专利名称：用于治疗癌症的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗领域，并且更具体而言，涉及使用含有数种治疗化合物的组合物治疗癌症的领域，所述组合物与单独使用所述化合物相比表现出提高的活性。
背景技术：
胆碱激酶是肯尼迪途径(Kennedy pathway)或磷脂酰胆碱(PC)合成途径的第一个酶。其作用是使用腺苷5’ -三磷酸盐(ATP)作为磷酸基供体将胆碱磷酸化为磷酸胆碱(PCho)。Ras基因构成了所谓的致癌基因家族，已经对其进行了广泛研究，因为它们在 25-30%的所有人类肿瘤中被激活，并且某些Ras基因在90%的所有人类肿瘤中被激活。由于Ras蛋白参与细胞增殖，终末分化和衰老的调节，所以它们在细胞内信号传递中起重要作用。不同致癌基因所介导的转化诱导高胆碱激酶活性水平，其中ras致癌基因发挥重要作用，这导致了胆碱激酶的产物PCho的细胞内水平的异常增加。其它发现也支持ChoK在人类肿瘤产生中的作用。例如，核磁共振(NMR)技术已经证实相对于正常组织，包括乳房、 前列腺、脑和卵巢肿瘤在内的某些人类肿瘤组织存在高PCho水平。现已公知的是，ras是人类癌症发生中最深入研究的致癌基因之一，并且ChoK抑制已经证实为致癌基因所转化的细胞中新的并且有效的抗肿瘤策略。随后在裸鼠中体内推断了这些初步发现。基于该资料，设计以单独或联合的方式直接影响胆碱激酶活性或磷酰胆碱所活化的酶的化合物将允许有效抗肿瘤治疗的开发。从该角度看，对ChoK抑制剂的研究已经将密胆碱-3 (HCD鉴定为相对有效并且具有选择性的阻断剂(Cuadrado A.，et al.，1993，Oncogene 8 :2959-2968, Jimenez B.，et al.,1995,J. Cell Biochem. 57 :141-149 ；Hernandez-Alcoceba,R. et al.,1997,Oncogene, 15 :2289-2301)。该具有联苯基结构的胆碱同系物已被用于设计新的抗肿瘤药物。然而，由于HC-3是有效的呼吸系统麻痹剂，所以HC-3不是用于临床实践的好的候选物。基于HC-3 的结构、通过在该化合物引入结构修饰，已经合成了具有改善的ChoK抑制活性和降低的毒性作用的某些衍生物。还已经发现，来源于吡啶鐺的双季铵化对称化合物能够抑制全细胞中PCho的产生(W098/05644)。然而，这些衍生物具有高毒性水平，这限制了其扩展的治疗应用。对于化疗的抗性(“药物抗性”)是限制目前癌症治疗中使用的许多化学治疗的有效性的根本问题。药物抗性的发生是由于多种机制，例如增加的药物失活、降低的药物积累、药物从癌细胞流出、化疗诱导的损伤的增强修复、促存活途径的活化和细胞死亡途径的失活(Hersey P. et al.，2008，Adv Exp Med Biol. 2008 ；615 :105-26)。药物抗性可以是在开始抗肿瘤治疗前肿瘤细胞所固有的。此外，特异性药物抗性机制可以是肿瘤细胞暴露于特定治疗之后才被激活的。鉴定出对固有抗性或获得性抗性负有责任的那些分子实体可以提供对于可以用于克服该抗性的潜在分子靶标的有价值的信息。因此，以干扰赋予对于确定的肿瘤特异性治疗的药物抗性的分子组分为目的的设计策略构成了致力于增加癌症治疗功效的重要步骤。Mori et al (Cancer Res.，2007，67 11284-11290)已经描述了 ChoK 抑制剂(胆
3碱激酶特异性siRNA)和5-氟尿嘧啶的联合使用导致对于降低乳腺癌细胞的细胞增殖/活力的协同效应。然而，该治疗依赖于使用siRNA，而siRNA在体内并未以有效方式转运至靶细胞内。此外，为此目的而设计的siRNA同时识别ChoKa和ChoKβ (Mori et al. ,Cancer Res.，2007，67 :11284-11290)，但是仅ChoK α是肿瘤学的分子靶标，ΟιοΚβ并不是肿瘤学的分子靶标(专利W02006108905和共同待决的西班牙专利申请Ρ200800416)，这质疑了该策略的潜在治疗用途。尽管如此，仍然非常需要开发提供ChoK酶的高抑制活性的化合物，以允许将其用于肿瘤治疗，同时，相对于现有技术中的化合物，所述化合物应当大大降低其毒性。发明概述在第一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含第一组分或第二组分、或者包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含一种或多种胆碱激酶抑制剂，所述第二组分选自一种或多种酸性神经酰胺酶抑制剂、一种或多种化疗剂和一种或多种死亡受体配体。在第二方面，本发明涉及包含本发明的组合物与药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物，并且涉及所述药物组合物在医药中并特别是在治疗癌症中的用途。在另一方面，本发明涉及酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体在增加肿瘤细胞对于胆碱激酶抑制剂的敏感性中的用途。在仍然另一方面，本发明涉及鉴定对ChoK抑制剂治疗具有抗性的癌症患者的方法，所述方法包括测定来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平，其中当所述样品中酸性神经酰胺酶的水平高于参考样品时，所述患者被鉴定为对ChoK抑制剂具有抗性。在另一方面，本发明涉及为癌症患者选择个体化治疗的方法，所述方法包括测定来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平，其中如果所述样品中酸性神经酰胺酶的表达水平高于参考样品，则将该患者候选用ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的组合进行治疗。在仍然另一方面，本发明涉及鉴定能够增加ChoK抑制剂在治疗癌症中的治疗效果的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)使表现出对ChoK抑制剂的抗性的肿瘤细胞与候选化合物接触；以及(ii)测定所述细胞中酸性神经酰胺酶的水平；其中如果用候选化合物处理后的细胞中酸性神经酰胺酶的水平低于处理前，则所述候选化合物被认为能够增加ChoK抑制剂在治疗癌症中的效果。附图简述
图1. NSCLC患者的肿瘤原代培养物中对于丽58b处理的反应。图2.对通过RT-qPCR的微阵列分析结果的验证。图3.对于NSCLC中ChoK抑制的抗性机制所提出的模型。图4.通过RT-qPCR测定的来源于人肺癌的不同细胞系中ASAHl和ChoK的水平。图5.对ChoK抑制剂具有抗性的细胞H460中通过qRT_PCR测定的ASAHl基因表达和通过Western印迹分析测定的酸性神经酰胺酶蛋白表达。图6.顺钼/ChoK抑制剂的联合相继治疗的协同效应。图7. NSCLC异种移植物中顺钼/ChoK抑制剂的联合治疗。(A)MN58b/顺钼(统计学显著性；MN58b ρ = 0. 09 ；顺钼 ρ = 0. 3 ；相继 ρ = 0. 017 ；同时 ρ = 0. 016)，(B) NSCLC 异种移植物中的联合治疗(统计学显著性；RSM-932A(932A)p = 0. 157 ；顺钼(DPP) ρ = 0. 441 ； 相继DPP和TCd-171治疗(SEC)p = 0. 03) ； (C)以对照小鼠和用ChoK抑制剂(2mg/Kg)、顺钼(lmg/Kg)以及联合治疗组治疗的小鼠的毒性衡量的体重监测；(D)与联合治疗产生相似抗肿瘤活性的单独顺钼导致了毒性的显著增加。图8.在标明的细胞系中肿瘤细胞对于胆碱激酶抑制剂RSM-932A(ChoKI) (A)或 TRAIL(B)的敏感性。图9. ChoKI和TRAIL联合治疗的协同作用。图10.结肠癌细胞中丽58b和TRAIL联合治疗的协同效应。图11.通过流式细胞仪分析所测定的结肠癌细胞中MN58b和TRAIL联合治疗的协同效应。图12. ChoK抑制增加DR5表达。图13. ChoKI/TRAIL联合治疗后的神经酰胺产生。图14.结肠异种移植物中Chokl/TRAIL的联合治疗。图15.结肠癌细胞中ChoK抑制剂和5-FU联合治疗的协同效应。图16.通过流式细胞仪所测定的结肠癌细胞中ChoK抑制剂和5-FU联合治疗的协同效应。图17.结肠异种移植物中ChokI/5-FU的联合治疗。发明详述ChoK抑制剂和酸件神经酰胺酶抑制剂的组合(本发明的第一组合物)本发明的发明人已鉴定出对于胆碱激酶(ChoK)抑制剂具有抗性的原代人肿瘤的存在(图1)。具体而言，本发明的实施例1描述了来源于人非小细胞肺癌组织的不同原代培养物表现出对于已知ChoK抑制剂MN58b的有差异的敏感性(图1)。出人意料的是，正如本发明的实施例2和3所示(图幻，发现这种抗性是由酸性神经酰胺酶表达水平的增加所造成。ChoK的功能是将Cho磷酸化，从而产生磷酸胆碱(Pcho)，磷酸胆碱(Pcho)是质膜的主要组分磷脂酰胆碱(PC)的前体(Lacal JC.，IDrugs. 2001 ；4 :419-26)。然而，细胞增殖必然需要膜，并因此必然需要PC。因此，不希望被任何理论所束缚，我们相信肿瘤细胞响应于ChoK抑制是通过备选途径的激活从而通过鞘磷脂(SM)的降解而产生PCho (图幻。然而，SM的切割不仅造成PCho的产生，还造成促凋亡的神经酰胺的产生，这导致了肿瘤细胞参与凋亡性细胞死亡。有趣的是，本文已经发现对于ChoK抑制具有抗性的那些细胞表现出增加的酸性神经酰胺酶水平，酸性神经酰胺酶是促进促凋亡的神经酰胺转变为促有丝分裂的鞘氨醇-IP的酶(图幻。这些结果提示酸性神经酰胺酶的过表达可以通过降低细胞内神经酰胺水平来抑制ChoK抑制所介导的细胞死亡的促进作用。因此，酸性神经酰胺酶的过表达使肿瘤细胞中ChoK抑制所触发的促凋亡信号失活。此外，产生的神经酰胺可以被转变为促有丝分裂的鞘氨醇-IP (图3)。该发现提供了通过同时给予酸性神经酰胺酶抑制剂来增加对ChoK抑制剂的敏感性而实现改进的癌症治疗的可能性。事实上，本申请的实施例4证实，使用酸性神经酰胺酶抑制剂NOE处理NSCLS来源的肿瘤细胞导致了对ChoK抑制剂的增加的敏感性。此外，与单独使用抑制剂或联合使用ChoK抑制剂和碱性神经酰胺酶的特异性抑制剂相比，ChoK抑制剂MN58b或RSM-932A和酸性神经酰胺酶抑制剂D-NMAPPD的联合使用得到了提高的抗肿瘤效果(参见实施例4)。按照此方式，酸性神经酰胺酶抑制剂和ChoK抑制剂的联合给药将允许使用较低剂量的ChoK抑制剂，从而产生较小的不良副作用。因此，在第一方面，本发明提供组合物(下文中的本发明第一组合物)所述组合物包含第一组分或第二组分、或者包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含一种或多种胆碱激酶抑制剂，所述第二组分包含一种或多种酸性神经酰胺酶抑制剂。术语“组合物”是指按照本发明的可选实施方案的一种或多种化合物的不同组合。 优选地，所述组合物包含至少一种酸性神经酰胺酶抑制剂和至少一种ChoK抑制剂。如本文所用的胆碱激酶是指在ATP的存在下催化胆碱的磷酸化作用而产生磷酰胆碱(PCho)的酶(EC 2.7.1.32)。示例性的按照本发明可以被抑制的胆碱激酶包括胆碱激酶α (如UniProt所限定的，人、小鼠和大鼠蛋白的登录号分别为Ρ35790、054804和 QO1134)。如本文所用的酸性神经酰胺酶(N-酰基鞘氨醇脱酰酶活性，EC 3. 5. 1. 23)是负责在溶酶体中将神经酰胺降解为鞘氨醇和游离脂肪酸的脂质水解酶。细胞含有至少三种神经酰胺酶，所述三种神经酰胺酶是按照其活性和定位的最适PH进行分类(Li CM. et al., Genomics, 1999,62 :223-31)，分为酸性神经酰胺酶(ASAH1, NM_177924. 3 或 Ql!3510)、中性神经酰胺酶(ASAH2，ΝΜ_019893 或 Q9NR71)和碱性神经酰胺酶(ASAH3，NM_133492, Q8TDN7 或Q5QJU;3)。已经也有对于第二酸性神经酰胺酶(称为酸性神经酰胺酶样蛋白或ASAHL)多肽的描述(UniProt登录号Q02083)。本发明中所使用的抑制剂为至少抑制酸性神经酰胺酶和/或酸性神经酰胺酶样蛋白的那些抑制剂，因为在对ChoK抑制剂具有抗性的细胞中，其它两种神经酰胺酶都未表现出表达的显著增加。在某些人类癌症中，酸性神经酰胺酶活性异常表达。这种酶可被用作癌症的新靶点，并且可以参与抗癌治疗抗性(参见Ian RS.，Genes Chromosomes Cancer. 2000， 29 :137-46 ；Liu X.，Front Biosci. 2008；13 :2293-8 禾口 Morales Α.，Oncogene. 2007,26 905-16)。胆碱激酶抑制剂如本文所用的胆碱激酶抑制剂涉及能够导致ChoK活性降低的任何化合物，包括阻止ChoK基因表达从而导致ChoK mRNA或蛋白水平降低的那些化合物以及抑制ChoK导致该酶的活性降低的化合物。在优选实施方案中，所述胆碱激酶抑制剂对于胆碱激酶α是特异性的。可以使用测定mRNA表达水平的标准检测鉴定导致ChoK mRNA水平降低的化合物， 所述检测例如RT-PCR、RNA保护分析、Northern印迹、原位杂交、微阵列技术等。可以使用测定蛋白表达水平的标准检测鉴定导致ChoK蛋白水平降低的化合物， 所述检测例如Wfestern印迹或Western转移、ELISA (酶联免疫吸附测定)、RIA (放射性免疫测定)、竞争性EIA (竞争性酶学免疫测定)、DAS-ELISA (双抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于使用包含特异性抗体的蛋白生物芯片或微阵列的技术、或基于胶体沉淀的、以诸如试纸的形式的检测。使用测量胆碱激酶活性的标准检测来检测对于胆碱激酶生物活性的抑制能力的测定，所述分析例如基于以下的方法如EP1710236所述，在纯化的重组胆碱激酶或富含胆碱激酶的组分的存在下，检测[14C]标记的胆碱被ATP的磷酸化作用，然后通过使用标准分析技术(例如TLC)检测磷酸化的胆碱。如果化合物对于胆碱激酶α (ChoK α )是特异性的，则可以通过使用对于ChoK α 是特异性的并且在严格条件下不会与其它ChoK异形体(例如，ChoK β)杂交的探针检测 ChoK α mRNA水平的降低或通过使用对于ChoK α是特异性的并且不会结合其它ChoK异形体(例如，ChoK β)的抗体检测ChoKa蛋白水平的降低来鉴定这些化合物。适于ChoKa mRNA和ChoK α蛋白水平的特异性测定的试剂在W02006108905中已有详细描述。表1的I至XVIII中描述了可以用于本发明第一组合物的示例性的胆碱激酶抑制剂。
权利要求
1.组合物，其包含第一组分或第二组分，或者包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含一种或多种胆碱激酶抑制剂，并且所述第二组分选自一种或多种酸性神经酰胺酶抑制剂、一种或多种化疗剂和一种或多种死亡受体配体。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述胆碱激酶抑制剂对于胆碱激酶α是特异性的。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述胆碱激酶抑制剂是表1所限定的化合物。
4.如权利要求1或3所述的组合物，其中所述酸性神经酰胺酶抑制剂是表2所限定的化合物。
5.如权利要求1至3中任一权利要求所述的组合物，其中所述化疗剂是烷化剂。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述烷化剂是基于钼的化合物。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述基于钼的化合物是顺钼。
8.如权利要求1至3中任一权利要求所述的组合物，其中所述化疗剂是抗代谢物。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述抗代谢物是5-氟尿嘧啶。
10.如权利要求1至3中任一权利要求所述的组合物，其中所述死亡受体配体是 TRAIL、TRAIL的功能等同变体或TRAIL的小模拟化合物。
11.药物组合物，其包含权利要求1至10中任一权利要求所述的组合物和药学可接受的载体或赋形剂。
12.用于医药的权利要求1至10中任一权利要求所述的组合物。
13.用于治疗癌症的权利要求1至10中任一权利要求所述的组合物。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述癌症是非小细胞肺癌或结肠癌。
15.增加肿瘤细胞对于胆碱激酶抑制剂的敏感性的方法，其包括使所述细胞与酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体接触。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述化疗剂是烷化剂或抗代谢物。
17.鉴定对ChoK抑制剂治疗具有抗性的癌症患者的方法，其包括测定来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平，其中当所述样品中酸性神经酰胺酶的水平高于参考样品时，所述患者被鉴定为对ChoK抑制剂具有抗性。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述样品是肿瘤样品。
19.为癌症患者选择个体化治疗的方法，其包括测定来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平，其中如果所述样品中酸性神经酰胺酶的表达水平高于参考样品，则将该患者候选用ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的组合进行治疗。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌或结肠癌。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述ChoK抑制剂是表1中所限定的化合物或其混合物，和/或其中所述酸性神经酰胺酶抑制剂是表2中所限定的化合物或其混合物。
22.鉴定能够增加ChoK抑制剂在治疗癌症中的治疗效果的化合物的方法，其包括以下步骤(i)使表现出对ChoK抑制剂抗性的肿瘤细胞与候选化合物接触；以及( )测定所述细胞中酸性神经酰胺酶的水平；其中如果用候选化合物处理后的细胞中酸性神经酰胺酶的水平或酸性神经酰胺酶活性低于处理前，则所述候选化合物被认为能够增加ChoK抑制剂在治疗癌症中的效果。
全文摘要
本发明涉及包含酸性神经酰胺酶抑制剂和胆碱激酶抑制剂的组合物，以及该组合物在治疗癌症中的用途。本发明还涉及基于检测酸性神经酰胺酶水平来为癌症患者选择个体化治疗的方法。此外，本发明还涉及包含胆碱激酶抑制剂和化疗剂的组合物，以及该组合物在治疗癌症中的用途。最后，本发明还涉及包含胆碱激酶抑制剂和死亡受体配体的组合物，以及该组合物在治疗癌症中的用途。
文档编号A61K45/06GK102215872SQ200980145259
公开日2011年10月12日 申请日期2009年9月17日 优先权日2008年9月17日
发明者劳德斯·加西亚奥茨, 安娜·拉米勒茨德莫利纳, 朱安·卡洛斯·拉卡桑朱安 申请人:特拉斯雷神诺癌症医药有限公司