表达至少两种可变表面蛋白(vsp)的修饰原生动物,其疫苗及纯化方法、应用和免疫方法

专利名称：表达至少两种可变表面蛋白(vsp)的修饰原生动物,其疫苗及纯化方法、应用和免疫方法
表达至少两种可变表面蛋白(VSP)的修饰原生动物，其疫苗及纯化方法、应用和免疫方法本发明涉及表达多于一种可变表面蛋白(VSP)的修饰原生动物，包含所述修饰原生动物的疫苗、杂交瘤系、识别蛋白的单克隆抗体，及其步骤、应用和方法。更具体地，本发明涉及包括同时表面表达多于一种可变表面蛋白(VSP)的经修饰的寄生性原生动物。修饰原生动物还可同时表达可变表面蛋白的所有种类(complete r印ertoire)。原生动物显示出切丁酶(Dicer)和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的表达下降，其中RdRP基因和/ 或切丁酶基因被沉默。所述原生动物可以是具有抗原变异机制的任何原生动物，并可通过调控此机制的分子沉默其表达。
背景技术：
抗原变异是含有暴露于表面的抗原决定簇的病原微生物发生的克隆表型变化。 这些生物使用不同的机制改变其表面抗原表达，从而能够在宿主产生的持续免疫压力下维持慢性感染(Deitsch, K. W.，Moxon, E. R.以及 ffellems, Τ. E. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61,281-293(1997)) ο 蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia，又名 runwayd 肠贾第鞭毛虫(runwayd Giardia intestinalis)或十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenal is))是最常见的人肠寄生虫之一。原生动物蓝氏贾第鞭毛虫也在使寄生虫能够发展成慢性和/或复发感染的过程中显示出抗原变异(Adam, R. D. Clin. Microbiol. Rev. 14,447-475(2001) 和 Nash，Τ. Ε. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 352,1369-1375 (1997)) 在编码可变表面蛋白 (VSP)的所有约190个基因，在特定时间，贾第鞭毛虫仅在每只寄生虫表面上表达一种VSP， 但通过未知的机制自发转化成不同的VSP。在贾第鞭毛虫中，抗原变异是导致某些可变和/或长期感染过程，以及多种感染倾向的原因，并且涉及已知为VSP的蛋白家族(Adam， R. D. Clin. Microbiol. Rev. 14, 447-475 (2001)和 Nash, Τ. Ε. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 352，1369-1375(1997)。VSP位于完全滋养体(complete trophozoite)表面，并且是宿主免疫反应识别的主要抗原。VSP的大小范围在30kDa至200kDa之间；其具有可变的富半胱氨酸氨基末端区域和保守的羧基末端区域，所述羧基末端区域包括疏水的跨膜结构域和仅包含5个氨基酸(CRGKA)的短胞质尾。寄生虫基因组编码总计约190个编码VSP的基因(Morrison， H.G.等，Science 317，1921-19^^2007))，但在任何给定时间点，在每个滋养体表面上仅表达一种VSP。向表达另一种VSP的转换每6-13代发生一次，即便没有任何免疫压力也是如此(Nash, Τ. Ε. ，Ailing, D. W. ，Merritt, J. W. Jr 以及 Conrad, J. Τ. Exp. Parasito 1. 71， 415-421(1990))。与其他蓝氏贾第鞭毛虫基因类似，编码VSP的基因没有内含子，并且其上游区域相对较短，并且发现其序列保守性有限或没有序列保守性。此外，在这些区域中不存在典型的真核启动子。包含贾第鞭毛虫VSP基因的信使RNA的3'非翻译区也往往较短， 通常长度为0-30个核苷酸。迄今为止，已经证明基因重排过程和依赖启动子的开/关机制都没有参与贾第鞭毛虫的抗原转换(Adam, R. D.Clin. Microbiol. Rev. 14，447-475 (2001)； Nash, Τ. Ε. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 352，1369—1375 (1997)和 Nash, Τ. Ε.，Ailing, D. W.，Merritt, J. W. Jr 以及 Conrad，J. Τ. Exp. Parasito 1. 71，415-421 (1990))。

发明内容
本发明提供了包括同时表面表达多于一种可变表面蛋白(VSP)的修饰寄生性原生动物。在一种优选的实施方式中，所述原生动物包括同时表面表达的可变表面蛋白的所有种类。原生动物显示出切丁酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的表达下降，其中 RdRP基因和/或切丁酶基因已被沉默。所述原生动物可以是显示抗原变异机制的任何原生动物，其中其抗原变异机制可不受其任何组件沉默的调控。本发明提供了一种对抗原生动物产生的感染的疫苗，其至少包含在其表面表达至少两种可变表面蛋白(VSP)的修饰原生动物。在一种优选的实施方式中，所述原生动物包括在其表面同时表达的可变表面蛋白的所有种类。原生动物显示出切丁酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的表达下降，其中RdRP基因和/或切丁酶基因被沉默。所述原生动物可以是显示抗原变异机制的任何原生动物。所述疫苗还可包含赋形剂和/或助剂。本发明提供了用于纯化原生动物所有种类的可变表面蛋白(VSP)的方法，所述方法包括a)将识别VSP CRKGA氨基酸序列的抗体连接到固体支持物；b)使所述固体支持物接触原生动物；和c)分离所有种类的可变表面蛋白(VSP)种类。所述原生动物可以是野生原生动物克隆的混合物，其中每个克隆表达不同的可变表面蛋白，或者所述原生动物也可以是表达所有种类VSP的克隆。本发明提供了包含多于一种原生动物可变表面蛋白以及赋形剂和/或助剂的疫苗，其中每种所述蛋白是不同的。在一种优选的实施方式中，所述疫苗包含原生动物可变表面蛋白的所有种类，其中每种所述蛋白是不同的。本发明提供了一种免疫方法，其包括向哺乳动物施用一定量包含修饰原生动物的疫苗，所述修饰原生动物表达至少两种可变表面蛋白(VSP)或同时表达原生动物VSP的所有种类。所述方法用于免疫哺乳动物以对抗原生动物产生的感染，其中所述原生动物具有抗原变异机制。此外，本发明还提供了免疫方法，其包括向哺乳动物施用一定量的包含原生动物可变表面蛋白的组合的疫苗，其中所述可变表面蛋白的组合分离自包含沉默的RdRP基因和/或切丁酶基因的修饰原生动物。所述方法用于免疫哺乳动物以对抗原生动物产生的感染，其中所述原生动物具有抗原变异机制。在一种实施方式中，施用的疫苗剂量包括50至 500 μ g的原生动物可变表面蛋白。本发明提供了核苷酸序列，其中所述序列可选自序列SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 112的任一条，其中所述序列为ARNdc。本发明提供了选自序列SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 112的至少一条序列的应用， 其用于沉默RdRP基因或沉默切丁酶基因。


图1显示了贾第鞭毛虫中的多个VSP基因同时转录；其中a:使用在[32P]UTP存在下诱导体外转录的新分离的贾第鞭毛虫细胞核进行核连缀分析(nuclear run-on assay)； b 使用包含存在于所有VSP的保守区的探针，对从克隆WB9B10和WB1267提取的总RNA进行 RNA印迹(Northern blot)检测；c 将体外产生的正义和反义转录本(vsp9B10、vspl267, vspA6、vspH7、cwp2和⑶H)印迹并与在如图Ia相同条件下的核连缀分析产物杂交；d 对使用特异引物(9B10F/9B10R和1267F/1267R)从克隆WB9B10滋养体基因组DNA上产生的 PCR产物(1道和5道)，或使用反向探针R2Q道和6道)或正义探针Sl(3道和7道)产生的cDNA进行比较，第4道是不含RT的反应对照，白色箭头指向vsp9B10片段，其存在于基因组DNA和正义cDNA，但不存在于反义cDNA中；黑色箭头指向vspl267片段，其存在于基因组DNA、正义cDNA和反义cDNA中。M表示分子量标记。图2显示了用于研究蓝氏贾第鞭毛虫中抗原变异的新工具。a 产生有待于通过 PCR扩增成大量VSP编码基因的适合的寡核苷酸；选择从(VSPU67、VSP9B10和VSPA6)和 GS(VSPH7)分离的四种蓝氏贾第鞭毛虫VSP的序列，比对这四条序列，并使用四个保守区设计引物；寡核苷酸序列下的箭头指明了用于设计VSP通用引物(S1-S4和R1-R2)的序列；b 在对贾第鞭毛虫WB9B10克隆(在其表面仅表达VSP9B10)的基因组DNA的PCR检测中，使用四种正义引物(S1-S4)和两种反义引物(R1、R2)的组合；不依赖于所用的引物组合扩增多个DNA片段，并且分离、克隆并测序了这些反应的59个主要产物，发现其均为编码VSP的片段；随后使用这些产物中的多个(白色标记1-8)作为探针来检测基因组DNA文库，这样可以鉴定编码具有贾第鞭毛虫VSP典型特征的新蛋白(VSPS1-S8，GenBank登录号AY142122 至AY142U9)的ORF(可读框)；左侧显示了以nt (核苷酸)计的分子量标记。c 为了核实贾第鞭毛虫VSP转录本沉默是否涉及VSP反义ARN，在从表达单一 VSP的滋养体分离的ARN 制备物中检索这些分子；使用与此前用于基因组DNA相同的VSP引物组合但在反转录反应 (RT)期间使用正义引物来进行RT-PCR ；上侧显示了正义引物(Si至S4)；泳道(a)至(h)表明了用于每个 PCR 反应的引物组合(a)Sl-Rl，(b)S2-Rl，(c)S3-Rl, (d) S4-R1, (e)Sl-R2, (f)S2-R2，(g)S3-R2和(h) S4-R2 ；此外，还显示了没有反转录的阴性对照(RT-)。在这些条件下，分离、克隆并测序了 38个扩增产物，证明反义编码VSP，这些产物中的12个(靶标标记为1至12)还作为探针用于基因组文库中，这样可以获得新VSP基因(VSPAS1-VSPAS12， GenBank登录号AY143130-AY142141)的完整序列，表明了 VSP基因反义转录本的功能靶标。图3显示a 使用WB9B10克隆滋养体表达的HA表位标记的gRdRP变体的免疫定位；所述酶(红色)位于两个寄生虫细胞核周边的区域；如与伴侣蛋白ER-BiP(Mab 9C9， 绿色)的免疫共定位所示，该区域主要涉及粗面内质网(黄色)；b:RdRP活性，其中在没有引物(A-C)或存在引物Rl (D)或R2(E)的情况下，使用不同的RNA底物组合(A、B和D vsp9B10 和 vspl267 ；C 和 E :vsp9B10, vspl267 和 vspH7)，A 是不含纯化 RdRP 的对照。c 使用WB9B10克隆滋养体表达的HA表位标记的g切丁酶的免疫定位；所述酶(绿色)位于细胞胞质中，细胞核由DAPI染色(蓝色)；d:使用WB9B10克隆滋养体中表达的HA表位进行信号标记的gAgo的免疫定位；所述酶(绿色)位于细胞胞质中，细胞核由DAPI染色(蓝色)；e 使用用于gRdRP、gAgo、g切丁酶、⑶H和CWPl的探针对从诱导形成包囊4、6或12 小时期间的WB9B10克隆滋养体(且所述滋养体保持在一个正常培养基(NT)中12个小时) 提取的总RNA进行RNA印迹，结果显示这些PTGS组分(转录后基因沉默)的组成型表达。图4显示了贾第鞭毛虫中的切丁酶活性和小VSP RNA的检测。a 从贾第鞭毛虫提取物的dsRNA产生小RNA，表明切丁酶型活性。对于Vspl267dsRNA，对其双链(1道)、仅正义RNA链O道)或仅反义链(3道)进行放射性标记。对于VSp9B10和gdh，进行双链标记。将双链RNA与WB9B10克隆的贾第鞭毛虫提取物一起在37°C温育1小时，随后，分离总 RNA并用于电泳。在所有情况下均获得小RNA ；b 贾第鞭毛虫dsRNA加工中存在ATP的作用，1道和2道显示未处理的对照将VspU67dsRNA与贾第鞭毛虫胞质裂解物一起温育而不浪费ATP (分别温育1小时和3小时)，通过添加2mM葡萄糖和0. IU/ μ L己糖激酶来减少 ΑΤΡ(3道)。使用磷酸肌酸(CP，4道)、肌酸激酶(CK，5道)或这二者(6道)产生ATP;c: 通过将VSP核糖核酸探针(VSP riboprobe)与来自贾第鞭毛虫WB9B10克隆的提取物温育来产生小RNA。将一种、两种或三种不同的VSP RNAm(vsp9B10, vspl267, vspH7)与贾第鞭毛虫提取物一起混合。在存在多于一种转录本的情况下形成小RNA。使用gdh作为无关基因对照。左侧为按核苷酸计的RNA分子量标记；d 对WB9B10克隆和WB1267克隆滋养体的总RNA，以及低分子量WB1267克隆RNA(LMW_低分子量)进行电泳、印迹并使用部分降解的体外转录vsp9B10 RNA探针进行杂交。在WB9B10克隆中没有发现小RNA ；与此不同，不表达VSP9B0的WB1267克隆中存在小vsp9B10 RNA (箭头所示处)。意外地发现了长度为70 个核苷酸的RNA (星号标记)，其可代表部分降解的RNAm。图5显示了通过将VSP核糖核酸探针与贾第鞭毛虫WB1267克隆提取物一起温育而产生小RNA ；将不同VSP(vsp9B10，vspl267, vspH7)的一种、两种或三种RNAm混合，并使之接触贾第鞭毛虫滋养体提取物，在存在多于一种转录本时产生了 [32P]标记的小RNA;左侧为按核苷酸计的RNA分子量标记。图6显示了过表达VSPH7的WB9B10滋养体中的抗原转换(antigenic commutation)。a 使用 pTubCWPl. Pac 载体或 pTubH7. Pac 载体转染 WB9B10 克隆滋养体， 在α-微管蛋白启动子的控制下指导CWPl或VSPH7表达，将使用对照载体(pTubCWPl. I^c) 转染的表达VSP H7的GS株滋养体作为对照(由倒三角表示)，方块显示使用对照载体转染的WB9B10滋养体，由于表面蛋白的自发转换，VSP 9B10表达随时间下降，而组成型地表达vspH7的WB9B10滋养体显示VSP9B10 (圆形)或VSPH7 (三角形)的表达下降速度快于各自的对照。结果表示为3个独立试验的平均百分数士标准差。b:在时间0，表达VSPH7 的WB9B10滋养体的典型图像，所有细胞同时在其表面表达VSP9B10和VSPH7 ；c 培养15天后，表达VSPH7的WB9B10滋养体的典型图像，一些细胞在其表面表达VSP9B10和VSPH7，另外一些细胞仅表达VSP9B10或VSPH7，其余细胞二者均不表达；使用DAPI将细胞核标记为蓝角·
JUL，图7显示了表达vsp9B10反义片段的WB9B10滋养体的抗原转换。a:使用 pTubCWPl.Pac载体(方形)或包含vsp9B10基因5'(圆形)或3'(三角)一半序列的反义序列的PTubPac载体转染WB9B10克隆滋养体；结果表示为3个独立试验的平均百分数士标准差，并且表明VSP 9B10阳性滋养体量的下降速度快于对照；b 使用不同VSP基因转染的WB9B10滋养体的典型图像，所有细胞均在其表面表达VSP9B10 ；c 培养15天后，表达 vsp9B10反义片段3'的WB9B10滋养体的典型图像，VSP9B10占群体的约50%，使用DAPI 将细胞核标记为蓝色。图8显示了不同转录本浓度的变化可决定哪一种转录本逃脱沉默系统。在 pGEM-T-easy载体中克隆编码VSP的1267、vsp9B10和cwpl基因，并在存在或不存在32P-UTP的情况下进行体外转录；在长短不同的时间段中，使用包含固定浓度的放射性标记vsp^67 RNA的WB1267胞质提取物产生不同浓度的无标记vsp9B10和CWPl转录本，1道多个核苷酸标记(Decade-Ambion) ；2、3 和 4 道将 750ng vsp9B10 和 250ng vspl267(比例 3 1) 分别温育1、5和24小时；5、6和7道将等量vsp9B10和vspl267(# 250ng,比例1 1) 分别温育1、5和M小时；8和9道将750ng CffPl和250ng vspl267分别温育5和24小时；10道250ng vspl267转录本的温育，短温育期(1小时)内，WB1267克隆中几乎没有 vspU67降解，这与添加到混合物中vsp9B10的量无关O道和5道)。与此不同，在温育较长时间(5小时)后，vsp9B10的存在使放射标记的小vspU67 RNA出现增加(将10道与 3、6和8道比较)，而CWPl转录本(无关)的存在则没有影响，包括在高浓度下(8道)。在温育M小时时，大多数放射标记的转录本被完全降解；图9显示了贾第鞭毛虫滋养体中切丁酶和RdRP基因的沉默结果，其中通过对 RT-PCR获得的条带的密度分析，以及5次RNA印迹测定，与未转染的WB9B10滋养体相比，贾第鞭毛虫切丁酶-AS和RdRP-AS克隆显示出65%至75%之间的信使RNA下降水平，其中结果表示为平均值士标准差。图10显示了具有沉默的RdRP和切丁酶的转基因贾第鞭毛虫滋养体中不同VSP的表达，a 使用共轭有TRITC的5C1单克隆抗体(VSP1267 ；右图)和共轭有FITC的9B10单克隆抗体(VSP9B10 ；左图)在切丁酶-AS转染的滋养体(下图)或空载体(上图)中的直接免疫荧光分析；贾第鞭毛虫中的切丁酶表达被沉默时，表达表面VSP9B10的滋养体还表达VSPU67(合成图；中图)；b 使用特异单克隆抗体(VSP9B10，9B10单克隆抗体；VSP1267, 5C1单克隆抗体；VSPA6，6E7单克隆抗体)，通过流式细胞术分析测定9B10、1267克隆以及使用针对贾第鞭毛虫RdRP(RdRP-AS)或切丁酶(切丁酶-AS)的反义构建体转染的细胞克隆中表达特定VSP的贾第鞭毛虫滋养体百分数，使用抗大鼠的山羊免疫球蛋白作为阴性对照；c 其中切丁酶基因被敲除的野生型WB9B10和滋养体WB9B10的蛋白提取物的蛋白质印迹(Western blot)测试，在电泳并转移到硝酸纤维素后，将滤膜(filter)与以下杂交(1) 本发明的G3克隆12F1单克隆抗体(针对所有VSP中的CRGKA保守结构域产生)或(2) 9B10 单克隆抗体(VSP9B10特异性)。图11显示了野生型贾第鞭毛虫克隆和经过抗原变异脱调节(deregulation)修饰的贾第鞭毛虫中的VSP表达；显示了滋养体的共焦免疫荧光图像，其中切丁酶(a)或 RdRP (b)已被沉默；使用DAPI (蓝色)复染，使用抗VSP单克隆抗体(绿色)的间接免疫荧光分析的典型图像，WB9B10(d)，WB1267(e)和GS/M-H7 (f)，以及(c)使用本发明的抗CRGKA 12F1单克隆抗体(绿色)染色并使用DAPI (蓝色)复染的分离的非克隆WB群体的免疫荧光图像。图12显示在由野生型和转基因滋养体的不同群体感染并使用WB9B10和WB1267 进行攻击的沙鼠的保存样品中，贾第鞭毛虫包囊的检测和定量。(a)首先使用WB9B10、 WB1267克隆群或切丁酶(DAS)或RdRP(RAS)表达被沉默的转基因滋养体以及二者1 1的混合物感染沙鼠。(b-e)对先前被贾第鞭毛虫WB9B10 (b)、WB1267 (c)、DAS (d)和RAS (e)感染的沙鼠，在初次感染2个月后，使用WB9B10和WB1267的克隆群进行攻击；计数动物释放的包囊量。该图显示了 5个不同试验的平均值。图13显示了在使用表达所有种类的VSP的贾第鞭毛虫滋养体初次感染后，继续使用表达特定VSP的滋养体对沙鼠进行攻击的结果。使用WB9B10(e-h)、WB1267克隆(i_l) 或纯化的包囊(m-p)对先前被WB9B10、WB1267, DAS或RAS克隆(a_d)感染的沙鼠进行攻击。该图显示了使用与共轭有抗CWP2 FITC的单克隆抗体(绿色)在沙鼠粪便中的免疫荧光分析的典型图像。图14显示了由表达所有种类的VSP的转基因滋养体感染的沙鼠的血清和肠内容物能够在体外凝集不同的贾第鞭毛虫克隆。显示了使用WB9B10克隆感染的动物的血清 (lb，3f和5f)或肠内容物Qb，4f和6f) ；WB1267克隆感染的动物的血清(2b和If)或肠内容物CBb和2f) ；GS/M-H7克隆感染的动物的血清或肠内容物( 和6b) ；VSP9B10特异性Mab (Ic和2c)、VSP1267特异性Mab (3c和4c)、VSPH7特异性Mab (5c和6c)、未感染动物的血清(la，2a，3a，4a，5a和6a)、敲除DAS的滋养体感染的动物的血清(Id, 2d, 3d, 4d, 5d和6d)以及RAS感染的动物的血清(le，2e，3e，4eje和6e)进行攻击的WB9B10 (1-2)、 WB1267(3-4)和GS/M H7克隆(5-6)的相差显微镜典型图像；图15显示了在先前使用来自野生型和/或本发明转基因贾第鞭毛虫滋养体的不同克隆群的纯化VSP免疫的沙鼠的粪便样品中，贾第鞭毛虫包囊的检测和定量。在一个月内，每天使用抗CWP2单克隆抗体监测免疫沙鼠的粪便，以检验包囊释放。使用WB9B10或 WB1267滋养体的克隆群感染沙鼠。使用来自本发明转基因滋养体DAS、RAS (及其混合物) 的纯化VSP进行免疫；动物先前接受纯化DAS (a)、RAS(b)VSP或其混合物(c)的免疫；这些动物得到保护而免于WB9B10或WB1267克隆的后续感染；对照动物(d)或用细胞内蛋白免疫的那些动物(e)没有得到对抗后续感染的保护。该图显示了 5次独立试验的平均值。图16显示了在感染和攻击期间沙鼠小肠形态的照片；上图显示了试验动物的小肠(a)使用接种后15天表达所有种类的VSP的滋养体(DAS)初次感染的沙鼠小肠；与对照动物(b)相比，发现淋巴集结(Peyer patch)的大小增加(箭头)。(c)是对使用DAS滋养体的纯化VSP免疫的沙鼠进行攻击期间的小肠；下图显示了实验动物的小肠显微检测 (d)感染的沙鼠显示淋巴集结膨大以及粘膜和粘膜下层中的中度浸润性炎症。在肠腔中可见一些贾第鞭毛虫滋养体(星标；400X) ； (e)未感染的对照/未免疫的沙鼠G00X) ； (f) 是显示组织学上正常的肠粘膜的免疫沙鼠G00X)；插图显示小肠大体形态Q50X)。
具体实施例方式在本申请中，滋养体是指单细胞寄生虫(例如原生动物)在特定阶段的细胞。考虑到本申请的效果，应理解术语滋养体、寄生虫、寄生虫细胞或原生动物具有相同的含义并可互换。在本申请中，本发明的转基因或修饰寄生虫、滋养体或原生动物可以是其转基因原生动物的切丁酶基因和/或RdRP基因被沉默的原生动物。在本申请中，这些原生动物也可替换为转基因、转染或修饰的滋养体、原生动物或寄生虫。在被沉默时，本发明的滋养体或原生动物切丁酶基因也可被称作切丁酶-AS或DAS。在被沉默时，本发明的滋养体或原生动物RdRP基因也可被称作RdRP-AS或RAS。在使用转基因滋养体或原生动物的混合物时， 可将其称为切丁酶-AS+RdRP-AS或DAS+RAS。在本申请中，表达所有种类的可变表面蛋白的滋养体或原生动物可以是抗原变异机制失活的任何原生动物寄生虫或病原体。
发现贾第鞭毛虫中的VSP表达调控包括包含RNA依赖性的RNA聚合酶、切丁酶和 RNA干扰装置(RNA interference machinery)组件Argonaute的系统。在表面表达单个表面抗原(蛋白)的克隆有效地转录多个VSP编码基因，但在细胞表面仅积累编码待表达 VSP的转录本。检测对应于沉默VSP基因的反义RNA以及来自沉默蛋白silenciadas但不用于表达VSP的小RNA表明抗原变异调控中存在RNA干扰途径。明显地，切丁酶和RNA依赖性RNA 聚合酶的沉默导致寄生虫个体中单种到多种VSP表达的变化。进行核连缀分析以测定VSP表达是否受到转录或转录后水平的调控。随后，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)研究滋养体中是否存在编码VSP的正义和反义RNA，并研究参与高等真核生物中双链(dsRNA)合成和降解的酶(例如RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)、 切丁酶和Argonaute)的活性。表征包括克隆并表达这些基因，并分析由编码VSP的dsRNA 产生的小RNA。此外，在沉默贾第鞭毛虫RNA干扰(RNAi)途径的组分后，评估不同VSP的表达。此前从未描述过破坏抗原变异机制，从而产生在病原生物内表达所有种类的可变表面蛋白的细胞。在病原生物中表达表面蛋白的所有种类，从而产生可用作疫苗的寄生虫， 或者纯化可变表面蛋白的所有种类以用于免疫预防由这些病原导致的疾病，都还不可能。VSP在贾第鞭毛虫中的转录使用从WB9B10克隆滋养体的细胞核分离的RNA，通过核连缀分析来分析VSP基因的转录(图la)；所述克隆在其表面仅表达VSP9B10 (GenBank登录号AAK97086)。所得结果表明大部分编码VSP的基因同时转录。与此不同，将从两种不同贾第鞭毛虫克隆(WB9B10 和WB1267)提取的总RNA与作为对应于VSP基因保守性3'末端的探针使用的寡核苷酸一起温育时，只检测到分子量大小对应于在这些克隆表面上表达的VSP的一个转录本(图 lb)。此外，还发现了疑似降解产物的极低分子量条带。使用VSP特异性探针，发现在不同贾第鞭毛虫克隆中仅积累一种VSP转录本(参见Nash，T. Ε. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 352, 1369-1375(1997)。这证明仅积累一种VSP转录本，但在寄生虫细胞核中转录多于一种VSP。贾第鞭毛虫中的转录后基因沉默(PTGS)PTGS的关键步骤是产生与沉默基因同源的dsRNA。通过设计用于特异性扩增正义或反义VSP产物的RT-PCR测试发现，在克隆并测序这些片段后，两条链的RNA均存在于滋生体中(图2)。为了评价针对VSP编码基因的正义和反义RNA的可能的同时转录，使用特异的正义和反义探针进行第二轮的核连缀实验(图Ic)。在此分析中，不能检测到VSP-反义 RNA，表明这些分子是转录后产生的。还分析了使用特异引物vsp9B10和vspU67由WB9B10 克隆PCR产生的产物(图Id)。对应于vsp9B10的条带存在于基因组DNA和正义的互补DNA 中，但很少出现在反义cDNA中。与此不同，可以从基因组DNA扩增并且同样也在正义和反义cDNA中扩增出没有在WB9B10克隆表面表达的vspU67。这些结果证明VSP被同时转录 (进一步支持了核连缀实验的结果)，并且所表达的反义VSP转录本的丰度低，并且存在被转录但没有翻译的反义VSP RNA。贾第鞭毛虫RNAi装置的组件由RdRP介导无引物地从异常mRNA产生dsRNA，以及通过短干扰RNA (siRNA)指导有引物/无引物地产生dsRNA，对于一些生物中RNAi触发是必需的。鉴定了 RdRP的贾第鞭毛虫同源物。此RdRP基因编码155，257Da的碱性蛋白，该碱性蛋白与其他真核RdRP共享高同源性并与贾第鞭毛虫病毒16编码的一种蛋白明显不同，这表明了所鉴定的基因的原生动物性质。通过RT-PCR和RNA印迹检验贾第鞭毛虫RdRP转录，并通过血凝素标记的表达 (HA)确定其定位。贾第鞭毛虫RdRP可能与存在于内质网胞质侧的核糖体结合。另外，所述酶在滋养体中具有活性，这是因为其能够在同源VSP RNA的存在下，在体外形成高分子量 RNA (图3)。RNAi的特征是通过dsRNA特异性切丁酶RNA酶将dsRNA降解成21-25核苷酸的siRNA。此前鉴定出贾第鞭毛虫切丁酶同源物，确定了其结构，并且证明了重组蛋白的体外切丁酶活性(Macrae, I. J. Science 311,195-198(2006) 通过使用果蝇切丁酶-1序列检索贾第鞭毛虫基因组数据库中的同源基因，鉴定出与切丁酶结构域具有高度同源性的多个克隆。通过PCR以及随后与基因组文库的比较， 发现了两个独立的0RF，其包含存在于已知切丁酶的结构域带有PIWI和PAZ结构域的 Argonaute 蛋白(gAgo，GenBank 登录号 AY142142)和双齿 RNase III (g 切丁酶，GenBank 登录号AY142144)，其包含可能分别参与酶与RISC其他组件及RNA相互作用的PAZ结构域和亮氨酸拉链基序。根据图3所示，切丁酶在整个贾第鞭毛虫生活周期中组成型表达，并具有胞质定位(图幻。为了评估贾第鞭毛虫切丁酶活性，进行了体外分析，其中将放射标记的dsRNA 暴露于核后(post-nuclear)贾第鞭毛虫提取物。结果(图4a)证明，无论基因和标记的链 (正义、反义或二者)，dsRNA都被加工成20-30个核苷酸的小RNA片段，与在高等真核生物中类似，ATP的存在有利于此加工(图4b)。由这些实验获得的小RNA能够被克隆成类似于具有5' -P和3' -OH末端的siRNA。这些siRNA的测序表明，其源自输入的VSP基因，并且具有22-25个核苷酸的长度(表1)。表1
权利要求
1.修饰的原生动物寄生虫，其特征在于，所述原生动物寄生虫包含在其表面同时表达的多于一种的可变表面蛋白。
2.如权利要求1所述的原生动物，其特征在于，所述原生动物包含在其表面同时表达的可变表面蛋白的所有种类。
3.如权利要求1所述的原生动物，其特征在于，选自切丁酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的酶的表达降低。
4.如权利要求1所述的原生动物，其特征在于，RdRP基因已被沉默。
5.如权利要求1所述的原生动物，其特征在于，切丁酶基因已被沉默。
6.如权利要求1所述的原生动物，其特征在于，RdRP基因和切丁酶都已被沉默。
7.如权利要求1所述的原生动物，其特征在于，所述原生动物包含抗原变异机制。
8.如权利要求1所述的原生动物，其特征在于，所述原生动物选自贾第鞭毛虫 (Giardia)、疟原虫(Plasmodium)、巴贝西虫(Babesia)和锥虫(Trypanosoma)
9.针对原生动物产生的感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗至少包含在其表面表达多于一种的可变表面蛋白的修饰原生动物。
10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物在其表面表达可变表面蛋白的所有种类。
11.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物中选自切丁酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的酶的表达下降。
12.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物的RdRP基因已被沉默。
13.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物的切丁酶基因已被沉默。
14.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物的RdRP基因和切丁酶都已被沉默。
15.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物包含抗原变异机制。
16.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物选自贾第鞭毛虫、疟原虫、巴贝西虫和锥虫。
17.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含赋形剂和/或助剂。
18.一种用于纯化原生动物所有种类的可变表面蛋白(VSP)的方法，其特征在于，所述方法包括a)将识别VSPCRKGA氨基酸序列的抗体连接到固体支持物；b)使所述固体支持物接触原生动物；和c)分离所有种类的可变表面蛋白(VSP)。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述原生动物是野生原生动物克隆的混合物，其中每种克隆均表达不同的可变表面蛋白。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述原生动物是表达多于一种不同VSP的克隆，其中所述克隆是修饰原生动物的克隆，所述修饰原生动物克隆的选自RdRP和/或切丁酶的基因被沉默。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述原生动物是表达所有种类的VSP的克隆，其中所述克隆是修饰原生动物的克隆，所述修饰原生动物克隆的选自RdRP和/或切丁酶的基因被沉默。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述原生动物选自贾第鞭毛虫、疟原虫、 巴贝西虫和锥虫。
23.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含多于一种的原生动物可变表面蛋白、赋形剂和/或助剂，其中每种所述蛋白是不同的。
24.如权利要求23所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含原生动物所有种类的可变表面蛋白，其中每种所述蛋白是不同的
25.如权利要求23所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物选自贾第鞭毛虫、疟原虫、 巴贝西虫和锥虫。
26.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含所有种类的可变表面蛋白(VSP)，其中所述蛋白是采用权利要求18的方法获得的。
27.一种免疫方法，其特征在于，所述方法包括向哺乳动物施用一定量的疫苗，所述疫苗包含表达至少两种可变表面蛋白(VSP)的修饰原生动物。
28.如权利要求27所述的疫苗，其特征在于，所述原生动物表达所有种类的VSP。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，施用形式选自口服、皮下施用、静脉内施用和肌内施用。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述原生动物是选自RdRP和/或切丁酶的基因被沉默的修饰原生动物。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法包括免疫哺乳动物以抵抗原生动物感染，其中所述原生动物具有抗原变异机制。
32.一种免疫方法，其特征在于，所述方法包括向哺乳动物施用一定量的疫苗，所述疫苗包含原生动物可变表面蛋白的组合。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，施用形式选自口服、皮下施用、静脉内施用和肌内施用。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述可变表面蛋白的组合分离自选自 RdRP和/或切丁酶的基因被沉默的修饰原生动物。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法包括免疫哺乳动物以抵抗原生动物感染，其中所述原生动物具有抗原变异机制。
36.如权利要求32所述的方法，其特征在于，施用至少一个包含50至500μ g可变表面蛋白的剂量。
37.一种核苷酸序列，其特征在于，所述序列为选自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 112的序列。
38.如权利要求37所述的序列，其特征在于，所述序列为dsRNA的序列。
39.选自SEQID No. 1至SEQ ID No. 112的至少一个序列用于沉默RdRP基因的用途。
40.选自SEQID No. 1至SEQ ID No. 112的至少一个序列用于沉默切丁酶基因的用途。
全文摘要
本发明提供了包含在其表面同时表达的至少两种可变表面蛋白(VSP)的修饰原生动物寄生虫。所述修饰原生动物还同时表达可变表面蛋白的所有种类。原生动物显示出切丁酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的表达下降，其中RdRP基因和/或切丁酶基因被沉默。所述原生动物可以是显示抗原变异机制的任何原生动物。
文档编号A61K39/002GK102281884SQ200980148055
公开日2011年12月14日 申请日期2009年12月2日 优先权日2008年12月2日
发明者胡戈·丹尼尔·卢延 申请人:国家科学和技术研究委员会(Conicet), 阿根廷科尔多瓦天主教大学