专利名称：用于产生树突细胞的方法
技术领域：
本发明涉及用于产生树突细胞的方法，所产生的树突细胞，及其用途。
背景技术：
树突细胞(DC)是存在于外周血、皮肤、淋巴器官和胸腺中的抗原呈递细胞(APC)， 在淋巴和非淋巴组织中有广泛的分布(见Steinman, R. M. Ann. Rev. Immunol. 9 :271 (1991)； Banchereau, J. B. and R. Μ. Steinman, Nature 392:245(1998))。树突细胞具有强烈的抗原呈递能力，并且在树突细胞表面上表达I类和II类分子的抗原肽，它们分别激活CD4和 ⑶8T细胞。通过这种激活，DC诱导针对特定抗原(例如致病微生物抗原、肿瘤相关抗原和移植抗原)的体内免疫应答。DC的强免疫诱导能力在针对多种肿瘤的免疫治疗(DC治疗)中是有用的。本发明人先前已经证明，被仙台病毒GeV)刺激的DC在小鼠体内具有强烈的抗肿瘤效果 (S.Shibata et al. , J. Immunol,177 :3564-3576(2006) ；Yoneyama, Y. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.，355 129-135 (2007))。抗肿瘤效果依赖于所接种的DC的数目。临床上，所接种的DC数目也被认为对治疗效果具有很大影响。然而，可能在很多情况下，由于患者的状况，只能收集到有限数目的DC前体细胞(DC祖先)。结果，治疗效果由于所得DC 数目的不足而可能变得不充分。因此，需要有方法能够高效地扩增有限的DC前体细胞。而且，为了实现抗癌效果，需要一种高效的方法用于制备具有高白介素12(IL-12)生产能力的 DC (Cancer Immunol Immunother.，(2005)54 :721-728)(日本特表 2008-515439 (相应于非日语国际公开的未经审查的日本国家阶段公布)。下面显示了与本发明相关的先前技术文献。先前技术文献非专利文献非专利文献 1 =Steinman, R. M.，Ann. Rev. Immunol.，(1991)9 :271-296非专利文献 2 =Banchereau, J. B. and R. Μ. Steinman, Nature, (1998) 392 :245-252非专利文献3 =Shibata, S. et al.，J. Immunol.，(2006) 177 :3564-35764 Yoneyama, Y. et al. ，Biochem. Biophys. Res. Commun. ， (2007) 355 129-135非专利文献 5 :Knutson, K. L. et al.，Cancer Immunol Immunother.，(2005)54 721-728专利文献专利文献1 日本特表2008-515439发明公开[本发明待解决的问题]本发明是鉴于上述情况而获得的。本发明的一个目标是提供高效的方法，用于生产具有产生高水平IL-12的能力的树突细胞。
[解决这些问题的方法]最近，本发明人开发出了一种用于扩增DC的高效方法。然而，他们发现，通过这种方法制备的DC的IL-12生产能力非常差。这提示了如下的可能性，即这种DC可能在体内不会产生充分的抗癌效果。本发明是本发明人经过专注研究的结果，涉及用于制备具有高 IL-12生产能力的DC的高效方法。本发明涉及用于产生树突细胞的方法，所产生的树突细胞，及其用途等。更具体地，本发明涉及[1] 一种用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在(a)和(b)的存在下培养树突细胞前体细胞(a)从(i)-(v)中选出的任意一种(i)粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)，(ii)白介素 3(IL-3)，(iii)血小板生成素(TPO)，(iv)Flt_3 配体(Flt_3L)，和 (v)Flt-3L、TP0 和 IL-6 ；禾口(b)干细胞因子(SCF) ’及(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞；[2] [1]中的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞因子(SCF)的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞；[3] [1]中的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在IL-3和SCF的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞；[4] [1]中的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在TPO和SCF的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞；[5] [1]中的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在Flt_3L和SCF的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞；[6] [1]中的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在Flt_3L，TPO, IL-6和SCF的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞；[7] [1]-[6]中任一项的方法，其中该树突细胞前体细胞是人类来源的细胞；和[8] [7]中的方法，其中该人类来源的细胞是脐带血来源的CD34+细胞。在上述每一个引用相同项目的条目中，两个或多个在这里描述的发明的任意组合也意图包含在所引用的上位条目内。本说明书意图包括在这里描述的发明的任何部分或其任意组合。本说明书还意图包括排除了这里描述的发明的任意部分及其任意组合的发明。 而且，当本说明书描述某些特定的优选实施方案时，本说明书不仅公开了这些实施方案，还公开了所公开的上位发明中除了这些实施方案之外的发明。[发明的效果]树突细胞具有强烈的诱导免疫的能力。因此，通过本发明方法获得的树突细胞可用作在用于癌症、感染等的免疫治疗中有用的树突细胞(DC)疫苗。例如，在肿瘤免疫治疗中，通过将树突细胞与肿瘤细胞裂解物混合、用肽冲激(pulse)树突细胞、将肿瘤抗原基因引入到树突细胞内等方法，使树突细胞呈递肿瘤抗原，并在针对肿瘤的DC疗法中使用。即使当从患者收集的DC数量较少时，通过使用本发明的方法也可以制备足以产生治疗效果的数目的DC。附图简述
图1中线图的纵轴刻度描述如下，其表示1. E+04, le4,或 1. 00E+04 1. 0 X IO4 (个细胞)1. E+05 或 1. 00E+05 1. 0 X IO5 (个细胞)1. E+06 或 1. 00E+06 1. 0 X IO6 (个细胞)1. E+07 或 1. 00E+07 1. OXlO7 (个细胞)1. E+08 或 1. 00E+08 1. 0 X IO8 (个细胞)
1. E+09 或 1. 00E+09 1. 0 X IO9 (个细胞)1. E+10 或 1. 00E+10 1. OX IO10(个细胞)1. E+11 或 1. 00E+11 1. OX IO11 (个细胞)将人脐带血来源的CD34+细胞在含有特定细胞因子的培养基中培养。图1用曲线图显示了该扩增和分化的结果。细节如下星号(*)指示第观天的时间点。“GMSCF”:来自在GMSCF施用组培养条件下培养35天的CD34+细胞培养物的样品。“GMSCF- > GMIL-4” 来自在GMSCF施用组培养条件下培养28天，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养7天的⑶34+细胞培养物的样品。“IL-3- > GMIL-4” 来自在IL-3施用组培养条件下培养28 天，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养7天的⑶34+细胞培养物的样品。“SCFIL-3- > GMIL-4” 来自在IL-3SCF施用组培养条件下培养28天，随后在GMIL-4施加组培养条件下培养7天的CD34+细胞培养物的样品。“TP0/SCF- > GMIL-4” 来自在TPOSCF施用组培养条件下培养观天，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养7天的CD34+细胞培养物的样品。 "Flt3-L/SCF- > GMIL-4” 来自在FS施用组培养条件下培养28天，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养7天的⑶34+细胞培养物的样品。“FST6- > GMIL-4”:来自在FST6施用组培养条件下培养观天，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养7天的CD34+细胞培养物的样品。图2的照片显示了当“⑶34+细胞在GMSCF施用组培养条件下培养28天，随后在 GMIL-4施用组条件下培养7天”时，树突存在与否的评估结果。在该图中，“iDC处理”是指经过iDC处理后的细胞的照片，而“0K432处理”是指经过0K432处理后的细胞的照片。在 "0K432处理”后，树突细胞显示树突。在该图的照片中，在0K432处理组中观察到了树突， 而在iDC处理组中则没有观察到。因此，“在GMSCF施用组培养条件下培养28天，随后在 GMIL-4施用组条件下培养7天的⑶34+细胞”被认为是树突细胞。图3 (A)的线图显示了对在含有特定细胞因子的培养基中培养35天的人脐带血来源CD34+细胞产生的细胞因子(IL-12)的定量结果。纵轴的单位是“pg/ml/48h”(lX106个细胞在Iml培养基中培养)。使用直径3. 5cm的皿培养细胞。IL-12的产生量通过ELISA 加以确定。将细胞在含有本图中指示的特定细胞因子的培养基中培养35天。本图显示了在培养35天后用iDC处理的样品中的细胞(在本图中标示为“iDC处理组”)和在含有特定细胞因子的培养基中培养35天后用iDC处理的样品中的细胞(iDC处理后用0K432处理)(在本图中标示为“0K432处理组”)中产生的IL-12的量。确定用于活化树突细胞的 "0K432处理”("0K432处理组”)后的样品中产生的IL-12的量，并与“iDC处理组”进行比较。结果如图所示。本图所示样品(1)-(8)在下文中有详细的描述。括号中显示的数值对应于每个样品的纵轴的数值(四舍五入到两位小数)。(1)CD34+细胞在GMSCF施用组培养条件下培养5周后获得的样品(iDC处理组中为0. 02 ；0K432施用组中为5. 96)。(2)⑶34+ 细胞在IL-3施用组培养条件下培养4周，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养1周后获得的样品(iDC处理组中为0 ；0K432施用组中为21. 12)。( ⑶34+细胞在GMSCF施用组培养条件下培养4周，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养1周后获得的样品(iDC处理组中为0.42 ;01(432施用组中为210.55)。(4) CD34+细胞在IL-3SCF施用组培养条件下培养4 周，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养1周后获得的样品(iDC处理组中为0 ；0K432施用组中为71. 40)。(5)CD34+细胞在TPOSCF施用组培养条件下培养4周，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养1周后获得的样品(iDC处理组中为0 ；0K432施用组中为8891. 03)。 (6)⑶34+细胞在FS施用组培养条件下培养4周，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养1周后获得的样品(iDC处理组中为0. 22 ；0K432施用组中为5333. 57)。(7)CD34+细胞在FST6 施用组培养条件下培养4周，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养1周后获得的样品(iDC 处理组中为0 ；0K432施用组中为6631. 32)。(8)⑶14+细胞在GMIL-4施用组培养条件下培养1周后获得的样品(iDC处理组中为0. 55 ；0K432施用组中为观3. 76)。该培养样品已知是可以产生IL-12的树突细胞(特表2008-515439)，并在实验中用作对照。图3 (B)更详细地显示了图3 (A)所示一些样品的数据。与图3 (A) —样，纵轴指示 IL-12的产生量，纵轴的单位是“pg/le6细胞/ml/48h”。IL-12的产生量通过ELISA确定。 本图中样品(1)- )和⑶的细节与图3(A)中一样。图4的曲线图显示了当人类脐带血来源的CD34+细胞在下面的条件(1)-(3) 下培养时的扩增和分化结果。(1)在GMSCF施用组培养条件下培养(在本图中指示为 “GMSCF”)。(2)在0. IGMSCF施用组培养条件下培养(在本图中指示为“GMSCF0. 1”)。(3) 在0. 0IGMSCF施用组培养条件下培养(在本图中指示为“GMSCF0. 01”)。图5显示了在上面图4中用星号㈩指示的时间点处(即在培养第35天)在每种条件下培养的细胞中CDllc阳性细胞的测定结果(百分比)。本图中的缩写如下=GMSCF 在 GMSCF施用组培养条件下培养。GMSCF0. 1 在0. IGMSCF施用组培养条件下培养。GMSCF0. 01 在0. 0IGMSCF施用组培养条件下培养。图6的曲线图显示了当人类外周血CD14+前体(单核细胞)在含有特定细胞因子的培养基中培养时的扩增和分化结果。细节描述如下“GMSCF”:在GMSCF施用组培养条件下培养25天的单核细胞。“GMIL-4”:在GMIL-4施用组培养条件下培养的单核细胞。该方法是一种已知的培养方法(特表2008-5151439)。实施本发明的樽式本发明涉及用于产生树突细胞的方法，其包括在多种细胞因子存在下培养树突细胞前体细胞的步骤。更具体地，本发明涉及用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在干细胞因子(SCF)和从下面(i)-(v)中选出的细胞因子的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞。
(i)-(v)组如下(i)粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(ii)IL-3(iii)TPO(iv)Flt-3L(ν) Flt-3L, TPO,和 IL—6DC前体细胞可以通过上述步骤被高效地扩增和/或分化。而且，通过这些步骤可以高效地产生具有高IL-12生产能力的DC。这里，“在特定细胞因子的存在下”的意思是含有至少一种特定的细胞因子。除了特定的细胞因子之外，可以包含其它的细胞因子。优选地，特定细胞因子是排他性地含有的，例如没有任何其它细胞因子。培养时间没有限制，但是，优选地为3-5周，更优选地为3-4周，例如可以是15天或者更多，16天或者更多，18天或者更多，19天或者更多，20天或者更多，21天或者更多，22天或者更多，23天或者更多， 24天或者更多，25天或者更多，38天或者更少，35天或者更少，30天或者更少，四天或者更少，观天或者更少，27天或者更少，沈天或者更少，25天或者更少，M天或者更少，22天或者更少，21天或者更少，或者20天或者更少。这里，树突细胞(DC)是在成熟状态下具有树突形态，并具有通过呈递抗原激活T 细胞的能力的细胞。这里，树突细胞前体细胞是在合适细胞因子(G-CSF，GM-CSF, TNF-α， IL-4，IL-13，SCF(c-kit配体)，Flt-3配体，或其组合)的存在下分化成DC的细胞。优选地，细胞能够在4周或更短时间内，更优选地在20天或更短时间，更加优选地在18天或更短时间，再更优选地在16天或更短时间内，分化成树突细胞。这些细胞包括CD34+干细胞、 造血祖细胞、和骨髓单核细胞。这些细胞可以被制备成例如细胞级分(cell fraction)。细胞级分是通过分离(或分级分离)细胞获得的细胞群体。细胞级分可以是包含细胞和药学可接受载体的组合物。载体包括期望的活细胞在其中能够悬浮的溶液，例如生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)、培养基、和血清。树突细胞包括分布于机体各种组织和器官中的具有树突形态的骨髓来源细胞群， 分布于机体各种组织和器官中的用细胞因子体外分化产生的具有树突形态的细胞群，或者来自骨髓或血液干细胞和等价细胞的类似细胞群。具体地，树突细胞包括例如淋巴树突细胞(包括可诱导Th2或免疫耐受的细胞)、骨髓树突细胞(一般使用的树突细胞，包括未成熟和成熟树突细胞)、朗格汉斯细胞(在皮肤中作为重要抗原呈递细胞的树突细胞)、交错突细胞(interdigitating cell)(分布于淋巴结和脾脏T细胞区内，被认为发挥向T细胞呈递抗原的作用)、和滤泡树突细胞(B细胞的重要抗原呈递细胞；该细胞通过抗体受体或补体受体呈递表面上的抗原-抗体复合体或抗原-补体复合体向B细胞呈递抗原)。优选地，树突细胞高表达MHC I类和II类分子，更优选地表达⑶11c。来自从骨髓、脐带血或外周血收集的细胞的DC或DC前体细胞是本发明更优选使用的。DC前体细胞包括例如CD34 阳性细胞。DC所来源的物种没有特别限制，可以是哺乳动物，包括灵长动物，例如人和猴，啮齿动物例如小鼠和大鼠，以及家兔、牛和山羊。树突细胞还可以是具有树突形态的细胞，并且对于从下组选出的两个或多个表面标记呈阳性=CDllc, HLA-II类(HLA-DR，-DP，或-DQ)，CD40和CDla0本发明的树突细胞更优选地是HLA-II类+且⑶Ilc+细胞，甚至更优选地，是⑶la+、HLA-II类+、⑶11c+、对谱系标记(lineage marker)呈阴性(LirT)的细胞，即不表达T细胞标记(⑶3)，B细胞标记(⑶19， ⑶20)，NK细胞标记(⑶56)，中性粒细胞标记(⑶15)，和单核细胞标记(⑶14)。当细胞是骨髓树突细胞(骨髓DC)时，它们优选地还表达⑶lib。例如，CDllb+，⑶Ilc+细胞包含在本发明的DC内。当细胞是淋巴树突细胞(淋巴DC)时，它们还可以表达⑶8。此外，本发明的树突细胞同时包括成熟和未成熟的树突细胞。“未成熟树突细胞”是指，与成熟状态相比，T细胞激活能力显著降低的树突细胞。具体地，未成熟树突细胞的抗原呈递能力低于通过添加LPS(1 μ g/ml)并培养2天而诱导成熟的树突细胞的 1/2，优选地低于前者的1/4。抗原呈递能力可以用例如异基因T细胞激活能力(alio T cell-activating ability)加以量化(混合淋巴细胞测试将异基因T细胞和树突细胞以 T细胞树突细胞1 10的比例，或者优选地以不同的比例共培养；在终止培养前8小时添加3H-胸苷，并根据掺入到T细胞DNA内的3H-胸苷的量评估T细胞生长能力(见Gene Therapy 7 ；249-254(2000)) 0或者，可以通过测试用肽诱导特异细胞毒T细胞(CTL)的能力进行评估，其中向树突细胞添加某抗原的已知的I类限制性肽；将树突细胞与从收集该树突细胞相同的健康供体的外周血获得的T细胞共培养(在第3天或更晚时间，用25U/ml 或者优选地100U/ml IL-2)。T细胞优选地在21天内用树突细胞刺激3次，更优选地在14 天内用树突细胞刺激2次。将所得的效应物细胞与51Cr-标记的靶细胞(肽-限制性I类阳性肿瘤细胞)以 100 1-2.5 1(100 1,50 1,25 1,20 1,12. 5 1,10 1， 5 1，或2.5 1)的比例，优选10 1的比例共培养4小时；并且定量从靶细胞释放的 51Cr (见Arch Dermatol Res 292 =325-332 (2000)) 而且，未成熟的树突细胞优选地具有吞噬抗原的能力，更优选地显示可诱导用于T细胞激活的共刺激的受体的低表达(例如与如上所述通过LPS诱导的成熟DC相比显著地低)或阴性表达。另一方面，“成熟树突细胞” 是指如下的树突细胞，其与未成熟状态相比，具有显著强烈的用于T细胞激活等的抗原呈递能力。具体地，成熟树突细胞可具有通过添加LPS(1 μ g/ml)并培养2天诱导成熟的树突细胞的抗原呈递能力的一半或者更强，优选地与之相当或者更强的抗原呈递能力。而且，成熟的树突细胞优选地具有微弱或没有抗原吞噬能力，更优选地阳性表达可诱导用于T细胞激活的共刺激的受体。树突细胞的激活是指从未成熟向成熟树突细胞的转变；激活的树突细胞包括成熟的树突细胞和处于转变过程中的树突细胞，其中诱导共刺激信号的CD80和 ⑶86的表达被激活刺激物提高。成熟的人树突细胞是⑶40、⑶80、⑶86、和HLA-II类表达为阳性的细胞。未成熟的树突细胞可以根据例如选自CD80和CD86的标记与成熟树突细胞区别。未成熟的树突细胞对这些标记呈弱阳性，优选阴性，而成熟的树突细胞是阳性的。如上所述，未成熟的树突细胞一般具有高吞噬能力。当向树突细胞添加LPS(1 μ g/ ml)并培养2天时，它们被激活，并且其吞噬能力降低。吞噬能力可以通过测量树突细胞摄取小分子的量或发生摄取的细胞的比例加以测定。吞噬能力优选地通过被摄入到树突细胞内的小分子的量加以确定。例如，使用直径大约为Iym的有色珠子，可以测量被摄入到树突细胞内的球珠。通过减去4°C时的阳性背景进行定量。高吞噬能力是指该树突细胞摄取的小分子的量是与如上所述用LPS(1 μ g/ml)刺激2天的树突细胞摄取的小分子的量的4 倍或者更多，更优选地5倍或者更多，再优选地6倍或者更多的能力。或者，摄取小分子的细胞的比例是2倍或者更多，更优选地3倍或者更多。低吞噬能力是指，被该树突细胞摄取的小分子的量少于比用LPS (1 μ g/ml)刺激2天的树突细胞摄取的小分子的量的4倍，更优选地少于其2倍，更优选地少于其1. 5倍。或者，当作为摄取小分子的细胞的比例进行测量时，比例为小于2倍，更优选地小于1. 5倍。成熟树突细胞的鉴别由本领域的技术人员常规地进行，并且上述的各个标记和测量其表达的方法也是本领域技术人员众所周知的。例如，⑶Ilc是大约150kD(pl50，整联蛋白α链)的粘附糖蛋白。⑶11与⑶18结合形成⑶Ilc/⑶18复合体，其能够与纤维蛋白原结合，并被报道可发挥iC!3b和ICAM-I受体的功能。此外，已经有报道，⑶Ilc/⑶18能够发挥粘附分子的功能，与经过刺激的上皮上的受体结合(Knapp，W. et al.，eds.，1989， Leucocyte Typing IVWhite Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press,New York ；Barclay,N. A. et al.,eds. ,1993, The Leucocyte Antigen Facts Book, CDll Section, Academic Press Inc., San Diego, California, p. 124 ；Stacker, S. A.禾口 Τ. A. Springer, 1991，J. Immunol. 146 :648)。⑶la是大约49kD的多肽，与β 2微球蛋白结合。OTl在结构上与MHCI类抗原相似，并被认为在抗原呈递中发挥功能(Knapp, W. et al.，eds.，1989，Leucocyte Typing IV White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York ； Schlossman, S. et al. , eds. ,1995, Leucocyte Typing V :ffhite Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press,New York ；Hanau,D.et al. ,1990,J. Investigative Dermatol. 95 :503 ；Calabi, F. and A.Bradbury. ,1991, Tissue Antigens 37 :1)。CDllb也称作整联蛋白α M链，Mac-I, CR3，iC3bR(3型补体受体)，或Mol， 是分子量为大约165-170的I型跨膜糖蛋白。⑶1 Ib发挥补体(iC3b)、纤维蛋白原和凝血因子X受体的功能，并参与吞噬作用(Todd R. F. et al. J. Immunol.，126， 1435-1442(1981) ；Leong Α. S.Y. Appl. Immunohistochem. Surg. Pathol. ,120-128(1993)； Todd R. F. et al. Hybridoma,1,329-337(1982) ；Cobbold S. et al. Leucocyte Typing III, 788-803(1987) ；Keizer G. et al. Eur. J. Immunol. ,15,1142-1148. (1985) ；Laffon A. et al. J. Clin. Invest. ,88,546-552(1991) ；Acevedo A. et al. J. Invest. Dermatol. , 97, 659-666(1991)) ο⑶lie(整联蛋白αΧ亚基，或pl50白细胞表面抗原)是整联蛋白家族的一个分子，并且与其它白细胞整联蛋白(⑶11a，⑶11b，和⑶lid)相似，与整联蛋白β2亚基 (CD18)非共价结合。CDllc是分子量为145-150kDa的跨膜糖蛋白，并且是众所周知的树突细胞标记(Molica S. et al. Blood, 81，2466 (1993) ；Van der Vieren Μ. et al. Immunity, 3,683-690(1995) ；Hogg N. et al. Leucocyte Typing III，576-602 (1987))。⑶14是53_55kD的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的单链糖蛋白，在树突网状细胞和一些类型的朗格汉斯细胞中表达。⑶14被鉴定为是一种表面受体，与LPS和血清LPS-结合蛋白(LPB)的复合体具有高亲和性(McMichael, A. J. et al.，eds.，1987，Leucocyte Typing III White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York ；Knapp, W. et al. , eds. ,1989, Leucocyte Typing IV White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York ；Schlossman, S. et al. , eds.,1995, Leucocyte Typing VWhite Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York ；Wright,S.D.et al. ，1990, Science 249 :1434)。
⑶40是45_48kD的I型整合膜蛋白(I型整合膜糖蛋白)。抗-⑶40抗体经常用作细胞标记(Schlossman, S. et al. , eds. , 1995, Leucocyte Typing V :ffhite Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York ；Galy, A. H. M. ；and H. Spits,1992, J. Immunol. 149 :775 ；Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83 :4494 ；Itoh, H. et al.，1991，Cell 66 :233 ； Bare lay, N. A. et al.，1993，The Leucocyte Antigen Facts Book. , Academic Press)。⑶80是一个大约60kD的跨膜糖蛋白，是Ig超基因家族的一员。⑶80是T 细胞中表达的 CD^ 和 CD152(CTLA-4)的配体(Schlossman，S. et al.，eds.，1995， Leucocyte Typing V White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York ；Schwarts, R. H.，1992，Cell 71 :1065 ；Azuma, Μ. et al.，1993，J. Exp. Med. 177 :845 ；Koulova, L. et al.，1991，J. Exp. Med. 173 :759 ；Freeman, G. J. et al.，1998， J. Immunol. 161 :2708 ；Behrens, L. et al.,1998, J. Immunol. ,161(11) :5943 ；Guesdon, J.-L. et al. , 1979, J. Histochem. Cytochem. 27 :1131-1139)。⑶83是大约45kD的跨膜蛋白，是Ig超家族的一员。⑶83具有一个V型Ig的短细胞外域和一个C端胞质尾。⑶83主要在滤泡树突细胞、循环树突细胞、淋巴组织中的交错突树突细胞、体外产生的树突细胞和胸腺树突细胞中表达(Zhou，L-J. ,and Τ. F. Tedder, 1995, J. Immunol. 154. 3821 ；Zhou, L-J. et al. , 1992, J. Immunol. 149 :735 ；Summers,K. L. et al. , 1995, Clin Exp. Immunol. 100 :81 ；ffeissman, D. et al. , 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92 826 ；Hart, D. N. J.，1997，Blood 90 :3245)。CD86 (B70/B7-2)是大约75kD的细胞表面蛋白，其是⑶观和CTLA-4的第二配体， 在早期免疫应答中的T细胞共刺激中发挥重要作用(Azuma Μ. et al. , 1993, Nature 366 76 ；Nozawa Y. et al.，1993，J. Pathology 169 :309 ；Engle, P. et al. 1994，Blood 84 1402 ；Engel, P. et al. , CD86 Workshop Report. In Leukocyte Typing V. Schlossman, S.F. et al. eds. ,1994,Oxford University Press ；Yang,X.F. et al. ,1994,Upregulation of CD86 antigen on TPA stimulated U937 cells,1994, (abstract). American Society of Hematology, Nashville, TN ；Guesdon, J. -L. et al. , 1979, J. Histochem. Cytochem. 27 1131-1139)。CCR7也称作BLR-2，EBI-1，和CMKBR7，其是一个7次跨膜G蛋白偶联受体，并且是 CC 趋化因子，ΜΙΡ-3 β /Exodus 3/ELC/CCL19 和 6Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21 的受体(Sallusto, F. et al.，1999，Nature 401 :708-12 ；Lipp, M. et al.，2000，Curr. Top. Microbiol.Immunol. 251 :173-9 ；Birkenbach, Μ. et al. ，1993, J. Virol. 67 :2209-20 ； Schweickart, V. L. et al. ,1994, Genomics 23 :643-50 ；Burgstahler, R. et al. ,1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215 :737-43 ；Yoshida, R. et al. , 1997, J. Biol. Chem. 272 13803-9 ；Yoshida, R. et al.，1998，J. Biol. Chem. 273 :7118-22 ；Yoshida, R. et al.，1998， Int. Immunol. 10 :901-10 ；Kim, C. H. et al. ,1998, J.Immunol. 161 :2580-5 ；Yanagihara, S. et al.，1998，J. Immunol. 161 :3096-102)。DR、DP、和DQ作为HLA-II类存在，并可以用结合所有这些的抗体一并检出 (Pawelec, G. et al.,1985, Human Immunology 12 165 ；Ziegler, A. et al.,1986, Immunobiol. 171 :77)。HLA-DR是人类MHC II类抗原的一员，是由一个由α链(36kDa)和一个β亚基(27kDa)构成的跨膜糖蛋白。在上皮朗格汉斯细胞中，其与⑶Ia抗原共表达。 CDla在抗原呈递的细胞互作中发挥主要作用(Barclay, N. A. et al. ,1993, The Leucocyte Antigen Facts Book. p. 376. Academic Press)。人和非人哺乳动物的树突细胞可以用上述标志物基因和其同源基因的产物作为指标来指定。针对这些标志物的抗体可以从例如BD Biosciences (BD PharMingen)获得， 详细信息可以在该公司网址或其分销商网址获得。对于树突细胞标志物，另见Kiertscher等和Oehler等的参考文献(Kiertscher SM, Roth MD, Human CD14+leukocytes acquire the phenotype and function of antigen-presenting dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL—4，J. Leukoc. Biol.，1996，59 (2) :208-18 ；Oehler, Let al.，Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics, J. Exp. Med., 1998,187(7) :1019-28) 0关于流式细胞术，见Okmo等和Mites等的参考文献(Okano, S. et al.，Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther.，2003，10(16) :1381-91 ；Stites，D. et al.，Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dual immunofluorescence, Clin. Immunol. Immunopathol.，1986，38 :161-177)。每禾中标志物的表达可以用例如当用同种型对照抗体染色时产生以下的阳性率的荧光强度作为阈值来确定，其中等于或高于阈值的荧光视为阳性，低于阈值的荧光视为阴性。树突细胞或其前体细胞可以根据或者基于已知的方法加以制备。例如，细胞可以从血液(例如外周或脐带血)、骨髓、淋巴结、其它淋巴器官、脾脏和皮肤分离(Bishop et al.，Blood 83 :610-616,1994 ；Bontkes, H. J. et al. (2002)J.Leukoc. Biol. 72，321—329 ； Katsuaki, S. et al. (1998)CRYOB10L0GY 37,362-371 ；Ladan, K. et al. (2006)Stem Cells 24,2150-2157 ；Ueda，T. et al. (2000) J. Clin. Invest. 105 :1013-1021)。本发明内容中使用的树突细胞优选地从血液或骨髓获得。或者，本发明使用的树突细胞可以是皮肤朗格汉斯细胞、输入淋巴细管(afferent lymphatics)的隐蔽细胞(veiled cell)、滤泡树突细胞、脾树突细胞和淋巴器官的交错突细胞。本发明使用的树突细胞包括从下组选出的树突细胞 CD34+-来源的树突细胞、骨髓来源的树突细胞、单核细胞来源的树突细胞、脾细胞来源的树突细胞、皮肤来源的树突细胞、滤泡树突细胞、和生发中心树突细胞。特别地，优选的DC前体细胞是造血干细胞、造血祖细胞等，从骨髓、脐带血或外周血获得。造血干细胞或造血祖细胞可以通过用商业可得的试剂盒等进行负选择，或通过用CD34+等进行阳性选择加以获得(见美国专利申请No. 08/539，142)。例如，已知的细胞分离方法包括通过磁珠用表面抗原分离、荧光标记分选、生物素-亲和素结合载体等(Berenson et al.，J. Immunol. Meth.， 91 11,1986 ；WO 93/08268)。当从包括DC或DC前体细胞和其它细胞的组合物中选择(或富集)DC或DC前体细胞时，优选地进行所谓的负选择，将非DC或DC前体细胞的细胞除去。通过负选择过程， DC-粒细胞前体(J.Exp. Med.，1998，187 :1019-1028 ；Blood, 1996,87 :4520-4530)被保留而不被除去，因此认为，不仅从粘附性的CD14+细胞分化的DC，而且从前体分化的DC可被一并回收。这预期可以减少在例如将载体引入到DC中时发生的细胞毒性。例如，通过使用特异抗体除去T细胞、NK细胞、B细胞等，可以富集DC。具体地，例如，优选地获得选自⑶2，⑶3，⑶8，⑶19，⑶56，和⑶66b，或其任意组合的表面标志物表达低或者表达为阴性的细胞。更优选的细胞是这样的细胞，其中⑶2，⑶3，⑶8，⑶19，⑶56和 CD66b的表达均低或为阴性。因此，优选地用针对这些标志物的抗体除去表达这些标志物的细胞(Hsu et al. ,Nature Med. 2 :52 (1996))。负选择用多价抗体执行。或者，使用磁珠或类似物进行磁细胞分离(MACS)，也可以进行相似的选择。珠子优选地用于大规模细胞制备，例如通过血细胞分离收集单核细胞等。例如，在本发明内容中可以适当使用从机体获得的细胞溶液富集单核细胞，然后对其进行负选择而制备的DC前体细胞。用于分离树突细胞的具体方法在下列文献中有描述，例如Cameron et al., Science 257 :383(1992) ；Langhoff et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :7998(1991)； Chehimi et al. , J. Gen. Viroi. 74 :1277(1993) ；Cameron et al. , Clin. Exp. Immunol. 88 226(1992) ； Thomas et al. , J. Immunol. 150 :821 (1993)；禾口 Karhumaki et al. ,Clin. Exp. Immunol. 91 :482(1993)。通过流式细胞术分离树突细胞在例如下列文献中有描述=Thomas et al.，J. Immunol. 153 :4016(1994) ；Ferbas et al.，J. Immunol. 152 :4649(1994)；和 0' Doherty et al.，Immunology 82:487(1994)。此外,磁细胞分离在例如 Miltenyi et al. , Cytometry 11 :231-238(1990)中有描述。进一步，例如，人树突细胞可以用下列文献中所述的方法加以分离和扩增 Macatonia et al. , Immunol. 74 :399-406(1991) ；0' Doherty et al. , J.Exp. Med. 178 1067-1078(1993) ；Markowicz et al. , J.Clin. Invest. 85 :955-961(1990) ；Romani et al.，J. Exp. Med. 180 :83-93(1994) ；Sallusto et al.，J. Exp. Med. 179 :1109-1118(1994)； Berhard et al.，J. Exp. Med. 55 :1099-1104(1995)；等。而且，树突细胞可以通过 Van Tendeloo et al. ,Gene Ther. 5 :700-707 (1998)所述的方法从骨髓、脐带血、外周血等来源的CD34+细胞形成，或从外周血来源的单核细胞形成。DC前体细胞在含有一种或多种细胞因子的培养基中扩增。例如，在甚至只用IL-3 的情况下，DC前体细胞可以扩增大约10天。然而，只用IL-3见不到更长期的扩增。本发明人发现，通过在含有SCF和IL-3的培养基中培养DC前体细胞，可以高效地扩增具有分化成 DC的能力的细胞。因此，为了扩增2周或者更长时间，优选地组合使用IL-3和SCF。特别地，通过在含有下列4种类型细胞因子的培养基中培养DC前体细胞，可以大量获得具有强的分化成DC的能力的DC前体细胞FLT-3L、SCF、ILUPIL-6。本发明涉及用于产生DC的方法，其包括如下的培养基中扩增DC前体细胞的步骤含有IL-3和SCF但没有FIT-3L和 IL-6的培养基，含有FLT-3L、SCF和IL-3但没有IL-6的培养基，或者含有SCF、IL_3和IL-6 但没有FLT-3L的培养基。本发明还涉及产生DC的方法，其包括在含有FLT-3L、SCF、IL-3 和IL-6的培养基中扩增DC前体细胞的步骤，例如含有这些细胞因子但没有显著量的一种或多种选自下组的细胞因子(或其任意组合)的培养基G-CSF、GM-CSF、IL-4、和TNF-α。同时，在这里所述的在细胞因子组合的存在下进行的培养中，该组合可以额外地包含其它细胞因子(即在其它额外细胞因子的存在下进行培养)，或者可以不包含其它额外的细胞因子。或者，有可能包括或者不包含额外的在其它细胞因子存在下培养的步骤。在这里所述的培养中，在细胞因子组合的存在下，例如，有可能使用从下组选出的一种或多种的任意组合GM-CSF、SCF、IL-4、IL-3, TPO, Flt_3L、和IL_6。本说明书还公开了这样的情况，其中排除了从上组选出的一种或多种的任意组合。有可能包括或者不包括额外的在从上组选出的一种或多种细胞因子的任意组合的存在下进行培养的步骤。本说明书还公开了这样的情形，其中排除了在选自上组的一种或多种细胞因子的任意组合的存在下培养的步骤。例如，当说“使用GM-CSF和SCF”时，可以意指额外地包含“选自从上述的细胞因子组中排除GM-CSF和SCF，即选自由IL-4、IL-3、TP0、Flt-3L和IL-6构成的组中的一种或多种的任意组合”，或者可以意指“不包含从该组选出的一种或多种细胞因子的任意组合”。有可能包括或者不包括额外的在该一种或多种细胞因子的任意组合的存在下进行培养的步骤。例如，培养可以在不使用ΤΡ0，不使用Flt-3L，不使用IL-6，不使用TPO和Flt_3L，不使用TPO 和IL-6，不使用Flt-3L和IL-6，或者不使用Flt_3L、TP0和IL-6的条件下进行。这同样适用于细胞因子的其它组合。这些组合在这里均被教导。 在本发明的培养中，例如GM-CSF(例如人GM-CSF)可以以如下浓度使用100ng/ ml或更少，50ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. OOlng/ ml 或更少,0. 0005ng/ml 或更少,0. 000 lng/ml 或更少,0. 00005ng/ml 或更少,0. 0000 lng/ml 或更少，或者可以不使用；SCF(例如人SCF)可以以如下浓度使用50ng/ml或更少，IOng/ ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ ml 或更少，0. 0 lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00 lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用；IL-4(例如人IL-4)按照如下浓度使用:50ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml 或更少，0. 5ng/ml 或更少，0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少,0. 005ng/ml 或更少，0. 00lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml 或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用；IL_3(例如人IL-3)可以以如下浓度使用10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少， 0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. 0 lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00 lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少,0. 000lng/ml 或更少,0. 00005ng/ml 或更少,0. 0000lng/ml 或更少，或者可以不使用；TPO(例如人ΤΡ0)可以以如下浓度使用50ng/ml或更少，IOng/ ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用； Flt3-L (例如人Flt3-L)可以以如下浓度使用:100ng/ml或更少，50ng/ml或更少，IOng/ ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用； IL-6(例如人IL-6)可以以如下浓度使用25ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml 或更少，0. 5ng/ml 或更少，0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00 lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000 lng/ml 或更少， 0. 00005ng/ml或更少，0. 0000 lng/ml或更少，或者可以不使用；G-CSF (例如人G-CSF)可以以如下浓度使用100ng/ml或更少，50ng/ml或更少，25ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ml或更少，0. Olng/ ml 或更少,0. 005ng/ml 或更少,0. 00 lng/ml 或更少,0. 0005ng/ml 或更少,0. 000 lng/ml
13或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 00001ng/ml或更少，或者可以不使用；TNF-α (例如人 TNF- a )可以以如下浓度使用100ng/ml或更少，50ng/ml或更少，25ng/ml或更少，IOng/ ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用； c-kit配体(例如人c-kit配体)可以以如下浓度使用100ng/ml或更少，50ng/ml或更少， 25ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. Ing/ ml或更少，0. 05ng/ml或更少，0. 0 lng/ml或更少，0. 005ng/ml或更少，0. 00 lng/ml或更少， 0. 0005ng/ml 或更少,0. 000 lng/ml 或更少,0. 00005ng/ml 或更少,0. 0000 lng/ml 或更少,或者可以不使用；IL-13(例如人IL-13)可以以如下浓度使用100ng/ml或更少，50ng/ml或更少，25ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少， 0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. O lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00 lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少,0. 000 lng/ml 或更少,0. 00005ng/ml 或更少,0. 0000 lng/ml 或更少，或者可以不使用。这些可以按照任意组合使用。这些组合均在这里被教导。FLT-3L (Fms样酪氨酸激酶3配体)是Flt_3的配体，并促进造血前体细胞分化和增殖(Namikawa R. et al.，BLOOD 87 1881-1890(1996))。EP 0627487 A2 和 WO 94Λ839中描述的多肽组包含在本发明的Flt-3L内。人Flt-3L cDNA可以根据登录号ATCC 69382从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。SCF也称作c_kit配体、肥大细胞生长因子(MGF)或青灰因子(steel factor) (Zsebo et al.，Cell 63 :195-201(1990) ；Huan, Ε.Cell 63 :225-233 ；Williams, D.Ε. , Cell 63:167-174(1990) ；Toksoz. D et al, PNAS 89 :7350-7354(1992)) ο SCF 包括 EP 423，980 中描述的多肽。IL(白介素)-3是由活化的T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞产生的血细胞生成因子。本发明的IL-3包括在美国专利No. 5，108，910中描述的IL-3多肽。编码人IL-3蛋白的DNA序列可以通过登录号ATCC 67747获得。IL-6是作为B细胞分化诱导因子被发现的。 除了参与抗体产生系统之外，IL-6还具有多种生理学活性，例如在肝脏中诱导急性期蛋白的生物合成和基于与IL-3的协同作用促进造血干细胞增殖(Paul SR et al. ,Blood, 1991, 77 :1723-1733)。IL-4主要是由辅助T细胞产生的，对T细胞、B细胞和其它血细胞具有广泛的生理学活性(Mosley et al.，Cell 59 :335(1989) ；Idzerda et al.，J. Exp. Med. 171 861(1990) ；Galizzi et al.，Intl. Immunol. 2 :669 (1990))。GM-CSF 是作为刺激含有巨噬细胞或粒细胞的集落生长的因子被分离出来的(美国专利Nos. 5，108，910和5，229，496)。 GM-CSF是粒细胞与巨噬细胞的前体细胞生长和发育的必需因子，并刺激成粒细胞和成单核细胞，诱导它们分化。血小板生成素(TPO)是一种造血细胞因子，其具有通过特异作用于从造血干细胞产生巨核细胞的过程而提高巨核细胞产生的功能(日本专利特许3058353)。每种细胞因子的浓度可以被适当地调整；然而FLT-3L的浓度可以是例如5ng/ml 或更多、10ng/ml或更多、20ng/ml或更多、或者30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml 或更少、500ng/ml或更少、300ng/ml或更少、200ng/ml或更少、或者100ng/ml或更少、例如， 大约5-35ng/ml、优选地大约10_30ng/ml、更优选地大约15_25ng/ml、再优选地大约20ng/ ml。GM-CSF的浓度可以是例如0. 5ng/ml或更多、lng/ml或更多、5ng/ml或更多、10ng/ml或更多、20ng/ml或更多、或者30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml或更少、500ng/ ml或更少、300ng/ml或更少、200ng/ml或更少、或者100ng/ml或更少。SCF的浓度可以是例如0. 25ng/ml或更多、0. 5ng/ml或更多、lng/ml或更多、5ng/ml或更多、10ng/ml或更多、 20ng/ml或更多、或30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml或更少、500ng/ml或更少、 300ng/ml或更少、200ng/ml或更少、100ng/ml或更少、或者50ng/ml或更少。IL-4的浓度可以是例如0. 5ng/ml或更多、lng/ml或更多、5ng/ml或更多、10ng/ml或更多、20ng/ml或更多、或者30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml或更少、500ng/ml或更少、300ng/ ml或更少、200ng/ml或更少、100ng/ml或更少、或者50ng/ml或更少。IL-6、TPO和其它细胞因子的浓度可以是例如lng/ml或更多、2ng/ml或更多、5ng/ml或更多、lOng/ml或更多、 20ng/ml或更多、或者30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml或更少、500ng/ml或更少、300ng/ml或更少、200ng/ml或更少、100ng/ml或更少、50ng/ml或更少、25ng/ml或更少、 或者lOng/ml或更少。当使用无GM-CSF培养基例如FS36时，SCF，IL-3和IL-6的浓度为大约3_20ng/ ml，优选地大约5-15ng/ml，更优选地大约7-12ng/ml，再优选地大约lOng/ml，但不仅限于此。这些可以按照任意组合使用。这些组合在这里均被教导。例如，RPMI1640或IMDM可以用作培养基。培养基适当地补加5% -20%血清，优选地大约10%血清，优选为胎牛血清 (FBS)。DC前体细胞的培养可以从大约IX 105-5X IO5细胞/ml开始，例如从大约2. 5 X IO5 细胞/ml开始。优选地，细胞每3-4天传代。在传代时，优选地将细胞浓度调节到2X IO6 细胞/ml或者更低浓度。当组合使用GM-CSF和SCF培养灵长类DC前体细胞，例如人CD34+ 细胞或人CD14+细胞时，可以使用如下浓度的GM-CSF 大约l-500ng/ml (大约l-200ng/ ml或大约l-100ng/ml)，更优选地大约2_300ng/ml，例如大约5_200ng/ml，优选地大约 10-150ng/ml，更优选地大约20_120ng/ml，再优选地大约30_100ng/ml。同时，可以使用如下浓度的SCF 例如大约0. 5-500ng/ml (大约0. 5-100ng/ml或大约0. 5_50ng/ml)，更优选地大约l_300ng/ml，甚至更优选地大约2_200ng/ml，再更优选地大约5_100ng/ml，例如大约10_70ng/ml，更优选地例如大约20_60ng/ml，再更优选地大约25_50ng/ml。当组合使用IL-3和SCF培养灵长类DC前体细胞例如人⑶34+细胞时，可以以如下浓度使用IL-3，例如大约0. l-10ng/ml，优选地大约Ι-lOng/ml，更优选地大约10ng/ml。SCF 可以按照例如如下浓度使用大约0. 5-500ng/ml (大约0. 5-100ng/ml或大约0. 5_50ng/ ml)，更优选地大约l_300ng/ml，甚至更优选地大约2_200ng/ml，再更优选地大约5_100ng/ ml，例如大约10_70ng/ml，更优选地例如大约20_60ng/ml，更优选地大约25_50ng/ml。当组合使用TPO和SCF培养灵长类DC前体细胞例如人⑶34+细胞时，可以以如下浓度使用TP0，例如大约0. 5-50ng/ml，优选地大约5_50ng/ml，更优选地大约50ng/ml。SCF 可以按照如下的浓度使用，例如大约0. 5-500ng/ml (大约0. 5-100ng/ml或大约0. 5_50ng/ ml)，更优选地大约l_300ng/ml，甚至更优选地大约2_200ng/ml，在更优选地大约5_100ng/ ml，例如大约10_70ng/ml，更优选地例如大约20_60ng/ml，更优选地大约25_50ng/ml。当组合使用Flt_3L和SCF培养灵长类DC前体细胞例如人⑶34+细胞时，可以以如下浓度使用Flt-3L，例如大约Ι-lOOng/ml，优选地大约lO-lOOng/ml，更优选地大约 100ng/ml。SCF可以以如下浓度使用，例如大约0. 5_500ng/ml (大约0. 5-100ng/ml或大约0. 5-50ng/ml)，更优选地大约l_300ng/ml，甚至更优选地大约2_200ng/ml，再更优选地大约5-100ng/ml，例如大约10_70ng/ml，更优选地例如大约20_60ng/ml，更优选地大约 25-50ng/mlo当组合使用Flt-3L，SCF, TPOjP IL_6培养灵长类DC前体细胞例如人CD34+细胞时，可以以如下浓度使用Flt-3L，例如大约Ι-lOOng/ml，优选地大约lO-lOOng/ml，更优选地大约100ng/ml。SCF可以以如下浓度使用，例如大约0. 5-500ng/ml (大约0. 5-100ng/ ml或大约0. 5-50ng/ml)，更优选地大约l_300ng/ml，再更优选地大约2_200ng/ml，再更优选地大约5-100ng/ml，例如大约10_70ng/ml，更优选地例如大约20_60ng/ml，更优选地大约25-50ng/ml。TPO可以以如下浓度使用，例如大约0. 5_50ng/ml，优选地大约5_50ng/ml， 更优选地大约50ng/ml。IL-6可以以如下浓度使用，例如大约0. 25-25ng/ml，优选地大约 2. 5-25ng/ml，更优选地大约 25ng/ml。当组合使用GM-CSF和IL-4培养灵长类DC前体细胞例如人⑶34+细胞时，可以以如下浓度使用GM-CSF，例如大约大约l-500ng/ml (大约l_200ng/ml或l-100ng/ml)， 更优选地大约2-300ng/ml，例如大约5_200ng/ml，优选地大约10_150ng/ml，更优选地大约20-120ng/ml，更更优选地大约30-100ng/ml。IL-4可以以如下浓度使用，例如大约 0. 5-50ng/ml，优选地大约5_50ng/ml，更优选地大约50ng/ml。本发明人发现，通过将DC前体细胞扩增的时期调节到3-5周，可以显著增加随后分化成DC的效率。更长的培养时期可产生更多的细胞，但是分化成DC的效率降低。特别地，当DC前体细胞在FS36培养基中扩增5周时，分化成DC的效率显著降低。因此，如果使用无GM-CSF培养基，例如FS36，DC前体细胞培养的时期大约3-大约4周，优选地大约3周， 例如18-M天，更优选地20-22天；优选地避免使DC前体细胞在含有相同细胞因子组合的培养基中扩增更长的时间。在培养这些时间之后，将DC在如下所述的DC分化培养基中培养和分化。例如，当DC前体细胞在含有FLT-3L、SCF、IL-3和IL-6的培养基中培养时，在培养了上面指示的时期之后，将它们在除含有全部FLT-3L、SCF、IL-3和IL-6的培养基之外的培养基中培养。而且，本发明包括在GM-CSF和IL-4的存在下培养在含有一种或多种细胞因子的培养基中扩增的细胞的步骤。在GM-CSF和IL-4存在下的培养时间为大约3-14天，优选地 7天(例如5天或更长时间，优选地6天或更长时间，9天或更短时间，优选地8天或更短时间)。在优选实施方案中，本发明的方法能够产生具有高IL-12生产能力的树突细胞。 IL-12生产能力可以例如如下地确定。例如，通过本方法的第一步培养人脐带血来源的 CD34+细胞，具体地，在干细胞因子(SCF)和从由下面(i)-(v)构成的组中选出的细胞因子的存在下培养4周。补充有10% FBS的IMDM可以用作培养基。(i)GM-CSF, (ii)IL-3, (iii)TPO, (iv)Flt_3L，(ν)Flt_3L、TPO 和 IL-6然后，通过第二步培养基细胞，具体地，在GM-CSF和IL-4的存在下培养1周。接着，用0K432处理细胞，具体地，在补充有10% FBS并含有0K432 (0. 5KE/ml)的IMDM中培
2 (48h)(Chugai Pharmaceutical Co. ；Japan Standard Commodity Classification No. 874299)。然后，通过ELISA或类似方法定量在2天期间释放到培养基中的IL-12。通过上述0K432处理，本发明的方法能够产生下述量的IL-12，例如50或更多，优选地60或更多，70或更多，80或更多，90或更多，100或更多，150或更多，200或更多，250或更多，300或更多，400或更多，500或更多，1000或更多，2000或更多，3000或更多，4000或更多，5000或更多，6000或更多，7000或更多，或者8000或更多(单位在图3的图注中有描述)。(i)当在上述第一步中使用GM-CSF时，特别地，该方法可能能够产生下述量的IL-12， 例如50或更多，100或更多，优选地200或更多。(ii)当在上述第一步中使用IL-3时，该方法可能能够产生下述量的IL-12，例如20或更多，30或更多，40或更多，优选地50或更多。 (iii)当在上述第一步中使用TPO时，该方法能够产生下述量的IL-12，例如100或更多， 200或更多，500或更多，1000或更多，3000或更多，4000或更多，优选地5000或更多。(iv) 当在上述第一步中使用Flt-3L时，该方法可能能够产生下述量的IL-12，例如100或更多， 200或更多，500或更多，1000或更多，3000或更多，4000或更多，优选地5000或更多.(ν) 当在上述第一步中使用Flt-3L，TP0和IL-6时，该方法可能能够产生下述量的IL-12，例如 100或更多，200或更多，500或更多，1000或更多，3000或更多，4000或更多，优选地5000 或更多。灵长动物⑶34+细胞包括例如脐带血来源的⑶34+细胞，骨髓来源的⑶34+细胞， 和外周血来源的⑶34+细胞。有可能使用合适的期望培养基作为培养溶液。这些培养溶液包括例如 DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium), MEM (Minimum Essential Medium), RPMI-1640，X-VIV0 (Lonza)，和 IMDM(Iscove，s Modified Dulbecco's Medium)。IMDM 是最优选使用的。优选地，培养基适当地补充血清，例如1 % -20 % (ν/ν)，更优选地2 % -20 %， 甚至更优选地5% -15%，再更优选地5% -10% (例如大约10% )。血清优选地是牛来源血清，最优选地是胎牛血清(FCS)。培养温度没有限制，可以是例如32°C -3935°C _38°C， 或大约37°C。CO2也没有限制，可以是例如大约5% (4% -6% )0本发明提供了用于扩增树突细胞的组合物，用于制备树突细胞的组合物，用于产生树突细胞的组合物，用于扩增树突细胞的培养基，用于制备树突细胞的培养基，和用于产生树突细胞的培养基，所有这些均包含SCF和下面(i)-(v)组中任一个的细胞因子(i)粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(ii)IL-3(iii) TPO(iv)Flt-3L(v)Flt_3L、TP0 和 IL-6。在本发明中，用于扩增树突细胞的组合物、用于制备树突细胞的组合物、用于产生树突细胞的组合物、用于扩增树突细胞的培养基、用于制备树突细胞的培养基、和用于产生树突细胞的培养基，除了 SCF和从上述(i)-(v)组中任一个的细胞因子之外，可以包含 GM-CSF 和 IL-4。而且，组合物可以适当地包括无菌水、缓冲剂、盐等。培养基包括上述的培养溶液， 但是不仅限于此。培养基可以含有或者不含血清。而且，培养基可以含有或者不含抗生素。本发明还涉及SCF和下面(i)-(v)组中任一个的细胞因子在产生上述组合物或培养基中的用途(i)粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)(ii)IL-3
(iii)TPO(iv)Flt-3L(v)Flt_3L、TP0 和 IL-6。本发明还涉及SCF和上面(i)-(v)组中任一个的细胞因子，以及GM-CSF和IL_4 在产生上述组合物或培养基中的用途。本发明还涉及用于扩增树突细胞的试剂盒，用于制备树突细胞的试剂盒，和用于产生树突细胞的试剂盒，所有这些均包括上述(i)-(v)和SCF作为组分。所述试剂盒可以进一步包括培养溶液(例如不包含血清)或用于制备培养溶液的粉末(含有氨基酸、盐等，但是不含任何血清、抗生素等)。优选地，这些组合物、培养基和试剂盒意图用于扩增、 制备和产生灵长动物树突细胞，包括人树突细胞，更优选地，用于从灵长动物⑶34+细胞包括人CD34+细胞扩增、制备和产生具有高IL-12生产能力的树突细胞。优选地，它们不含有 TNF-α和/或IL-4。例如，在组合物和培养基中，当添加血清时，TNF-α和IL-4的浓度范围优选地不显著高于它们在血清中的浓度。例如，浓度优选地是血清中细胞因子浓度的3 倍、2倍、1倍或者低于血清(例如正常FCQ中浓度，优选地是一半或更低，更优选地三分之一或更低，或者五分之一或更低，具体地为50ng/ml或更低，优选地40，30，20，10，5，3，或 lng/ml或更低。当不添加血清时，优选地只包含GM-CSF和SCF作为细胞因子。根据本发明的方法，DC可以从⑶34+细胞扩增例如IO2倍，优选地0. 5 X IO3倍，更优选地1 X IO3倍，甚至更优选地0. 5 X IO4倍，再更优选地1 X IO4倍，再更优选地0. 5 X IO5 倍，甚至再更优选地ι χ IO5倍，进一步再更优选地0. 5 X IO6倍或更多。例如，通过1周培养，细胞可以以5倍，优选地6、7、8、9、10、11、12、或13倍或者更多的比率增加。扩增的细胞含有高纯度的DC(iDCs)。扩增细胞中⑶Ilc-阳性细胞的百分比(⑶Ilc+在总细胞中的比值)是例如30 %或更高，优选地40 %或更高，更优选地50 %或更高，60 %或更高，70 %或更高，75%或更高，80%或更高，或者85%或更高。而且，通过用LPS、Poly (I :C)、仙台病毒、 0K432等处理iDC可以获得成熟的DC。通过本发明方法获得的具有高IL-12生产能力的树突细胞可以用作DC疫苗，其可用于感染、癌症和其它可望从免疫诱导获得有益效果的感兴趣疾病的免疫治疗。例如，在肿瘤免疫疗法中，通过将树突细胞与肿瘤细胞裂解物混合、用肽冲激、将肿瘤抗原基因引入到树突细胞内等方法，可以使树突细胞呈递肿瘤抗原。所得到的树突细胞可以在针对肿瘤的 DC疗法中使用。例如，与肿瘤裂解物和肽冲激相比，将肿瘤抗原引入树突细胞内的方法可以预期延长肿瘤抗原在体内呈递的持续时间，并且还具有不受HLA限制的优势(在肽的情况下使用来自抗原的特定肽；然而，由于需要HLA结合，当HLA类型改变时，抗原中使用的肽区域也要改变)。例如，通过在GM-CSF和SCF存在下培养前体细胞并进一步再GM-CSF和IL_4存在下培养细胞来使通过本发明方法扩增的DC前体细胞分化成DC，然后通过在0K432、RNA病毒等存在下培养来活化DC。培养时间可以适当地进行调节，例如2-7天。例如，当于用于免疫刺激(例如肿瘤免疫)时，RNA病毒例如负链RNA病毒可用于基因转移，并且RNA病毒感染自身可以诱导树突细胞的活化。因此有可能省略引入后通过细胞因子处理等活化的步骤，这预期有助于保持细胞活力、降低成本，并进一步减少用于离体操作所需的时间。通过使用用RNA病毒载体引入了基因的树突细胞，能够在短期内高效而容易地离体诱导活化的T细胞，特别是T细胞转移疗法必需的肿瘤特异性细胞毒T细胞等(W0 2005/042737 ；WO 2006/001122)。DC能够与药学可接受的载体一起适当地配制成组合物。载体的实例包括能够用于悬浮活细胞的期望溶液，例如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBQ、培养液和血清。组合物可以包括要呈递到树突细胞上的抗原肽。而且，当DC被用作疫苗时，可以向疫苗组合物添加免疫刺激物，例如细胞因子、霍乱毒素、和沙门氏菌毒素，以增加免疫原性。而且，疫苗可以和佐剂组合，例如明矾、弗氏不完全佐剂、MF59(油乳剂)、MTP-PE(分枝杆菌细胞壁来源的胞壁酰三肽)，和QS-21 (来自皂皮树Quilaja saponaria)。可以通过将DC与细胞裂解物抗原混合、通过肽冲激、或通过将编码抗原基因载体引入到DC中，来在DC上呈递抗原。抗原包括与感染性微生物、病毒、寄生虫、病原体、癌症等相关的期望抗原。这些可以是结构或非结构蛋白。这些抗原(或其经过加工的肽)与树突细胞表面上的MHC分子结合，并被呈递在细胞表面上，诱发免疫应答。当用作疫苗时，抗原可以被应用于例如肿瘤、感染性疾病、和其它一般性疾病。为了治疗感染性疾病，可以对例如感染性微生物的抗原蛋白的表位进行分析，然后将其表达或通过树突细胞呈递。病原体来源的抗原包括例如如下甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、 δ型肝炎病毒、乳头瘤病毒抗原、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB 病毒、巨细胞病毒(CMV)、HIV、疟疾等的蛋白质，或其部分肽(G.L. Mandell et al. (Ed.) Hinman et al. , Principles and Practice of Infectious Diseases,3rd Ed., Churchill Livingstone Inc. , NY, pp. 2320-2333) 呈递这些抗原的 DC 可以预防性或治疗性用于感染性疾病。具体地可以列举流感的流感高毒力病毒株H5W的包膜、日本脑炎的日本脑炎病毒的包膜蛋白(Vaccine, vol. 17，No. 15-16，1869-1882 (1999))、AIDS 的 HIV 和 SIV gag 蛋白(J. Immunology(2000)vol. 164,4968-4978)、HIV 包膜蛋白、Nef 蛋白、和其它病毒蛋白。此外，可以列举，例如，霍乱的霍乱毒素B亚基(CTB) (Arakawa T, et al. , Nature Biotechnology(1998) 16(10) :934-8, Arakawa Τ, et al., Nature Biotechnology(1998) 16(3) :292-7)；狂犬病的狂犬病病毒糖蛋白(Lodmell DL et al.， 1998，Nature Medicine 4(8) :949-52)；和子宫颈癌的人6型乳头瘤病毒的衣壳蛋白Ll。 而且。有可能使用日本脑炎的JE-E抗原蛋白(日本专利申请特开昭64-74982(未经审查公开的日本专利申请)，特开平1力邪498)，人单纯疱疹病毒gD2蛋白(特开平5-25四65)， 丙型肝炎病毒来源的多肽(特开平5-192160)，伪狂犬病毒来源的多肽(特表平7-502173) 等。例如，可以对来自被这些病原微生物感染的患者的细胞进行分析，以鉴定被呈递在抗原呈递细胞(APC)上的抗原肽供使用。还优选地适当地选择HLA类型，鉴定与期望HLA类型相应的表位以便使用。为了特异促进针对肿瘤的免疫应答，在树突细胞上呈递一种或多种肿瘤抗原。肿瘤相关抗原可以通过例如制备粗肿瘤细胞提取物或者通过部分纯化抗原而获得((Cohen et al. , Cancer Res. 54 :1055(1994) ；Cohen et al. , Eur. J. Immunol. 24 :315(1994) ；Itoh et al.，J. Immunol. 153 :1202(1994))。所获得的肿瘤抗原可以被进一步纯化，或者可以被合成或作为重组肽表达。
当将纯化的树突细胞(暴露于)或用抗原冲激并使其摄取抗原时，抗原被DC加工并呈递在细胞表面(Germain, R.N.，Cell 76 :287(1994))。有多种已知的方法用于用抗原冲激树突细胞，并且本领域的技术人员可以根据待呈递的抗原常规地选择合适的方法。本发明提供了包括通过本发明方法产生并呈递抗原的DC的组合物，及其在免疫治疗中的用途。为了刺激免疫应答，本发明的组合物可以通过注射、连续输注、从植入体持续释放或其它合适的技术施用。典型地，包括树突细胞的组合物与生理可接受的载体、赋形剂或稀释剂一起施用。在所用剂量或浓度下对接受施用的个体不显示任何显著毒性的载体均可用作载体，并且包括例如生理盐水。肿瘤抗原可以是肿瘤细胞特异性抗原(即存在于肿瘤细胞内但不存在于非肿瘤细胞内)或者在肿瘤细胞内的表达水平高于相同类型抗原在非肿瘤细胞内的表达水平的抗原。通过施用树突细胞对免疫系统进行刺激。当CTL作为主要效应物时，可以使用期望的细胞内或细胞外肿瘤抗原。当通过使用树突细胞活化CD4T细胞，继而通过B细胞活化刺激抗体产生，使抗体作为效应物进行反应时，优选地使用被呈递在细胞表面上的抗原。例如，可以使用细胞表面受体或细胞粘附蛋白作为抗原。肿瘤抗原包括例如诱发卵巢癌等的 Muc-I或Muc-I样粘蛋白串联重复肽(美国专利No. 5，744，144)；导致子宫颈癌的人乳头瘤病毒的E6和E7蛋白；黑色素瘤抗原MART-I，MAGE-I, -2，-3，gplOO，和酪氨酸酶；前列腺癌抗原 PSA ；以及 CEA (Kim, C. et al.，Cancer Immunol. Immunother. 47(1998)90-96)和 Her2neu(HER2p63-71，p780_788 ；Eur. J. Immunol. 2000 ；30 :3338-3346)。根据本发明制备的树突细胞可用于有效的对癌症和感染性疾病的免疫治疗。由引入了肿瘤抗原基因或感染性疾病相关抗原的树突细胞或用这些树突细胞刺激的T细胞导致的免疫致敏是在患者体内诱发抗肿瘤或抗感染性疾病免疫的有效方法。本发明还涉及通过本发明方法获得的树突细胞在诱导免疫应答中的用途。具体地，本发明涉及通过本发明方法获得的树突细胞在免疫治疗中的用途，特别地，例如在肿瘤或感染性疾病的治疗中的用途。而且，本发明涉及通过本发明方法获得的树突细胞在产生免疫激活剂中的用途。具体地，本发明涉及通过本发明方法获得的树突细胞在产生免疫治疗剂特别是例如抗肿瘤剂 (肿瘤生长抑制剂)或感染性疾病的治疗剂中的用途。细胞还可以应用于一般性疾病。为了治疗糖尿病，例如，胰岛素片段的肽可以在I 型糖尿病患者或其动物模型中用作表位(Coon, B. et al.，J. Clin. Invest.，1999，104(2) 189-94)。DC组合物可以进一步包括可溶的细胞因子受体、细胞因子、或其它免疫调节分子 (Schrader，J. W. Mol. Immunol. 28 :295(1991))。这些细胞因子可以制备成与DC组合物分离的组合物，并且可以和DC同时、分别或顺次施用。此外，通过在树突细胞中表达细胞因子，细胞刺激免疫系统，从而提高针对癌症或感染性微生物的免疫应答。因此，引入了编码细胞因子的基因的树突细胞也可用于治疗癌症和其它预期细胞因子治疗有效的疾病。引入了携带编码免疫刺激性细胞因子的载体的树突细胞可用作有效的免疫诱导剂。例如，免疫刺激性细胞因子包括白介素(例如IL-Ici， IL-I β，IL-2, IL-3, IL-4，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-15，IL-18，IL-19， IL-20，IL-21，IL-23，和 IL-27)，干扰素(例如 IFN-α，IFN-^jP IFN-Y)，肿瘤坏死因子(TNF)，转化生长因子(TGF)-i3，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，GM-CSF，含有IL-3和GM-CSF的融合蛋白，胰岛素样生长因子(IGF)-I，IGF-2， Flt-3配体，Fas配体，c-kit配体，⑶40配体(⑶40L)，和其它免疫调节蛋白(例如趋化因子和共刺激分子)。这些可以单独或者组合使用。这些细胞因子的氨基酸序列是本领域技术人员众所周知的。可以参考对于 IL-4,例如 Arai et al. (1989)，J. Immunol. 142 (1) 274-282 ；对于 IL-6，例如 Yasukawa et al. (1987)，EMBO J.，6 (10) :2939-2945 ；对于 IL-12，例如 Wolf et al. (1991)， J. Immunol. 146(9) :3074-3081 ；对于 IFN-α，例如 Gren et al. (1984) J. Interferon Res.4(4) :609-617,禾口 Weismann et al. (1982)Princess Takamatsu Symp. 12 1—22 ；对于 TNF，例如 Pennica et al. (1984)Nature 312 :724-729 ；对于 G-CSF，例如 Hirano et al. (1986)Nature 324 :73-76 ；和对于 GM-CSF，例如 Cantrell et al. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 (18) :6250_62M。更具体地，编码GM-CSF的核酸序列包括含有登录号 NM_000758第84-461位序列的序列(相应于NP_000749第18-144位的氨基酸序列)。编码 IL-4的核酸序列包括含有登录号NM_000589第443-8 位序列的序列(相应于NP_000580 第25-153位的氨基酸序列)。可以设计出包含编码这些细胞因子的天然基因、或者由于遗传密码子的简并性而仍然编码功能细胞因子的突变体基因的载体，并引入树突细胞内。而且，基因可以被修饰表达被修饰形式的细胞因子。例如，具有前体和成熟形式两种形式的细胞因子(例如通过剪切其信号肽或通过限制性蛋白水解产生活性片段的细胞因子)，可以被遗传修饰从而表达其前体或成熟形式。也可以使用其它的修饰形式(例如细胞因子的活性片段与异源序列(例如异源信号肽)的融合蛋白)。树突细胞可用于体内刺激患者自身的T细胞，也可以用于体外刺激T细胞。可以通过离体免疫治疗来刺激患者的免疫系统，其中向患者施用被致敏的T细胞。例如，可以使 T细胞与呈递抗原的成熟树突细胞接触而制备用树突细胞刺激的T细胞。被树突细胞呈递的抗原可以是从载体表达的蛋白质(或其加工产物)，或者可以通过外源冲激进入树突细胞。被激活的τ细胞诱导CTL。本发明还涉及用通过本发明方法产生的树突细胞刺激免疫系统的方法。例如，对于患有感染、癌症等的患者，可以刺激其免疫系统来进行治疗。这些方法包括施用树突细胞或T细胞的步骤。具体地，该方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明产生的DC或用 DC刺激的T细胞的步骤。通过用期望的抗原肽冲激树突细胞从而使它们呈递该抗原，可以诱导针对期望抗原的免疫。当T细胞与树突细胞在体外接触时，优选地从患者收集T细胞， 并进行离体施用。包括DC或T细胞的组合物向受试者施用的剂量取决于疾病、患者体重、年龄、性别、症状、施用目的、施用组合物的形式、施用方法等而变化；然而，剂量可以由本领域的技术人员适当地加以确定。施用的途径可以适当地选择；例如，优选地施用到受影响的部位。 一般地，组合物可以通过肌肉内、腹膜内、皮下或静脉内注射进行输注，或者通过直接输注进入淋巴结。优选地，组合物通过皮下或腹膜内注射，或者直接输注进入淋巴结施用给患者。患者可以被施用的量通常为IO5-IO9个树突细胞，优选地IO6-IO8个细胞，更优选地大约IO7个细胞。施用的次数可以是一次，或者可以是在临床可接受的副作用的范围内施用多次。施用的对象没有特定限制，包括例如鸟类和哺乳动物(人和非人哺乳动物)，包括鸡、 鹌鹑、小鼠、大鼠、狗、猪、猫、牛、兔、绵羊、山羊、猴和人，以及其它脊椎动物。
树突细胞可以用作抗肿瘤剂。例如，通过向肿瘤部位内部施用呈递肿瘤抗原的树突细胞可以抑制肿瘤生长。肿瘤部位是指肿瘤及其周围区域(例如距离肿瘤5mm的区域内，优选地，距离肿瘤3mm的区域内)。通过在将树突细胞施用到肿瘤内之前使肿瘤抗原与树突细胞接触可以获得更强的效果。肿瘤抗原与树突细胞的接触可以通过使用如下的方法进行其中将肿瘤细胞裂解物与树突细胞混合的方法，其中用肿瘤抗原肽冲激树突细胞的方法，或者其中将肿瘤抗原肽基因引入到树突细胞内并使树突细胞表达该抗原肽的方法。当施用用树突细胞激活的T细胞时，例如，可以施用T细胞的剂量为，大约IO5-IO9 个细胞、优选地IO6-IO9个细胞、更优选地IO8-IO9个细胞每Im2体表面积，静脉内注射(见 Ridell et al.、1992，Science 257:238-241)。注射可以以期望的间隔重复(例如每月)。 在施用后，如果需要，可以监视接受者在T细胞注射期间和之后的任何副作用。在这种情况下，优选地，T细胞从与树突细胞所来源的患者相同的患者获得。或者，T细胞可以从患者获得，而用于刺激T细胞的树突细胞可以来自HLA相容的健康供体。相反，树突细胞可以从患者获得，而T细胞可以来自HLA相容的健康供体。作为根据本发明产生的疫苗的活性成分，含有树突细胞的细胞作为治疗疫苗被接种于人体。因此，可以使生长能力发生缺陷而增加安全性。例如，已知脐带血来源的单核细胞的生长能力在诱导分化后被极度降低。然而，为了将细胞作为更安全的细胞疫苗使用，可以通过加热、辐射、丝裂霉素C(MMC)处理等消除其生长能力，而不会损失疫苗功能。例如， 当使用X-射线辐射时，X-射线辐射的总辐射剂量可以是1000-3300Rad。对于丝裂霉素C处理，向树突细胞添加的丝裂霉素C的浓度可以是25-50 μ g/ml，并在37°C温育30-60分钟。 当用加热处理细胞时，例如，细胞可以被50°C -65°C热处理20分钟。
实施例下面，通过参考实施例对本发明进行具体地描述；然而，不应解释本发明仅限于此。这里引用的所有公开均被合并作为本说明书的一部分。下面，在实施例和这些实施例所涉及的附图中描述的特定施用组具有如下的组成。GMSCF 施用组补充 10 % FBS 的 IMDM，其含有重组人 GM-CSF (10ng/ml) (Peprotech)和重组人干细胞因子(SCF) (5ng/ml) (Peprotech)0. IGMSCF 施用组补充 10 % FBS 的 IMDM，其含有重组人 GM-CSF (100ng/ml) (Peprotech)和重组人干细胞因子(SCF) (50ng/ml) (Peprotech)0. OIGMSCF 施用组补充 10 % FBS 的 IMDM，其含有重组人 GM-CSF (lng/ml) (Peprotech)和重组人干细胞因子(SCF) (0. 5ng/ml) (Peprotech)GMIL-4 施用组补充 10 % FBS 的 IMDM,其含有重组人 GM-CSF (100ng/ml) (Peprotech)禾口重组人 IL-4 (50ng/ml) (ffako, Japan)IL-3 施用组IMDM 补充 10% FBS 的 IMDM，其含有 IL-3 (10ng/ml) (R&D Systems Inc.)IL-3SCF 施用组补充 10 % FBS 的 IMDM，其含有 IL-3 (10ng/ml) (R&DSystems Inc.)和重组人 SCF(50ng/ml) (Peprotech)TPOSCF施用组补充 10% FBS 的 IMDM，其含有重组人 TPO(50ng/ml) (ffako, Japan)和重组人 SCF(50ng/ml) (Peprotech)FS施用组补充10 % FBS的IMDM，其含有重组人Flt3_L (100ng/ml) (Richter-HELM BioLogics GmbH & Co. KG)和重组人 SCF (50ng/ml) (Peprotech)FST6 施用组补充 10 % FBS 的 IMDM，其含有重组人 Flt3_L (100ng/ml) (Richter-HELM BioLogics GmbH & Co. KG)，重组人 SCF(50ng/ml) (Peprotech)，重组人 TP0(50ng/ml) (ffako, Japan)，和重组人 IL-6Q5ng/ml)SCF 施用组补充 10% FBS 的 IMDM，其含有重组人 SCF(50ng/ml) (Peprotech)下面，在实施例相关附图中描述的(l)iDC处理和(2)0K432处理是指如下的处理(1) iDC处理在如下培养基中温育2天补充10% FBS 的 IMDM(2)0K432处理在如下培养基中温育2天补充10% FBS 的 IMDM，并含有 0Κ432 (0. 5KE/ml) (Chugai Pharmaceutical Co.； Japan Standard Commodity Classification No. 874299)除非另外指明，否则细胞在37°C和5% CO2下培养，并且所用培养基为补充10% FBS 的 IMDM。实施例1 用特定细胞因子从人来源的树突细胞前体细胞制备树突细胞通过在含有特定细胞因子的培养基中培养35天，扩增并分化人脐带血来源的 CD34+细胞(购自 Lonza)。图1的结果显示，通过如下方法，即在GMSCF施用组培养人脐带血来源的⑶34+细胞预定的时间，随后在GMIL-4施用组中培养(图1表示为“GMSCF- > GMIL-4”)，可以获得大量的细胞。细胞形态学观察显示，这些细胞在0K432处理(其是一种树突细胞活化处理) 后，具有树突(图幻。通过上述方法制备的大群细胞被预期是树突细胞。如图1所示，当与在GMSCF施用组培养条件下培养特定时期，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养的培养方法比较时，如下的方法可以产生大量的细胞，虽然其中一些方法产生的细胞数目少于其它方法在IL-3SCF施用组培养条件下培养特定时期，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养的方法；在TPOSCF施用组培养条件下培养特定时期，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养的方法；在FS施用组培养条件下培养特定时期，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养的方法；和在FST6施用组培养条件下培养特定时期，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养(图1 ；表示为“SCFIL-3- > GMIL-4”，"TP0/SCF- > GMIL-4”，"Flt3-L/SCF- > GMIL-4",和"FST6- > GMIL-4")。还进行了图1中没有显示的另一个实验，其中将上述人脐带血细胞来源的⑶34+ 细胞在SCF施用组培养条件下培养。在开始培养后第一周内观察细胞扩增(开始培养的细胞计数为1. OX IO5 (个细胞)，1周后为大约2. 25 X IO5 (个细胞)。然而，在第一周后，由于没有细胞扩增，细胞计数降低。实施例2 用特定细胞因子制备的树突细胞中IL-12的产生水平的确定对于用特定细胞因子从人脐带血细胞来源的⑶34+细胞，评估其产生IL-12的能力。在本实验中使用Beckton Dickinson公司(BD)的人炎症试剂盒(目录号N0. 551811) (图 3)。
0K432刺激增加了全部施用组中IL-12的生产能力。然而，图3㈧和⑶所示的结果证明，图3中(3)-(7)的样品与其它样品(除图3中的对照样品⑶之外)相比，具有更强的IL-12生产能力。实施例3 用特定细胞因子从人外周血CD14+前体(单核细胞)制备树突细胞人外周血CD14+前体细胞(单核细胞)通过在含有特定细胞因子的培养基中培养 28天进行扩增和分化。图6所示的结果提示，使用含有GM-CSF和SCF的培养的方法与使用含有GM-CSF 和IL-4的培养基的传统方法相比，更适合从单核细胞制备大量树突细胞。工业应用性本发明使得大量生产树突细胞成为可能。可以使所产生的DC呈递癌抗原以用作抗肿瘤DC疫苗。通过使用本发明的方法，有可能高效地产生大量DC，即使当从患者获得的 DC前体细胞的数目较少时也是如此。通过这些生产方法获得的DC具有强抗肿瘤效果，因此可以用作DC疫苗，可用于癌症、感染等的免疫治疗。本发明预期大大有助于针对癌症的免疫疗法。本发明并不仅限于上述实施例所述的方法。本发明还包括各种修改的实施方案， 它们能够由本领域技术人员容易地想到，而不背离附加权利要求中提供的描述。上述实施例具体地描述了用于制备大量具有IL-12生产能力的树突细胞的方法实例，其是基于“在GMSCF施用组培养条件下培养⑶34+细胞4周，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养1周”。但是，例如，下面描述的备选方法也是可能的。这是由于如下的事实。备选方法是指这样的方法，其中“CD34+细胞在特定培养基中培养预定时期，随后在GMIL-4施用组培养条件下培养1周”。这里，“特定培养基”是指“含有lng/ml或更高浓度GM-CSF和0. 5ng/m或更高浓度SCF的培养基”。“如下的事实”是指，即使将GM-CSF(lOOng/ml)和SCF(50ng/ml)的浓度降低到 1/10 (10ng/ml GM-CSF和5ng/ml SCF)，仍能够保持高增殖，尽管细胞计数略有减少，而且， 即使 GM-CSF (100ng/ml)和 SCF (50ng/ml)的浓度降低到 1/100 (lng/ml GM-CSF 和 0. 5ng/ml SCF)，也能够实现DC扩增(图4)。图5显示了培养35天的⑶Ilc阳性细胞的百分比。还有一个事实，即所有施用组均产生了高百分比的CDllc阳性细胞(图5)。
权利要求
1.一种用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在下述的存在下培养树突细胞前体细胞(a)从(i)-(v)中选出的任意一项(i)粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)， (ii)白介素 3(IL-3)，(iii)血小板生成素(TPO)，(iv)Flt-3 配体(Flt_3L)，和(v)Flt_3L、 TPO 和 IL-6 ；及(b)干细胞因子(SCF)；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞。
2.权利要求1的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在GM-CSF和SCF的存在下培养；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞。
3.权利要求1的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在IL-3和SCF的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞。
4.权利要求1的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在TPO和SCF的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞。
5.权利要求1的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在Flt-3L和SCF的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞。
6.权利要求1的用于产生树突细胞的方法，其包括如下步骤(1)在Flt-3L、TPO、IL-6和SCF的存在下培养树突细胞前体细胞；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培养在步骤(1)中培养的细胞。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中该树突细胞前体细胞是人类来源的细胞。
8.权利要求7的方法，其中该人类来源的细胞是脐带血来源的CD34+细胞。
全文摘要
公开了用于产生树突细胞(DC)的方法，其包括在多种细胞因子的存在下培养DC前体细胞。还提供用该方法产生的树突细胞。进一步公开了所述DC的用途。发现通过在多种细胞因子的存在下培养DC祖细胞，随后在GM-CSF和IL-4的存在下培养所得的培养产物大约1周，可以获得具有高IL-12生产能力的树突细胞。从少数DC前体细胞产生大量具有高IL-12生产能力的DC成为可能。因此，利用DC的抗肿瘤免疫治疗、感染性疾病治疗等所施用的DC数目能够容易地增加，并且可以预期提高DC疫苗的效果。
文档编号A61K39/00GK102307989SQ20098015429
公开日2012年1月4日 申请日期2009年11月13日 优先权日2008年11月14日
发明者上田泰次, 原田结, 米满吉和 申请人:上田泰次, 生物载体株式会社