专利名称：微型铁调素肽及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种具有铁调素活性的肽。
背景技术：
铁调素，一种由肝脏产生的肽类激素，是一种人类和其它哺乳动物的铁稳态调节剂。铁调素通过与其受体铁输出通道铁转运蛋白结合，并引起其内化和降解，从而发挥作用。人铁调素是一种25-氨基酸的肽0fep25)。参见Krause等0000)FEBS Lett 480 147-150，和 Park 等 Q001)J Biol Chem276 :7806_7810。如 Jordan 等 Q009)J Biol Chem 284 J4155-67所描述，该具有生物活性的25-氨基酸形式的铁调素的结构为由8个半胱氨酸形成4个二硫键的单一的发夹结构。铁调素活性异常与包括遗传性血色病和铁负荷性贫血的铁超负荷疾病相关。遗传性血色病(HH)是一种遗传性铁超负荷疾病，主要是由铁调素不足引起，或极少数由铁调素耐受性引起。这些使得饮食中铁离子的过量吸收和铁超负荷的形成。HH的临床表现可以包括肝病(肝硬化，肝癌)，糖尿病和心脏衰竭。目前，HH的唯一治疗方法是定期放血，这种方法非常有效，但使病人非常苦恼。铁负荷贫血是一种无效红细胞生成的遗传性贫血症，如β -地中海贫血，并伴有严重的铁超负荷。铁超负荷的并发症是这些患者发病和死亡的主要原因。铁调素缺乏是未输血患者铁超负荷的主要原因，并且促使输血患者的铁超负荷。对于这些患者，目前治疗铁超负荷的方法是铁螯合，这种方法非常繁重，有时无效，并且伴有频繁的副作用。
发明内容
本发明涉及一种具有铁调素活性的肽及其使用方法。本发明提供了一种肽，该肽可以是分离的和/或纯化的，含有下述结构式、主要由以下结构式构成或者由以下结构式构成 Α1-Α2-Α3-Α4-Α5-Α6-Α7-Α8-Α9-Α10其中Al是Asp、Glu、焦谷氨酸(pyroglutamate)、Gln、ASn、或者常用作它们的替代物的
非天然氨基酸；A2是Thr、kr、Val、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；
A3是His、AsruArg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A4是Wre、Leu、lie、Trp, Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；A5是ftx)、kr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A6是lie、Leu、Val、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A7是Cys、kr、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括S-叔丁基-半胱氨酸；A8是lie、Leu、Thr、Val、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A9是Wre、Leu、lie、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；并且AlO是Cys、kr、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；其中，羧基末端氨基酸是酰胺或羧基形式；至少一个巯基氨基酸作为氨基酸之一存在于序列中；并且Al、A2、A3、Al至A2、Al至A3、AlO、A9至AlO、A8至AlO、或者它们的组合可选择
性地缺失。条件是所述肽不含有H印25的氨基酸残基1至6。在一些实施方式中，本发明的所述肽不是H印4-7、H印3-7、Hep 1-7, H印9C7_tBut、 H印9-C7A、H印9-7CS、(D) Pen、Cyc_2、Cyc_3、Cyc_4、或者 Pr26。在一些实施方式中，本发明的所述肽只含有一个氨基酸残基，所述氨基酸残基含有能够形成二硫键的巯基。在一些实施方式中，本发明的所述肽只含有两个氨基酸残基，所述氨基酸残基各自含有能够形成二硫键的巯基。在一些实施方式中，Al 是 0-六8 、0-6111、0-焦谷氨酸、0-6111、04811、131^8 、1(^、或者^]^六8口 ；A2 是 D-Thr、D4er、D-Val、Tie、Inp、Chg、bhThr、或者 N-MeThr ；A3 是 D-His、D_Asn、DArg、Dpa、_pa、或者 2_ 氨基茚；A4 是 D-Phe、D-Leu、D_11e、D-Trp、Phg、bhPhe、Dpa、Bip、INal、bhDpa、Amc、PheF5、 hPhe, Igl、或者环己基丙氨酸；A5 是 D-Pro、D-Ser> Oic、bUro、反式-4-PhftO、顺式-4-PhftO、顺式-5-PhPro、 Idc ；A6 是 D-Ile、D-Leu、Phg、Chg、Amc、bhlle、Ach JPMeIle ；A7 是 D-Cys、D-Ser、D-Ala、Cys(S_tBut)、homoC、Pen、(D) Pen、Dap (AcBr)、禾口 Inp ；A8 是 D-Ile、D-Leu, D-Thr, D-Val, D-Arg, Chg, Dpa、bhlle、Ach、或者 MeIle ；A9 是 D-Phe、D-Leu、D_11 e、PheF5、N-MePhe、苄酰胺、bhPhe、Dpa、Bip、INal、bhDpa、 环己基丙氨酸；或者AlO 是 D-Cys> D-Ser > D-Ala ；或者它们的组合。在一些实施方式中，Al 是 Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Phe、D_Phe、Asp 或者连接于 Cys 或者 DCys 的 D_Asp、Phe或者连接于聚乙二醇分子的D-Phe、或者Dpa或者连接于棕榈酰的(D)Dpa，所述聚乙二醇分子连接于鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、或者棕榈酰；A2 是 Ala、D-Ala, Cys, D-Cys, Pro、D-Pro, Gly、或者 D-Gly ；A3 是 Ala、D_Ala、Cys、D-Cys, Dpa、Asp 或者连接于 Dpa 或者(D) Dpa 的 D-Asp ；A4 是 Ala、D_Ala、Pro、或者 D-Pro ；A5 是 Ala、D_Ala、Pro、D_Pro、Arg、D-Arg ；A6 是 Ala、D_Ala、Phe、D_Phe、Arg、D-Arg> Cys、D-Cys ；A7 是 Hi s、或者 D-Hi s ；A8 是 Cys、或者 D_Cys ；或者A9 是连接于 RA 的 Phe 或者 D_Phe、Asp、D_Asp、连接于 RB 的 Asp 或者 D_Asp、 连接于RC的bhPhe、或者巯基乙胺，其中，所述RA是-CONH2-CH2-CH2-S、连接于Pro-Lys 或者Pro-Arg的_D_Pro、连接于与Pro-Lys或者Pro-Arg连接的Pro的-bhPro、连接于 bhPro-Lys 或者 bhPro-Arg 的-D-Pro，RB 是-PEGl 1-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、- (PEG 11)-(GPHyp) 10,并且，RC 是连接于 Pro-Lys 或者 Pro-Arg 的-D_Pro、连接于 bhPro-Lys 或者 bhPro-Arg 的-DPro ；或者它们的组合物。在一些实施方式中，Al是 Asp，A2 是 Thr，A3 是 His，A4 是 Wie，A5 是 ftx)，A6 是 He, A7是Ala，A8是lie，A9是Phe，并且AlO是酰胺形式的Cys，其中Al或者Al至A2可选择性地缺失。在一些实施方式中，Al是 Asp，A2 是 Thr，A3 是 His，A4 是 Wie，A5 是 ftx)，A6 是 He, A7是Cys或者非天然巯基氨基酸，A8是Ile ；A9是酰胺形式的Wie，并且AlO缺失。在一些实施方式中，Al和A2缺失，A3是His，A4是Wie，A5是ftx)，A6是lie，A7 是Cys或者非天然巯基氨基酸，A8是酰胺形式的lie，并且A9和AlO缺失。在一些实施方式中，Al和A2缺失，A3是His，A4是Wie，A5是ftx)，A6是lie，A7 是Cys或者酰胺形式的非天然巯基氨基酸，并且A8至AlO缺失。在一些实施方式中，所述肽是环肽。在一些实施方式中，所述肽是倒序的(retroinverted)，使得Al是酰胺的C-末端并且AlO是N-末端，所有的氨基酸是D-型氨基酸而不是天然L-型氨基酸。在一些实施方式中，所述肽在N-末端、C-末端、或者两端含有一个加成。在一些实施方式中，所述肽选自由Hep3_8、H印3-9、Hep 1-8, Hep 1-9, H印1-10C7A、 H印9F4A、H印9C7-SStBut、(D) C、homoC、Pen、(D) Pen, Cyc-I、Pr 10、Pr 11、Pr 12、riH印7 Δ DT、 Pr23、Pr24、Pr25、Pr27、Pr28、F4bhPhe、F4Dpa、F4Bip、F41Nal、F4bhDpa、F9bhPhe、F9Dpa、 F9B ip、F9 INal、F9bhDpa、Pr 39、Pr40、Pr41、Pr42、Pr43、Pr44、Pr45、Pr46、Pr 13、Pr 14、Pr 15、 Prl6、Prl7、Prl8、Prl9、Pr20、Pr21、Pr22、Pr_l、Pr_2、Pr_3、和 Pr_4 组成的组。 在一些实施方式中，所述肽具有铁调素活性。在一些实施方式中，所述肽与铁转运蛋白结合，优选为人铁转运蛋白。 在一些实施方式中，本发明提供了含有至少一种本发明所述的肽的组合物和药物制剂。在一些实施方式中，本发明提供了含有至少一种本发明所述的肽的药物制剂的制备方法，该药物制剂用于治疗铁代谢疾病，如铁超负荷疾病。还提供了治疗患者铁代谢疾病的方法，如哺乳动物患者，优选为人类患者，该方法包括给予患者至少一种本发明所述的肽或者组合物。在一些实施方式中，所述肽以治疗有效量进行给药。在一些实施方式中，本发明提供了结合铁转运蛋白或诱导铁转运蛋白内化和降解的方法，该方法包括将铁转运蛋白与本发明所述的至少一种肽或组合物接触。在一些实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括与试剂、装置、指导材料、或者它们的组合一起包装的本发明所述的至少一种肽或组合物。在一些实施方式中，本发明提供了一种复合物，该复合物含有本发明所述的至少一种肽与铁转运蛋白结合，优选为人铁转运蛋白，或者与抗体相结合，例如该抗体可特异性地结合于本发明所述肽，Hep25，或者与它们的组合。无论是以上的概述还是以下的详细说明都仅是典型和解释，旨在为权利要求所述的发明做进一步的解释。附图旨在对本发明提供进一步的理解，全部包含在本说明书中并构成本说明书的一部分，对本发明的多个实施方式进行说明，并与说明书一起来解释说明本发明的原理。
本发明可通过参考附图进一步理解。图1为表示Hep25中丙氨酸替代物的相对铁调素活性的图；图2A为表示H印25中F4替代物的相对铁调素活性的图；图2B为表示H印25中F9替代物的相对铁调素活性的图；图3A为表示H印1-9和H印1-10C7A相对于H印25 (A)的铁调素活性的图；图;3B为表示H印1-7和H印1_8相对于H印1_9或者H印25的铁调素活性的图；图3C为表示H印4-7、H印3-7、H印3-8和H印3-9相对于H印1-9的铁调素活性的图；图4为表示C7修饰肽相对于!fep25的铁调素活性的图；图5为表示与H印25，或者对照组(PBS)相比，微型铁调素H印l_9、Pr6和1^12的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)，每只小鼠腹腔注射50 μ g肽；图6为表示腹腔注射微型铁调素1^27 (20和200nmOleS)的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)，Hep25的注射剂量为20nmOles ；图7为表示腹腔注射微型铁调素riH印7 ADT(20和200nmOleS)的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)，Hep25的注射剂量为20nmoles ；图8为表示腹腔注射微型铁调素1^27和(20nmoles)的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)，腹腔注射前预先与脂质体混合，H印25的注射剂量为20nmOles ；图9为表示口服强制给予微型铁调素ft^TQOOnmoles)后的体内作用(通过小鼠血清铁浓度测定)。
具体实施例方式本发明提供了一种肽，该肽可应用于铁代谢疾病的研究和治疗。本发明所用的“铁代谢疾病”，包括铁代谢异常直接引起的疾病，或者血液中铁水平失调引起的疾病，或者是由另一种疾病引起的铁失调的疾病，或者可以通过调节铁水平治疗的疾病，等等。更具体地说，根据该权利要求所述，铁代谢疾病包括铁超负荷疾病，铁缺乏症，铁生物分布紊乱症，其它铁代谢紊乱症及其它与铁代谢潜在相关的紊乱症，等等。铁代谢疾病包括血色病、HFE突变的血色病、铁转运蛋白突变的血色病、转铁蛋白受体2突变的血色病、血幼素(hemojuvelin)突变血色病、铁调素突变的血色病、青少年血色病、新生儿血色病、铁调素缺乏症、输血性铁超负荷、地中海贫血、中度地中海贫血、α地中海贫血、 铁粒幼细胞性贫血、吓啉症、迟发性皮肤卟啉症、非洲铁超负荷、高铁蛋白血症、铜蓝蛋白缺乏症、无转铁蛋白血症、先天性红细胞生长不良性贫血、慢性贫血疾病、炎症性贫血、感染性贫血、低色性小球性贫血、缺铁性贫血、难治性缺铁性贫血、慢性肾病性贫血、促红细胞生成素障碍、缺铁性肥胖、其它贫血、过量产生铁调素或诱导其过量产生的良性或恶性的肿瘤、 铁调素过剩症、弗里德(Friedreich)共济失调、纤细综合征、苍白球色素性退变综合征、威尔森氏症、肺含铁血黄素沉着病、肝癌、癌症、肝炎、肝硬化、异食癖、慢性肾功能衰竭、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、多发性硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病和阿尔茨海默氏病。在某些情况下，“铁代谢性疾病”的定义所包括的疾病和紊乱通常未被明确确定为与铁相关。例如，铁调素在小鼠胰腺的过高表达表明糖尿病(I型或II型)、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受和其它紊乱可能通过治疗根本上的铁代谢疾病来改善。参见Ilyin，G.等(2003 年)FEBS Lett. 54222-26，其在此处作为参考。因此，这些疾病都包含在广义的定义中。根据本发明使用的本领域公知的方法，本领域技术人员很容易就能确定给定的疾病是否是一种“铁代谢疾病”，包括本发明所参考的W0200409M05所述的方法，以及本领域公知的监测铁调素、血幼素或铁水平和表达的方法，例如本发明引用的美国专利No. 7，534，764所述。在本发明的优选的实施方式中，铁代谢疾病是指铁超负荷疾病，其中包括遗传性血色病、铁负荷性贫血、酒精性肝疾病和慢性丙型肝炎。本发明所使用的术语“蛋白”，“多肽”和“肽”可以互换使用，指两个或两个以上相连的氨基酸。除了如表2所示的罕见或非天然氨基酸的缩写之外，在本发明中使用本领域常用的三个字母和一个字母的缩写来表示氨基酸残基。除前面标明“D-”外，所述氨基酸是 L-氨基酸。氨基酸缩写群组或字符串用来表示肽。除非特别注明外，所述肽以N-末端在左侧表示，并且其序列是从N-末端写到C-末端。本发明所述肽可以用本领域公知的方法制备，包括化学合成、生物合成或用 DNA重组方法体外合成，以及固相合成。例如，参见Kelly和Winkler (1990)Genetic Engineering Principles and Methods, vol. 12, J. K. Setlow ed. , Plenum Press, NY, pp. 1-19 ；Merrifield(1964) J Amer Chem Soc 85 :2149 ；Houghten (1985)PNAS USA 82: 5131-5135 ； 禾口 Stewart&Young(1984) Solid Phase Peptide Synthesis,2ed. Pierce, Rockford, IL，本发明将它们引入作为参考。本发明所述肽可以用本领域公知的蛋白纯化技术纯化，诸如反相高效液相色谱法(HPLC)、离子交换或免疫亲和层析、滤过或尺寸排阻色谱法、或电泳法。参见 01snes，S.和 A. Pihl (1973) Biochem. 12 (16) :3121-3126 ；^P Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag，NY，本发明将它们引入作为参考。 另外，本发明所述肽可用本领域公知的重组DNA技术制备。因此，在此处引入编码本发明所述多肽的多聚核苷酸。在优选的实施方式中，多聚核苷酸是分离的。本发明使用的“分离的多聚核苷酸”是指存在于不同于多聚核苷酸自然产生的环境中的核苷酸。
在一些实施方式中，本发明所述肽进行了大致纯化。此处使用的“大致纯化”的化合物是指一种从该化合物的天然环境提取的化合物，并且有最少约60%，优选约75%，最优选约90 %的该化合物从与该化合物相关的其它大分子化合物相游离。本发明所使用的“分离的”化合物是指将其从自然环境中分离。例如，相对于全链多肽，分离肽是在其N-末端、C-末端、或两端的侧链上不含天然氨基酸的多肽。例如，分离的H印1-9是指H印25的氨基酸残基1-9组成的分离肽，该分离肽可以再在其N-末端、C-末端、或两端含有非天然氨基酸，但在C-末端的第九个氨基酸残基之后无半胱氨酸的氨基酸残基。如本发明所规定，本发明涉及的氨基酸位置与H印25的氨基酸残基一致。例如，所述氨基酸位置9，对应于!fep25的第九个氨基酸残基。本发明所述肽可结合于铁转运蛋白，优选为人铁转运蛋白。本发明优选的肽可特异性结合于人铁转运蛋白。此处所使用的“特异性结合”是指与样品中其它试剂相比、特异性结合剂可与样品中给定配体优先作用。例如，能特异性结合给定配体的特异性结合剂，在合适条件下，其结合于给定的配体，在量或程度上，明显超过与样品中其它组分的非特异性结合。所述合适条件是指能够允许给定特异性结合剂和给定配体相互作用的条件。所述条件包括PH值、温度、浓度、溶剂、孵化时间等等，这些条件可能在不同的给定的特异性结合剂和配体对间有差异，但本领域技术人员可以容易地测得。本发明的所述肽，以下简称“微型铁调素”，模拟H印25即生物活性的人类25-氨基酸形式的铁调素活性。本发明中所使用的具有“铁调素活性”的化合物是指该化合物在给予(如肠外注射或口服)患者后，能够呈剂量依赖性和时间依赖性降低患者(如小鼠或人) 的血浆铁水平。例如参见Rivera等(2005)，blood 106 :2196-9。在一些实施方式中，本发明的所述肽具有体外活性，根据文献Nemeth等Q006) Blood 107 :3观-33，其可以通过测定铁转运蛋白表达细胞株内铁转运蛋白的内化和降解来测定。体外活性可以通过将铁转运蛋白标记为绿色荧光蛋白，测定细胞中剂量依赖性荧光损失来测定。参见Nemeth等(2006)Bloodl07 :328_33。按参比制剂H印25或微型铁调素浓度梯度，将等份细胞培养M小时。如此处所述，EC5tl值是指能够引起参比H印25制剂产生最大荧光损失的50%所需的给定化合物浓度(如肽)。在测定中!fep25的EC5tl值在5至 15nM范围内，在体外活性测定中优选微型铁调素的EC5tl值约为IOOOnM或更低。根据本发明，本领域其它已知方法也可以用于计算铁调素活性和肽体外活性。例如，可以通过测定其导致铁转运蛋白细胞内化的能力来测定化合物体外活性，它是采用能识别细胞外铁转运蛋白抗原决定簇的抗体，应用免疫组织化学或流式细胞仪测定。另外，如 Nemeth等O006)Blood 107 :328-33所述，可预先用铁的放射性同位素或稳定同位素使铁转运蛋白表达细胞超负荷，测定化合物抑制铁转运蛋白表达细胞铁外流的剂量依赖性抑制能力，来测定化合物体外活性。微型铁调素设计以往研究表明，Hep25的N-末端区段对其铁调素活性非常重要，并有可能形成与铁转运蛋白的接触界面。然而，每个N-末端氨基酸对铁调素活性的重要性仍不明确。因此，对Hep25的残基1-6进行丙氨酸扫描诱变，以测定每个N-末端氨基酸对铁调素活性的影响。如图1所示，T2A替代物对铁调素活性无实质性影响。苯丙氨酸替代物(F4A或F9A) 引起铁调素活性下降幅度最大，高达70%以上。其余丙氨酸替代物也可测得其使铁调素活性下降，但不如F4A或F9A替代物影响显著。为确定高度保留的并且结构上极为重要的F4位苯丙氨酸对铁调素活性是否有重要作用，本发明用其它氨基酸系统地替代H印25的F4位氨基酸。如图2A所示，侧链极性增加(F4Y)可以导致铁调素活性明显降低，即用D-型苯丙氨酸(f)或带电氨基酸(D、K和Y) 替代。然而，用非芳香族环己基丙氨酸替代F4位残基时，铁调素活性未变化，从而表明，大量疏水性残基有助于提高铁调素活性。为确定高度保留的并且结构上极为重要的F9位苯丙氨酸对铁调素活性是否有重要作用，本发明用其它氨基酸替代H印25的F9位氨基酸。如图2B所示，当F9位不论是用丙氨酸替代还是用非芳香族环己基丙氨酸替代时，铁调素活性均降低，从而表明，芳香族残基对铁调素活性有重要影响。基因突变研究表明，C326，即人铁转运蛋白3 位半胱氨酸残基，是参与铁调素结合的关键氨基酸残基。因此，本发明化学合成、重组了多种包含巯基的Hep25N-末端片段， 如 H印4-7、H印3-7、H印3-8、H印3-9、Hep 1-7, Hep 1-8, Hep 1-9 和 H印 1-10C7A，它们相对于 Hep25的相对活性采用流式细胞仪定量测定铁转运蛋白-GFP的降解、基于细胞铁蛋白测定方法的铁外排评价、以及放射性同位素铁外流研究进行测定。这些序列和这些N-末端片段的EC50值如表1所示。显著的并且出乎意料的是，如图3所示，在流式细胞仪测定铁转运蛋白-GFP中， H印1-9和H印1-10 C7A显示相当强的活性。与!1印邪相比，在质量水平上，H印1-9和H印1-10 C7A只有大约4倍以下活性，在摩尔水平上，大约10倍以下活性。因此，H印1-9和!fepl-10 C7A被用作构建其它具有铁调素活性的肽的基底。为确定半胱氨酸巯基对H印1-9的铁调素活性的重要作用，将H印1-9的C7位用具有相似形状但不能形成二硫键的氨基酸替代，得到Hep9-C7S(丝氨酸替代物)和 Hep9C7-tBut (叔丁基阻断半胱氨酸)，或用叔丁基耦合二硫键修饰的半胱氨酸(可以作为保留基团参与HS-叔丁基的二硫键交换)替代，得到H印9C7-SMBut。如图4所示，能够切断二硫键形成或交换的氨基酸替代物可以导致铁调素活性完全丧失，从而表明，二硫键形成是铁调素活性的必需条件。其它C7氨基酸替代物及其铁调素活性见表1。基于H印1-9和H印1-10 C7A的其它肽构建成二硫键环化肽，所述肽含有非天然氨基酸替代物，是经后逆转录的，包含修饰F4和F9位残基，或带有一个正电荷。其C-末端氨基酸是酰胺形式。修饰后和相应的铁调素活性如表1所示。如表1所示，除和之外，EC50约为IOOOnM或以下的微型铁调素包含至少6个相邻的氨基酸残基，相对于Ifep25的残基3-8 (参见H印3-8)。因此，在一些实施方式中，优选微型铁调素至少含有6个相邻的氨基酸残基，相对于Hepl-9的6个相邻氨基酸残基，优选残基3-8。氨基酸残基可以是非天然或稀有氨基酸、L-型或D-型氨基酸残基、修饰残基、或它们的组合。在一些实施方式中，本发明所述微型铁调素至少有一个氨基酸替代物、修饰、或加成。氨基酸替代物实例包括将用D-型氨基酸残基替代其相应的L-型氨基酸残基，用homoC、 Pen、D-型Pen、hp、或类似氨基酸替代半胱氨酸，用WiWie、Dpa, bhDpa, Bip、INal、以及其类似氨基酸替代Wie。替代残基的名称和结构在表2中列出。其它合适的替代物在表1中列出。修饰的实例包括修饰一个或多个氨基酸残基的肽使肽形成一个环状结构、后倒序(retroinversion)、以及修饰一个残基使形成二硫键。如表1所示，加成的实例包括在N-末端、C-末端、或两端增加至少一个氨基酸残基或至少一个化合物。如表1所示，大多数微型铁调素的EC5tl约IOOnM或以下，至少包含一个Dpa或WiDPA 氨基酸替代物。因此，在一些实施方式中，本发明所述微型铁调素至少有一个Dpa或W1DPA
氨基酸替代物。由图1丙氨酸取代数据来看，在一些实施方式中，本发明所述微型铁调素可以在7 位氨基酸位置含有Ala，而不是在4位和9为氨基酸位置，因为在7位氨基酸位置含有可以形成二硫键的巯基。见表1中H印9F4A和H印9C-SStBut。由图2和表1中4位氨基酸取代数据来看，本发明的所述微型铁调素在4位可以有氨基酸替代物，与H印25、H印1-9或H印1-10 C7A相比，该替代物不会导致其荷电性质或极性的实质性变化。H印1-9或H印1-10 C7A的4位的优选氨基酸替代物包括Wie、D-Phe, bhPhe、Dpa、bhDpa、Bip、INal、或类似氨基酸。根据本发明的微型铁调素，具有以下结构式A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10其中Al是Asp、Glu、焦谷氨酸、Gin、Asn、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A2是Thr、kr、Val、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A3是His、AsruArg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A4是W!e、LeU、Ile、Trp、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，其中，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；A5是ft~0、kr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A6是lie、Leu、Val、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A7是Cys、kr、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，其中，所述非天然氨基酸包括S-叔丁基-半胱氨酸；A8是lie、Leu、Thr、Val、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；A9是W!e、LeU、Ile、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，其中，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；并且AlO是Cys、kr、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸；其中，羧基末端氨基酸是酰胺或羧基形式；Cys或不同的巯基氨基酸作为氨基酸之一存在于序列中；并且Al、A2、A3、Al至A2、Al至A3、A10、A9至A10、A8至A10、或者它们的组合可选择性地缺失。在一些实施方式中，Al是 Asp，A2 是 Hir，A3 是 His，A4 是 Phe，；A5 是 Pro，A6 是 He, A7是Ala，A8是lie，A9是Phe，并且AlO是酰胺形式的Cys，其中，Al或Al至A2可选择性地缺失。在一些实施方式中，Al是 Asp，A2 是 Thr，A3 是 His，A4 是 Wie，A5 是 ftx)，A6 是 He, A7是Cys或非天然巯基氨基酸，A8是lie，A9是酰胺形式的Wie，并且AlO缺失。在一些实施方式中，Al和A2缺失，A3是His，A4是Wie，A5是ftx)，A6是lie，A7 是Cys或非天然巯基氨基酸，A8是酰胺形式的lie，并且A9和AlO缺失。
在一些实施方式中，Al和A2缺失，A3是His，A4是Wie，A5是ftx)，A6是lie，A7 是Cys或非天然巯基氨基酸，并且A8至AlO缺失。在一些实施方式中，非天然氨基酸A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、或者它们的组合是指相应的D-型氨基酸。例如，对Al来说，其非天然氨基酸可以是D-Asp、D-Glu, D-Gln, D-Asn、或其它等等。在一些实施方式中，所述非天然氨基酸为Al 是 D-Asp、D-Glu、D-焦谷氨酸、D-Gln、D-Asn、bhAsp、Ida、或者 N-MeAsp ；A2 是 D-Thr、D4er、D-Val、Tie、Inp、Chg、bhThr、或者 N-MeThr ；A3 是 D-His、D_Asn、DArg、Dpa、_pa、或者 2_ 氨基茚；A4 是 D-Phe、D-Leu、D_11e、D-Trp、Phg、bhPhe、Dpa、Bip、INal、bhDpa、Amc、PheF5、 hPhe, Igl、或者环己基丙氨酸；A5 是 D-Pro、D-Ser> Oic、bUro、反式-4-PhftO、顺式-4-PhftO、顺式-5-PhPro、 Idc ；A6 是 D-Ile、D-Leu、Phg、Chg、Amc、bhlle、Ach JPMeIle ；A7 是 D-Cys、D-Ser、D-Ala、Cys(S_tBut)、homoC、Pen、(D) Pen、Dap (AcBr)、禾口 Inp ；A8 是 D-Ile、D-Leu> D-Thr> D_Val、D_Arg、Chg> Dpa、bhlle、Ach、或 MeIle ；A9 是 D-Phe、D-Leu、D_11 e、PheF5、N-MePhe、苄酰胺、bhPhe、Dpa、Bip、INal、bhDpa、 环己基丙氨酸；并且AlO 是 D-Cys、D_Ser、D-Ala0在一些实施方式中，所述氨基酸替代物(以及加成物，如有说明)为Al 是 Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Phe、D_Phe、Asp 或者连接于 Cys 或者 DCys 的 D_Asp、 Phe或者连接于聚乙二醇分子的D-Phe、或者Dpa或者连接于棕榈酰的(D)Dpa，所述聚乙二醇分子连接于鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、或者棕榈酰；A2 是 Ala、D-Ala、Cys、D_Cys、Pro、D-Pro、Gly、或者 D-Gly ；A3 是 Ala、D-Ala、Cys、D_Cys、Dpa、Asp 或者连接于 Dpa 或者(D) Dpa 的 D-Asp ；A4 ^ Ala> D~Ala>D-Pro ；A5 是 Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Arg、D-Arg ；A6 是 Ala、D-Ala、Phe、D-Phe、Arg、D-Arg、Cys、D-Cys ；A7 是 Hi s、或者 D-Hi s ；A8 是 Cys、或者 D_Cys ；并且A9 是连接于 RA 的 Phe 或者 D_Phe、Asp、D_Asp、连接于 RB 的 Asp 或者 D_Asp、 连接于RC的bhPhe、或者巯基乙胺，其中，所述RA是-CONH2-CH2-CH2-S、连接于Pro-Lys 或者Pro-Arg的_D_Pro、连接于与Pro-Lys或者Pro-Arg连接的Pro的-bhPro、连接于 bhPro-Lys 或者 bhPro-Arg 的-D-Pro，RB 是-PEGl 1-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL、- (P EGll)-(GPHyp) 10,并且，RC 是连接于 Pro-Lys 或者 Pro-Arg 的-D_Pro、连接于 bhPro-Lys 或者 bhPro-Arg 的-DPro。在一些实施方式中，所述微型铁调素是10部分序列，其中A7是Ala，并且AlO是 Cys0在一些实施方式中，所述微型铁调素通过二硫键形成环状结构。
在一些实施方式中，所述肽是倒序的(retroinverted)，使Al为C-末端并且AlO 为N-末端，并且氨基酸残基是D-型氨基酸。在一些实施方式中，所述倒序(retroinverted) 肽在N-末端、C-末端、或两端至少包含一个加成。在一些实施方式中，所述倒序 (retroinverted)肽至少包含一个L-型氨基酸。在一些实施方式中，所述微型铁调素在4位、9位、或两个位置含有氨基酸替代物。在一些实施方式中，所述氨基酸替代物是Wig、Phe、D-Phe、bhPhe、Dpa、BipUNal、Dpa、 bhDpa、Amc、或巯乙胺。在一些实施方式中，所述微型铁调素在7位含有氨基酸替代物。在一些实施方式中，所述氨基酸替代物是 Cys(S-tBut)、Ala、D_Ala、Ser, D-Ser, homoC、Pen、(D) Pen、His、 D-His> gJc Inp0根据本发明，一些优选的微型铁调素在表1中列出。
权利要求
1.一种分离的肽，该肽具有以下结构式 A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10 其中，Al是Asp、Glu、焦谷氨酸、Gin、Asn、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸； 八2是11^、^^、￥31、411或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸； A3是His、AsruArg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸； A4是Wre、Leu、lie、Trp, Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；A5是ftx)、kr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸； A6是lie、Leu、Val、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸； A7是Cys、Ser, Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括S-叔丁基-半胱氨酸；A8是lie、Leu、Thr, Val、Arg、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸； A9是Wre、Leu、lie、Tyr、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸，所述非天然氨基酸包括环己基丙氨酸；并且AlO是Cys、kr、Ala、或者常用作它们的替代物的非天然氨基酸； 其中，羧基末端氨基酸是酰胺或羧基形式； 至少一个巯基氨基酸作为氨基酸之一存在于序列中；并且Al、A2、A3、Al至A2、Al至A3、AlO、A9至AlO、A8至AlO、或者它们的组合可选择性地缺失。
2.根据权利要求1所述的肽，其中，Al是D-Asp、D-Glu,D-焦谷氨酸、D-Gln、D-Asn, bhAsp、Ida、或者 N-MeAsp ；A2 是 D-Thr、D-kr、D-Val、Tle、Inp、Chg、bhThr、或者 N-MeThr ； A3 是 D-His、D-Asn、DArg、Dpa、(D)Dpa、或者 2-氨基茚；A4 是 D-Phe、D-Leu、D-11e、D-Trp、Phg^bhPhe、Dpa、Bip、INal、bhDpa、Amc、PheF5、hPhe、 Igl、或者环己基丙氨酸；A5 是 D-Pro、D4er、0ic、bhPro、反式-4-PhPro、顺式-4-PhPro、顺式-5-PhPro、Idc ； A6 是 D-Ile、D-Leu、Phg、Chg、Amc、bhIle、Ach、和 MeIle ；A7 是 D-Cys>D-Ser、D_Ala、Cys (S-tBut)、homoC、Pen、(D) Pen、Dap (AcBr)、禾口 Inp ； A8 是 D-Ile、D-Leu, D-Thr, D-Val, D-Arg, Chg、Dpa、bhlle、Ach、或者 MeIle ； A9 是 D-Phe、D-Leu, D_Ile、PheF5、N-MePhe、节酰胺、bhPhe、Dpa、Bip、INal、bhDpa、环己基丙氨酸；或者AlO 是 D-Cys、D-Ser,D-Ala ； 或者它们的组合。
3.根据权利要求1所述的肽，其中，Al 是 Ala、D-Ala、Cys、D-Cys、Phe、D_Phe、Asp 或者连接于 Cys 或者 DCys 的 D-Asp、Phe 或者连接于聚乙二醇分子的D-Phe、或者Dpa或者连接于棕榈酰的(D) Dpa，所述聚乙二醇分子连接于鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、或者棕榈酰；A2 是 Ala、D-Ala, Cys、D_Cys、Pro、D-Pro, Gly、或者 D-Gly ；A3 是 Ala、D-Ala, Cys、D-Cys, Dpa、Asp 或者连接于 Dpa 或者(D) Dpa 的 D-Asp ；A4 是 Ala、D-Ala, Pro、或者 D-Pro ；A5 是 Ala、D-Ala、Pro、D-Pro> Arg> D-Arg ；A6 是 Ala、D-Ala、Phe、D-Phe、Arg、D-Arg> Cys、D-Cys ；A7 是 His、或者 D-His ；A8是Cys、或者D-Cys ；或者A9是连接于RA的Phe或者D-Phe、Asp、D-Asp、连接于RB的Asp或者D-Asp、连接于RC 的bhPhe、或者巯基乙胺，其中，所述RA是-CONH2-CH2-CH2-S、连接于Pro-Lys或者ftx)-Arg 的-D-Pro、连接于与Pro-Lys或者Pro-Arg连接的Pro的-bhftx)、连接于bhPro-Lys或者 bhPro-Arg 的-D-Pro，RB 是-PEGl I-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEffVLLSTFL, - (PEG11) - (GPHy ρ) 10,并且，RC是连接于Pro-Lys 或者Pro-Arg 的-D-Pro、连接于bhPro-Lys 或者bhPro-Arg 的-DPro ；或者它们的组合。
4.根据权利要求1所述的肽，其中，Al是Asp，A2是Thr，A3是His，A4是Wie，A5是 Pro, A6是lie，A7是Ala，A8是lie，A9是Wie，并且AlO是酰胺形式的Cys，其中Al或者 Al至A2可选择性地缺失。
5.根据权利要求1所述的肽，其中，Al是Asp，A2是Thr，A3是His，A4是Wie，A5是 Pro,A6是Ile，A7是Cys或者非天然巯基氨基酸，A8是Ile ；A9是酰胺形式的Wie，并且AlO 缺失。
6.根据权利要求1所述的肽，其中，Al和A2缺失，A3是His,A4是Phe, A5是Pro, A6 是lie，A7是Cys或者非天然巯基氨基酸，A8是酰胺形式的lie，并且A9和AlO缺失。
7.根据权利要求1所述的肽，其中，Al和A2缺失，A3是His,A4是Phe, A5是Pro, A6 是lie，A7是Cys或者酰胺形式的非天然巯基氨基酸，并且A8至AlO缺失。
8.根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽是环肽。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽，其中，所述序列是倒序的，使得Al是C-末端，并且AlO是N-末端。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的肽，其中，所述肽在N末端、C末端、或者两端含有一个加成。
11.根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽选自由H印3-8、H印3-9、Hep1-8, Hep 1-9, H印 1-10C7A、H印9F4A、H印9C7_SStBut、(D) C、homoC、Pen、(D) Pen、Cyc-I、Pr 10、Pr 11、Pr 12、 riHep7ADT> Pr23、Pr24、Pr25、Pr27、Pr28、F4bhPhe> F4Dpa> F4Bip> F41Nal> F4bhDpa> F9bhPhe、F9Dpa、F9Bip、F91Nal、F9bhDpa、Pr39、Pr40、Pr41、Pr42、Pr43、Pr44、Pr45、Pr46、 Prl3、Prl4、Prl5、Prl6、Prl7、Prl8、Prl9、Pr20、Pr21、Pr22、Pr_l、Pr_2、Pr_3、和 Pr-4 组成的组。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的肽，其中，所述肽具有铁调素活性。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的肽，其中，所述肽与铁转运蛋白结合。
14.一种组合物，该组合物含有权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽。
15.一种结合铁转运蛋白或诱导铁转运蛋白内化和降解的方法，该方法包括将铁转运蛋白与权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽或权利要求14所述的组合物接触。
16.一种治疗患者铁代谢疾病的方法，该方法包括将权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽或者权利要求14所述的组合物给予治疗对象。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述铁代谢疾病是铁超负荷疾病。
18.—种试剂盒，该试剂盒包括与试剂、装置、指导材料、或者它们的组合一起包装的权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽或者权利要求14所述的组合物。
19.一种复合物，该复合物包括与铁转运蛋白或者抗体结合的权利要求1至13中任一项所述的至少一种肽。
20.本发明如所述。
全文摘要
本发明提供了具有铁调素活性的肽及其制备和使用方法。
文档编号A61P3/00GK102245626SQ200980148967
公开日2011年11月16日 申请日期2009年12月4日 优先权日2008年12月5日
发明者E·内梅特, G·普雷萨, P·鲁沙拉, T·甘兹 申请人:加利福尼亚大学董事会