专利名称：结合淋巴细胞活化基因3(lag-3)之人类抗体及其用途的制作方法
结合淋巴细胞活化基因3(LAG-(3)之人类抗体及其用途
背景技术：
淋巴细胞活化基因3或LAG_3(也称作⑶223)系免疫球蛋白超基因家族之一员， 并且在结构上以及遗传上与⑶4有关。LAG-3并不在休眠的外周血淋巴细胞上表达，但在被活化的T细胞以及NK细胞上表达。LAG-3系由位于染色体12的短臂的远程部分、在⑶4 基因附近的一基因进行编码的膜蛋白，表明该LAG-3基因可能已经藉由基因重复而进化 (Triebel et al. (1990) T. Exp. Med. 171 1393-1405)。类似于⑶4，LAG-3已被证明与MHC II类分子进行相互作用，但不像⑶4，LAG-3不与人类免疫缺陷病毒gpl20蛋白进行相互作用(Baixeras et al. (1992) J. Exp. Med. 176 327-337)。使用可溶的LAG-3免疫球蛋白融合蛋白(sLAG_3Ig)的研究证明了 LAG-3与在细胞表面上的MHC II类直接并且特异的结合(Huard et al. (1996)Eur. J. Immunol. 26 1180-1186)。在抗原特异性T细胞应答的体外研究中，加入抗LAG-3抗体导致T细胞增殖增加、活化抗原(如CD25)的更高表达、以及更高浓度的细胞因子(例如干扰素、以及白介素4)，从而支持LAG-/MHC II类分子相互作用在下调CD4+T淋巴细胞的抗原依赖性刺激中的作用(Huard et al. (1994)Eur. J. Immunol. 24 :3216-3221)。已经证明 LAG-3 的胞质内区与名为LAP的蛋白进行相互作用，此蛋白被认为是与CD3/TCR活化途径的下调有关的信号转导分子(Iouzalen et al. Q001) Eur. J. Immunol. M :2885-2891)。此外，已显示 ⑶4+CD25+调节性T细胞(TMg)在活化时表达LAG-3，并且针对LAG-3之抗体在体内以及体外均抑制由所诱导的TMg细胞所产生的阻抑，表明LAG-3有助于TMg细胞的阻抑活性(Huang，
C.et al. (2004) Immunity 21:503-513)。另外，已显示LAG-3藉由调节性T细胞以T细胞依赖性以及非依赖性这两种机制对T细胞稳态进行负向调节(Workman，C. J. and Vignali,
D.Α. (2005) J. Immunol. IU :688-695)。在某些情况下，LAG-3还已显示出具有免疫刺激作用。例如，当与未经转染的肿瘤细胞相比时，移植到同系基因小鼠中的转染了 LAG-3的肿瘤细胞显示出显著的生长下降或完全消退，表明LAG-3在肿瘤细胞上的表达藉由经由MHC II类分子触发抗原呈递细胞而刺激了抗肿瘤应答(Prigent et al. (1999)Eur. J. Immunol. 29 :3867-3876) 另外地， 当与抗原一起被给予小鼠时，已显示可溶性LAG-3Ig融合蛋白刺激体液免疫反应以及细胞免疫反应，说明可溶性LAG-3 Ig可作为疫苗佐剂发挥作用(El Mir and Triebel (2000) J. Immunol. IM :5583-5589)。此外，已显示可溶性人类LAG_3Ig扩大了在体外产生I型肿瘤特异性免疫(Casati et al. (2006) Cancer Res.巡4450-4460)。在 Triebel Q003) Trends Immunol. 24 :619-622中对LAG-3的功能活性进行了进一步综述。鉴于以上原因，用于调整 LAG-3活性的另外的药剂系令人感兴趣的。发明概述本披露提供了分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，该等人类单克隆抗体特异性结合LAG-3并且具有所希望的功能特性。该等特性包括与人类LAG-3的高亲和力结合，与人类和猴类LAG-3 (猕猴和/或恒河猴LAG-3)结合，但不与小鼠LAG-3结合，抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC) II类分子的结合和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。例如，本发明之抗体可被用于(如，在携带肿瘤的受试者或携带病毒的受试者中)检测 LAG-3蛋白或刺激抗原特性性T细胞应答。一方面，本发明涉及分离的之人类单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体结合人类LAG-3，并且表现出以下特性中的至少一种(a)结合猴类 LAG-3 ；(b)不结合小鼠LAG-3 ；(c)抑制LAG-3与主要组织相容性(MHC) II类分子的结合；以及(d)刺激免疫反应。较佳的是，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的至少两种。更佳的是，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)以及(d)中的至少三种。甚至更佳的是，该抗体表现出特性 (a)、(b)、(c)以及(d)中的全部四种。在一较佳的实施方案中，该抗体刺激抗原特异性T细胞应答，例如抗原特异性T细胞应答中白介素2(IL-2)之产生。在其它实施方案中，该抗体刺激免疫反应，例如抗肿瘤应答(例如在体内肿瘤移植物模型中抑制肿瘤生长)或自身免疫反应(例如在NOD小鼠中促进糖尿病的形成)。在另一较佳的实施方案中，该抗体结合人类LAG-3的表位，该表位包括氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID NO :76)。在又另一较佳的实施方案中，该抗体结合人类 LAG-3 的表位，该表位包括氨基酸序列 HPAPPSSW(SEQ ID NO :77)或 PAAPSSWG (SEQ ID NO: 78)。在仍又其它的实施方案中，该抗体以IX 10- 或更小的Kd与人类LAG-3相结合，或以 1 X 10、或更小的Kd与人类LAG-3相结合，或以5 X 1(Γ9Μ或更小的Kd与人类LAG-3相结合， 或以IX 101或更小的Kd与人类LAG-3相结合。在一实施方案中，该抗体藉由免疫组织化学法使垂体组织染色，而在另一实施方案中，该抗体藉由免疫组织化学法不使垂体组织染色。在另一方面，本发明涉及分离的人类单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体与参考抗体交叉竞争而结合人类LAG-3，其中该参考抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :37，以及轻链可变区，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 43 ；(b)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :38，以及轻链可变区，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 44 ；(c)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :39，以及轻链可变区，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 45 ；(d)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO -AO,以及轻链可变区，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 46 ；(e)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :41，以及轻链可变区，包括氨基酸序列 SEQ ID NO 47 ；或者(f)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :42，以及轻链可变区，包括氨基酸序列 SEQ ID NO :48ο在一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID Ν0:37的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO :43的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO :38的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO 44 的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID N0:39 的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO :45的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO :40的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO :46的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO 41的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ ID NO 47的轻链可变区。在另一较佳的实施方案中，该参照抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO :42的重链可变区以及包含氨基酸序列SEQ IDNO 48的轻链可变区。在另一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区系人类Vh 3-20基因、人类Vh 4-34基因、人类Vh 3_33基因或Vh 1- 基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异地结合人类LAG-3。在另一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk L18基因、 人类Vk L6基因或人类Vk A27基因的产物或是衍生于该基因，其中该抗体特异地结合人类 LAG-3。在一较佳的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括(a)重链可变区，该重链可变区系人类Vh 4-34基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk L6基因的产物或衍生于该基因；(b)重链可变区，该重链可变区系人类Vh 3-33基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk A27基因的产物或衍生于该基因；(c)重链可变区，该重链可变区系人类Vh 3-20基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk L18基因的产物或衍生于该基因；(d)重链可变区，该重链可变区系人类Vh I-M基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk L6基因的产物或衍生于该基因；或者(e)重链可变区，该重链可变区系人类Vh 3-33基因的产物或衍生于该基因，以及轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk L6基因的产物或衍生于该基因；其中该抗体特异地结合人类LAG-3。在另一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为SEQ ID NO 37 至 42 ；(b)轻链可变区，包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为SEQ ID NO 43 至 48 ；其中该抗体特异性结合人类LAG-3。一较佳的组合包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ另一较佳的组合包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ另一较佳的组合包括
ID NO 37 ；以及 ID NO :43。
ID NO 38 ；以及 ID NO :44。
10
(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 39 ；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :45。另一较佳的组合包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 40 ；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :46。另一较佳的组合包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 41 ；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :47。另一较佳的组合包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 42 ；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO :48。本发明之抗体可以是例如全长抗体，例如IgGl、IgG2或IgG4同种型。在一较佳的实施方案中，该抗体系IgG4同种型。在另一较佳的实施方案中，该抗体系IgG4同种型，其在重链恒定区的铰链区(在与如Angal et al. (1993)Mol. Immunol.巡105_108中所说明的位置241对应的位置)具有从丝氨酸到脯氨酸的突变，这样重链之间二硫桥的异质性被减小或消除。可替代地，该抗体可以是诸如Fab、Fab’或Fab’ 2片段之抗体片段，或单链抗体。本披露还提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包括连接到治疗剂(例如细胞毒素或放射性同位素)的本发明之抗体、或其抗原结合部分。本披露还提供了双特异性分子，该双特异性分子包括本发明的抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分与第二功能模块相连接，该第二功能模块具有与所述抗体或其抗原结合部分相比不同的结合特异性。还提供了含有本发明的抗体、或其抗原结合部分、或免疫缀合物、或双特异性分子，以及药学上可接受的载体的组合物。本披露还涵盖了对本发明之抗体、或其抗原结合部分进行编码的核酸分子，连同包括此类核酸的表达载体以及包括此类表达载体的宿主细胞。还提供了使用包括此类表达载体的宿主细胞制备抗LAG-3抗体的方法，并且该等方法可包括以下步骤(i)在该宿主细胞中表达该抗体以及(ii)从该宿主细胞中分离该抗体。在另一方面，本发明涉及使用本发明的抗LAG-3抗体来刺激免疫反应的方法。例如，在一实施方案中，本发明提供了刺激抗原特异性T细胞应答的方法，该方法包括使所述 T细胞与本发明的抗体相接触，这样刺激了抗原特异性T细胞应答。在一较佳的实施方案中，刺激了由抗原特异性T细胞进行的白介素2之产生。在另一实施方案中，本发明提供了在受试者中刺激免疫反应(例如，抗原特异性T细胞应答)的方法，该方法包括给予该受试者本发明之抗体，这样刺激了该受试者中的免疫反应(例如，抗原特异性T细胞应答)。在一较佳的实施方案中，该受试者系携带肿瘤的受试者，并且刺激了针对该肿瘤的免疫反应。 在另一较佳的实施方案中，该受试者系携带病毒的受试者，并且刺激了针对该病毒的免疫反应。在另一方面，本发明提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括给予该受试者本发明之抗体，这样该受试者中的肿瘤生长受到抑制。又在另一方面，本发明提供了治疗受试者中病毒感染的方法，该方法包括给予该受试者本发明之抗体，这样该受试者中的病毒感染得到治疗。又在另一方面，本发明提供了在受试者中刺激免疫反应的方法，该方法包括给予该受试者抗LAG-3抗体以及至少一种另外的免疫刺激性抗体，如抗PD-I抗体、抗PD-Ll抗体和/或抗CTLA-4抗体，这样在该受试者中刺激了免疫反应，例如以抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。在一实施方案中，给予受试者抗LAG-3抗体以及抗PD-I抗体。在另一实施方案中，给予受试者抗LAG-3抗体以及抗PD-Ll抗体。在另一实施方案中，给予受试者抗LAG-3 抗体以及抗CTLA-4抗体。在一实施方案中，抗LAG-3抗体系人类抗体，如本披露的抗体。可替代地，该抗LAG-3抗体可以是例如嵌合或人源化抗体。在另一实施方案中，至少一种另外的免疫刺激性抗体(例如，抗PD-1、抗PD-Ll和/或抗CTLA-4抗体)系人类抗体。可替代地，至少一种另外的免疫刺激性抗体可以是例如嵌合或人源化抗体。又在另一方面中，本发明涉及制备抗LAG-3抗体的方法。该方法包括(a)提供(i)重链可变区抗体序列，包括选自下组的CDRl序列，该组的构成为 SEQ ID NO :1至6，选自下组的⑶R2序列，该组的构成为SEQ ID NO :7至12，和/或选自下组的CDR3序列，该组的构成为SEQ IDNO :13至14、GGY、16至18 ；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，包括选自下组的CDRl序列，该组的构成为SEQ ID NO 19至M，选自下组的 ⑶R2序列，该组的构成为SEQ ID NO :25至30，和/或选自下组的⑶R3序列，该组的构成为=SEQ ID NO 31 至 36 ；(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变之抗体序列；并且(c)将被改变之抗体序列表达成蛋白质。从以下详细的说明以及实施例中本披露的其它特征及优点将是清楚的，该等说明与实施例不得被解释为限制性的。本申请全文引用的所有参考文献、Genbank条目、专禾IJ、 以及已公开的专利申请的内容都明确地藉由引用结合在此。附图简述图IA示出了 25F7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO 49)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:37)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO 1)、CDR2 (SEQ ID N0:7)、以及 CDR3 (SEQ ID NO :13)区，并指明了 V、D、以及J的种系来源。图IB示出了 25F7人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO 55) 以及氨基酸序歹 Ij (SEQ ID Ν0:43)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO 19)、CDR2 (SEQ ID NO: 25)、以及⑶R3(SEQ ID NO :31)区，并指明了 V与J的种系来源。图2A示出了 ^HlO人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO 50) 以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:38)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :2)、CDR2 (SEQ ID NO :8)、以及 CDR3 (SEQ ID NO :14)区，并指明了 V、D、以及J的种系来源。图2B示出了 26H10人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO 56)以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO 44)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :20)、CDR2 (SEQ ID NO :26)、 以及CDR3(SEQ ID NO :32)区，并指明了 V与J的种系来源。图3A示出了 25E3人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO 51)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:39)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :3)、CDR2 (SEQ ID NO :9)、以及CDR3区，并指明了 V、D、以及J的种系来源。图3B示出了 25E3人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO 57) 以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID Ν0:45)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :21)、CDR2 (SEQ ID N0:27)、以 R CDR3 (SEQ ID NO 33)区，并指明了 V与J的种系来源。图4A示出了 8B7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO 52)以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:40)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :4)、CDR2 (SEQ ID N0:10)、以及 CDR3 (SEQ ID NO: 16)区，并指明了 V、D、以及J的种系来源。图4B示出了 8B7人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO 58) 以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID Ν0:46)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :22)、CDR2 (SEQ ID N0:28)、以及CDR3(SEQ ID NO 34)区，并指明了 V与J的种系来源。图5A示出了 11F2人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO 53)以及氨基酸序列(SEQ ID N0:41)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :5)、CDR2 (SEQ ID NO: 11)、以及 CDR3 (SEQ ID NO: 17)区，并指明了 V、D、以及J的种系来源。图5B示出了 11F2人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO 59) 以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID Ν0:47)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :23)、CDR2 (SEQ ID N0:29)、以 R CDR3 (SEQ ID NO 35)区，并指明了 V与J的种系来源。图6A示出了 17E5人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO 54)以及氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:42)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :6)、CDR2 (SEQ ID N0:12)、以及 CDR3 (SEQ ID NO: 18)区，并指明了 V、D、以及J的种系来源。图6B示出了 17E5人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO 60) 以及氨基酸序列(SEQ ID N0:48)。描绘了 CDRl (SEQ ID NO :24)、CDR2 (SEQ ID N0:30)、以 R CDR3 (SEQ ID NO 36)区，并指明了 V与J的种系来源。图7示出了 25F7的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 37)与人类种系Vh 4-34 以及JH5b氨基酸序列(分别是SEQ ID N0:61以及62)的比对。图8示出了 25F7的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 43)与人类种系Vk L6 以及JK2氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 63以及64)的比对。图9示出了 26H10的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 38)与人类种系Vh 3-33以及JH6B氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 65以及66)的比对。
图10示出了 26H10的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 44)与人类种系Vk A27以及JK3氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 67以及68)的比对。图11示出了 25E3的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 39)与人类种系Vh 3-20以及JH4b氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 69以及70)的比对。图12示出了 25E3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 45)与人类种系Vk L18 以及JK2氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 71以及64)的比对。图13示出了 8B7的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 40)与人类种系Vh 4-34 以及JH5b氨基酸序列(分别是SEQ ID N0:61以及62)的比对。图14示出了 8B7的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 46)与人类种系Vk L6 以及JK4氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 63以及72)的比对。图15示出了 11F2的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 41)与人类种系Vh1-24以及JH4b氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 73以及70)的比对。图16示出了 11F2的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 47)与人类种系Vk L6 以及JKl氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 63以及74)的比对。图17示出了 17E5的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 42)与人类种系Vh 3-33以及2-2氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 65以及70)的比对。图18示出了 17E5的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 48)与人类种系Vk L6 氨基酸序列(分别是SEQ ID NO 63以及75)的比对。图19示出由猴类LAG-3cDNA的克隆pa23-5(SEQ ID NO :93)编码的蛋白质序列与 Genbank 存储的恒河猴 LAG-3 蛋白质序列(SEQ ID NO 94) (Genbank 登录号 ΧΜ_001108923) 的比对。外环肽区以及跨膜结构域标有下划线。在两条序列之间的一处氨基酸差异(氨基酸位置419)以加粗强调。发明详述本披露涉及分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，该等抗体结合人类LAG-3 并且具有所希望的功能特性。在某些实施方案中，本发明之抗体来源于特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR区。本披露提供了分离的抗体、制备这种抗体的方法、包括这种抗体的免疫缀合物以及双特异性分子以及包括本发明之抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。本披露还涉及使用该等抗体 (例如检测LAG-3蛋白)的多种方法，连同使用本发明的抗LAG-3抗体(单独或与其它免疫刺激性抗体组合)来刺激免疫反应的多种方法。因此，本披露还提供了使用本发明的抗 LAG-3抗体来例如抑制肿瘤生长或治疗病毒感染的多种方法。为了可以更容易地理解本披露，首先定义了某些术语。其它定义在整个详细说明中给出。术语“LAG-3”指淋巴细胞活化基因3。术语“LAG-3”包括变体、同等型、同源物、 直向同源物、以及旁系同源物。例如，在某些情况下，对人类LAG-3蛋白特异之抗体可能与来自于非人类的物种的LAG-3蛋白进行交叉反应。在其它实施方案中，对人类LAG-3蛋白特异之抗体可能对人类LAG-3蛋白完全特异，并且可能不表现出物种或其它类型的交叉反应性，或可能与来自某些其它物种但不是所有其它物种的LAG-3进行交叉反应(例如与猴类LAG-3而非小鼠LAG-3进行交叉反应)。术语“人类LAG-3”指人类序列LAG-3，如具有 Genbank登录号NP_002277的人类LAG-3的完整氨基酸序列。术语“小鼠LAG-3”指小鼠序列LAG-3，如具有Genbank登录号NP_032505的小鼠LAG-3的完整氨基酸序列。LAG-3在本领域还称作例如CD223。人类LAG-3序列可通过具有例如保守的突变或在非保守区的突变而不同于Genbank登录号NP_002277的人类LAG-3，而LAG-3具有基本上与Genbank登录号NP_002277的人类LAG-3的生物功能相同的生物功能。例如，人类LAG-3的一项生物功能系在LAG-3的细胞外结构域中具有一个表位，该表位被本披露的一种抗体特异性地结合或者人类LAG-3的一项生物功能系与MHC II类分子结合。术语“猴类LAG-3 ”旨在涵盖由旧世界猴以及新世界猴所表达的LAG-3蛋白， 包括但不限于猕猴LAG-3以及恒河猴LAG-3。猴类LAG-3的一种代表性序列系在图19 以及SEQ ID NO 85中示出的恒河猴LAG-3氨基酸序列，它还被储存为Genbank登录号 XM_001108923。猴类LAG-3的另一种代表性序列系在图19以及SEQ ID NO 84中示出的克隆pa23-5的可替代的恒河猴序列，如在实施例3A第3小节所说明而被分离。当与Genbank 所存储的序列比较时，这个可替代的恒河猴序列在位置419上显示出一处单个氨基酸的差别。一种特定的人类LAG-3序列与Genbank登录号为NP_002277的人类LAG-3在氨基酸序列上通常会有至少90%的同一性，并且包含多个氨基酸残基，当与其它物种(如鼠类) 的LAG-3氨基酸序列相比时，该等氨基酸残基将该氨基酸序列鉴定为是人源的。在某些情况下，一种人类LAG-3与Genbank登录号为NP_002277的LAG-3在氨基酸序列上可具有至少 95 %，或者甚至至少96 %、97 %、98 %或99 %的同一性。在某些实施方案中，与Genbank登录号为NP_002277的LAG-3序列相比，一种人类LAG-3序列会展示出不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，与Genbank登录号为NP_002277的LAG-3序列相比，该人类LAG-3 可展示出不超过5个，或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。百分比同一性可以如在此处所说明进行确定。术语“免疫反应”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、以及补体)的作用，该作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌性细胞、或者在自身免疫或病理炎症情况下的正常人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体中清除。“抗原特异性T细胞应答”指由T细胞产生的应答，该应答产生于用对该T细胞特异的抗原对该T细胞的刺激。由T细胞在抗原特异性刺激时产生的反应的非限制性实例包括增殖以及细胞因子的产生(例如IL-2的产生)。此处所指之术语“抗体”包括完整抗体以及它们的任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或它们的单链。完整抗体系包括由二硫键相互连接的至少两条重(H)链以及两条轻(L)链的糖蛋白。每一条重链均包括一个重链可变区(在此缩写为Vh)以及一个重链恒定区。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每一条轻链均包括一个轻链可变区(在此缩写为以及一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，Q。Vh以及八区可以进一步被细分为多个高可变性区，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的被称为框架区(FR)的多个区。每个Vh以及\均由三个CDR及四个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。该等抗体的恒定区能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该等宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)以及经典补体系统的第一成分(Clq)。此处使用之术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)，是指抗体保留特异性结合抗原(例如LAG-3蛋白)的能力的一或多种片段。已发现抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来进行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由Vl、VH、Cl及ChI结构域构成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包括通过在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab'片段，它实质上是带有铰链区部分的 Fab (见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed. ,3. sup. rd ed. 1993) ； (iv)由 Vh 及 ChI结构域构成的Fd片段；(ν)由抗体的单臂的\及Vh结构域构成的Fv片段；(vi) dAb片段(Ward et al.，(1989) Nature 341 :544_546)，它由 V11 结构域构成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体(nanobody)，含有单个可变结构域及两个恒定结构域的
15重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域\和￥11系由多个分开的基因进行编码的，但是使用重组方法藉由合成接头可以将它们连接起来，使它们形成单条蛋白链，其中\和Vh 区进行配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al. (1988) Science 242 :423-426 以及 Huston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 迎5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖此类单链抗体。该等抗体片段系使用本领域中技术人员已知的常规方法获得，并且对该等片段采用与完整抗体相同的方式进行有用性筛选。此处所使用之“分离之抗体”旨在表示如下的抗体，它基本上不含具备不同的抗原特异性的其它抗体(例如，特异性结合LAG-3蛋白的分离之抗体基本上不含特异性结合除 LAG-3蛋白以外的抗原之抗体)。然而，特异性结合人类LAG-3蛋白的分离之抗体对于其它抗原(如来自其它物种的LAG-3蛋白)可具有交叉反应性。此外，分离之抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学物。此处使用之术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成之抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示了针对某一特定表位的单一结合特异性及亲和力。此处使用之术语“人类抗体”旨在包括具有如下可变区之抗体，在该等可变区中， 框架区及CDR区均衍生自人类种系免疫蛋白序列。此外，如果该抗体包括恒定区，则该恒定区也衍生自人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可以包含不是由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如，由体外随机诱变或定点诱变引入的突变或藉由体内体细胞突变引入的突变)。然而，在此所使用之术语“人类抗体”并非旨在包括这样之抗体， 其中衍生自另外的哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人类框架序列上。术语“人类单克隆抗体”指展示出单一结合特异性之抗体，该等抗体具有如下可变区，其中框架区以及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列。在一实施方案中，人类单克隆抗体系由杂交瘤产生的，该杂交瘤包括融合至永生化细胞的从转基因的非人类动物(例如转基因小鼠)处获得的B细胞，具有包括人类重链转基因及轻链转基因的基因组。此处使用之术语“重组人类抗体”包括藉由重组的手段制备、表达、产生、或分离的所有人类抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)或由其制备出的杂交瘤(以下将进一步说明) 中分离之抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因系转基因性的或转染色体性的、(b)从被转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)中分离之抗体、(c)从重组的组合的人类抗体文库中分离之抗体、以及(d)藉由任何其它方法制备、表达、产生或分离之抗体，该等方法涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上。此类重组的人类抗体具有如下可变区，其中框架区及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，此类重组的人类抗体能经受体外诱变(或者，当使用对于人类Ig序列而言转基因的动物时，经受体内体细胞诱变)，并且因此，重组抗体的区的氨基酸序列系这样的序列， 该等序列也许并不自然地存在于体内的人类抗体种系全集之中，尽管该等序列衍生自人类种系的Vh和\序列及与其相关。术语“同种型”指由重链恒定区基因进行编码之抗体的种类(例如IgM或IgGl)。短语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”此处可以与术语“特异地结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”指人类抗体的任何已修饰的形式，例如，该抗体与另一试剂或抗体的缀合物。术语“人源化抗体”旨在表示以下抗体，其中衍生自另一哺乳动物物种(如小鼠) 的种系的CDR序列已被移植到人类框架序列上。可以在人类框架序列中进行另外的框架区修饰。术语“嵌合抗体”旨在表示以下抗体，其中可变区序列系衍生于一物种而恒定区序列系衍生于另一物种，例如如下抗体，其中可变区序列衍生于小鼠抗体而恒定区序列衍生于人类抗体。在此所使用“特异性结合人类LAG-3”之抗体意指如下抗体，它结合人类LAG-3蛋白(并且可能是来自一或多种非人类物种的LAG-3蛋白)，但基本上不结合非LAG-3蛋白。 较佳的是，该抗体以“高亲和力”(也就是以IX ICT7M或更小的Kd)结合人类LAG-3蛋白， 更佳地为5 X 10_8M或更小，更佳地为3 X 10_8M或更小，更佳地为1 X 10_8M或更小，更佳地为 5X 10_9M或更小，或甚至更佳地为1 X 10_9M或更小。此处使用之术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即，以IX 10_6M或更大，更佳地为1X10_5M或更大，更佳地为1X10_4M或更大，更佳地为1X10_3M或更大，甚至更佳地为1X10_2M或更大的Kd结合蛋白质或细胞。此处使用之术语"Kass。。”或“Ka”旨在表示特定之抗体-抗原相互作用的结合速率， 而此处使用之术语"Kdis”或“Kd，，，旨在表示特定之抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用之术语“KD，”旨在表示解离常数，它系由&与1之比(即Kd/Ka)得到，并被表示为摩尔浓度(M)。抗体的Kd值可以使用本领域已经充分确认的方法进行确定。确定抗体的Kd的一较佳方法系藉由使用表面等离子共振，较佳地是使用例如Biaeore 系统的生物传感器系统。术语IgG抗体的“高亲和力，，是指对于靶抗原而言抗体具有的Kd为1 X IO-7M或更小，更佳地为5 X 10_8M或更小，甚至更佳地为1 X 10_8M或更小，甚至更佳地为5 X 10_9M或更小，并且甚至更佳地为IXlO-9M或更小。然而，对于其它抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以发生变化。例如，对于IgM同种型而言，“高亲和力”结合是指抗体具有的Kd为10_6M或更小，更佳地为IiT7M或更小，甚至更佳地为ICT8M或更小。术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖动物、以及爬行动物，尽管哺乳动物系较佳的，如非人类的灵长类、绵羊、犬、猫、牛、以及马。在以下各分部中进一步详细地说明了本发明的不同方面。具有特定功能特性的抗LAG-3抗体本发明抗体之特征为抗体特定的功能性特征或特性。例如，该等抗体与人类LAG-3 特异地结合，并且可与来自某些其它物种的LAG-3相结合，例如猴类LAG-3 (例如猕猴、恒河猴)，但是基本上不与来自某些其它物种的LAG-3(例如小鼠LAG-3)相结合。较佳的是，本发明之抗体以高亲和力与人类LAG-3相结合。该抗体刺激免疫反应(如抗原特异性T细胞应答)的能力可藉由(例如)该抗体在抗原特异性T细胞应答中刺激白介素2 (IL-2)的产生来说明。在某些实施方案中，本发明的抗体与人类LAG-3结合并且表现出刺激抗原特异性T细胞应答的能力。在某些实施方案中，本发明的抗体与人类LAG-3结合但并不表现出刺激抗原特异性T细胞应答的能力。评估抗体刺激免疫反应的能力的其它手段包括该抗体(如在体内肿瘤移植物模型中)抑制肿瘤生长的能力(参见，例如实施例6)或该抗体刺激自身免疫反应的能力，例如在自身免疫模型中促进自身免疫疾病的发生的能力，例如在NOD小鼠模型中促进糖尿病的发生的能力 (参见，例如实施例7)。本发明之抗体与LAG-3的结合可用本领域已充分确认的一或多种技术进行评估。 例如，在一较佳的实施方案中，抗体可用流式细胞术测定法进行测试，其中该抗体与表达人类LAG-3的细胞系进行反应，例如已经被转染而能在它们的细胞表面表达LAG-3 (例如人类 LAG-3、猴类LAG-3 (例如，恒河猴或猕猴)或小鼠LAG-3)的CHO细胞(参见，例如实施例3A 中适宜的测定)。在流式细胞术测定中使用的其它适宜的细胞包括表达天然LAG-3的由抗 CD3刺激的CD4+活化的T细胞。另外地或可替代地，抗体的结合，包括结合动力学(例如Kd 值)可在BIAcore结合测定中进行测试(参见，例如实施例中适宜的测定)。还有其它适宜的结合测定包括ELISA测定，例如使用重组的LAG-3蛋白(参见，例如实施例1中适宜的测定)。较佳的是，本发明之抗体以5X 10_8M或更小的Kd与LAG-3蛋白结合，以2X 10_8M 或更小的Kd与LAG-3蛋白结合，以5 X IO-9M或更小的Kd与LAG-3蛋白结合，以4 X 1(Γ9Μ或更小的Kd与LAG-3蛋白结合，以3X 10_9M或更小的Kd与LAG-3蛋白结合，以2X 10_9M或更小的Kd与LAG-3蛋白结合，以1 X 10_9M或更小的Kd与LAG-3蛋白结合，以5X 10_1(IM或更小的Kd与LAG-3蛋白结合，或1 X IO^10M或更小的Kd与LAG-3蛋白结合。典型地，本发明的抗体与淋巴样组织(如扁桃体、脾脏或胸腺)中的LAG-3相结合，这可藉由免疫组织化学法进行检测。另外地，如在实施例8中进一步说明，本发明的某些抗LAG-3抗体如藉由免疫组织化学法所测量使垂体组织染色(例如，被保留在垂体中)， 而本发明的其它抗LAG-3抗体如藉由免疫组织化学法所测量不使垂体组织染色(例如，不被保留在垂体中)。因此，在一实施方案中，本发明提供了藉由免疫组织化学法使垂体组织染色的人类抗LAG-3抗体，而在另一实施方案中，本发明提供了藉由免疫组织化学法不使垂体组织染色的人类抗LAG-3抗体。本发明较佳之抗体系人类单克隆抗体。另外地或可替代地，该抗体可以是(例如) 嵌合或人源化单克隆抗体。单克隆抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5较佳的本发明之抗体系如在实施例1和2中所说明进行分离以及结构表征的人类单克隆抗体 25F7J6H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5。25F7J6H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5 的VH氨基酸序列分别示于SEQ ID N0:37至42中。25F7J6H10、25E3、8B7、11F2以及17E5 的VK氨基酸序列分别示于SEQ ID NO 43至48中。考虑到该等抗体中的每一种均可结合人类LAG-3，可将V1^P \序列进行“混合并匹配”以产生本发明的其它抗LAG-3结合分子。较佳的是，当V1^n八链被混合并匹配时，来自特定VH/VL对的Vh序列被结构相似的Vh序列代替。同样地，较佳的是来自特定对的 Vl序列被结构相似的\序列代替。因此，一方面，本披露提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括(a)重链可变区，包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为SEQ ID
18NO :37至42 ；以及(b)轻链可变区，包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组，其构成为SEQ ID NO 43 至 48 ；其中该抗体特异性结合人类LAG-3。较佳的重链及轻链组合包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 43 ；(b)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 44 ；(c)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 45 ；(d)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 46 ；(e)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO 47 ；或者(f)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO 列 SEQ ID NO :48ο在另一方面，本披露提供了多种抗体，该等抗体包括25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 或17Ε5的重链及轻链的CDRl、CDR2及CDR3，或它们的组合。25F7、^HlO、25Ε3、8Β7、11F2以及 17E5&Vh CDRl 的氨基酸序列分别示于 SEQ ID N0:37 至 42 中。25F7、26H10、25E3、8B7、 11F2以及17E5的Vh CDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO 43至48中。25F7J6H10、 25E3、8B7、11F2以及17E5的Vh CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO 13至14、GGY以及16至18中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的Vk CDRl的氨基酸序列分别示于 SEQ ID N0:19 至 24 中。25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5&VK CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID NO 25 至 30 中。25F7J6H10、25E3、8B7、11F2 以及 17E5 的 Vk CDR3 的氨基酸序列分别示于SEQ ID N0:31至36中。CDR区系用Kabat系统绘出的(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。在该等抗体中每一种均能结合人类LAG-3、并且抗原结合特异性主要由⑶Rl、 CDR2、及CDR3区提供的条件下，Vh CDRl、CDR2、以及CDR3序列与\ CDRl、CDR2、以及CDR3 序列可以被“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合并匹配，尽管每种抗体均必须包含Vh⑶R1、⑶R2、以及⑶R3以及八⑶R1、⑶R2，以及⑶R3)，以产生本发明的其它抗 LAG-3结合分子。使用以上所说明及实例中的结合测定(例如，ELISA、Biaeore 分析)可以测试此类“混合并匹配”之抗体的LAG-3结合。较佳的是，当Vh CDR序列被混合并匹配时，来自特定Vh序列的CDRl、CDR2和/或CDR3序列被结构上相似的一或多种CDR序列代替。类似地，当\⑶R序列被混合并匹配时，来自特定\序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列较佳的是被结构上相似的一或多种CDR序列代替。对于普通技术人员非常清楚的是，藉由用来自在此披露的单克隆抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2以及17E5的CDR序列的结构类似序列代替一或多个Vh和/或\ CDR区序列可以产生新颖的Vh以及\序列。
:37，以及轻链可变区，包括氨基酸序 :38，以及轻链可变区，包括氨基酸序 :39，以及轻链可变区，包括氨基酸序 :40，以及轻链可变区，包括氨基酸序 :41，以及轻链可变区，包括氨基酸序 :42，以及轻链可变区，包括氨基酸序
19
至6 ； 至12 ； 至14、 至24 ； 至30 ； 至36 ；
因此，在另一方面，本披露提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括
(a)重链可变区⑶R1，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为SEQID NO=I
(b)重链可变区⑶R2，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为SEQID NO 7
(c)重链可变区⑶R3，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为SEQID NO 13 GGY以及16至18 ；
(d)轻链可变区⑶R1，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为SEQID NO 19
(e)轻链可变区CDR2，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为以及
(f)轻链可变区CDR3，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为
其中该抗体特异性结合人类LAG-3。 在一较佳的实施方案中，该抗体包括
(a)重链可变区CDRl，包括SEQID NO 1 ；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQID NO 7 ；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQID NO 13
(d)轻链可变区CDRl，包括SEQID NO 19
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQID NO :25 ；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQID NO :31。 在另一较佳的实施方案中，该抗体包括
(a)重链可变区CDRl，包括SEQID NO 2 ；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQID NO 8 ；
(c)重链可变区⑶R3，包括SEQID NO 14
(d)轻链可变区CDRl，包括SEQID NO 20
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQID NO :26 ；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQID NO :32。 在另一较佳的实施方案中，该抗体包括
(a)重链可变区CDRl，包括SEQID NO 3 ；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQID NO 9 ；
(c)重链可变区⑶R3，包括GGY；
(d)轻链可变区CDRl，包括SEQID NO 21 ；
(e)轻链可变区CDR2，包括SEQID NO :27 ；以及
(f)轻链可变区CDR3，包括SEQID NO :33。 在另一较佳的实施方案中，该抗体包括
(a)重链可变区CDRl，包括SEQID NO 4 ；
(b)重链可变区CDR2，包括SEQID NO 10 ；
(c)重链可变区CDR3，包括SEQID NO 16 ；
:SEQ ID NO 25 :SEQ ID NO 31
(d)轻链可变区 CDRl，包括 SEQ ID NO 22 ；(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO :28 ；以及(f)轻链可变区 CDR3，包括 SEQ ID NO 340在另一较佳的实施方案中，该抗体包括(a)重链可变区 CDRl，包括 SEQ ID NO 5 ；(b)重链可变区 CDR2，包括 SEQ ID NO 11 ；(c)重链可变区 CDR3，包括 SEQ ID NO 17 ；(d)轻链可变区 CDRl，包括 SEQ ID NO 23 ；(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO :29 ；以及(f)轻链可变区 CDR3，包括 SEQ ID NO :35。在另一较佳的实施方案中，该抗体包括(a)重链可变区 CDRl，包括 SEQ ID NO 6 ；(b)重链可变区 CDR2，包括 SEQ ID NO 12 ；(c)重链可变区 CDR3，包括 SEQ ID NO 18 ；(d)轻链可变区 CDRl，包括 SEQ ID NO 24 ；(e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO :30 ；以及(f)轻链可变区 CDR3，包括 SEQ ID NO :36。在本领域中熟知的是，⑶R3结构域，独立于⑶Rl和/或⑶R2域，可以单独确定抗体对关联抗原的结合特异性，并且可预测地产生多种抗体，该等抗体具有基于共同的CDR3序列的相同的结合特异性。参见，例如Klimka et al.，British J. of Cancer 83(2) :252-260(2000) ；Beiboer et al. , J. Mol. Biol. 296 :833-849 (2000) ；Rader et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95 :8910-8915 (1998) ；Barbas et al.，J. Am. Chem. Soc. 116 2161-2162(1994) ；Barbas et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :2529-2533 (1995)； Ditzel et al. , J.Immunol. 157 :739-749(1996) ；Berezov et al. , BIAjournal 8 Scientific Review 8(2001) ；Igarashi et al.，J. Biochem(Tokyo) 117 :452-7(1995) Bourgeois et al. , J. Virol 72 :807-10 (1998) ；Levi et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 :4374-8(1993) ；Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152 :5218-5329(1994)及 Xu and Davis, Immunity 1^:37-45 0000)。还参见美国专利号 6，951，646 ;6, 914，1 ; 6，090，382 ；6，818，216 ；6，156，313 ；6，827，925 ；5，833，943 ；5，762，905 以及 5，760，185。该等参考文献中每一篇的全文均藉由引用由此结合。因此，本披露提供的单克隆抗体包括来自如下抗体的一或多个重链和/或轻链 CDR3域，该抗体衍生自人类或非人类动物，其中该单克隆抗体能够特异性结合人类LAG-3。 在某些方面，本披露提供的单克隆抗体包括来自非人类抗体(如小鼠或大鼠抗体)的一或多个重链和/或轻链CDR3域，其中该单克隆抗体能够特异性结合LAG-3。在一些实施方案中，此类创造性之抗体包括来自非人类抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3域，与相应的亲本的非人类抗体比较，(a)能与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)结合到相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。在其它方面，本披露提供的单克隆抗体包括来自人类抗体(例如，获自非人类动物的人类抗体)的一或多个重链和/或轻链CDR3域，其中该人类抗体能够特异性结合人类LAG-3。在其它方面，本披露提供的单克隆抗体包括来自第一人类抗体(例如获自非人类动物的人类抗体)的一或多个重链和/或轻链CDR3域，其中该第一人类抗体能够特异性结合人类LAG-3，并且其中来自该第一人类抗体的CDR3域替换在缺乏针对LAG-3的结合特异性的人类抗体中的CDR3域，以产生能特异性结合人类LAG-3的第二人类抗体。在一些实施方案中，此类创造性之抗体包括来自该第一人类抗体的一或多个重链和/或轻链CDR3域，与相应的亲本的第一人类抗体相比较，(a)能与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)结合到相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。具有特定种系序列之抗体在某些实施方案中，本发明之抗体包括来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，在一较佳的实施方案中，本披露提供分离的单克隆抗体、或其抗原结合部位，包括重链可变区，该重链可变区系人类Vh 3-20基因、人类Vh 4-34基因、人类Vh 3-33 基因或人类Vh 1-24基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在另一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk L18基因、人类Vk L6基因或人类Vk A27基因的产物或是衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类 Vh 3-20基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk L18基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中， 本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类Vh 4-34基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类乂￡ L6基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类VH3-33基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk A27基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类Vh 1-24基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类Vk L6基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类 LAG-3。在又一较佳的实施方案中，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中该抗体包括重链可变区，该重链可变区系人类Vh 3-33基因的产物或衍生于该基因，并包括轻链可变区，该轻链可变区系人类\ L6基因的产物或衍生于该基因，其中该抗体特异性结合人类LAG-3。此类抗体还可以拥有一或多项以上详细说明的功能特征，例如高亲和力与人类 LAG-3结合、与猴类LAG-3结合、缺乏与小鼠LAG-3的结合、抑制LAG-3与MHC II类分子结合的能力、和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。分别具有Vh 3-20及Vk L18的Vh及\之抗体的实例系25E3抗体。分别具有Vh 4-34及Vk L6的Vh及\之抗体的实例系25F7抗体以及8B7抗体。分别具有Vh 3-33及Vk A27的Vh及Vl之抗体的实例系26H10抗体。分别具有Vh 1-24及Vk L6的Vh及\之抗体的实例系11F2抗体。分别具有Vh 3-33及Vk L6的Vh及\之抗体的实例系17E5抗体。
如在此所用，如果人类抗体的可变区从使用特定人类种系免疫球蛋白基因的系统中获得，则该抗体包含如下重链或轻链可变区，该等可变区系该种系序列的“产物”或者“衍生于”该种系序列。此类系统包括用所感兴趣的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或者用所感兴趣的抗原对在噬菌体上进行展示的人类免疫球蛋白基因文库进行筛选。人类抗体系人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列，藉由将该人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近(即最大％同一性)该人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列，就可以将该人类抗体鉴定为是此类抗体。人类抗体系特定的人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于” 该序列，与该种系序列相比，该人类抗体可含有氨基酸差异，由于例如自然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变。然而，经定的人类抗体典型地与由人类种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90%的同一性，并且当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)进行比较时，该选定的人类抗体包含将该人类抗体鉴定为人类的氨基酸残基。在某些情况中，人类抗体与由该种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可具有至少95 %、或甚至至少96 %、97 %、98 %，或99 % 的同一性。典型地，与由特定的人类种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列相比，衍生于该人类种系序列的人类抗体会展示不超过10处氨基酸差异。在某些情况中，与由该种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列相比，该人类抗体可以展示出不超过5处，或甚至不超过4处、3处、2处，或1处氨基酸差异。同源抗体在又另一实施方案中，本发明之抗体包括含有与此处说明的较佳抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链可变区以及轻链可变区，并且其中该抗体保留本发明的抗 LAG-3抗体的所希望的功能特性。例如，本披露提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括重链可变区及轻链可变区，其中(a)该重链可变区包括氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的同源性，该组的构成为SEQ ID NO 37至42 ；(b)该轻链可变区包括氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的同源性，该组的构成系SEQ ID NO :43至48 ；以及(c)该抗体特异性地结合人类LAG-3。另外地或可替代地，该抗体还可以拥有一或多项以上所讨论的以下功能特性，例如高亲和力与人类LAG-3结合、与猴类LAG-3结合、缺乏与小鼠LAG-3的结合、抑制LAG-3 与MHC II类分子结合的能力、和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。在不同的实施方案中，该抗体可以是(例如)人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在其它实施方案中，V1^P/或八氨基酸序列可与以上给出的序列具有85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%的同源性。与以上给出的序列的Vh与Vl区具有高(S卩，80% 或更大)同源性的Vh与\区之抗体，可以藉由以下方式获得对编码SEQ ID而49至讨或55至60的核酸分子进行诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)，接着使用在此说明的功能测定针对保留的功能(即，以上所给出的功能)测试所编码的经改变之抗体。如在此所使用，两条氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两条序列之间的百分比同一性。在这两条序列之间的百分比同一性系该等序列共享的相同位置的数目的函数
23(即，％同源性=相同位置的数目/位置的总数目X100)，考虑到缺口(gap)的数目、以及每个缺口的长度，需要将它们引入用于这两条序列的最佳比对。正如在以下的非限制性实例中说明，使用数学算法可以完成两条序列之间的序列比较以及百分比同一性的确定。使用已经被整合至ALIGN程序(2. 0版本)中的E. Meyers和W. Miller (Comput. Appl.Biosci. ,4 11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12以及缺口罚分为4，可以确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，使用已经被整合至 GCG软件包(可在www. gcg. com上获得)中的GAP程序里的Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 444-453 (1970))的算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及缺口权重16、 14、12、10、8、6、或4以及长度权重1、2、3、4、5、或6，可以确定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。另外地或者可替代地，本披露的蛋白质序列可以作为“查询序列”进一步被使用，对公共数据库进行检索，例如来鉴定相关序列。使用Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. @ =403-10的XBLAST程序(版本2. 0)可以进行此类检索。BLAST蛋白质检索可采用XBLAST程序，记分=50，字长=3而进行，以获得与本发明之抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的缺口比对，可如在Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) =3389-3402中所说明地使用带缺口的BLAST。当使用BLAST及带缺口的BLAST 程序时，对应的程序(例如XBLAST及NBLAST)的默认参数系有用的。见www. ncbi. nlm. nih. gov ο具有保守件修饰之抗体在某些实施方案中，本发明之抗体包括含有⑶R1、⑶R2及⑶R3序列的重链可变区以及含有⑶R1、⑶R2及⑶R3序列的轻链可变区，其中该等⑶R序列中的一或多个包括基于在此所说明的较佳抗体(例如，25F7、26H10、25E3、8B7、11F2、17E5)的限定的氨基酸序列、或它们的保守性修饰，并且其中所述抗体保留了本发明的抗LAG-3抗体的所希望的功能特性。在本领域中所理解的是，可以进行某些保守性序列修饰，该等保守性序列修饰并不去除抗原结合。参见，例如Brummell et al. (1993)Biochem 32 1180-8 ；de Wildt et al. (1997)Prot. Eng. 10 835-41 ；Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 26864-26870 ；Hall et al. (1992)J. Immunol. 149 1605-12 ；Kelley and 0'Connell(1993) Biochem. 32 6862-35 ；Adib-Conquy et al. (1998) Iht. Immunol. 10 341-6 \)XR Beers et al. (2000)Clin.Can.Res4:2835-43。因此，本披露提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括含有⑶R1、⑶R2、以及⑶R3序列的重链可变区以及含有⑶R1、⑶R2、以及⑶R3 序列的轻链可变区，其中(a)该重链可变区CDR3序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为氨基酸序列SEQ ID NO :13至14、GGY、以及16至18，以及它们的保守性修饰；(b)该轻链可变区CDR3序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为氨基酸序列SEQ ID NO 31至36，以及它们的保守性修饰；以及(c)该抗体特异性地结合人类LAG-3。另外地或可替代地，该抗体还可以拥有以上所说明的以下功能特性中的一或多项，例如高亲和力与人类LAG-3结合、与猴类LAG-3结合、缺乏与小鼠LAG-3的结合、抑制 LAG-3与MHC II类分子结合的能力和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。
在一较佳的实施方案中，该重链可变区⑶R2序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为氨基酸序列SEQ ID No :7至12，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区 ⑶R2序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为氨基酸序列SEQ ID No 25至30，以及它们的保守性修饰。在另一较佳的实施方案中，该重链可变区CDRl序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为氨基酸序列SEQ ID No :1至6，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDRl序列包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为氨基酸序列SEQ ID No 19至24，以及它们的保守性修饰。在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。如此处所使用，术语“保守性修饰”旨在表示氨基酸修饰，该等修饰不显著影响或改变包含该氨基酸序列之抗体的结合特征。此类保守性修饰包括氨基酸的替代、插入、以及删除。修饰可藉由本领域已知的标准技术(如，定点诱变以及PCR介导的诱变)被引入本发明之抗体中。保守性氨基酸替代系以下该等替代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。该等家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明之抗体的CDR区中的一或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基所替换，并且使用在此说明的功能测定可以针对保留的功能(即，以上给出的功能)测试被改变之抗体。与抗LAG-3抗体结合到相同的表位上之抗体在另一实施方案中，本披露提供了如下抗体，它们在LAG-3上所结合的表位与本发明的抗LAG-3单克隆抗体中的任何抗体在LAG-3上所结合的表位相同(即，该等抗体有能力与本发明的该等单克隆抗体中的任何抗体进行交叉竞争而与人类LAG-3相结合)。在较佳的实施方案中，用于交叉竞争研究的参考抗体可以是单克隆抗体25F7、26H10、25E3、 8B7、11F2 或 17E5。此类交叉竞争之抗体可基于它们在标准LAG-3结合测定中与25F7、26H10、25E3、 8B7、11F2和/或17E5交叉竞争的能力被鉴定。例如，可使用标准ELISA测定，其中将重组的人类LAG-3蛋白固定在板上，该等抗体之一用荧光进行了标记，并且评价了未被标记之抗体进行竞争使被标记之抗体脱离结合(off the binding)的能力。另外地或可替代地，也可以使用BIAcore分析来评价抗体的交叉竞争的能力。测试抗体抑制(例如)25F7、26H10、 25E3、8B7、11F2和/或17E5与人类LAG-3相结合的能力证明该测试抗体能与25F7、26H10、 25E3、8B7、11F2 和 / 或 17E5 竞争而结合人类 LAG-3，并因此与 25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 和/或17E —样结合人类LAG-3上的相同表位。在一较佳的实施方案中，与25F7J6H10、 25E3、8B7、11F2和/或17E5 —样结合人类LAG-3上的相同表位之抗体系一人类单克隆抗体。如在实施例中所说明，可以对此类人类单克隆抗体进行制备并分离。如在实施例3C中进一步所讨论，已经将25E3、25F7以及8E7与人类LAG-3的结合定位(map)于人类LAG-3的第一个细胞外结构域内的“额外(extra)环”区。该额外环区的序列在SEQ ID N0:79中给出。使用肽扫描实验将25E3与额外环区的结合定位于以下氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID NO :76)，而将25F7与额外环区的结合定位于以下氨基酸序列HPAAPSSW(SEQID NO 77)，并且8B7与额外环区的结合定位于以下氨基酸序列 PAAPSSffG(SEQ ID NO :78)。因此，在一较佳的实施方案中，本发明提供了抗LAG-3抗体，该抗体结合人类LAG-3的如下表位，该表位包括氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID NO :76)。在另一较佳的实施方案中，本发明提供了抗LAG-3抗体，该抗体结合人类LAG-3的如下表位，该表位包括氨基酸序列 HPAPPSSW(SEQ ID NO 77)或 PAAPSSWG (SEQ ID NO :78)。经工稈处理及经修饰之抗体可以进一步藉由下述方式制备本发明之抗体使用具有在此披露的V1^P/或八序列中的一或多个之抗体作为起始材料，对经修饰之抗体进行工程处理，这种经修饰之抗体可具有与起始抗体不同的特性。藉由在一或两个可变区(即V1^n/或VJ中，例如在一或多个CDR区内和/或在一或多个框架区内中修饰一或多个残基，可以对抗体进行工程处理。另外地或可替代地，藉由在一或多个恒定区中修饰残基，例如改变该抗体的一或多项效应器功能，可以对抗体进行工程处理。在某些实施方案中，可以使用CDR移植对抗体的可变区进行工程处理。抗体与靶抗原主要藉由位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基进行相互作用。由于这一原因，CDR中的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDR之外的序列更具有多样性。因为 CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以藉由构建包括被移植至框架序列(来自具有不同特性的不同抗体)上的来自特异的自然发生之抗体的CDR序列的表达载体，表达模拟特异的自然发生之抗体的特性的重组抗体系可能的(参见，例如Riechmarm et al. (1998) Nature 332 323-327 Jones et al. (1986)Nature 321522-525 ；Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U. S. Α. 86 10029-10033 ；美国专利号 5，225，539 ;5，530，101 ； 5，585，089 ；5，693，762 以及 6，180，370)。因此，本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括包含⑶R1、⑶R2、以及⑶R3序列的重链可变区，该⑶R1、⑶R2以及⑶R3序列包含选自下组的氨基酸序列，该组的构成分别为=SEQID NO :1至6，SEQ ID NO 7至12，以及SEQ ID NO 13 至14、GGY、以及16-18，以及包含CDRU CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，该CDRU CDR2 以及⑶R3序列包含选自下组的氨基酸序列，该组的构成分别为SEQID N0:19至24、SEQ ID NO :25 至 30，以及 SEQ ID N0:31 至 36。因此，包含单克隆抗体 25F7、26H10、25E3、8B7、11F2 或17E5的Vh以及\ CDR序列的此类抗体可包含不同于该等抗体的框架序列。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公开的参考文献中获得。例如，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“Vbase”人类种系序列数据库中找到(在互联网在http://www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase上获得)，连同在以下献中找到如上所引述的Kabat et al. (1991) ；Tomlinson et al. (1992) " The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227 776~798 以及 Cox et al. (1994)" A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. M :827_836 ；该等文献中每一篇的内容均明确地藉由引用结合在此。作为另一实例，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的 Genbank 登录号中可获得1_69 (NG_0010109、NT_024637 以及 BC070333) ,3-33 (NG_0010109 & NT_024637)、以及 3-7(NG_0010109 & NT_024637)。作为另一实例，在 HCol2 HuMAb 小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得1_69 (NG_0010109、 NT_024637 以及 BC070333)，5-51 (NG_0010109 &NT_024637)，4-34(NG_0010109 & NT_024637)，3-30. 3 (CAJ556644)，以及 3-23 (AJ406678)。使用被称为带缺口的BLAST (Altschul et al. (1997)，如上所述)的序列相似性检索方法之一将抗体蛋白序列与已编制的蛋白质序列数据库进行比较，这对本领域技术人员而言系熟知的。在本发明之抗体中使用的较佳框架序列系那些结构上与由本发明的选定之抗体所使用的框架序列相似的框架序列，例如类似于由本发明较佳的单克隆抗体所使用的Vh 3-20 (SEQ ID N0:69)、Vh 4-34 (SEQ ID NO :61)、Vh 3-33 (SEQ ID NO :65)、或 Vh 1-24 (SEQ ID NO 73)框架序列和 / 或 VKL18(SEQ ID NO :71)、Vk L6 (SEQ ID NO :63)或 Vk A27 (SEQ ID NO 67)框架序列。Vh CDRl、CDR2、以及CDR3序列，以及Vk CDRl、CDR2、以及CDR3序列可以被移植至如下框架区上，该等框架区具有与在从中衍生出该框架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者该等CDR序列可以被移植至如下框架区上，该等框架区与该等种系序列相比含有一或多处突变。例如，已发现在某些情况下在框架区内对残基进行突变可能是有益的，以保持或增强该抗体的抗原结合能力(参见，例如美国专利号 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 以及 6，180，370)。另一类型的可变区修饰系在V1^P/或\⑶R1、⑶R2和/或⑶R3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善所感兴趣之抗体的一或多项结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入一或多处突变，并且对抗体的结合、或其它所感兴趣的功能特性的作用可以如在此说明的以及在实施例中提供的体内或体外测定中进行评估。引入较佳的是保守性修饰(如以上所讨论)。该等突变可以是氨基酸替代、插入、或删除，但较佳地是替代。此外，典型地在⑶R区中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。因此，在另一实施方案中，本披露提供了分离的抗LAG-3单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区包括(a)Vh CDRl区，包括选自下组的氨基酸序列， 该组的构成为SEQ ID NO :1至6，或与SEQID NO 1至6相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；(b)Vh CDR2区，包括选自下组的氨基酸序列， 该组的构成为SEQ ID NO :7至12，或与SEQ ID NO :7至12相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；(C)VH CDR3区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为SEQ ID NO :13至14、GGY以及16至18，或与SEQ ID NO :13至14、GGY以及16至18相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；
(d)VlCDRI区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为SEQ ID NO 19至M，或与SEQ ID NO :19至对相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；
(e)VL⑶R2区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为SEQID NO :25至30，或与SEQ ID NO :25至30相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列；以及⑴八⑶R3区，包括选自下组的氨基酸序列，该组的构成为SEQ ID NO :31至36， 或与SEQ ID NO :31至36相比具有一处、两处、三处、四处或五处氨基酸替代、缺失或删除的氨基酸序列。本发明的工程化之抗体包括以下抗体其中在Vh和/或\内已经对框架残基进行了修饰，例如改善了抗体的特性。典型地进行了此类框架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法系使一或多个框架残基进行“回复突变”为对应的种系序列。更具体地说，已经经历了体细胞突变之抗体可以包含与从中衍生出抗体的种系序列不同的框架残基。此类残基可以藉由将该抗体框架序列与从中衍生出抗体的种系序列进行比较而被鉴定。例如，表A示出了不同于种系的框架区氨基酸位置(使用Kabat编号系统)的区
域，并示出这个位置如何藉由所指示的替代而回复突变为该种系
表A-示例性回复突变区框架氨基酸位置(Kabat编号)回复突变25E3 Vh72G72R25E3 Vh95Y95H25E3 Vh97T97A25E3 Vh98T98R25F7 Vh69L69I25F7 Vh71L71V25F7 Vh83R83S25F7 Vh97F97R8B7 Vh76K76N8B7 Vh79A79S8B7 Yh83N83S8B7 Vh112P112Q11F2 Vh3D3A17E5 Vh3H3Q8B7 Vh59C59Y8B7 Vh59C59S另一类型的框架修饰涉及在框架区内，或甚至在一或多个CDR区内，对一或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，由此降低该抗体的潜在的免疫原性。这一方法也被称为 “去免疫化”，并且美国专利公开号20030153043中进一步详细地说明了该方法。除了在框架区或⑶R区内进行的修饰之外，或可替代地，还可以对本发明之抗体进行工程处理，以在Fc区内包含修饰，以便典型地改变该抗体的一或多项功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞的细胞毒性作用。此外，本发明之抗体可以进行化学修饰(例如，一或多个化学物模块可以被附联至抗体上)，或被修饰以改变其糖基化作用，再次改变该抗体的一或多项功能特性。以下对该等实施方案中的每一
28个均进行更详细的说明。Fc区中的残基的编号系Kabat的EU索引号的编号。在一较佳的实施方案中，抗体系IgG4同种型抗体，该抗体包括在重链恒定区的铰链区中对应于位置228(S2^P;EU索引)的位置上的丝氨酸到脯氨酸的突变。已经报导这个突变消除了铰链区中重链之间二硫桥的异质性(Angal et al.如上所述；位置241系基于Kabat编号系统的)。例如，在各种实施方案中，本发明的抗LAG-3抗体可包括连接至一人类IgG4恒定区的25F7(SEQ ID NO :37)或 H10(SEQ ID NO :38)的重链可变区，在人类 IgG4恒定区中在对应于位置Ml的位置上的丝氨酸如在以上所述之Angal et al.中所说明已经被突变成脯氨酸。因此，对于连接至人类IgG4恒定区的25F7或^HlO重链可变区而言，这种突变对应于EU索引的S228P突变。在一实施方案中，对CHl的铰链区进行修饰，这样铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生了变化，例如，增加或减少。这个方法进一步说明于美国专利号5，677，425中。CHl 的铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生变化，以(例如)便于组装轻链以及重链或者增大或减小抗体的稳定性。在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更具体地说，将一或多处氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域的界面区，这样相对于天然Fc铰链结构域的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合而言，该抗体具有削弱的SpA结合。这一方法更详细地说明于美国专利号6，165，745中。在另一实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。多种不同的方法系可能的。例如，如在美国专利号6，277，375中所说明，可引入以下突变中的一或多处突变T252L、T2MS、以及T256F。可替代地，为了增大生物半衰期，该抗体可以在CHl或CL 区内进行改变以包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环中得到的补救受体(salvage receptor)结合表位，如在美国专利号5，869，046以及6，121,022中所说明。在仍又其它的实施方案中，藉由用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变该抗体的效应器功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、四7、 318、320及322的一或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，这样该抗体对于效应器配体而言具有已改变的亲和力，但仍保留亲本抗体的抗原结合能力。例如，亲和力被改变的效应器配体可以是例如Fc受体或补体Cl成分。这一方法更详细地说明于美国专利号 5，624，821 以及 5，648，260 中。在另一实例中，选自氨基酸残基329、331及322的一或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，这样该抗体具有已改变的Clq结合和/或降低或已消除的补体依赖的细胞毒性作用(⑶C)。这一方法更详细地说明于美国专利号6，194，551中。在另一实例中，改变氨基酸位置231及239中的一或多个氨基酸残基，由此改变抗体的固定补体的能力。这个方法进一步说明于PCT公开文件W094/29351中。在又另一实例中，藉由在以下位置修饰一或多个氨基酸对Fc区进行修饰以提高该抗体介导抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加该抗体对Fc γ受体的亲和力238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、 283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、 322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、 389、398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439。这一方法进一步说明于 PCT 公开文件
29WO 00/42072中。而且，已经定位出针对Fc yR1、Fc yRII、Fc YRIII以及FcRn在人类IgGl 上的结合位点，并且已经说明了具有结合已被改善的变体(参见Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 6591-6604)。已表明在位置 256、290、298、333、334 及 339 上特定的突变改善了对Fc γ RIII的结合。额外地，已表明以下组合突变体改善了 Fc γ RIII结合T256A/ S298A、S298A/E333A、S298A/K224A、以及 S298A/E333A/K334A。在又另一实施方案中，对抗体的糖基化进行了修饰。例如，可以制做去糖基化之抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化，以(例如)增加该抗体对抗原的亲和力。 例如，藉由在抗体序列中改变一或多个糖基化的位点可以实现此类碳水化合物修饰。例如， 可以进行一或多处氨基酸替代，这导致了一或多个可变区框架糖基化位点的消除，由此在该位点处消除糖基化作用。这种去糖基化作用可增加该抗体对抗原的亲和力。参见例如美国专利号 5，714，350 以及 6，350，861。另外地或可替代地，可以制做具有被改变类型的糖基化作用的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化之抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类已改变的糖基化类型增加抗体的ADCC能力。例如，藉由在具有已改变的糖基化机制的宿主细胞中表达该抗体可以实现此类碳水化合物修饰。具有已改变的糖基化机制的细胞在本领域中系已有记载的，并可被用作表达本发明的重组抗体的宿主细胞，由此产生具有已改变的糖基化之抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705以及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8 (α (1,6)-岩藻糖基转移酶)，这样在Ms704、Ms705、以及Ms709细胞系中表达之抗体中缺乏在它们的碳水化合物上的岩藻糖。Ms704、Ms705、以及Ms709 FUT8+细胞系系藉由使用两种替换载体对CH0/DG44细胞中的FUT8基因的靶向破坏而产生(参见美国专利公开号 20040110704 以及 Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 位614_22)。作为另一实例，EP 1，176，195说明了带有在功能上被破坏的FUT8基因的细胞系(该基因对岩藻糖基转移酶进行编码)，这样藉由减少或消除α -1，6键相关的酶，在这种细胞系中表达之抗体表现出低岩藻糖基化作用。EP 1，176，195还说明了这样的细胞系它们具有低的用于将岩藻糖加至与抗体的Fc区相结合的N-乙酰基葡糖胺的酶活性，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开文件WO 03/035835说明了变种的CHO细胞系Lecl3细胞，它具有降低的将岩藻糖附联于与Asn (297)相连的碳水化合物的能力，这也导致在该宿主细胞中表达之抗体的低岩藻糖基化作用(还可参见Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277 =26733-26740)。具有经修饰的糖基化特性之抗体还可在鸡蛋中产生，如在PCT公开文件W006/089231所说明。可替代地，具有经修饰的糖基化特性之抗体可在植物细胞(如浮萍(Lemna))中产生。在植物系统中用于生产抗体的方法披露于美国专利申请中，该专利申请对应于2006年8月11日提交的Alston & Bird LLP代理参考号040989/314911。PCT公开文件WO 99/54342中说明了经工程处理而表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β (1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III (GnTIII))的细胞系，这样在经工程处理的细胞系中表达之抗体展示出增多的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高(还可参见Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17 176-180) 可替代地，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶切掉；例如，岩藻糖苷酶(α-L-岩藻糖苷酶)从抗体中除去岩藻糖基残基(Tarentino et al. (1975) Biochem. :5516_23)。由本披露在此所考虑之抗体的另一修饰系聚乙二醇化作用(pegylation)。可对抗体进行聚乙二醇化以例如增加该抗体的生物(例如血清)半衰期。为了对抗体进行聚乙二醇化，典型地在一或多个聚乙二醇(PEG)基团附联于该抗体或其片段的条件下，将抗体或抗体片段与PEG(如PEG的反应性酯或醛类衍生物)进行反应。较佳的是，藉由酰化反应或烷化反应使用反应性的PEG分子(或类似的反应性的水溶性聚合物)进行聚乙二醇化。 在此使用之术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其它蛋白质的PEG的形式中的任何形式 (如单(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺)。在某些实施方案中，有待聚乙二醇化之抗体系去糖基化之抗体。对蛋白质进行聚乙二醇化的方法在本领域中系已知的，并可应用至本发明之抗体。参见例如EP 0 154,316以及EP 0 401,384。抗体之物理特件本披露之抗体可藉由其多种的物理特性进行表征，以检测和/或区分它们的不同类别。本披露之抗体可在轻链或重链可变区中含有一或多个糖基化位点。此类糖基化位点可导致抗体的免疫原性提高或抗体的PK发生变化，这系因为抗原结合发生改 ^ (Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702 ；Gala and Morrison(2004) J Immunol 172 :5489-94 ；Wallick et al(1988)J Exp Med 168 1099~109 ；Spiro (2002) Glycobiology 12 :43R-56R ；Parekh et al (1985)Nature 316 :452-7 ；Mimura et al. (2000)Mol Immunol 37 =697-706) 已知糖基化作用发生在包含N-X-S/T序列的基序中。在某些情况下，较佳地是具有不包含可变区糖基化的抗LAG-3抗体。这可以藉由选择在可变区中不包含糖基化基序之抗体，或者藉由在糖基化区域内突变残基来实现。在一较佳的实施方案中，本披露之抗体不含有天冬酰胺同分异构位点。在N-G序列或D-G序列上有可能发生天冬酰胺的脱酰胺作用，并导致生成一异天冬氨酸残基，这将一缠绕结构引入多肽链中并且降低它的稳定性(异天冬氨酸效应)。每种抗体均具有一独特的等电点(pi)，等电点通常落在6至9. 5的pH范围内。 IgGl抗体的pi典型地落在7至9. 5的pH范围内，并且IgG4抗体的pi典型地落在6至8 的PH范围内。推测pi在正常范围之外之抗体在体内条件下可能会有一些解折叠以及不稳定性。因此，较佳的是具有包含落入正常范围内的Pl值的抗LAG-3抗体。这可以藉由选择 Pl在正常范围内之抗体或者藉由对带电荷的表面残基进行突变来实现。每种抗体均具有特征性的解链温度，解链温度越高表明在体内的总体稳定性越好 (Krishnamurthy R and Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 2:361—71)。 il胃，罾佳的是Tmi (开始解折叠的温度)大于60°C，较佳的是大于65°C，甚至更佳的是大于70°C。 使用差示扫描热量法(Chen et al (2003) Pharm Res 20 :1952-60 ；Ghirlando et al (1999) Immunol Lett M :47-52)或者圆二色性法(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40 343-9)可以测量抗体的解链温度。在一较佳的实施方案中，选择不会快速降解之抗体。使用毛细管电泳法(CE)以及 MALDI-MS 可以测量抗体的降解(Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67 3626-32)。在另一较佳的实施方案中，选择具有最低限度的聚集作用之抗体，聚集作用可能导致触发不想要的免疫反应和/或经改变的或不良的药物动力学特性。总体上，可接受之抗体的聚集度系25 %或更低，较佳地是20 %或更低，甚至更佳地是15 %或更低，甚至更佳地是10 %或更低，并甚至更佳的是5 %或更低。可以使用几种技术来测量聚集，所述技术包括大小排阻柱(SEC)、高效液相层析(HPLC)、以及光散射法。工稈化抗体的方法如以上所讨论，藉由修饰V1^P/或\序列，或其附联的一或多个恒定区，可以使用具有在此披露的Vh和\序列的抗LAG-3抗体以产生新的抗LAG-3抗体。因此，在本发明的另一方面，使用本发明的抗LAG-3抗体(如25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5)的结构特征来产生在结构上相关的抗LAG-3抗体，该抗体保留了本发明之抗体的至少一功能特性， 例如结合人类LAG-3。例如，如以上所讨论，可以将25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的一或多个⑶R区，或它们的突变与已知的框架区和/或其它⑶R重组地组合，以产生另外的重组工程化的本发明的抗LAG-3抗体。其它类型的修饰包括上节中说明的那些修饰。用于工程化方法的起始材料系在此提供的V1^P /或\序列中的一或多个序列，或它们的一或多个⑶R区。为了产生工程化之抗体，不必实际地制出一抗体(即，表达成一蛋白)，该抗体具有在此提供的Vh和/或\序列中的一或多个序列、或它们的一或多个CDR区。相反，在一或多个序列中所包含的信息被用作起始材料来创造从一或多个原始序列所衍生的一或多个“第二代”序列，并接着制备该一或多个“第二代”序列并将其表达为蛋白质。因此，在另一实施方案中，本披露提供了用于制备抗LAG-3抗体的一种方法，包括(a)提供(i) 一重链可变区抗体序列，包括选自下组的一 CDRl序列，该组的构成为SEQ ID NO :1至6，选自下组的一 CDR2序列，该组的构成为SEQ ID N0:7至12，和/或选自下组的一 CDR3序列，该组的构成为SEQ ID NO 13至14、GGY、16至18 ；和/或(ii) 一轻链可变区抗体序列，包括选自下组的一⑶Rl序列，该组的构成为SEQ ID N0:19至24， 选自下组的一⑶R2序列，该组的构成为SEQ ID N0:25至30，和/或选自下组的一⑶R3序列，该组的构成为=SEQ ID NO 31至36 ；(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变之抗体序列；并且(c)将被改变之抗体序列表达成一蛋白。可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达被改变之抗体序列。较佳的是，由一或一些经改变之抗体序列所编码之抗体系以下抗体，它(们)保留了在此说明的抗LAG-3抗体中的一种、一些或全部功能特性，该等功能特性包括但不限于(i)与人类LAG-3的高亲和力结合；(ii)结合猴类 LAG-3;(iii)缺乏与小鼠LAG-3结合；(iv)抑制LAG-3与MHC II类分子相结合的能力；和/或(ν)刺激一免疫反应(例如，抗原特异性T细胞应答)的能力。使用本领域可获得的和/或在此所说明的标准测定(例如实施例中所给出那些测定)评定被改变之抗体的功能特性。在本发明的工程化抗体的方法的某些实施方案中，可以沿抗LAG-3抗体编码序列的全长或一部分随机地或选择性地引入突变，并针对结合活性和/或在此说明的其它功能特性可对得到的经修饰的抗LAG-3抗体进行筛选。已在本领域中说明了突变的方法(参见，
32例如 PCT 公开文件 WO 02/092780 以及 WO 03/074679)。编码本发明抗体之核酸分子本发明的另一方面涉及对本发明之抗体进行编码的核酸分子。该等核酸可存在于整个细胞中、细胞裂解物中、或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。藉由标准的技术，包括用碱/SDS处理、CsCl成带(CsCl banding)、柱层析法、琼脂糖凝胶电泳、以及其它的本领域熟知的技术，当将核酸从其它的细胞成分或其它污染物，如其它细胞核酸或蛋白中纯化出来，核酸系“分离的”或“使之基本上是纯的”。参见Ausubel，et al. ,ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在一较佳的实施方案中，该核酸为cDNA分子。使用标准的分子生物学技术可以获得本发明的核酸。对于藉由杂交瘤表达之抗体 (例如，如以下进一步说明从携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠中制备的杂交瘤)而言，藉由标准的PCR扩增或cDNA克隆技术可以获得对由杂交瘤制作的抗体的轻链以及重链进行编码的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得之抗体(例如，使用噬菌体展示技术) 而言，可以从该基因文库中回收编码此类抗体的核酸。本发明的较佳的核酸分子系对25E3、25F7、8B7J6H10、11F2以及17E5单克隆抗体的Vh以及Vl序列进行编码的核酸分子。对25E3、25F7、8B7、26H10、11F2以及17E5的Vh序列进行编码的DNA序列分别示于SEQID NO :49至54。对25E3、25F7、8B7J6H10、11F2以及 17E5的\序列进行编码的DNA序列分别示于SEQ ID NO 55至60。—旦获得了编码Vh和\区段的DNA片段，则藉由标准的重组DNA技术(例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因)可以对该等DNA片段进行进一步操作。在该等操作中，编码^或乂^勺DNA片段被可操作地连接至编码另一蛋白(如一抗体恒定区或一柔性接头)的另一条DNA片段上。在本文中使用之术语“可操作地连接”旨在说明将这两个DNA片段连接，这样由这两条DNA片段编码的氨基酸序列仍在阅读框内。藉由将编码Vh的DNA可操作地连接至另一编码重链恒定区(CHI、CH2及CH3)的 DNA分子，可以将编码Vh区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中系已知的(参见例如Kabat et al. (1991)，如上所述)，并且包括该等区域的DNA片段可藉由标准PCR扩增获得。该重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、 IgE、IgM或IgD恒定区，但最佳地是IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，可以将编码Vh的DNA可操作地连接至另一仅对重链CHl恒定区进行编码的DNA分子。藉由将编码\的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一 DNA分子上，可以将编码\区的分离的DNA转化成全长轻链基因(连同Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在本领域系已知的(参见，例如Kabat et al.，如上所述)，并且涵盖该等区域的DNA片段可藉由标准的PCR扩增获得。在较佳的实施方案中，该轻链恒定区可以为κ或 λ恒定区。为了产生scFv基因，将编码Vh和\的DNA片段可操作地连接至另一条编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段，这样V1^nt序列可被表达为连续的单链蛋白，其中区域藉由柔性接头进行连接(参见，例如Bird et al. (1988) Science塑: 423-426 ；Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 ；McCafferty etal. ， (1990)Nature 348 552~554)。本发明之单克降抗体的牛产使用熟知的Kohler and Milstein(1975)Nature 256 495 的体细胞杂交(杂交瘤)技术可以产生本披露的单克隆抗体(单抗)。产生单克隆抗体的其它实施方案包括B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合抗体或人源化抗体在本领域也是熟知的。参见，例如美国专利号 4，816，567 ；5，225，539 ；5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 以及6，180，370，它们的全文内容藉由引用特定地结合在此。在一较佳的实施方案中，本发明之抗体系人类单克隆抗体。使用携带部分的人类免疫体系而不是小鼠体系的转基因或转染色体小鼠，可以产生针对人类LAG-3的此类人类单克隆抗体。该等转基因小鼠和转染色体小鼠包括在此分别称作HuMAb Mouse 及 KM Mouse 的小鼠，并在此共同称作“人类Ig小鼠”。HuMAb Mouse ( Medarex , Inc.)含有对非重排的人类重链(μ以及γ)以及κ轻链免疫球蛋白序列进行编码的人类免疫球蛋白基因微型基因座，并含有使内源性 μ和Y链基因座失活的靶向突变(见，例如Lonberg et al. (1994)Nature 368(6474) 856-859)。因此，该等小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达减少；并且响应于免疫，所引入的人类重链以及轻链转基因经历了类别转换以及体细胞突变以产生高亲和力的人类 IgGK 单克隆抗体(Lonberg et al. (1994)，如上所述；在 Lonberg(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113 49~101 进行综述LonberR, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 以及Harding and Lonberg (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 536-546)。HuMAb Mouse 的制备及用途，以及由这种小鼠携带的基因组修饰，进一步说明于 Taylor et al. (1992)Nucleic Acids Research 20 6287-6295 ；Chen et al. (1993) International Immunology 5 647-656 ；Tuaillon et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 3720-3724 ；Choi et al. (1993)Nature Genetics 4117-123 ；Chen et al. (1993) EMBO J. 12 821-830 ；Tuaillon et al. (1994)J. Immunol. 152 2912-2920 ；Taylor et al. (1994) International Immunology 互579_591 ；以及 Fishwild et al. (1996)Nature Biotechnology 14 845-851中，所有该等文献的全文内容均藉由引用特定地结合在此。进一步参见美国专利号 5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，789，650 ； 5，877，397 ；5，661，016 ；5，814，318 ；5，874，299 ；5，770，429 ；以及 5，545，807 ；PCT
发明者凯拉·D·曾斯, 海迪·勒布兰克, 肯特·B·苏迪厄姆, 艾伦·J·科曼, 马克·亚马纳卡, 马克·塞尔比 申请人:梅达雷克斯股份有限公司