专利名称：利用磁性纳米颗粒和超声技术实现基因转染的制作方法
技术领域：
此发明是有关于设计用纳米结构组成的运载系统将生物分子传递到指定部位，以及在外加磁场和超声的辅助下将所设计的纳米结构运载系统通过生物膜运送到细胞内的方法。
背景技术：
基因转染是用传染媒介转染媒介传染媒介作为传送方式将外来基因物质引入真核细胞。基因转染常常是针对哺乳动物细胞而言，而基因转化则常用于描述DNA植入到细菌和非动物真核细胞，如真菌、海藻和植物中。现存的基因转染手段必须要克服细胞膜渗透性和转染颗粒溶解性的问题。药物传送通常涉及到将药物通过细胞膜传输到细胞内。最基本的体内药物运载方法是通过口服或静脉注射将药物引入血液，然后期待药物能被正确的细胞吸收。这种无差别释放技术需要相对大的药物剂量，但是这种单剂量药物运载方法无法用于对基因治疗中所需传递的生物分子比如DNA。现在的基因转染进入细胞的方法可分为两类病毒性和非病毒性基因转染。用病毒来将基因转染进入细胞被证明是极其有效的；然而，对进入身体的病毒和诱变物质的免疫反应所引起的后果/副作用特别是临床试验中必须认真考虑，谨慎使用。非病毒药物送达方法包括裸DNA注射和电激发法。但是裸DNA注射的基因转染的效率非常低，而电激法又会导致组织损伤。显微注射是另一种用精确工具直接将分子注入细胞的机械性方法。对DNA非常管用，但在很多情况下，此方法并不能被大规模使用因为它一次只能转染一个细胞。基因枪是一个机械设备能将捆绑有生物分子的颗粒通过高压射入细胞。由于这些颗粒的粒径相对较大，所以常常损坏细胞。并且这种方法需要大量注射才有一小部分达到转染效果。电激法是一种物理方法，它通过电击细胞在细胞膜上产生孔隙。这些孔隙增加了物质扩散进入细胞的几率。使得基因比较容易进入细胞。超声穿孔法与电激法颇为类似，只是超声穿孔法利用超声来刺激细胞膜。超声对细胞周围的液体产生扰动，从而增加了外界物质通过细胞膜的扩散几率。磷酸钙转染是另一种基因转染的化学方法，它很便宜。基本原理是用磷酸钙绑在 DNA上。这个混合分子能通过细胞膜上的钙离子通道进入细胞；然而这种转染方法的效率通常是不高并且有很大局限性。病毒传递是一种较有效的方法，因为病毒本身是一种基因信息载体并且擅于进入细胞。这些特点使它们被选择来帮助将DNA分子输入细胞。然而有时病毒载体的应用并不适宜，因为其致敏原性能导致免疫性疾病并有潜在诱导基因突变的危险。更进一步，病毒传递是一种非特定的转染方法并能在宿主身上产生负作用。另一种方法是用磁场力和分子载体通过细胞膜。此方法已申请美国专利(专利号2007/0231908A1)，此方法需要在穿过生物膜之前将分子载体定向。对上述大多数方法，基因转染的效果很大程度上取决于被转染的细胞类型。有些细胞比其他细胞更难转染，但这些难转染的细胞，比如干细胞和植物细胞，但通常它们的商用价值很大。因此，有必要寻找新的手段来传递生物分子或其他有兴趣的分子进入细胞，以克服旧方法所面临的困难。
发明内容
本发明提供了一种用磁性纳米颗粒在外磁场操控下穿过细胞壁/细胞膜实现基因转染/转化的方法。在一个实例中，纳米颗粒被定向通过细胞膜、细胞核膜、或体内细胞膜如血脑屏障。在一实例中，此发明进一步发展是结合超声技术来增加生物膜的渗透性。这种组合的方法能达到更好的生物分子传递或细胞转染/转化效率。本发明包括如下方面(a) —种产生无毒，磁性纳米颗粒的方法；(b)将纳米颗粒捆绑在生物分子或其他感兴趣的分子上；(c)在外磁场的作用下，使这些纳米颗粒穿过细胞薄膜。在一实例中，我们用低强度脉冲超声(LIPUQ用于增加薄膜渗透性。一方面，此发明利用磁性颗粒作为传递载体将特定分子穿透细胞膜带入细胞，此方法包含以下步骤(a)将生物分子固定在纳米颗粒上；(b)将纳米颗粒定位于细胞膜紧邻区域；(c)对纳米颗粒和细胞膜施加磁场；(d)并同时对纳米颗粒和细胞膜施加超声。纳米颗粒表面经过修饰以便于分子附着其上。反应位点的数量随反应位点间距不同而改变。另外，外加分子和纳米颗粒的联接可以是共价键、离子键或其他能将分子固定于纳米颗粒的键合方式。在一实例中，外加分子可以是基因材料如DNA或RNA、蛋白质、或任何其他生物分子。纳米颗粒可包扩纳米管，如碳纳米管，或单壁碳纳米管。在一实例中，纳米颗粒可以是生物可降解或生物可相容的纳米材料，比如二氧化硅。这些纳米颗粒应对体内或体外细胞表现为低毒性或无毒性。在宏观尺度，磁场力用于控制分子载体向身体的特定部位移动的方向。在微观至纳米尺度，此磁力能迫使分子载体穿过生物膜。如果有必要，分子载体能进一步在磁力作用下进入细胞核。薄膜可以是细胞壁或细胞内的细胞核壁，或其他生物膜如线粒体双层生物膜。此膜也可以是血脑屏障。因此，此方法也可将分子运送进入中枢神经系统。总之，通过此方法生物分子能被传递到特定目标。在一实例中，此发明包含的分子载体是具有磁性的纳米结构，并且其上有生物分子能附着的位点。结合位点的数量随位点间的距离不同而不同。另外，键合类型可以是共价键、离子键或其他能固定住外加分子的键合方式。磁性纳米颗粒可在磁场力作用下通过各种方式被操控。在一实例中，载体可用磁场力吸引下聚集到器官或体内组织的某一位置。在一方面，本发明包涵利用分子载体将分子传递到体内或体外细胞。在体外细胞转染时，靶向细胞可以是在固体或液体细胞培养液中。
为理解本发明的优势和特色，在此我们结合图表给出更详尽的说明。特定的例子， 我们会给出明确的细节，并且其结果会用附录中的图表阐明。任何例子只是此发明的单一实例，不可理解为对其适用范围的局限。在如下图表中图IA是一磁性单壁纳米管的示意图，图IB是一功能化的球形纳米颗粒的示意图。图2显示载体被推过细胞膜。箭头表示磁场方向。在此图中我们用碳纳米管来代表载体。图3显示用磁铁聚集纳米颗粒于身体的特定位置。此例中颗粒被聚集于患者左臂上部。图4A、4B、4C、和4D显示功能化单壁纳米管的形成过程。图5A和5B显示羧酸化的单壁纳米管的X射线和红外谱的图谱。图6A和6B是异硫氰酸荧光素标记的单壁碳纳米管的红外和紫外-可见光谱。纵坐标A显示吸收量。图7A为激光共聚焦显微图像显示的对照细胞。图7B为激光共焦显微图像，图中显示了异硫氰酸荧光素(FITC)标记在细胞质中的纳米颗粒。图7C和7D显示了乳腺癌细胞线(MCF-7对照细胞)和MCF细胞在被纳米颗粒捆绑绿色荧光蛋白质粒转染后的激光共聚焦显微照片。图8A显示了乳腺癌细胞(MCF-7细胞)被FITC标记后纳米颗粒的分布；图8B显示了乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)被FITC标记的磁性纳米颗粒在外磁场诱导后纳米颗粒的分布。图9为乳腺癌细胞(MCF-7细胞)摄入磁性纳米管，FITC标记的磁性纳米管百分比在不同时间点的比较。图lOAUOBjP IOC显示了对照组，FITC标记的磁性纳米管进入造血干细胞3小时后和6小时后的照片。图11为乳腺癌细胞(MCF-7细胞)经过FITC标记的纳米颗粒摄入与对照细胞的对比。图12A显示不含绿色荧光蛋白质粒，无微泡(Definity)，无超声处理的阴性对照样品的流式细胞仪结果。流式细胞仪结果标记为M1，门控百分比为0.16。我们观察到极高的细胞存活率。图12B显示对照样品的流式细胞仪结果，其中包含2微克绿色荧光蛋白质粒，无微泡(Definity)，脂质体转染试剂为PEI，无超声处理。流式细胞仪结果标记为M1，门控百分比为33. 12%。观察到极低的细胞存活率。图13显示了超声处理过样品的流式细胞仪结果，这里超声强度为0. 5W/cm2，脉冲超声工作周期为20%，时间为60秒QOO微秒超声开启，800微秒超声关闭)。在实验中所使用的DNA浓度也不同。图13A，DNA质粒浓度是2μ g/mL，标记为M1，门控百分比为16. 20。 图13B，DNA质粒浓度是15 μ g/mL，标记为Ml，门控百分比为26. 93。图13C，DNA质粒浓度是30μ g/mL，标记为M1，门控百分比为32. 51。在所有的情形下都观察到了高数量的细胞存活。图14显示了超声处理过样品的流式细胞仪结果，实验中使用超声的强度为0. 3W/ cm2,超声刺激60秒，工作周期为100%。DNA质粒浓度是30 μ g/mL。流式细胞仪结果标记为M1，门控百分比为14. 67。观察到细胞存活率降低。图15显示了超声处理过的样品的流式细胞仪结果，实验中使用超声的强度为 0. 5W/cm2，超声刺激60秒，工作周期为100%。DNA质粒浓度是30 μ g/mL。流式细胞仪结果标记为M1，门控百分比为32. 12。观察到细胞存活率较低。图16显示一个生物相容的硅纳米管的图片。图17显示了硅纳米管(Si-NT)经过管末羧酸化后的红外光谱。图18显示了用绿色荧光蛋白质粒(Si-NT-GFP plasmid)标记的硅纳米管转染后人类宫颈癌HeLa细胞，以及对照细胞的照片。图19显示经过48小时和72小时细胞培养，硅纳米管对细胞基本没毒性。
具体实施例方式本发明包含用一分子运载工具将生物分子或其他感兴趣的分子传递进入细胞的方法，运载工具是用磁场驱动并带有至少一个生物分子。在外加磁场力的帮助下此分子载体可通过细胞壁。“生物分子”是指那些具有生物功能并能影响生物系统的行为或性质的一些生物学分子。“磁性颗粒”是指任何纳米尺度的颗粒(其一维尺度小于100纳米)，其运动受外磁场影响。“纳米尺度”是指长度范围，用于测量从0. 1纳米至1000纳米的物体，这里1纳米为10-9米。“转染”是指将外源基因物质引入细胞的过程。本发明是有关于用磁性颗粒传递生物分子和其他感兴趣的分子穿过细胞膜。在本发明的一个实例中，磁性颗粒为一金属核被例如碳的材料所包裹如图IB所示。这些纳米颗粒实现其功能化随后标记上生物分子。在本发明的一个实例中，磁性颗粒为碳纳米管，如单壁碳纳米管嵌入磁性金属原子(图1A)。在一实例中，磁性金属原子包含镍，铁或钴。单壁碳纳米管已为众所周知。它可以通过适当的技术，如化学气相沉积的方法，来合成。这些碳纳米管可在镍或钇或镍钇为催化剂为种子的基础上从表面上生长出来。在一实例中，镍和/或钇至少被包入碳纳米管的顶端。在一实例中，合适的单壁纳米管的直径在 1.2到1.5纳米之间，长度在2至5微米间。单壁纳米管可有不同手性(座椅式纳米管或旋转式纳米管)。在一实例中所用的单壁纳米管为座椅式手性为(5，5)纳米管。磁性纳米颗粒或碳纳米管表面经过修饰后可通过功能团与生物分子联接。这些功能团可作为结合位点用于将生物分子固定在纳米颗粒或碳纳米管上。另外，功能化至关重要，因为许多纳米颗粒或碳纳米管，特别是单壁纳米管，是不溶于水的。功能化能增加它们的水溶性。在一实例中，如示意图4A和4B所示，功能化是通过碳纳米管表面化学改性来实现。在一个例子中，磁性碳纳米管的表面被管末羧酸化而羧酸并与亚硫酰二氯反应生成酸性氯化物。此酸性氯化物与tert-butyl-12-aminododecylcarbamate，or tert-butyl (2-aminoethyl) carbamate耦合，随后Boc官能团脱保护以生成胺衍生物。在一替代实例中，如图4C所示，胺衍生物纳米管通过酸性氯化物纳米管与 2' -(ethylenedioxy)bis (ethylamine)反应来生成。在进一步替代实例中，如图4D所示， 胺衍生物可用ethane_l，2 diamine合成。在一个例子中，胺衍生物与异硫氰酸荧光素(FITC)反应生成FITC衍生的磁性碳纳米管。这些生物分子标记的磁性碳纳米管随后被置于磁场和细胞培养基中，如下面所述。生物分子如DNA或RNA可附于纳米颗粒或碳纳米管表面的羧基官能团上。在一例子中，DNA质粒体载体和羧基化的单壁碳纳米管连接，这种连接是通过l-ethyl-3-(3-dime thylaminopropyl)earbodiimide(EDC)在 2-[N_morpholino]ethane sulfonic acid (MES) 或磷酸溶液(PH值为4. 5)作用下的DNA上的氨基官能团和纳米管上的羧基官能团的氨基化结合。DNA或RNA也可通过用静电作用捆绑在纳米颗粒表面的上。纳米颗粒可包含二氧化硅或其他可在细胞中生物降解或生物相容的材料，比如 (但不局限于)纳米纤维素或纤维素纳米晶体。这里“可生物降解”是指可在活体作用下分解为无害产物的物质。而“生物相容”指无论是在体外或体内对生物无毒性或无害的物质。 在一实例中，碳纳米管被二氧化硅包裹，碳纳米管在随后的材料过程中被除去或烧尽，留下在碳纳米管模板上生长的硅纳米管。硅纳米管随后被用类似前述碳纳米管的技术功能化。一旦生物分子或其他感兴趣的分子被标记在磁性纳米颗粒上，磁纳米颗粒和将要转染的细胞放入细胞培养液中，然后在外磁场作用下，磁纳米颗粒在培养液中加速碰撞到细胞，必然有一部分磁纳米颗粒穿过细胞膜进入细胞，如图2所示。如果颗粒没有进入细胞，它将被重新加速以期进入另外细胞。在观察中发现，相当数量的细胞能在相对较短的时间内被转染。用于驱动分子载体的磁场可被调适，使得磁场力在一定方向上和强度上是固定或可调的。在一个实例中，根据需要，在不同阶段，磁场的磁力可以被调节为可变的或固定的。 在一实例中，磁性颗粒在不断改变方向和力度的磁力作用下以复杂的路径移动。在另一实例中，载体以变化的速度和加速度在复杂的路径上移动。在一实例中，被转染过程中，通过施加超声，比如低强度脉冲超声(LIPUS)，于细胞培养液，使得细胞膜更易于穿透。此时运用的超声波频率比用来促进细胞生长的超声波频率更高。通常低强度脉冲超声的使用频率低于约1MHz，然而在本发明的一个实例中所使用的超声频率是在IMHz到2MHz之间，如1. 5MHz。超声可使用传统的或稍加改变的医用超声治疗仪。超声强度在每平方厘米0. 1瓦至1.0瓦之间变化。在一实例中，强度约在每平方厘米0.3瓦至0.5瓦之间。工作周期和重复脉冲也被调节使用，如工作周期在20%至100%之间而重复频率为100Hz。通常，高强度和长工作周期将增加穿过细胞膜的几率，但这是以牺牲细胞存活率为代价。我们可以用如下的公式计算超声总能量，超声能量不应超过会引起大量细胞损伤的能量。能量(J)=强度*工作周期*时间
在一实例中，总能量在优化情况下是18000毫焦耳。合适的超声成像对照试剂，如施贵宝公司的Def inity 可用于促进在细胞附近产生微孔以便细胞转染/转化。在一实例中，磁性纳米颗粒可用于体内传递，将治疗药剂如药物或生物分子送达体内特定位置。如图3所示磁铁可置于身体上特定部位以便聚集磁性纳米颗粒。随着磁性颗粒在体内的循环，它们会在磁铁所放置的部位聚集。因此，通过这种方法，纳米颗粒可将生物分子传递到特定目标区域。在一实例中，这种靶向传输的方法可将分子传送到通常难以进入的地方，比如穿过血脑屏障进入中枢神经系统。用磁场方式可将磁性纳米颗粒收集于血脑屏障的特定地点。然后，在外磁力作用下，迫使磁性纳米颗粒穿越血脑屏障。一旦纳米颗粒聚集在特定点或区域，纳米颗粒可在快速变换方向的外磁力作用下迫使颗粒进入细胞。快速变换方向的外磁力，会使颗粒快速前进和后退。这种方向的改变是使颗粒有根多机会和速度撞击细胞膜，最后至少有一部分颗粒会穿过细胞膜而进入细胞。 在一实例中，使用超声和磁力能增强颗粒在体内的这种运动。超声波发生仪将超声能量施于人体，广为人知的是超声在成像中的应用。此类仪器也可在稍加改变或不改变的情况下， 应用于靶向分子传递系统。正如在这里的描述和以后随之而来的申报，本发明可具体实现于其他特定形式， 而不偏离其结构、方法、或其它基本特性。正如附录的申报所指，所有被描述的例子在每一方面都被认为是就其所是的具体实例，因此，而不仅仅是之前的描述。任何在申报中的含义上的变化和等同的改变将都包含在其范围内。例子除非特别说明，以下例子意在描述所指的发明而不以任何形式限制所指的发明。
例一，FITC标记的碳单壁纳米管的合成(如图4B所示)含镍的碳纳米管用3当量的硝酸处理45小时以引入羧酸基团。处理完成后，溶液用去离子水稀释，然后用去离子水过滤和清洗数次。用酸处理的单壁纳米管被收集并在真空中晾干。IOOmg的单壁纳米管(SWNTs)在20mL的亚硫酸氯(含ImL的二甲基甲酰胺)中在 70oC搅拌M小时。离心后，棕色的上清液被倒出而剩下的固体用无水四氢呋喃清洗。离心以后，白色的上清液被倒出。剩下的固体在真空中晾干。混合的 SWNTs 禾Π Ig 的 tert-butyl-2-aminoethylcarbamate 在氩气氛 IOOoC 加热 100小时。冷却到室温后，多余的tert-butyl-2-aminoethylcarbamate用甲醇洗除。剩下的黑色固体在真空晾干。SffNTs 和 tert-butyl-2-aminoethylcarbamate 的耦合物悬浮在 MeOH 中并加入二氧杂环乙烷GN)的盐酸溶液，所得的混合物在室温下搅拌4小时。然后加入无水乙醚，收集所得的沉降物并在真空晾干。包含胺官能团的SWNTs悬浮在DMF和diisopropylethylamine的混合物中，加入 FITC在DMF的溶液中。所得混合物在暗室室温下搅拌4小时。然后加入无水乙醚，将沉淀物用离心方法收集并用乙醚和甲醇彻底清洗，在真空晾干就是FITC标记的单壁纳米管。在另一方法中，如图4C所示，从Aldrich公司购买的单壁纳米管氧化并在表面形成羧酸组。这些纳米管与亚硫酰二氯反应然后与2，-(ethylenedi0Xy)biS(ethylamine)反应生成胺终结的纳米管。胺随后与FITC反应使得FITC附着在单壁纳米管上。例2，红外、X射线和紫外-可见光谱特性为确认合成确实发生，所有图4C所示的中间产物和最终产物(SWNT-FITC)都用红外、X射线电子光谱和紫外-可见光谱表明特征，结果如图5和图6所示。红外数据清楚表明单壁纳米管成功的羧基组功能化了，而X射线电子光谱数据显示约6. 的碳原子在羧基组中出现。水中的异硫氰酸荧光素标记的单壁纳米管的紫外-可见光谱如图8所示，作为对比，水中的异硫氰酸荧光素的紫外-可见光谱也在图中显示。例3，荧光着色和成像FITC标记的单壁纳米管(CNT-FITC)用例一(图4B)的方式制备，用于乳腺癌细胞的标记和成像。材料 乳腺癌MCF-7细胞 细胞培养基-GIBCO 11330，DMEM/F12(1 1)20·福尔马林溶液(w/v) 16%, Methanol-free, Pierce, Cat#28906· Hoechst-Invitrogen Cat#33342· Rhodamine Phalloidin-Invitrogen Cat#R_415(Rhodamine Phalloidin 300U 溶解于 1. 5ml 的甲醇以形成 200units/ml 的浓度， 分装成IOul的小瓶，保存在零下20度)· PBS 缓冲液·封闭缓冲液-PBS/0. 5% BSA·提供磁场的磁铁 Cat#ND075 (www magnet4Iess. com) 2X1 的厚园片，级别 N42，稀土钕超强磁铁(拉力176磅)圆形覆盖纸片放入6孔或M孔盘，一个覆盖片盖一个孔而人乳腺癌细胞系 (MCF-7)细胞放入每个孔，细胞数lxl05/ml，在37oC隔夜孵化。每孔加入Boechst (Iul Hoechst inlml medium)并在37oC孵化1小时。Iml的异硫氰酸荧光素标记的单壁纳米管 (CNT-FITC)加入盘的每个孔(除了对照)并在37oC孵化1小时。每孔用PBS清洗3次。用镊子从一个孔中取出覆盖片，垂直放入装有IOml添加了 CNT-FITCdO 1， medium =CNT-FITC)的无血清培养基的烧杯，放在电炉(磁力搅拌器)上细胞面对进入的纳米管3分钟。搅拌速度设为1200rpm。覆盖片铺放在装有不含CNT-FITC的无血清培养基的碟中，将碟放在磁铁上7分钟。用PBS清洗覆盖片3次并放入另一个M孔盘，也放入未磁化处理的覆盖片。细胞用4%的甲醛溶液固定10分钟(或在4oC隔夜)。甲醛溶液然后被去除并将细胞用PBS洗3次。250ul的PBS/0. 2 TX-100加在孔中的覆盖片上并在室温保持10分钟。 再将细胞用 PBS 洗 3 次，并用 250ul 的 PBS/0. 5% BSAblocked20 分钟。2. 5ul 的 Rhodamine Phalloidin 力卩入 50ul 的 block buffer 然后 the mix pipetted on parafilm。覆盖片放入溶液30分钟。覆盖片然后放回盘中并用PBS洗3次。覆盖片然后放置在载玻片上并送去做共聚焦显微。样品用激光扫描共聚焦显微做成像，510 (Carl Zeiss) equipped with AxiovertlOOMmicroscopy(Zeiss),a F-Fluar 40X-1. 3 NA oil lens and 3 different lasers(Uv, Argon/2and HeNel)。如图7A和7B所示，由于hvitrogen双链DNA着色的结果，细胞核发出强烈荧光。 图8B中，FITC moities的荧光可在细胞质中清楚可见，说明CNT-FITC穿过了细胞膜进入细胞质。另一个例子中，SffNT与GFP质粒(pDRIVE5_0FP)用EDC和磷酸缓冲液的共价键形成共轭。SWNT-GFP质粒与MCF-7细胞孵化3分钟，然后用磁力搅拌器加磁场7分钟。细胞随后孵化M小时，用共聚焦显微确认GFP表达。图7D显示细胞中GFP荧光结果，与图7C 中的对照细胞做对比。例4，细胞摄入效率FITC标记的SWNT传递入贴壁MCF-7乳腺癌细胞。传递和恢复阶段后，荧光标记的SWNT被共聚焦显微探测到。结果如图8A和8B所示。数据清楚显示SWNT穿过了细胞膜进入细胞质甚至进入细胞核(如图8B中的绿点；有些用箭头指出)。摄入比在图9中约为 90%。除了将FITC传递进入贴壁细胞，如MCF-7细胞，我们也成功将FITC传递进入难以转染的细胞，或悬浮细胞，如造血干细胞(HSCs)。图10显示了传递结果。结果显示SWNT可将FITC传递进入HSCs。随着时间增加到3到6小时，更多的FITC进入了细胞(FITC显为绿色荧光)。对照样品显示没有内部荧光。例5，细胞存活率值得一提的是细胞存活率与对照相比没有因SWNT的摄入而受损害，如图11。经过FITC-SWNT摄入并用磁场作用的MCF-7细胞的存活率与对照细胞和仅摄入SWNT而无磁场作用的细胞作了对比。6小时后的摄入SWNT的细胞与对照相比其存活率基本相似。例6，超声传递(USD)-细胞制备和DNAUSD和转染用人体乳腺癌细胞(MCF-7)做评估。细胞保存在10%胎牛血清的IMDM 培养基中。实验前一天在培养烧瓶中加入0.25% Trypsin以收集细胞并等待分离。ImL 的细胞加入10mmx35mm的含有ImL培养基的碟中。细胞浓度约为1. ^cl05cells/mL。为确认转染，绿色荧光蛋白质粒(GFP plasmid-pDRIVE5-GFP)在超声之前15分钟加入培养基。 使用了不同的GFP浓度2 μ g/mL, 15 μ g/mL,及30 μ g/mL。超声对照试剂Definity，购于 Lantheus Medical，用于制造微孔。UCA体积为140 μ L0USD用Excel UltraMax治疗超声仪来进行，探头半径2. 5cm。用超声胶将超声探头连接在细胞培养皿底部。超声作用60秒，IMHz频率，不同的输出强度0. 3ff/cm2和0. 5W/ cm2。工作周期试验了 100%和20%的情况，用了固定的脉冲重复频率100Hz。做为对照，我们超声了无UCAs或GFP的空白样品，和有GFP但无UCAs的样品。并且，我们用PEI，一个脂质转染试剂，做了正对照。最后，我们制备了未被超声处理但含有Definity和GFP的样品。细胞数用流式细胞仪(FACS)来计数。USD后M小时，细胞用含0.25% trypsin 的FACS试管收集并用1小PBS洗一次。之后，细胞在200uL 1 %的多聚甲醛中重悬浮并用流式细胞仪测试。细胞存活率用血球仪计数来核定。用FACS试管收集细胞后，转移20 μ 1的每一样品进入小离心管并用0.4% trypan blue稀释。将10 μ 1放入血球仪数细胞。最后用如下公式计算细胞浓度所有格子中的细胞数/格子总数*稀释因子*lxl04。所有FACs测试结果如图12至15所示。我们的负对照样品没有产生任何转染，但维持很好的细胞存活率，正如FACs的结果。PEI脂质转染正对照显示了 GFP表达，和极度的细胞死亡。
权利要求
1.用含磁性纳米颗粒作为运载手段将分子运送穿过细胞膜的方法，此方法的步骤如下(a)固定分子于纳米颗粒之上；(b)将纳米颗粒定位于紧邻细胞膜的区域；(c)对纳米颗粒和细胞膜施加磁场；且(d)同时对纳米颗粒和细胞膜施加超声。
2.如权利要求1所述的方法，超声包括低强度脉冲超声。
3.如权利要求1所述的方法，纳米颗粒包括单壁碳纳米管。
4.如权利要求1所述的方法，纳米颗粒包含可生物降解或生物相容的材料。
5.如权利要求4所述的方法，纳米颗粒包括二氧化硅。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，分子包含DNA或RNA分子。
7.如权利要求1至5之中任一权利要求所述的方法，应用于体内，用磁力放在近邻特定区域的方法将运送载体集中在特定区域，并用磁场使之穿过细胞膜。
8.如权利要求7所述的方法，集中运送载体后作用在特定区域的磁场不断变换方向。
9.如权利要求7或8所述的方法，特定区域在血脑屏障之后或与之相联。
全文摘要
此发明包括磁性纳米颗粒的分子运送载体用于转染和将药物分子运送穿过细胞膜到达体内特定地点，使用磁场和超声的方法。
文档编号A61K48/00GK102272312SQ200980153661
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月9日 优先权日2008年11月7日
发明者卢卫兵, 邢赞 申请人:智能纳米公司