之前总HDAC(例如，HDAC4和/或 HDAC6)或总 HIFl α 水平的大约 5 % UO % ,15 %,20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70 %,80 %, 90% ,100% ,150%,200%,250%,300%,350%,400%,450%,500%,550%,600%,650%, 700 %、750 %、800 %、850 %、900 %,950%,1000% 或更多。如本文所用，术语“接触”(即，细胞与试剂接触)意在包括在体外将试剂和细胞在一起温育(例如，向培养的细胞添加试剂)或向受试者施用试剂，使得试剂与受试者的细胞在体内接触。术语“接触”不包括将细胞暴露于可能在受试者中自然存在的试剂(即，可能由于自然的生理过程而发生的暴露)。在某些示例性的实施方式中，本发明提供用于治疗、预防和/或延迟与生物体中的神经元细胞相关的病症和疾病(例如，神经变性性疾病)的方法和材料。如本文所用，术语“神经变性性疾病”包括但不限于，眼睛的神经变性性疾病，诸如，萎缩性黄斑变性、色素性视网膜炎、医源性视网膜病变、视网膜撕裂和裂孔、糖尿病性视网膜病变、镰状细胞视网膜病变、视网膜静脉和动脉阻塞等。神经变性性疾病还包括但不限于某些以血管发生和神经变性为特征的眼科疾病，诸如镰状细胞视网膜病变和视网膜静脉或动脉阻塞。神经变性性疾病进一步包括诸如视神经病变、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、皮克病、佩-梅二氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、植烧酸C: 积症(Resfum' s disease)、山德霍夫氏病(sandhoff disease)、弥漫性硬化(Schilder disease)、斯-里-奥综合征(Meele-Richardson-Olszewskidisease)、肌萎缩性侧索硬化症、原发性侧索硬化症、多发性硬化、多系统萎缩、发作性睡病、神经包柔螺旋体病 (neuroborreliosis)、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩症、脊髓痨、朊病毒疾病(例如，羊瘙痒症、克雅氏病、Gerstmann-Strassler Scheinker病、牛海绵状脑病等)、亚历山大疾病、 阿尔珀病、共济失调毛细血管扩张症、巴廷病、卡纳万病(Canavan disease)、科凯恩综合征 (Cockaynesyndrome)、皮质基底节变性、HIV相关的痴呆、肯尼迪氏病、克拉贝病、路易体痴呆症、脊髓小脑共济失调3型、继发于恶性贫血的脊髓亚急性联合变性、精神分裂症、巴廷病等疾病。在某些示例性的实施方式中，本发明提供了促进和/或加速细胞的损失(例如，神经元(例如，视网膜)细胞损失)来治疗、预防和/或延迟一种或多种与异常神经元细胞增殖相关的病症和/或疾病(例如癌症)的方法和材料。细胞增殖病症意在包括与迅速增殖相关的疾病。如本文所用，术语“细胞增殖病症”包括以多细胞生物体中的一个或多个细胞亚组的不良或不当增殖为特征的疾病。术语 “癌症”指各类恶性肿瘤，其中大部分可侵入周围组织，并可能转移到不同部位(参见，例如， PDR医学辞典第1版(1995)，本文为所有目的引入全部内容作为参考)。术语“瘤”和“肿瘤”是指通过细胞增殖比正常细胞更快速地生长的不正常的组织。同上。这种不正常的组织显示部分或完全缺乏结构组织和与正常组织的功能协调，它可能是良性的(即良性瘤) 或恶性的(即恶性肿瘤)。本发明包含的瘤类型的例子包括但不限于那些与神经组织、造血组织、乳腺、皮肤、骨骼、前列腺、卵巢、子宫、宫颈、肝、肺、脑、喉、胆囊、胰腺、直肠、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、免疫系统、头颈、结肠、胃、支气管、和/或肾的癌症相关的瘤。如本文所用，术语“生物体”包括但不限于人、非人类灵长类动物、牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、沙鼠、青蛙、蟾蜍及其转基因物种。术语“生物体”还包括但不限于酵母细胞、酵母四分体(yeast tetrad)、酵母菌落、细菌、细菌菌落、病毒体、病毒颗粒、病毒样颗粒和/或其培养物等。在本发明的一个实施方式中，适用于本发明方法的细胞是神经元细胞。如本文所用，术语“神经元”或“神经元细胞”指能够接受和传导来自神经系统的电脉冲的神经细胞。 神经细胞或“神经元”通常包括细胞体、轴突、轴突终端和树突，且很容易由本领域的技术人员识别。在一个实施方式中，神经元是“感光细胞”，即在视网膜中发现的特化的神经元。视网膜是薄的、透明的组织，含有大约1. 2亿单独的视杆细胞(夜视)和700万视锥细胞(日间和彩色视觉)以及数百万其他结构支持和互连细胞。感光细胞由“视杆”和“视锥”组成， 它们是视网膜的感光细胞。视杆含有视紫红质-视杆感光色素，视锥含有其他不同的感光色素，这些感光色素对光作出反应，并最终引起视网膜的输出细胞-神经节细胞-的神经放电。最终，该信号被记录为视觉皮层和大脑中的其他目标位置的视觉刺激。视网膜色素上皮(RPE)细胞产生、储存和转运多种负责光感受器的正常功能和存活的因子。也可以感受光的视网膜神经元由光感神经节细胞组成。这些细胞被称为黑视素(melanopsin)神经节细胞，在内视网膜中发现，具有树突和投射到protectunK中脑)、下丘脑中的视交叉上核和外侧膝状体(丘脑)的长轴突。视网膜也由位于光感受器(视杆细胞和视锥细胞)和神经节细胞之间的双极细胞组成。这些细胞从光感受器向神经节细胞传送信号。双极细胞接受来自视杆或视锥但不是二者同时的突触输入，它们分别被称为视杆双极细胞或视锥双极细胞。在一个实施方式中，感光细胞是视杆。在一个实施方式中，感光细胞是视锥。在一个实施方式中，感光细胞是细胞，是双极细胞。本发明的某些方面涉及载体，例如，含有编码一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白 (和/或其部分)的核酸的表达载体。如本文所用，术语“载体”指能够运送已与之连接的另一种核酸的核酸分子。载体的一个类型是“质粒”，它指环状双链DNA环，另外的DNA片段可以连接到其中。载体的另一种类型是病毒载体，其中，另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型(印isomal)哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合进入宿主细胞的基因组，从而连同宿主基因组被复制。此外， 某些载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。一般来说，在重组DNA技术中应用的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，本发明意在包括发挥相当的功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。如本文所用，术语“逆转录病毒”指在其复制周期中利用逆转录酶的RNA病毒。逆转录病毒基因组RNA被逆转录酶转化为双链DNA。该病毒的这种双链DNA形式能够被整合进入受感染细胞的染色体中；一旦整合，它被称为“原病毒”。原病毒作为RNA聚合酶II的模板发挥作用，并引导编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。在原病毒的每个末端是称为“长末端重复”或“LTRs”的结构。LTRs含有许多调节信号，包括转录控制元件、多腺苷酸化信号、以及病毒基因组的复制和整合所需的序列。LTRs的长度可以为几百个碱基对。术语“AAV载体”指源自包括但不限于 AAV-l、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5 或 AAVX7 的腺伴随病毒血清型的载体。“rAAV载体”指包括AAV核苷酸序列以及外源核苷酸序列的载体。rAAV载体只需要顺式的145个碱基末端重复就能生成病毒。所有其他的病毒序列不是必需的，且可以提供为反式(Muzyczka(Iggz)CurrjopicsMicrobiol. Immunol. 158 97)。通常情况下，rAAV载体的基因组将只保留反向末端重复序列(ITR)序列，以使可以被载体有效包装的转基因的大小最大化。ITR不一定是野生型的核苷酸序列，并可能被改变， 例如，通过核苷酸的插入、缺失或替代，只要序列提供功能拯救、复制和包装即可。在特定的实施方式中，AAV载体是AAV2/5或AAV2/8载体。合适的AAV载体在以下文献中有描述，例如，美国专利 7，056，502 和 Yan 等人(2002) J. Virology 76(5) :2043_2053，本文通过引入其全部内容作为参考。如本文所用，术语“慢病毒”指引起缓慢发育疾病的逆转录病毒的组(或属)。包含在该组中的病毒包括HIV (人类免疫缺陷病毒，包括但不限于1型HIV和2型HIV)-人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；维士那-梅地病毒(visna-maedi)，它会导致羊的脑炎(visna)或肺炎(maedi)；山羊关节炎-脑炎病毒，它会导致山羊的免疫缺陷、关节炎和脑病；马传染性贫血病毒(EIAV)，它会导致马的自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，它会导致猫的免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，它会导致牛淋巴结病、淋巴细胞增多症和可能的中枢神经系统感染；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，它会导致类人灵长类动物的免疫缺陷和脑病。这些病毒引起的疾病的特征是潜伏期长和迁延不愈。通常情况下，病毒潜伏地感染单核细胞和巨噬细胞，它们从这些细胞扩散到其他细胞。HIV、FIV和 SIV也容易感染T淋巴细胞(即T-细胞)。在本发明的一个实施方式中，慢病毒不是HIV。如本文所用，术语“腺病毒”(“Ad”)指一组具有大约361Λ的线性基因组的双链DNA 病毒。参见，例如，Berkner 等人，Curr. iTop. Microbiol. Immunol.，158 :39-61 (1992)。在一些实施方式中，基于腺病毒的载体是基于Ad-2或Ad-5的载体。参见，例如，Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol.，158 :97-123,1992 ；Ali 等人，1994GeneTherapy 1:367-384 ；美国专利4，797，368和5，399，346。源自腺病毒株Ad型5dl324或其他腺病毒株(例如，Ad2、 Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体是本领域的技术人员公知的。重组腺病毒是有利的，因为它们不需要分裂细胞为有效的基因递送载体，且可用于感染多种细胞类型。此外，引入的腺病毒DNA (和其中包含的外来DNA)没有整合进入宿主细胞的基因组，而保持为游离型，从而避免在引入的DNA整合到宿主基因组(例如，逆转录病毒DNA)的情况下，由于插入突变可能导致发生的潜在的问题。此外，腺病毒基因组携带外来DNA的能力相对于其他基因递送载体较大(可达 8 千碱基)(Haj-Ahmand 等人 J. Virol. 57，267-273 [1986])。在一个实施方式中，腺病毒是复制缺陷型腺病毒。目前使用的大多数复制缺陷型腺病毒载体具有病毒El和E3基因的全部或部分缺失，但保留多达80 %的腺病毒遗传物质。全部病毒编码区域缺失的腺病毒载体也在以下文献中有描述=Kochanek等人和 Chamberlain等人(美国专利5，985，846和美国专利6，083, 750)。这些病毒在缺乏由第二病毒(被称为“辅助”病毒)所提供的病毒产物的情况下，无法作为病毒复制。在一个实施方式中，腺病毒载体是“无病毒(gutless)”载体。这些载体含有最少量的腺病毒DNA，且不能表达任何腺病毒抗原(因此称为“无病毒”)。无病毒复制缺陷型Ad 载体提供了显著优势容纳外来DNA的大插入片段，同时当无病毒复制缺陷型腺病毒载体用于基因治疗中时，完全消除了表达导致对于病毒蛋白的免疫应答的腺病毒基因的问题。 产生无病毒复制缺陷型Ad载体的方法已在以下文献中描述，例如，属于Kochanek等人的美国专利5，981，225和属于Chamberlain等人的美国专利6，063，622和6，451，596 ；Parks等人，PNAS 93 13565 (1996)和 Lieber 等人，J. Virol. 70 :8944-8960 (1996)。在另一实施方式中，腺病毒载体是“条件复制型腺病毒”(“CRAd”)。CRAd通过以下方法遗传修饰以在特定的细胞中优先复制(i)用组织特异性启动子替代病毒启动子； 或(ii)删除只被靶细胞补偿的对于复制重要的病毒基因。本领域的技术人员能够识别上皮细胞特异性的启动子。其他本领域已知的腺病毒载体可以在本发明的方法中使用。例子包括具有用于改变向性的重组纤维蛋白的Ad载体(例如，vanBeusechem等人，2000Gene Ther. 7 :1940-1946 中描述)、蛋白酶预处理过的病毒载体(例如，Kuriyama等人，2000Hum. Gene Ther. 11 2219-2230中描述)、E^i温度敏感突变Ad载体(例如，Engelhardt等人，1994Hum. Gene Ther. 5 :1217-1229 中描述)和“无病毒Id 载体(例如，Armentano 等人，1997J. Virol. 71 2408-2416 ；Chen 等人，1997Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94 :1645-1650 ；Schieder 等人， 1998Nature Genetics 18 180-183 中描述)。本发明的重组表达载体包含适于在宿主细胞中表达本发明的核酸的形式的本发明的核酸(例如，编码一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列)，这意味着重组表达载体包括在用于表达的宿主细胞的基础上选定的一个或多个调控序列，其可操作地连接待表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”表示感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式连接到调控序列(例如，当载体被引入宿主细胞中时，在体外转录/翻译系统或在宿主细胞中)。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和其他表达调控元件(例如，多腺苷酸化信号)。这些调控序列在以下文献中有描述，例如， Goeddel ；Gene Expression Technology :Methods inEnzymology 185，Academic Press， San Diego,Calif. (1990)。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列的组成型表达和只在某些宿主细胞中引导核苷酸序列的表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域的技术人员可以理解表达载体的设计可以取决于以下因素待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。本发明的表达载体可以被引入到宿主细胞，从而产生蛋白质或其部分，包括由本文所述的核酸编码的融合蛋白或其部分(例如，一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分)。如本文所用，术语“核酸分子”意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组cDNA)和 RNA分子(例如，mDNA)及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链，但优选是双链DNA。可以使用标准分子生物学技术分离本发明的方法所用的核酸分子。使用感兴趣的核酸序列的全部或部分作为杂交探针，可以使用标准杂交和克隆技术(例如，如 Sambrook, J. , Fritsh, E. F.禾口Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989 所述)分离核酸分子。“分离的”核酸分子是与存在于该核酸的天然来源中的其他核酸分子分开的核酸分子。例如，关于基因组DNA，术语“分离的”包括与基因组DNA与其自然关联的染色体分开的核酸分子。优选地，“分离的”核酸分子不含在得到所述核酸分子的生物体的基因组DNA 中天然地位于所述核酸分子侧翼的序列(即位于核酸分子5'和3'末端的序列)。也可以使用基于感兴趣的核酸分子序列设计的合成的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(PCR)分离用于本发明方法的核酸分子。根据标准PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA 或者基因组DNA作为模板并使用合适的寡核苷酸引物，可以扩增用于本发明方法的核酸分子。此外，可以通过标准合成技术，例如，使用自动DNA合成仪，制备对应于感兴趣的核苷酸序列的寡核苷酸。也可以制备用于本发明方法的核酸，例如，通过标准重组DNA技术制备。也可以使用标准的技术化学合成本发明的核酸。化学合成聚脱氧核苷酸的各种方法是已知的， 包括已在市售的DNA合成仪中自动化的固相合成(参见，例如，Itakura等人的美国专利 4，598，049 ；Caruthers 等人的美国专利 4，458，066 ；和 Itakura 的美国专利 4，401，796 和 4，373，071，本文引入作为参考)。在本发明的一个实施方式中，用于本发明方法的试剂是编码感兴趣的蛋白质的核酸分子。例如，使用标准的分子生物学技术，cDNA(全长或部分cDNA序列)被克隆到重组表达载体中，且该载体被转染进入细胞。例如，通过采用聚合酶链反应(PCR)扩增或通过筛查合适的cDNA文库，可以获得cDNA。在cDNA分离或扩增后，将DNA片段引入合适的表达载体中。例如，基于编码感兴趣的蛋白质的核酸分子的核酸序列使用核苷酸序列，可以制备适于在宿主细胞中表达该蛋白质的形式的、编码感兴趣的蛋白质的核酸分子。在一个实施方式中，核酸分子可以存在于诱导型构建体中。在另一实施方式中，核酸分子可以存在于导致组成型表达的构建体中。在一个实施方式中，在缺乏载体的情况下，本发明的核酸分子可以被递送到细胞 (例如神经元细胞)或受试者。在某些实施方式中，使用病毒载体、优选本领域已知其基因治疗用途的病毒载体，本发明的核酸分子可以被递送到细胞(例如神经元细胞)或受试者。用于形成载体或病毒体的技术在〃 Working Toward Human GeneTherapy,"第观章， Recombinant DNA,第二版,Watson, J. D.等人，编，New York-Scientific American Books, 第 567-581 页(1992)中有概括描述。Wilson, J. Μ.，Clin. Exp. Immunol. 107(Suppl. 1) 31-32 (1997), 以及 Nakanishi, Μ. , Crit. Rev. Therapeu. Drug Carrier Systemsl2 263-310(1995) ；Robbins，P. D.，等人，Trends Biotechnol. 16 :35-40 (1998) ；Zhang，J.，等人，Cancer Metastasis Rev. 15 :385-401 (1996)；禾口 Kramm，C. Μ.，等人，Brain Pathology 5:345-381(1995)中提供了对于合适的病毒载体或病毒体的概述。这样的病毒载体可以从含有 RNA 的病毒(Vile，R. G.，等人，Br. Med Bull. 51 :12-30(1995))或含有 DNA 的病毒(Ali M.，等人，Gene Ther. 1 :367-384(1994))衍生。用于基因治疗且因此适用于本发明的病毒载体系统的例子包括以下系统逆转录病毒(Vile, R.G.，同上；美国专禾Ij 5，741，486 和 5, 763, 242)；腺病毒(Brody, S. L.，等人，Ann. N. Y. Acad. Sci. 716 :90-101 (1994) ；Heise, C.等人，Nat. Med. 3 :639-645 (1997))； 腺病毒 / 逆转录病毒嵌合体(Bilbao, G.，等人，FASEB J. 11 =624-634(1997) ；Feng, Μ.， 等人，Nat. Biotechnol. 15 :866-870(1997))；腺伴随病毒(Flotte, T. R.和 Carter, B. J.， Gene Ther. 2 :357-362(1995)；美国专利 5，756，283)；单纯疱疹病毒 I 或 II (Latchman， D. S. , Mol. Biotechnol. 2 179-195 (1994)；美国专利 5，763，217 ;Chase，M.，等人， NatureBiotechnol. 16 :444-448(1998)) ;_/]、__ (Shaughnessy, Ε.,等)κ, Semin Oncol. 23 :159-171 (1996))；网状内皮组织增殖病毒(Donburg, R.，Gene Therap. 2 301-310(1995))。染色体外的复制载体也可以用于本发明的基因治疗方法。这样的载体在Calos, M. P. (1996)TrendsGenet. 12 :463-466中有描述，本文引入其全部内容作为参考。可以用作基因递送的载体的其他病毒包括脊髓灰质炎病毒、乳头瘤病毒、痘苗病毒、 慢病毒、以及结合了两种或多种病毒的有利特征的杂合或嵌合载体(Nakanishi，Μ. (1995) Crit. Rev. Therapeu. Drug CarrierSystems 12 :263-310 ；Zhang, J.,等人(1996) Cancer Metastasis Rev. 15 :385-401 Jacoby, D. R.，等人(1997) Gene Therapy 4 :1281-1283)。。在一个特定的实施方式中，用于本发明的方法的病毒载体是AAV载体。在特定的实施方式中，病毒载体是AAV2/5或AAV2/8载体。这种载体在例如美国专利7，056，502中有描述，本文引入其全部内容作为参考。载体包括一种或多种启动子或增强子，其选择是本领域技术人员已知的。合适的启动子包括但不限于逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV) 启动子和本领域的技术人员已知的其他病毒和真核细胞启动子。用于治疗目的的基因治疗载体的构建及其引入患病动物的指导原则，可以从上述出版物以及美国专利 5，631，236,5, 688，773,5, 691，177,5, 670，488,5, 529，774,5, 601，818 和PCT公开WO 95/06486中获得，本文引入其全部内容作为参考。—般来说，感兴趣的细胞的病毒感染方法是本领域已知的。该病毒可以接触感兴趣的神经元细胞，或者可选择地，可以被注射进入患有神经变性性疾病的受试者。本文所述的核酸(例如，载体DNA)可以通过本领域的任何合适的方法递送。例如， 递送可以通过注射(例如，玻璃体内或视网膜下注射)、基因枪，通过将核酸应用在凝胶、油或乳膏中，通过电穿孔，利用脂基转染试剂，或通过任何其他合适的转染法。如本文所用，术语“转化”和“转染”指向宿主细胞引入外来核酸(例如DNA) 的本领域公认的各种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、 脂质转染(例如，使用市售试剂，例如LIPOFECTIN (Irwitrogen Corp.，San Diego, CA)、LIPOFECTAMINE (Invitrogen)、FUGENE (Roche Applied Science, Basel, Switzerland) > JETPEI (Polyplus-transf ection Inc. , New York, NY)、EFFECTENE (Qiagen, Valencia, CA)、DREAMFECT (( Biosciences，France)等)、 或电穿孔(例如，在体内电穿孔)。转化或转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook，等人(MolecularCloning :A Laboratory Manual.第二片反，Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y.，1989)禾口其他实验室手册中找到。本发明的核酸分子可以被插入载体中和用作基因治疗载体。基因治疗载体可以递送到受试者，例如，通过静脉注射、局部施用(参见，例如，美国专利5，3 ，470)、立体定向注射(参见，例如，Chen 等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91 :30 )，或通过体内电穿孔(参见，例如，Matsuda 和 C印ko Q007) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 104 :1027)。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，也可以包括包埋有基因递送载体的缓释基质。另外，当可以完全由重组细胞产生完整的基因递送载体(例如，逆转录病毒载体)时，药物制剂可以包含一种或多种产生基因递送系统的细胞。可以使用用于核酸递送的任何合适的病毒，包括但不限于，腺病毒、腺伴随病毒、 逆转录病毒等。例如，LIA逆转录病毒可以用于递送核酸(C印ko等人(1998)Curr. Top. Dev. Biol. 36 :51 ；Dyer 和 C^pko (2001) J. Neurosci. 21 :4259)。病毒滴度可能会变化，以改变表达水平。病毒滴度可以在任何合适的范围内。例如，病毒滴度可以具有大约IO5Cfu/ ml、106cfu/m、107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml、1010cfu/ml、10ncfu/ml 或更高的上限。病毒滴度可以具有大约 1013cfu/ml、1012cfu/ml、10ncfu/ml、1010cfu/ml、109cfu/ml、108cfu/ml、 107cfu/mlU06cfu/ml或更低的下限。通常，病毒滴度范围为大约106cfu/ml至108cfu/ml。 更通常，范围为大约107cfu/ml至108cfu/ml。待增加的病毒的量也可能是变化的。增加的病毒或其他核酸和试剂的量可以在任何合适的范围内。例如，该量可以具有大约ΙΟΡμΙ、 200μ ,300μΚ 400μΚ 50()μ1、750μ 、ιοοομ Ι、125()μ1、Ι500μ 1 或更高的上限。 该量可以具有大约125Ρμ1、1000 μ 1,750 μ 1、500μ 1、400μ 1,300 μ 1,200 μ 1、100μ 1、 50μ 1、25μ 1或更低的下限。本发明的重组表达载体可以设计用于一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分在原核或真核细胞中的表达。例如，一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分可以在细菌细胞(诸如大肠杆菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞进一步在Goeddel，Gene ExpressionTechnology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)中讨论。另夕卜， 重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如，使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。原核生物中蛋白质的表达最经常使用含有引导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体在大肠杆菌中进行。融合载体向其中编码的蛋白质、通常向重组蛋白的氨基末端添加许多氨基酸。这样的融合载体通常具有三个目的1)增加重组蛋白的表达；幻增加重组蛋白的溶解度，和幻通过在亲和纯化中作为配体来帮助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解切割位点，使得融合蛋白纯化后重组蛋白能够与融合部分分离。这样的酶及其同源识别序列，包括)(a 因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Wiarmacia BiotechInc ；Smith, D. B.禾口 Johnson, K. S. (1988)Gene 67 :31-40) ；pMAL(NewEngland Biolabs, Beverly, ΜΑ)；和pRIT5 (Pharmacia，Piscataway, N. J.)，它们分别向目标重组蛋白上融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A。在另一实施方式中，HDAC和/或HIFl α蛋白质和/或其部分的表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的例子包括 pYepSecl(Baldari, et.al. , (1987)EMBO J. 6 :229-234) ；pMFa(Kurjan 禾口 Herskowitz， (1982)Cell 30:933-943) ；ρJRY88 (Schultz 等人，(1987)Gene 54:113-123)； pYES2 (InvitrogenCorporation, San Diego, Calif.)禾口 picZ (Invitrogen Corporation)。另外，使用杆状病毒载体，可以在昆虫细胞中表达HDAC和/或HIFl α蛋白质和 /或其部分。可用于在培养的昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括 pAc 系歹Ij (Smith 等人(1983)Mol. Cell Biol. 3 :2156-2165)和 pVL 系歹lj (Lucklow 禾口 Summers(1989)Virology 170:31-39)。在再另一实施方式中，使用哺乳动物表达载体，在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B. (1987) Nature 329 :840)和 pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMB0 J. 6 :187-195)。当用在哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核和真核细胞的其他合适的表达系统参见Sambrook，J.，Fritsh, Ε. F.和Maniatis， Τ. Molecular Cloning :ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. , 1989 的第 16禾口 17章。在另一实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够优先在特定细胞类型中引导核酸表达(例如，组织特异性调控元件用来表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性的例子包括视网膜细胞类型特异的启动子(例如，视紫红质调控序列 Cabp5、Cralbp, Nrl、Crx, Ndrg4、簇蛋白、feix、Hesl 等(Matsuda 和 C印ko，同上))，白蛋白启动子(肝特异性的，Pinkert等人(1987)Genes Dev. 1 :268)，淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv. Immunol. 43 :235)，尤其是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore (1989) EMBO J. 8 :729)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等人 (198 Cell 33 :729 ；Queen 和 Baltimore (1983) Cell 33 :741)，神经元特异性的启动子 (例如，神经丝启动子；Byrne 和 Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 :5473)，胰腺特异性的启动子(Edlund等人(1985)kience 230 :912)，和乳腺特异性的启动子(例如， 乳清启动子；美国专利4，873，316和欧洲申请沈4，166)。也包含发育调节的启动子，例如， 小鼠hox启动子(Kessel和Gruss (1990) kienceM9 :374)和甲胎蛋白启动子(Campes和 Tilghman(1989)Genes Dev. 3 :537)。本发明的另一方面涉及已引入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可以互换使用。可以理解，这些术语不仅指特定的受试细胞， 也指这种细胞的后代或可能的后代。因为可能由于突变或环境影响而在后代出现某些修饰，这种后代可能实际上不与亲代细胞相同，但仍然包括在本文所用的术语的范围内。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分可以在细菌细胞(诸如大肠杆菌)、病毒细胞(诸如逆转录病毒细胞)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞是本领域的技术人员已知的。也提供了用于确定调节剂的筛选分析，所述调节剂即候选或测试化合物或药物 (例如，肽类、环肽类、拟肽类、小分子类、有机小分子类或其他药物)，它们对于本文所述的一种或多种蛋白质或其部分(例如，一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分) 具有刺激或抑制效果。如本文所用，术语“小的有机分子”指具有以下分子量的自然存在的或合成的有机分子超过大约25道尔顿且小于大约3000道尔顿，通常小于大约2500道尔顿，更通常小于大约2000道尔顿，通常为大约100至大约1000道尔顿，更通常为大约200至大约500道尔顿。在一个实施方式中，本发明提供了用于筛选候选或测试化合物的试验，所述化合物是本文所述的一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的底物。在另一实施方式中，本发明提供了用于筛选候选或测试化合物的试验，所述化合物结合或调节本文所述的一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的活性。使用本领域已知的组合文库方法中的许多方法之一，可以获得本发明的测试化合物，所述组合文库方法包括生物文库、空间寻址平行固相或溶液相文库、需要去卷积的合成文库方法、“一珠一化合物”文库方法和使用亲和色谱法选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽库，而其他4种方法适用于化合物的肽、非肽类低聚物或小分子文库(Lam， K.S. (1997)Anticancer Drug Des. 12 :145)。本文所述的测试化合物、一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分、和/ 或编码一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列，可以掺入适于施用的药物组合物中。这样的组合物通常包含核酸分子或蛋白质和药学可接受的载体。如本文所用，术语“药学可接受的载体”意在包括与药品施用相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。这些用于药用活性物质的介质和试剂的应用是本领域公知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂，考虑它们在组合物中的应用。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。在本发明的一方面，治疗性核酸分子或含有它的载体采取含有药学可接受的载体的药物组合物的形式。如本文所用，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。在一个实施方式中，载体适于眼内、肠胃外、静脉内、腹膜内、局部或肌肉内施用。在另一实施方式中，载体适于口服。药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。这些用于药用活性物质的介质和试剂的应用是本领域公知的。除了与基因治疗载体不相容的任何常规介质或试剂，考虑它们在本发明的药物组合物中的应用。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。在一个特定的实施方式中，本发明的药物组合物以可注射组合物的形式施用。载体可以制备为可注射的液体溶液或悬浮液。制剂也可乳化。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，制剂可能含有少量的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂、佐剂或免疫增强剂。在一个特定的实施方式中，核酸分子和/或载体可以掺入适于眼内施用的组合物。例如，组合物可以被设计用于玻璃体内、结膜下(subconjuctival)、眼球筋膜下(sub-tenon)、眼周、眼球后、脉络膜上、和/或巩膜内施用，例如，通过注射，以有效地治疗视网膜疾病。此外，缝合的或可再装的圆顶(dome)可以放置在施用部位上，以防止或减少活性剂以非优选方向“洗出”、滤出和/或扩散。如本文所述，相对高粘度的组合物可用于提供有效的、优选基本上持续的核酸分子和/或载体的递送，例如，通过注射到眼后段。粘度诱导剂可以用于维持核酸分子和/或载体处于理想的悬浮形式，从而防止组合物沉积于眼睛的底部表面。这种组合物可以按照美国专利5，292, 724所述来制备，其完整内容通过引入作为参考。通过将适当溶剂中的所需量的本文所述的测试化合物、一种或多种HDAC和/或 HIFl α蛋白和/或其部分、和/或编码一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列与上述的一种或多种成分合并，(如需要)接着过滤除菌，来制备无菌注射溶液。一般来说，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和需要的上述其他成分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其他所需的成分的粉末。口服组合物一般包含惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以被封入明胶胶囊或压缩成片。出于口服治疗施用的目的，活性成分可以与赋形剂合并，并以片剂、锭剂、或胶囊形式使用。也可以使用用作漱口水的流体载体来制备口服组合物，其中，流体载体中的化合物经口服应用，漱口并吐出或吞咽。可以包含药学相容的粘合剂和/或辅助材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以包含任何以下成份或性质类似的化合物粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或^erotes ；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙香味。在一个实施方式中，用载体制备本文所述的测试化合物、一种或多种HDAC和/或 HIFl α蛋白和/或其部分、和/或编码一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列，所述载体保护化合物免受身体的迅速消除，诸如控释制剂，包括植入物和微胶囊化的递送系统。可以使用可生物降解、生物相容性的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的制备方法对于本领域的技术人员是明显的。该材料也可以从Alza Corporation and Nova PharmaceuticalsJnc商购取得。 脂质体悬浮液(包括应用抗病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，美国专利4，522，811 所述的方法。鼻组合物一般包括鼻喷剂和吸入剂。鼻喷剂和吸入剂可以包含一种或多种活性成分和赋形剂诸如防腐剂、粘度调节剂、乳化剂、缓冲剂等。鼻喷剂可以向鼻腔应用，用于局部和/或全身应用。鼻喷剂可以通过适于递送计量的活性成分的非加压分散器分散。鼻吸入剂通过口服吸入递送到肺部，用于局部和/或全身应用。鼻吸入剂可以通过用于递送计量的一种或多种活性成分的密闭容器系统分散。在一个实施方式中，鼻吸入剂与气雾剂一起使用。这可以通过制备含化合物的水喷雾剂、脂质体制剂或固体颗粒来完成。可以使用非水(如氟碳抛射剂)悬浮液。可以使用声波喷雾器(sonicnebulizer)以尽量减少将试剂暴露于可导致化合物降解的剪切。
通常情况下，通过将试剂的水溶液或悬浮液与常规药学可接受的载体和稳定剂一起配制来制备水性气溶胶。载体和稳定剂随具体化合物的要求而变化，但通常包括非离子表面活性剂(吐温、Pluronics或聚乙二醇)、无害的蛋白质类如血清白蛋白、山梨醇酐酯、 油酸、卵磷脂、氨基酸类诸如甘氨酸、缓冲液类、盐、糖或糖醇。气雾剂一般是从等渗溶液制备。全身施用也可以通过经粘膜或经皮方法实现。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适用于待透过的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的，且包括，例如，用于经粘膜施用的去污剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻喷剂或栓剂实现经粘膜施用。 对于经皮施用，将活性化合物制成本领域公知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。也可以以用于直肠递送的栓剂(例如，使用传统的栓剂基质，诸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式制备本文所述的测试化合物、一种或多种HDAC和/或HIFl α 蛋白和/或其部分、和/或编码一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列。以易于施用和剂量均勻的剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物是特别有利的。 本文使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理离散的单位， 每个单位包含与所需药物载体结合的预定量的活性化合物，该量被计算为产生需要的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由以下因素规定并直接取决于它们活性化合物的独特特性、待达到的特定疗效和本领域中固有的组合用于个体治疗的活性化合物的限制。可以通过在细胞培养或实验动物中，使用标准的药学程序，确定本文所述的测试化合物、一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其部分、和/或编码一种或多种HDAC 和/或HIFl α蛋白和/或其部分的核酸序列的毒性和治疗效果，例如，确定LD50(群体的 50%致死的剂量)和ED50(群体的50%治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，它可以表示为比例LD50/ED50。显示大治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用显示毒副作用的化合物，但应注意设计将这种化合物靶向受影响的组织的部位的递送系统，以尽量减少对于未受感染的细胞的潜在的损害，从而减少副作用。从细胞培养分析和/或动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于人类的剂量。剂量通常位于循环浓度范围内，其包括有很少或没有毒性的ED50。剂量可以在此范围内变化，取决于所用的剂型和所用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何化合物，可以从细胞培养分析初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量，以达到包括在细胞培养中确定的IC50(即实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可以被用来更准确地确定人类有用的剂量。可以测定血浆中的水平，例如， 通过高效液相色谱法。本发明的一个实施方式涉及一种治疗神经变性性疾病(例如，视网膜神经变性性疾病)的方法，包括向受试者施用治疗有效量的试剂的步骤，例如，一种或多种测试化合物、一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其突变体和/或其部分、和/或编码一种或多种HDAC和/或HIFl α蛋白和/或其突变体和/或其部分的核酸序列。在本发明的某些方面，眼睛的神经变性性疾病与视锥细胞的活力降低相关。在本发明的其他方面，眼睛的神经变性性疾病与视杆细胞的活力降低相关。在另外的方面，眼睛的神经变性症是遗传疾病。
如本文所用，术语向受试者“施用，，包括通过可向受试者的所需位置递送组合物的任何合适的途径，向受试者分配、递送或应用组合物，包括通过眼内(视网膜下或玻璃体下)施用或静脉内施用进行递送。可选择地或结合起来，递送是通过局部、肠胃外或口服途径、脑内注射、肌肉内注射、皮下/皮内注射、静脉内注射、口腔施用、经皮施用和通过直肠、 结肠、阴道、鼻内或呼吸道途径施用。一般情况下，提供治疗有效量的试剂(例如，核酸分子)，以引起理想效果，例如， 抑制神经元细胞死亡。待施用的载体的量，根据治疗的次数和量，也取决于其他因素，例如待治疗的受试者的临床状态、年龄和重量，以及该病症的严重性。需要进行施用的活性成分的精确量取决于基因治疗专家的判断，并且对于每个个体患者是特定的。一般来说，以每毫升大约IxlO5至大约IxlO9菌落形成单位(cfu)的滴度施用病毒载体，虽然范围可能会变化。优选滴度范围为大约IxlO6至大约lxl08Cfu/ml。试剂的治疗有效量(即，有效剂量)可以为大约0. 001至30毫克/千克体重，优选大约0. 01至25毫克/千克体重，更优选大约0. 1至20毫克/千克体重，甚至更优选大约1至10毫克/千克、2至9毫克/千克、3至8毫克/千克、4至7毫克/千克或5至6 毫克/千克体重。本领域的技术人员明白，某些因素可能会影响有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重性、以前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄和其他现有的疾病。此外，用治疗有效量的试剂治疗受试者可以包括单一的治疗，或优选地，可以包括一系列治疗。也可以理解，用于治疗的抑制剂的有效剂量可能会在特定疗程中增加或减少。剂量的变化可能是由于本文所述的诊断分析的结果。药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或分散器中。在一个实施方式中，用携带所需的核酸分子的逆转录病毒载体转导包装细胞系， 以形成生产者细胞系。可以通过本领域已知的任何方式转导包装细胞，包括，例如，电穿孔、 CaPO4沉淀、或使用脂质体。可能转染的包装细胞的例子包括但不限于B0SC23、Bing、PE501、 PA317、Ψ-2、Ψ-ΑΜ、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、Ψ-CRE, Ψ—CRIP、GP+E86、GP+envAml2 和DAN细胞系。关于生产逆转录病毒的包装细胞和如何构建它们的指导原则可以从以下文献中获得Short 等人，J. Neurosci. Res. 27 :427-433 (1990) ；Miller, A. D.，Human Gene Ther.1 :5-14(1990) ；Danos, 0, “ Construction ofRetroviral Packaging Cell Lines," in Methods in Molecular Biology(M. Collins,编)，第 8 卷，The Humana Press Inc.，Clifton, N. J.，17-26 (1991) ；Murdoch, B.，等人，Gene Therapy 4 :744-749(1997)； 及美国专利5，529，774和5，591，624，本文引入其全部内容作为参考逆转录病毒载体也已经用水泡性口炎病毒(VSV)包膜糖蛋白G( “假型”)成功地包装。这些载体更稳定，且可以浓缩至109cfu/ml，使它们能够直接注射(Burns，J. C.等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :8033-8037)。生产者细胞然后可以被移植到所需的位置附近或其中，例如，眼内。直接注射高滴度逆转录病毒生产者细胞(Murdoch, B.，等人，Gene Ther. 4 :744-749(1997) ；Onodera, M.，等人，Hum Gene Ther. 8 :1189-1194 (1997))应该允许用逆转录病毒序列有效原位感染 (Rainov, N. G.,等人，Cancer Gene Ther. 3 :99-106(1996) ；Ram, Ζ.,等人，Cancer Res. 53 83-88(1993))。眼内注射的生产者细胞一般不从注射部位迁移。此外，尽管它们可能被宿主排斥，但不会发生持续5-10天，到这一时间会发生附近细胞的逆转录病毒感染(Ram，Z.，等人，J. Neurosurg. 79 :400-407(1993)). 一般情况下，载体生产者细胞(VPC)剂量范围为大约2. 5x108VPC至大约lxl09VPC。生产者细胞的确切量最终由技术人员根据许多因素确定，包括但不限于可用的注射量、患者的临床状况和该病症的严重性。优选地，用于本发明的病毒载体的病毒基因组应进行修饰，以消除或限制其复制能力，但是，复制条件病毒在本发明中也是有用的，能够靶向某些细胞的复制载体也是有用的。(参见，例如，Zhang, J.等人(1996)Cancer Metastasis Rev. 15 :385-401)。在一个实施方式中，一种病毒载体用于携带多种核酸分子，例如，编码HDAC4和 HDAC6的基因。在另一项实施方式中，使用两种病毒载体，它们各携带一种或多种感兴趣的基因。如果使用两种病毒载体，它们可以源自相同或不同类型的病毒，且可以同时或相继施用(即，不考虑特定的顺序)。也可以使用用于基因转移的非病毒方法，优选其在基因疗法中的用途为本领域已知的方法来递送核酸分子(Nakanishi，M.，Crit. Rev. Therapeu. Drug Carrier Systems 12 :263-310(1995) ；Abdallah, B.,等 A, Biol Cell 85 :1-7(1995) ；Zhang, J., 等人’ Cancer Metastasis Rev. 15 :385-401(1996) ；Philips, S. C. , Biologicals 23 :13-16 (1995) ；Lee, R. J. and Huang, L. , Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14 173-206(1997))。这些用于基因递送的非病毒载体的例子包括原核载体、阳离子脂质体、DNA-蛋白质复合物、非病毒T7自身基因(autogene)载体(Chen，X.，等人，Hum. Gene Ther. 9 :7四_736 (1998))、促融脂质体、核酸(“裸DNA”)的直接注射、颗粒或受体介导的基因转移、杂合载体诸如DNA-腺病毒结合物或包括非病毒和病毒成分的其他分子结合物、星射状聚酰胺-胺型树枝状聚合物(starburstpolyamidoamine dendrimers) (Kukowska-Latallo, J. F.,等人，Proc Natl Acad Sci USA 93:4897-4902(1996); Tang, Μ· X.，等人，Bioconjug. Chem. 7 :703-714(1996))、阳离子肽(ffyman, T. B.，等人， Biochemistry 36 :3008-3017(1997))和哺乳动物人工染色体(Ascenzioni，F.，等人， Cancer Lett. 118 135-142(1997))。此外，本发明提供了上述方法的实施方式，其中，使用任何细胞载体、优选其在基因治疗中的应用为本领域技术人员所确定的细胞载体，递送核酸分子。这些用于基因治疗的细胞载体的例子包括内皮细胞(Rancourt，C.，等人，Clin. Cancer Res. 4 265-270 (1998) ；Qjeifo, J. 0.，等人，Cytokines Mol. Ther. 2 :89-101 (1996))，和巨噬细胞，包括肿瘤浸润巨噬细胞(Zufferey，R.，等人，Nat. Biotechnol. 15 :871-875(1997)； Naldini, L.，等人，Science 272 :263-267 (1996))，它们可以各自使用病毒或非病毒载体修饰，以携带所需的核酸分子，从而表达所需的基因产物。其他合适的非病毒载体对于本领域的技术人员是显而易见的。通过包括内部核糖体进入位点(IRES)序列，以实现双顺反子信使(bicistronic message)上的多个基因的协调表达，可以提高基因递送。IRES是含有500_600bp的序列，是小核糖核酸病毒(包括脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒(EMCV))的5'非转导区域的典型特征。参见，例如，Ghattas, I. R.，等人，Molecular and Cellular Biologyll 5848-5859(1991) ；Morgan，R. Α.，等人，Nucleic Acids Research20 1293-1299 (1992)。这种方法已被用于白细胞介素-12的两个亚基的高效逆转录病毒共表达(Tahara，H.，等人， J. Immunol. 154 :6466-6474(1995))。另一种选择是，载体含有在不同启动子控制下的多个基因。在本发明的一个实施方式中，在症状(诸如视杆损失导致的夜盲)发作前，向患有神经变性性视网膜病症或处于发展为神经变性性视网膜病症的危险中的受试者(例如，具有神经变性性视网膜疾病家族史的受试者)施用本文所述的试剂。在本发明的另一项实施方式中，在症状(诸如视杆损失导致的夜盲)发作后，向患有神经变性性视网膜病症或处于发展为神经变性性视网膜病症的危险中的受试者(例如，具有神经变性性视网膜病症家族史的受试者)施用本文所述的试剂。在一个实施方式中，该受试者的视锥是活的。可以理解，已描述的本发明的实施方式仅仅是例示本发明的原理的一些应用。本领域的技术人员可以根据本文的教导作出许多修改，而不背离本发明的真正精神和范围。 本文为了所有目的引入本申请中引用的所有参考文献、专利和专利申请的全部内容作为参考。阐述下面的实施例作为本发明的代表。这些实施例不应视为限制本发明的范围， 且鉴于目前的公开内容、附图以及所附的权利要求，其他相当的实施方式是明显的。实施例下面的材料和方法用于实施例I-V。动物野生型CDl和视网膜变性rdl (FVB染色)小鼠购自Charles RiverLaboratory。HDAC4 RNAi和体内电穿孔HDAC4 RNAi 靴序列 GGAGATGCTGGCCATGAAGCA (SEQ IDNO :1)被克隆到 pBS/U6 RNAi 构建体中(Matsuda 和 C印kc^2004)Proc. Natl. Acad. ki. USA 101:16)。为了产生 HDAC4 RNAi抗性表达载体，利用简并密码子，使shRNA靶序列突变(突变的核苷酸以小写字母表示)为GGAaATGCTaGCtATGAAaCA(SEQ ID NO :2)。pCAG-HDAC4、pCAG_HDAC6和pCAG-dnHIFl α 构建体用于体内电穿孔。筛选发现有效shRNA的方案如前面所述。同上。TUNEL分析、免疫组织化学和荧光显微镜检查如前所述，进行TUNEL分析和免疫组织化学(Chen和C^pko (2007) BMC Dev. Biol.7:78M24)。使用LEICA TCS SP2共聚焦显微镜处理视网膜切片的荧光图像。使用 Nikon ECLIPSE ElOOO显微镜处理铺片视网膜的荧光图像。使用的第一抗体HDAC4(Sigma， 1 200)，使用 0. 1 μ g/ μ 1 的 HDAC4 的阻断肽 MSSQSHPDGLSGRDQPVEL (SEQ ID NO 3)；对于视紫红质的 Rho4D2( (Molday 和 MacKenzie (1983) Biochemistry22 :653Μ25) 1 100)；活化的胱天蛋白酶 _3(Cell Signaling, 1 200) ；HIFl α (R&DSystems, 1 300)。克隆分析如前所述，使用不能复制的逆转录病毒LIA进行克隆分析(Cepko等人(1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36 :51 ；Dyer 和 C^pko (2001) J. Neurosci. 21 :4259)。LIA 逆转录病毒如前所述制备，并具有大约IX 107CfU/ml的滴度。将半微升病毒悬浮液注射到PO小鼠视网膜的视网膜下间隙。视网膜在P21被固定，并对由病毒感染的视网膜祖细胞生成的细胞进行AP染色。实施例I :HDAC的过度表达为了检验哺乳动物视网膜的HDAC4表达，使用单克隆抗体进行免疫组织化学。在内成神经细胞层(INBL)中具有强信号的Pl视网膜中(图1A)检测HDAC4免疫反应性。在INBL中，如用1^x6 ( 一种核蛋白质)抗体共免疫染色显示，它主要被从发育的无长突细胞 (AC)和神经节细胞的细胞核排除(图9)。在由有丝分裂的祖细胞和新生感光细胞组成的整个ONBL中，观察HDAC4的细胞质表达模式。HDAC4免疫反应性在成熟的视网膜中较低(图 1B)。它在感光细胞的内段(IS)中被检测到，但在外段(OS)或位于外核层(ONL)的细胞体中没有检测到。在内核层(INL)中，在BP细胞和AC的细胞质中检测到微弱的免疫反应性。 在神经节细胞层(GCL)和进程所在的两个丛状层中，观察到核染色。HDAC4的免疫反应性是特异性的，因为它被抗体与同源阻断肽的预温育破坏(图1C，1D)。为了研究HDAC4在体内的功能，通过体内电穿孔将具有针对HDAC4的shRNA的质粒(图 6)电穿孔进入 PO 小鼠视网膜(Matsuda 和(^pkoOO(M)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :16)。为了标记转染的细胞，同时电穿孔质粒pCAG-GFP，该质粒编码由具有广泛活性的启动子CAG驱动的绿色荧光蛋白(GFP)。针对GAPDH的shRNA用作成功的RNA靶向事件的对照。用GAPDH shRNA电穿孔的视网膜显示，大部分电穿孔的细胞是视杆光感受器，小部分为位于INL中的BP细胞、AC和小胶质细胞(MG)((同上)和图2A)。当靶向HDAC4时，GFP+细胞数急剧下降(图I)，在P6极少见到(图2B)，在P8或以后没有观察到GFP+细胞。GFP+ 细胞的损失表明HDAC4是存活所需要的。观察到的RNAi表型不是由于脱靶效应，因为共电穿孔的表达抗HDAC4 shRNA的HDAC4等位基因的pCAG载体导致出现象GAPDH对照一样多的GFP+细胞(图2C)。为了进一步研究HDAC4 shRNA是否导致细胞死亡，在P5进行TUNEL分析。在用针对HDAC4的shRNA电穿孔的区域检测到许多TUNEL+细胞(图2E)。在同样的HDAC4 shRNA 电穿孔视网膜的非电穿孔区域(图2E)，观察到极少数TUNEL+细胞(图2F)，类似于在GAPDH shRNA对照(图2D)中观察到的数量。只有小部分的TUNEL+细胞显示GFP表达(箭头，图 2E)。不打算受限于科学理论，这种观察结果可能是由于TUNEL只检测那些经受细胞凋亡的最后阶段的细胞的事实。为了检测凋亡级联的较早期阶段，分析了胱天蛋白酶的活化。用识别胱天蛋白酶-3的活化(裂解的)形式(在DNA裂解之前具有活性的执行胱天蛋白酶) 的抗体对P5视网膜切片染色。相比GAPDH RNAi对照(图2G，21)，在HDAC4 RNAi样品(图 2J)中观察到更多的具有活化的胱天蛋白酶-3染色的细胞。HDAC4 RNAi视网膜中的大多数活化的胱天蛋白酶-3+细胞是GFP+(箭头，图2H)。使用来自3个独立实验的视网膜，对于HDAC4 RNAi平均有6. 5士 1. 6个细胞(每100 μ m切片)被评分为活化胱天蛋白酶-3+ 的，相比而言，对于GAPDH RNAi为0.沘士0. 07个细胞。通过将pCAG-HDAC4体内电穿孔到PO小鼠视网膜中，实现HDAC4的过度表达。当视网膜神经发生完成时，在P14收集电穿孔的视网膜(Young(1985)Anat. Rec. 212 :199)。 在对照pCAG-GFP电穿孔(图3A)中，超过80%的GFP+细胞成为ONL中的光感受器，而大约10%的GFP+细胞成为INL上半部分中的BP细胞(Matsuda和Cepko (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:16))。然而，当过度表达HDAC4时(图，在被BP细胞占据的区域的 INL中观察到更多的GFP+细胞，且它们的突起延伸到IPL。在视网膜发育过程中，过度产生 BP 细胞，到 P14 许多被消除(Young(1984) Anat. Rec. 212 :199)。如前所述进行TUNEL分析、免疫组织化学和荧光显微镜检查(Chen和C^pko (2007) BMC Dev.Biol.7 :78)。使用LEICA TCS SP2共聚焦显微镜处理视网膜切片的荧光图像。使用Nikon ECLIPSEE1000显微镜处理铺片视网膜的荧光图像。使用如下的第一抗体HDAC4 (Sigma;原液以1 200稀释供使用)；使用0. 1 μ g/μ 1的HDAC4的阻断肽 MSSQSHPDGLSGRDQPVEL (SEQ ID NO 3)；对于视紫红质的 Rho4D2 ((MacKenzie (1983) Biochemistry 22 :653)；原液以1 100稀释供使用)；活化的胱天蛋白酶-3 (Cell Signaling，原液以1 200稀释供使用)；和HIFl α (R&D Systems，原液以1 300稀释供
使用)。实施例II =HDAC的表达改善感光细胞的存活通过电穿孔的HDAC4表达抑制视杆光感受器的死亡。在PO小鼠视网膜的电穿孔导致许多视杆的转导，但视锥很少(Matsuda 和(^pkoOO(M)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 16)。进行pCAG-HDAC4或pCAG-HDAC6向PO视网膜中的电穿孔。HDAC6包括在特异性试验中，因为它最近已被证明能够救治果蝇(Drosophila)中的视网膜变性(^iao等人Q001) J. Biol. Chem. 276 :35042)。在P50收集视网膜，这一时间点远远超过视杆在对照、未处理的 rdl视网膜中死亡的时间。用抗视紫红质(一种视杆特异性的标记)的抗体对铺片视网膜染色。在由共电穿孔的PCAG-GFP标记的转染区中(图4A，B)，许多视杆被HDAC4拯救(图 4D)而不被HDAC6拯救(图4C)。作为对于视杆存在的另外的分析，使用视紫红质的报告质粒 Rho-DsRed 检测紫红质启动子的活性(Matsuda 和 C^pko (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :16)，该质粒中2. 2kb的视紫红质启动子驱动DsRed (—种红色荧光蛋白)的表达。 Rho-DsRed与pCAG-HDAC4共电穿孔进入PO rdl视网膜。在P70收获的组织显示，由抗视紫红质免疫组织化学(图41)标记的视杆，在GFP标记的电穿孔的区域(图4H)中表达视紫红质启动子(图4J)。HDAC6-电穿孔的视网膜(图4E)没有表现出视紫红质免疫反应性细胞(图4F)，也没有视紫红质启动子活性(图4G)。对于HDAC4处理的视网膜，每100 μ m切片平均评分24. 3士7. 2个视紫红质+细胞，在HDAC6电穿孔的视网膜(图4K)或HDAC4处理的非电穿孔区域中，观察到O个视紫红质+细胞。HDAC6没有拯救患病的视杆光感受器的死亡。然而，HDAC6在保护双极细胞免受rdl视网膜(图4E，4H)以及野生型视网膜(图 7)中自然发生的细胞死亡方面如同HDAC4—样有效。视锥光感受器的存活取决于视杆光感受器的存活，因此HDAC4处理的视网膜也具有更多的视锥光感受器是可能的。在P70收集HDAC4电穿孔的视网膜(图40)，并用标记视锥的花生凝集素(PNA)染色。相比HDAC6电穿孔的视网膜(图4L-4N)，HDAC4明显增加了具有拯救的视杆的区域(图4P)的视锥密度(图4Q)。只在HDAC4电穿孔的区域观察到增加的视锥密度(图4R-4T)。实施例III 过度表达的细胞质HDAC防止视杆感光细胞的损失HDAC4主要在野生型鼠光感受器的细胞质中发现(图1B，4U，4X)。测试细胞质 HDAC4对于光感受器存活的效应。HDAC4-L175A是不与MEF2转录因子相互作用因此停留在细胞质中的细胞质突变体。也测试位于核中的突变体HDAC-3SA。HDAC-3SA突变体的3 个丝氨酸磷酸化位点突变为丙氨酸，这将导致突变体停留在核中(Vega等人QO(M)Cell 119 555 ；Zhao等人(2001) J. Biol. Chem. 276 :35042)。将这些等位基因的每个电穿孔进入 PO的rdl小鼠视网膜，且通过抗视紫红质免疫组织化学分析视杆光感受器的存活。细胞质 HDAC4-L175A突变体保留rdl杆体至少到P70 (图4V，4Y)。核HDAC4-3SA突变体未能拯救甚至直到P50 (图4W，4Z)。因此，细胞质HDAC4-L175A有效防止视杆感光细胞损失。实施例IV =HIFl α蛋白质和视网膜细胞变性
HIFla蛋白质在氧动态平衡的调节中发挥核心作用(Semenza(2000) J. Appl. Physiol. 88 :1474 ；Semenza(2006)Exp. Physiol. 91 :803)，并参与与代谢、血管生成、红细胞生成、糖酵解、心血管发育和系统O2动态平衡(GENEATLAQ有关的基因的活化。在正常情况下，HIFl α蛋白质在成熟的小鼠视网膜中不能检测到。低氧预处理可稳定HIFl α并保护光感受器免于光致视网膜变性(Grimm等人Q002)Nat. Med. 8 :718)。HIFl α蛋白质的稳定性通过赖氨酸乙酰化调节。乙酰转移酶ARDl对HIFl α的乙酰化提高其泛素化和蛋白酶体降解(Jeong等人(2002) Cell 111 :709)。为了测试HDAC是否能够稳定HIFl α，在PO将 HDAC4和HDAC6各电穿孔进入野生型或rdl视网膜。在成熟的视网膜上进行对于HIFl α的免疫组织化学方法。在野生型光感受器的OS中检测到HIFl α蛋白质(图5Α，5Β)，但只是在电穿孔的区域(图5C，5D)。在HDAC6电穿孔之后没有检测到HIFl α的免疫反应性(图 5E，5F)。同样，HDAC4但不是HDAC6(图5I，5J)导致HIFl α蛋白质出现在rdl视网膜的光感受器的核/核周(图5G，5H)。为了研究rdl小鼠中的HDAC4介导的光感受器拯救是否需要HIFl α，占优势的阴性 HIFl α (dnHIFl α )构建体(Jiang 等人(I"6) J. Biol. Chem. 271 :17771)与 pCAG_HDAC4 在PO共电穿孔进入rdl视网膜，并在P70通过抗视紫红质监测感光器的存活。尽管单独的 HDAC4导致光感受器的保护(图5K，5L)，但dnHIFl α消除了 HDAC4的光感受器存活效应 (图 5Μ，5Ν)。为了进一步研究HIFl α的乙酰化是否可以在拯救rdl视网膜中的视杆细胞死亡方面发挥作用，通过在PO在体内电穿孔进入rdl视网膜来测试比其野生型更稳定的 HIFl α的组成型活性乙酰突变体HIFlaK532R(Jeong等人QO(^)Cell 111 :709)和野生型HIFla。通过在P70共电穿孔的I^ho-DsRed监测视杆光感受器的存活。通过计数每 100 μ m切片的Rho+细胞数量化HIFl a、HIFl a K532R和HDAC4的存活效应(图81)。虽然对照GFP电穿孔没有检测到视杆(图8々，8幻，但野生型!1正1(1保护了少量视杆(图8B， 8F)。HIFl a K532R比野生型HIFl α拯救更多的视杆(图8C，8G)。HDAC4在拯救视杆光感受器方面最有效(图8D，8H)。不受限于科学理论，HDAC4相比HIFl a K532R更大的效力可能是由于HDAC4具有除了 HIFl α之外的靶标，或者可能是这样的情况HIF1 a K532R不象 HDAC4介导的去乙酰化之后HIFl α的野生型等位基因那样有效。实施例V 逆转录病毒介导的HDAC4的表达保护视网膜细胞免于细胞死亡进行逆转录病毒谱系分析，以研究增多的HDAC4蛋白质是否保护双极(BP)细胞。 如图3C中所示，以前的谱系分析表明，PO视网膜祖细胞能产生视杆光感受器和BP细胞，以及许多克隆只有单视杆。许多BP细胞自然死亡；因此，可能一些仅有视杆的克隆是由于最初具有视杆和BP 细胞的克隆的BP细胞损失。如果HDAC4的表达能防止双极细胞死亡，用编码HDAC4的谱系追踪逆转录病毒感染应该导致具有BP细胞的克隆增加，以及具有单视杆的克隆减少。为了检验这一假设，使用表达HDAC4的不能复制的逆转录病毒LIA进行克隆分析。使用不能复制的逆转录病毒LIA的分析如前所述进行(Cepko等人(1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36 51 ；Dyer, C. L. Cepko (2001) J. Neurosci. 21 :4259)。LIA 逆转录病毒如前所述制备，并具有大约lX107cfu/ml的滴度。将半微升病毒悬浮液注射到PO小鼠视网膜的视网膜下间隙。 视网膜在P21被固定，并对于由病毒感染的视网膜祖细胞生成的细胞进行AP染色。在P0，在体内用对照LIA病毒和包含HDAC基因的病毒(LIA-HDAC4)感染视网膜。在P21收集组织，并分析克隆中的细胞数量和类型(图3D)。仅含有视杆细胞的克隆(图3E)减少大约 13%，从对照LIA感染的61. 2%降至LIA-HDAC4感染的47. 9%。与此同时，相比LIA克隆的5. 7%,LIA-HDAC4克隆中含有1个视杆加1个BP(图3F)的克隆的百分比增加大约2倍 (14. 9% )。含有2个视杆加1个BP的克隆数也统计学显著地增加，从LIA感染的3. 4%升至LIA-HDAC4感染的5. 7%。当1个视杆加1个BP与2个视杆加1个BP这两类一起添加时，包含BP的总克隆从LIA感染的9. 增加至LIA-HDAC4感染的20.6%。这些结果与BP 细胞的存活增加一致，并且与HDAC4 RNAi治疗的发现互补，这两者在本文中都进一步说明。以下总结了实施例I-IV的结果。使用小鼠视网膜作为检验HDAC4的体内功能的模型系统，人们发现，HDAC4在神经元存活方面起着至关重要的作用。RNAi引起的HDAC4减少导致通过胱天蛋白酶_3活化途径的广泛的凋亡细胞死亡。HDAC4的过度表达拯救BP细胞免于自然发生的细胞死亡。更重要的是，从治疗的角度来看，HDAC4拯救rdl小鼠中的光感受器免于死亡。使用编码限制在细胞质或细胞核的蛋白质的HDAC4的等位基因，HDAC4的促进存活功能被证明是由细胞质HDAC4介导的。虽然核HDAC4不能救治视网膜变性，但是以其他视网膜细胞类型为代价导致AC的产生增加。这些数据表明，HDAC4在不同的细胞室中具有不同的功能。HDAC4介导的rdl小鼠中光感受器变性的救治需要HIFl α的转录活性。有趣的是，HDAC6并没有导致小鼠中HIFl α蛋白质增加或促进视杆的存活。它在果蝇中救治变性是在一个蛋白酶体受损的模型中，其中认为需要HDAC6诱导自我吞噬(Pandey等人Q007) Nature447 :859)。不打算受限于科学理论，这个功能可能是由于其导致其被分类为第II类但不是IIa类HDAC的独特的结构特征，而HDAC4是IIa类HDAC(Yang和Gregoire (2005) Mol. Cell. Biol. 25 :287 。因此，超过一个的神经元细胞存活途径是受HDAC的调节。 由于HDAC4在中枢神经系统其他区域的神经元细胞质中表达(Bolger和Yao Q005) J. Neurosci. 25 :9544)，这些数据表明HDAC4对其他神经变性性疾病可能具有神经保护作用。此外，HDAC抑制剂作为抗癌治疗药物可能是有效的。实施例VI如以上实施例III所述，已证明HDAC4基因可以被递送到体内的视杆光感受器，并抑制视杆死亡以及视锥死亡。使用电穿孔递送该基因，这导致视杆转导而不是视锥转导。这表明，HDAC4可以通过视杆固有的过程拯救视杆。然而，视锥的拯救是间接的，因为该基因不被递送到视锥。在患有色素性视网膜炎(RP)的人以及动物中，这种疾病的基因只在视杆中表达， 然而，视杆死亡后接着视锥死亡。因此，视锥的存活是由于邻近的视杆的存活。因此，如通过电穿孔实验所证明的，在RP中促进视杆的存活应该能促进视锥的存活。由于电穿孔没有转导所有细胞，且由于它不是稳定的长期转导方法，因此开发基因转移的替代方法。病毒载体可以产生更广泛和更稳定的转导。病毒载体也具有比电穿孔能够转导更广泛的物种的优势。已创造了转导HDAC4基因的腺伴随病毒(AAV)。这是可以感染感光细胞的AAV2/5 病毒。CMV启动子和CAG启动子已被用来驱动表达。CMV启动子载体已被用于在出生后第O 天(PO)感染RP的rdl小鼠模型。结果表明，它能够直接促进视锥存活。感染后视杆仍然死亡，这是由于从这个载体表达HDAC4的延迟。通常情况下，具有CMV启动子的AAV2/5直到感染几乎4周后才表达高水平的病毒基因。由于视杆到P21在rdl中死亡，预期它们不会存活。然而，视锥的死亡具有慢得多的动力学，在大约P21开始，持续到外周直到大约3 个月(P90)，此时大部分视锥已经死亡。AAV2/5-HDAC4的感染导致更多的视锥存活，特别是在中心视网膜，直至至少P60(图10)。只表达GFP的对照病毒不显示显著的视锥存活，特别是到这个阶段在外周。(图10)这些数据表明，可以治疗已损失其视杆且正在经历视锥视觉损失(即日间和彩色视觉)的RP患者。此外，由于视杆的死亡动力学在RP患者中慢得多，使用这种方法也将使视杆存活。实施例VII如以上实施例VI所述，已经表明，AAV2/5-HDAC4对rdl感光细胞的感染导致视锥存活直到至少P60。然而，由于在此动物模型中的快速视杆死亡速率与AAV2/5载体表达 HDAC4的延迟，视杆没有存活。因此，为了证明HDAC4表达也可以导致视杆存活，使用具有比上述rdl小鼠模型慢的死亡动力学的视网膜变性小鼠模型。例如，使用视紫红质敲除小鼠(Mio-/-)。HDAC4基因在可操作地连接到组成型启动子的病毒载体中表达。该构建体用于通过电穿孔、视网膜下和/或玻璃体内注射感染感光细胞。根据本文提出的证据，预计结果将显示该构建体能够直接促进视杆的存活。
权利要求
1.一种抑制神经元细胞死亡的方法，包括将所述细胞与增强HDAC4、HDAC5、HDAC6、 HDAC7或HIFl α的表达和/或活性的试剂接触，从而抑制视网膜细胞的死亡。
2.一种治疗或预防受试者中的神经变性性病症的方法，包括向所述受试者施用增强 HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7或HIFl α的表达和/或活性的试剂，从而治疗或预防所述受试者中的所述神经变性性病症。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述神经元细胞是视网膜细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述视网膜细胞选自双极细胞、视杆感光细胞和视锥感光细胞。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述试剂是核酸分子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子在细胞质中表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述核酸分子包括包含突变的HDAC4基因，所述突变导致外源性HDAC4定位于细胞的细胞质中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述HDAC4是HDAC4-L175A。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包括没有被ARDl酰化的HIFla基因。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包括没有被泛素化的HIFlα基因。
11.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包括没有被蛋白酶体降解的 HIFl α基因。
12.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包括包含导致外源性HIFlα具有组成型活性的突变的HIFl α基因。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述神经元细胞死亡是自然发生的。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述神经元细胞死亡由神经变性性病症引起。
15.根据权利要求2或14所述的方法，其中，所述神经变性性病症是年龄相关性黄斑变性。
16.根据权利要求2或14所述的方法，其中，所述神经变性性病症是色素性视网膜炎。
17.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸分子包含在载体中。
18.—种抑制神经元细胞死亡的方法，包括将所述细胞与抑制所述细胞中HDAC4降解的试剂接触，从而抑制所述神经元细胞的死亡。
19.一种抑制神经元细胞死亡的方法，包括将所述细胞与防止ARDl乙酰化所述细胞中的HIFl α的试剂接触，从而抑制所述神经元细胞的死亡。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，HIFlα泛素化被抑制。
21.—种抑制双极细胞死亡的方法，包括将所述细胞与增强所述细胞中HDAC6的表达和/或活性的试剂接触，从而抑制所述双极细胞的死亡。
22.根据权利要求17所述的方法，其中，所述载体是逆转录病毒、腺病毒、腺病毒/逆转录病毒嵌合体、腺伴随病毒(AAV)、单纯疱疹病毒I或II、细小病毒、网状内皮组织增殖病毒、脊髓灰质炎病毒、乳头瘤病毒、痘苗病毒和慢病毒。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述载体是AAV载体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述AAV载体是AAV2/5或AAV2/8载体。
全文摘要
本发明提供了通过改变视网膜细胞中的HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HIF1α中的一种或多种的表达来抑制视网膜细胞死亡的方法。
文档编号A61K31/70GK102170783SQ200980139144
公开日2011年8月31日 申请日期2009年8月13日 优先权日2008年8月13日
发明者C·L·塞普科, 陈波 申请人:哈佛学院院长等