通过抑制肿瘤抑制基因的天然反义转录物治疗肿瘤抑制基因相关性疾病的制作方法

专利名称：通过抑制肿瘤抑制基因的天然反义转录物治疗肿瘤抑制基因相关性疾病的制作方法
技术领域：
本发明的实施方案包括调节肿瘤抑制基因的表达和/或功能的寡核苷酸和相关分子。
背景技术：
DNA-RNA和RNA-RNA杂交对核酸功能的许多方面起重要作用，包括DNA复制、转录和翻译。杂交对于检测具体核酸或改变核酸表达的各种技术也很重要。反义核苷酸，例如， 通过杂交至靶RNA而破坏基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反义DNA还具有DNA-RNA杂交体作为核糖核酸酶H消化底物的特征，这种活性存在于大多数的细胞类型中。反义分子可以被运送进入细胞(例如寡脱氧核苷酸(ODNs))，或者他们可由内源基因表达为RNA分子。FDA最近批准了一种反义药物_VITRAVENE (用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，说明反义分子有治疗实用性。发明概述该概述部分概括介绍本发明，简要说明本发明的性质及实质。应理解的是概述部分不能用来解释或限制权利要求的范围或含义。在一个实施方案中，本发明提供通过使用反义寡核苷酸靶向天然反义转录物的任何区域从而抑制天然反义转录物的作用，导致相应的有义基因上调的方法。本文还考虑到抑制天然反义转录物可以通过siRNA、核酶和小分子来实现，这些也被认为属于本发明的范围内。一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织里肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括使所述细胞或组织与5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与一种多核苷酸的反向互补序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含以下核苷酸序列内的5-30个连续核苷酸SEQ ID NO 4的核苷酸1-1675、或者SEQ ID NO :5的核苷酸1-518、或者SEQ ID NO :6的核苷酸1-759、或者SEQ ID NO :6a的核苷酸1-25892、或者SEQ ID NO :6b的核苷酸1-279、或者SEQ ID NO 7的核苷酸1-1982、 或者SEQ ID NO 8的核苷酸1-789或者SEQ ID NO 9的核苷酸1-467(图5)，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列，例如SEQ ID N0:4、5、6、6a、6b、7、8或9的核苷酸以及它们的任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例为SEQ ID NO :10-30(图6-9)。
另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义序列的反向互补序列具有至少50%的序列同一性，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。另一个实施方案提供了在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%的序列同一性，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。在优选的实施方案中，组合物包含一种或多种结合至有义和/或反义肿瘤抑制基因多核苷酸的反义寡核苷酸。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种修饰的或置换的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种修饰的键。在再一个实施方案中，修饰的核苷酸包含修饰的碱基，其包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-0_甲基、氟代或碳、亚甲基或其它锁定核酸(LNA)分子。优选修饰的核苷酸是锁定核酸分子，包括a-L-LNA。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸通过皮下、肌内、静脉或腹膜内给予患者。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸以药学组合物给药。治疗方案包括给予患者至少一次反义化合物；但是，可修改该治疗方案以包括在一段时间内多次给药。该治疗可以结合一种或多种其它类型的疗法。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸包裹于脂质体中或结合于载体分子(例如胆固醇、TAT肽)。一个实施方案提供一种体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列的反向互补序列具有至少50%的序列同一性，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。一个实施方案提供一种体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少 50%的序列同一性，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。另一个实施方案提供了体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列的区域的反义寡核苷酸接触；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。在一个实施方案中，相对于对照，在体内或体外增加肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。
在另一个实施方案中，至少一种反义寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列。在一个实施方案中，至少一种反义寡核苷酸靶向包含肿瘤抑制基因多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，至少一种反义寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的重叠和 /或非重叠序列。在一个具体的实施方案中，至少一种反义寡核苷酸包含的一种或多种修饰选自 至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键合、至少一种修饰的核苷酸和它们的组
I=I O在一个相关的实施方案中，一种或多种修饰包含的至少一种修饰的糖部分选自 2’ -0-甲氧乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分和它们的组合。在另一个实施方案中，一种或多种修饰包含的至少一种修饰的核苷间键合选自 硫代磷酸酯、2' -0-甲氧乙基(M0E)、2'-氟代、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯(acetamidate)、羧甲酯和它们的组合。在一个实施方案中，一种或多种修饰包含的至少一种修饰的核苷酸选自肽核酸 (PNA)、锁定核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(FANA)、类似物、衍生物和它们的组合。在另一个实施方案中，至少一种寡核苷酸包含SEQ ID NO :10-30所示的至少一种寡核苷酸序列。本发明还提供一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种5-30个核苷酸长度的短干扰RNA(siRNA)寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA对肿瘤抑制基因多核苷酸的反义多核苷酸是特异性的，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少大约5个连续核酸的互补序列有至少50%的序列同一性；和在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和/或表达。在一个实施方案中，寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少大约5个连续核酸的互补序列有至少80%的序列同一性。另一个实施方案提供一种体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种对肿瘤抑制基因多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码和/或编码序列特异性的大约5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种反义寡核苷酸与SEQ ID N0:l、la、lb、2、 h、2b、3、3a、4、5、6、6a、6b、7、8和9中的至少一种核酸序列具有至少50%的序列同一性；和在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和/或表达。一个实施方案提供包含至少一种修饰的合成的修饰的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰选自至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷酸间键合、至少一种修饰的核苷酸和它们的组合；和进一步地其中所述寡核苷酸是反义化合物，其在体内或体外杂交至肿瘤抑制基因多核苷酸，并且与正常对照相比调节肿瘤抑制基因多核苷酸的表达和/或功能。
在一个实施方案中，至少一种修饰包含的核苷酸间键合选自硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和它们的组合。在另一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在一个相关的实施方案中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键合骨架。在一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自肽核酸、锁定核酸(LNA)、类似物、衍生物和它们的组合。在另一个实施方案中，寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包含的核苷酸间键合选自硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和它们的组合。在一个实施方案中，寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包含修饰的核苷酸选自肽核酸、锁定核酸(LNA)、类似物、衍生物和它们的组合。在另一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一种选自以下的修饰的糖部分 2’ -0-甲氧乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分和它们的组合。在另一个实施方案中，寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包含修饰的糖部分选自2’-0_甲氧乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’-0-烷基修饰的糖部分、 二环糖部分和它们的组合。在另一个实施方案中，寡核苷酸是长度至少大约5-30个核苷酸并且杂交至肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义链的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少大约5个连续核酸的互补序列有至少大约20%的序列同一性。在另一个实施方案中，寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少大约5个连续核酸的互补序列有至少大约80%的序列同一性。在另一个实施方案中，在体内或体外所述寡核苷酸与至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸杂交，并且与正常对照相比调节所述肿瘤抑制基因多核苷酸的表达和/或功能。在一个实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO 10_30所示的一种序列。本发明进一步提供包含对一种或多种肿瘤抑制基因多核苷酸特异性的一种或多种寡核苷酸的组合物，所述多核苷酸包含反义序列、互补序列、等位基因、同系物、同种型、 变体、衍生物、突变体、片段或它们的组合。在特定的实施方案中，其中寡核苷酸与SEQ ID NO :10-30所示的任一种核苷酸序列相比具有至少大约40%的序列同一性。在一个实施方案中，一种或多种寡核苷酸包含SEQ ID NO :10-30所示的任一种核苷酸序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO :10-30所示的寡核苷酸包含一种或多种修饰或
核苷酸置换。在另一个实施方案中，一种或多种修饰选自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、锁定核酸(LNA)分子和它们的组合。
本发明的一个实施方案提供一种预防或治疗与至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸和/或其至少一种编码产物相关的疾病的方法，所述方法包括给予患者治疗有效剂量的至少一种结合所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列的反义寡核苷酸，并且所述反义寡核苷酸调节所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸的表达；从而预防或治疗与所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸和/或其至少一种编码产物相关的疾病。在特定的实施方案中，与所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸相关的疾病选自 凋亡减少或增加相关性疾病、组织/细胞老化、癌症(包括表1所列的癌症)、自身免疫性疾病、包括AIDS在内的免疫缺陷病、衰老、神经变性疾病或障碍(例如阿尔茨海默氏病、运动失调性毛细血管扩张症、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、亨廷顿氏病等)、过度增生性疾病(例如瘢痕瘤)、类风湿性关节炎、冠心病、局部缺血性细胞死亡、淋巴增生性障碍、动脉粥样硬化、骨质疏松症、骨髓增生异常综合征、毒素诱发性疾病、病毒感染、伤口愈合、考登氏病(CD)、Lhermitte-Duclos 病(LDD)、Bannayan-Zonana 综合征(BZS，也称为 Bannayan-Riley-Ruvalcaba 综合征、Ruvalcaba-Myhre-Smith 综合征禾口 Riley-Smith 综合征)、移植、凋亡相关性疾病或障碍、代谢疾病或病症(例如糖尿病)、肾病或障碍、心肌梗塞 /心力衰竭、局部缺血、脓毒症、其中特别的造血炎症细胞过量的炎性疾病、增殖性疾病或者其中有治疗范例通过增加凋亡治疗炎症性疾病的疾病或障碍。一个实施方案提供一种鉴定和选择用于体内给药的至少一种寡核苷酸的方法，所述方法包括选择与疾病状态有关的目标多核苷酸；鉴定至少一种包含与选定目标多核苷酸互补或其反义方向的至少5个连续核苷酸的寡核苷酸；检测在严格杂交条件下反义寡核苷酸和所述目标多核苷酸的杂合体的热熔点；以及根据获得的信息选择用于体内给药的至少一种寡核苷酸。以下介绍本发明其它方面。附图简述图 1 图IA和IB为实时PCR结果图，其显示相对于对照，HepG2细胞用Lipofectamine 2000导入硫代磷酸寡核苷酸处理后，TP73mRNA的倍数变化。实时PCR结果显示，用针对 p73as设计的寡聚体处理IfepG2细胞48小时后，p73 mRNA的水平显著增加(

图1A)。用针对p73as的寡聚体处理的同一样品中，p73as RNA的水平显著减少(图1B)。图柱寡聚体1、 寡聚体2和寡聚体3分别对应于用SEQ ID NO 10、11和12处理的样品。图IC为实时PCR结果图，其显示相对于对照，HepG2细胞用Lipofectamine 2000 导入siRNA寡核苷酸处理后，TP73 mRNA的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，用针对P73反义Hs. 668503设计的其中两种寡聚体和针对p73反义Hs. 674463设计的其中一种寡聚体处理ifepG2细胞48小时后，p73 mRNA的水平显著增加。图柱p73Hs. 668503_1、 p73Hs. 668503_2、p73Hs. 674463_1 和 p73Hs. 674463_2 分别对应于用 SEQ ID NO 13、14、15 和16处理的样品。图ID为实时PCR结果图，其显示相对于对照，TM4细胞用Lipofectamine 2000导入硫代磷酸寡核苷酸处理后，TP73 mRNA的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，用针对小鼠P73反义Hs. 668503设计的其中一种寡聚体和针对小鼠p73反义WDR8设计的其中一种寡聚体处理小鼠TM4细胞48小时后，p73mRNA的水平显著增加。图柱p73小鼠Hs. 668503_1、p73 小鼠 Hs. 668503_10、p73 小鼠 Hs. 668503_14、p73 小鼠 Hs. 668503_15、p73 小鼠 WDr8_l、 p73小鼠WDr8_7、p73小鼠WDr8_8和p73小鼠WDr8_3分别对应于用SEQ ID NO 14-24处理的样品。图2为实时PCR结果图，其显示相对于对照，HUVEC细胞用Lipofectamine 2000导入硫代磷酸寡核苷酸处理后，p53mRNA的倍数变化。实时PCR结果显示，用针对p53as设计的所有siRNA处理HUVEC细胞48小时后，p53mRNA的水平显著增加(寡聚体IP = 0. 003， 寡聚体2P = 0. 001和寡聚体2P = 0. 03)。图柱寡聚体1、寡聚体2和寡聚体3分别对应于用SEQ ID NO 25,26和27处理的样品。图3为实时PCR结果图，其显示相对于对照，!fepG2细胞用Lipofectamine 2000导入硫代磷酸寡核苷酸处理后，PTEN mRNA的倍数变化。实时PCR结果显示，用针对PTEN反义Hs. 624903设计的其中一种寡聚体处理H印G2细胞48小时后，PTEN mRNA水平显著增加。 图柱 PTEN Hs. 607931_2、PTEN Hs. 624903_2、PTEN Hs. 624903_3 分别对应于用 SEQ ID NO 28、29和30处理的样品。图4显示SEQ ID NO 1 人肿瘤抑制基因(TP73)转录物变体1，mRNA。(NCBI注册号 NM_005427. 2)。SEQ ID NO :1a显示p73的基因组序列(外显子用大写字母表示，内含子用小写字母表示)。SEQ ID NO :1b显示p73的小鼠基因组序列(外显子用大写字母表示，内含子用小写字母表示)。SEQ ID NO :2 人肿瘤蛋白p53 (TP53)，转录物变体1，mRNA。(NCBI注册号 NM_000546. 4)SEQ ID NO :2a 显示p53的基因组序列(外显子用大写字母表示，内含子用小写字母表示)。SEQ ID NO :2b显示p53同种型D的基因组序列(NCBI注册号:NM_001126115)。
SEQ ID NO :3 人磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)，mRNA。(NCBI注册号 NM_000314)。SEQ ID NO :3a 显示PTEN的基因组序列(外显子用大写字母表示，内含子用小写字母表示)。图5显示SEQ ID NO 4 天然反义序列 p73as (NCBI 注册号:NM_017818. 2)SEQ ID NO :5 :p73 天然反义序列 Hs. 668503SEQ ID NO :6 :p73 天然反义序列 Hs. 674463SEQ ID NO :6a :p73小鼠天然反义序列SEQ ID NO :6b :p73小鼠天然反义序列Hs. 668503 (大写字母表示cDNA和基因组序列中匹配的碱基)SEQ ID NO 7 :p53 天然反义序列(NCBI 注册号:NM_018081. 2)SEQ ID NO :8 :PTEN 天然反义序列(Hs. 624903)SEQ ID NO :9 :PTEN 天然反义序列(Hs. 607931)
图6显示反义寡核苷酸SEQ ID NO: 10-16。‘r，代表RNA和*代表硫代磷酸酯键。图7显示反义寡核苷酸SEQ ID NO :17_对。*代表硫代磷酸酯键。图8显示针对天然反义序列NM_018081的p53反义寡核苷酸SEQ ID NO :25_27。图9显示针对天然反义序列Hs. 624903和Hs. 607931的PTEN反义寡核苷酸SEQ ID NO 28-30。‘r，代表 RNA。图10显示有义寡核苷酸SEQ ID NO :31_；34。‘r，代表RNA。有义寡核苷酸SEQ ID NO 31是反义寡核苷酸SEQ ID NO 13的反向互补序列，有义寡核苷酸SEQ ID NO 32是反义寡核苷酸SEQ ID NO 14的反向互补序列，有义寡核苷酸SEQ ID NO 33是反义寡核苷酸SEQ ID NO 15的反向互补序列；和有义寡核苷酸SEQ ID NO 34是反义寡核苷酸SEQ ID NO 16的反向互补序列。图 11 显示由 Applied Biosystems Taqman gene Expression Assay 设计的测定的 SEQ ID NO 35 和 36。SEQ ID No. :；35 是 p73 靴序列，外显子 2 (Hs00232088_ml)SEQ ID No. :36 是 p73as 靴序列，外显子 7 (Hs0021535_ml 和 Hs00892470_gl)图 12 显示由 Applied Biosystems Taqman gene Expression Assay 设计的测定的 SEQ ID NO 37 和 38。SEQ ID No. :37 是 p53 靶序列(Hs00153340_ml)SEQ ID No. :38 是 p53as (WDR79)靴序列(Hs00216360_ml)图13显示有义寡核苷酸SEQ ID NO 39-41。‘r，代表RNA。有义寡核苷酸SEQ ID NO 39是反义寡核苷酸SEQ ID NO 28的反向互补序列，有义寡核苷酸SEQ ID NO 40是反义寡核苷酸SEQ ID NO 29的反向互补序列；和有义寡核苷酸SEQ ID NO 41是反义寡核苷酸SEQ ID NO 30的反向互补序列。发明详述本发明的几个方面在下面参照实例应用进行例证性说明。应当理解的是所列的无数具体细节、关系和方法是为了完整理解本发明。但是，相关领域的普通技术人员容易认识到省去一个或多个具体细节或采用其它方法，本发明也可以实施。本发明不受动作或事件的顺序限制，因为某些动作可以不同的顺序发生和/或与其它动作或事件同时发生。另外， 实施本发明方法并不需要所有例证的动作或事件。本文公开的所有基因、基因名称和基因产物意指本文公开的组合物和方法适用的任何物种的对应同系物。因此，所述术语包括但不限于人和小鼠的基因和基因产物。应当理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，该公开仅仅是示例性的，不能解释为一种限制，除非文中明确表示一种限制。因此，例如本文公开的基因，其在一些实施方案中与哺乳动物核酸和氨基酸序列相关，还包括来自其它动物的同源和/或直向同源基因和基因产物，其它动物包括但不限于其它哺乳动物、鱼类、两栖类、爬行类和鸟类。在优选的实施方案中，基因或核酸序列都是人基因或核酸序列。定义本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并无意限制本发明。本文所用的单数形式"一种"、“所述”和"该"包括复数形式，除非文中另有明确说明。另外，在发明详述和/或权利要求书中使用了术语"包括"、“具有"、“有"或它们的变体，这类术语类似于术语"包含"。术语"大约"或"近似"意指本领域普通技术人员确定的具体值的允许误差范围，其部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如"大约"按照本领域的实践可意指1以内或超过1的标准差。或者，“大约"可意指给定值的至多20%的范围，优选至多10%，更优选至多5%，甚至更优选至多的范围。或者，具体对生物系统或方法而言，该术语可意指在数量级范围内，优选5倍值以内，更优选2倍值以内。在应用和权利要求中描述了具体值，除非另有说明，否则术语"大约"指在具体值的允许误差范围之内。本文所用的术语"mRNA"意指靶基因目前公知的mRNA转录物，以及任何可以阐明的其它转录物。‘‘反义寡核苷酸〃或〃反义化合物〃意指结合另一种RNA或DNA(靶RNA、DNA)的 RNA或DNA分子。例如，如果它是RNA寡核苷酸，它则以RNA-RNA相互作用的方式结合另一种 RNA 靴，并改变靴 RNA 的活性(Eguchi 等，(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反义寡核苷酸能上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义包括以治疗、诊断或其它观点来看有用的任何外源RNA或DNA分子。这种分子包括杂交至靶核酸的至少一部分的分子，例如反义RNA或DNA分子、干扰RNA (RNAi)、微小RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗编辑RNA和激动剂以及拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS) 寡核苷酸、可变剪接子、引物、探针和寡聚化合物。因此，这些化合物可以以单链、双链、部分单链或环形寡聚化合物的形式导入。在本发明上下文中，术语"寡核苷酸"指寡聚体或多聚体核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或它们的模拟物。术语"寡核苷酸"也包含天然的和/或修饰的单体或键链体的线性或环状寡聚体，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、它们的取代和α异头形式、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能以单体-单体相互
作用(例如碱基配对的华生-克里克(Watson-Crick)类型、碱基配对的Hodgsteen或反
Hodgsteen类型等)的规律模式特异性地结合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是"嵌合的"，也就是由不同的区域组成。在本发明中，“嵌合的 (型)“化合物是寡核苷酸，其包含两种或更多种化学区域，例如DNA区域、RNA区域、PNA区域等。每个化学区域由至少一个单体单位组成，在寡核苷酸化合物情况下单体单位为核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个区域，其中寡核苷酸被修饰以具有一种或多种所需的特征。所需的寡核苷酸特征包括但不限于例如增加对核酸酶降解的抗性、增加细胞摄取和 /或增加对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的不同区域可以因此具有不同的特征。本发明的嵌合寡核苷酸可以上述两种或更多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸类似物的混合结构制成。寡核苷酸可以以"套准对齐(register)“的方式连接的区域组成，即单体连续连接，例如天然DNA，或通过间隔区连接。间隔区构成区域之间的共价"桥"，并且优选其长度不超过大约100个碳原子。间隔区可以具有不同功能性，例如带正电荷或负电荷的，具有特殊核酸结合特征(嵌入剂、沟结合剂、毒素、荧光团等)，具有亲脂性，诱导特殊二级结构例如诱导α螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的"肿瘤抑制基因"包括所有的家族成员、突变体、等位基因、片段、种型(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等。
本文所用词语肿瘤蛋白73、p73、TP73在本申请中可交换使用。本文所用的词语TRP53、肿瘤抑制基因ρ53、ρ53、ρ53抗原NY-C0-13、细胞肿瘤抗原 p53.FLJ92943.LFSl和磷蛋白ρ53在本申请中可交换使用。本文所用的词语PTEN、10q23del、BZS、MGCl 1227、MHAM、MMACl、在多发性晚期癌症 1中的突变、磷酸酶和张力蛋白同系物、磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸3-磷酸酶和双重特异性蛋白磷酸酶PTEN、PTENl、TEPl在本申请中可交换使用。本文所用的术语"对...特异(性)的寡核苷酸"或"靶向...的寡核苷酸"指寡核苷酸具有这样的序列(i)能与靶基因的一部分形成稳定复合体，或(ii)能与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体。复合体和双链体的稳定性能通过理论计算和/ 或体外测定确定。测定杂交复合体和双链体稳定性的示例性测定在下面的实施例中介绍。本文所用的术语〃靶/目标核酸〃包括DNA、从这种DNA转录而来的RNA(包括 premRNA和mRNA)、和从这种RNA衍生而来的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰靶核酸的正常功能。这种通过化合物调节靶核酸的功能(化合物特异性地杂交至核酸)一般称为"反义"。待被干扰的DNA的功能包括，例如复制和转录。待被干扰的RNA的功能包括所有重要功能，例如RNA转移至蛋白翻译位点、从RNA翻译蛋白、剪接RNA产生一种或多种mRNA和由RNA参与或促进的催化活性。 这种干扰靶核酸功能的总体效果是调节编码产物或寡核苷酸的表达。RNA干扰"RNAi"由对它们的"靶"核酸序列具有序列特异性同源性的双链 RNA (dsRNA)分子介导(Caplen，N. J.等 Q001) Proc. Natl. Acad. ki. USA 98:9742-9747)。 在本发明的某些实施方案中，介导物是5-25个核苷酸的"小干扰"RNA双链体(siRNA)。 siRNA 来自被称为 Dicer 的 RNAase 酶加工 dsRNA (Bernstein，Ε.等 Q001) Nature 409 363-366)。siRNA双链体产物被募集入称为RISC(RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白 siRNA复合体。尽管不希望被任何具体理论所束缚，人们还是认为RISC被指引至靶核酸(适合的mRNA)，其中siRNA双链体以序列特异方式相互作用，从而以催化形式介导切割(Bernstein, Ε.等(2001)Nature409:363-366 ；Boutla, Α.等(2001)Curr. Biol. 11 1776-1780)。适用于本发明的小干扰RNA可以根据本领域公知的方法和普通技术人员熟悉的方法合成和使用。用于本发明的方法中的小干扰RNA适合包含大约1到大约50个核苷酸 (nt)。在非限制性实施方案的实施例中，siRNA可以包含大约5-大约40个nt、大约5-大约30个nt、大约10-大约30个nt、大约15-大约25个nt或者大约20-25个核苷酸。使用自动比对核酸序列和指明同一性或同源性区域的计算机程序可以帮助选择适合的寡核苷酸。这类程序用于比较例如搜索数据库(例如GenBank)或测序PCR产物所获得的核酸序列。比较不同物种之间的核酸序列允许选择物种间表现出适度同一性的核酸序列。在没有进行基因测序的情形下，进行DNA印迹(Southern blots)使得可以确定靶物种和其它物种基因之间的同一性程度。通过进行如本领域公知的不同严格程度的DNA印迹， 可能获得同一性的近似值。这些方法允许选择表现出与待控制对象的靶核酸序列具有高度互补性的寡核苷酸，以及选择与其它物种的相应核酸序列具有较低程度的互补性的寡核苷酸。本领域技术人员将会意识到选择用于本发明的合适基因区域相当大的自由度。“酶促 RNA “意指 RNA 分子具有酶活性(Cech，(1988) J. American. Med. Assoc.沈0，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通过首先结合靶RNA起作用。这种结合通过酶促核酸的靶结合部分实现，该靶结合部分与所述RNA分子的起切割靶RNA作用的酶活性部分非常靠近。因此酶促核酸首先识别靶RNA，然后通过碱基配对结合靶RNA，一旦结合到正确的位点，即发挥酶促作用切割靶RNA。“诱饵RNA"意指模拟针对配体的天然结合结构域的RNA分子。因此诱饵RNA与天然结合靶竞争结合特异性配体。例如，已经证实过表达的HIV反式激活应答(TAR)RNA 能作为〃诱饵〃，并且有效结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合HIV RNA编码的TAR序列 (Sullenger等(1990)Cell，63，601-608)。这是一个具体的实例说明。本领域技术人员应认识到这仅是一个实例，利用本领域公知的方法可容易地产生其它实施方案。本文所用的术语"单体"通常指由磷酸二酯键或其类似物连接的单体，从而形成大小从几个单体单位(例如大约3-4个)到几百个单体单位的寡核苷酸。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，下文将进行更全面的描述。术语"核苷酸"包括天然核苷酸和非天然核苷酸。本领域技术人员应该清楚的是，以前被认为是"非天然(的)"的各种核苷酸后来发现存在于在自然界中。因此"核苷酸"不仅包括公知的包含嘌呤和嘧啶杂环的分子，而且包括杂环类似物和其互变异构体。其它类型核苷酸示例性的实例是包含以下碱基的分子腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4, N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6, N6-桥亚乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、 5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷，以及描述于Bermer等的美国专利公开号5，432，272 中"非天然"核苷酸。术语"核苷酸"包括全部实例以及其类似物和互变异构体。特别令人感兴趣的核苷酸是那些包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，它们被认为是与人类治疗和诊断应用相关的天然核苷酸。核苷酸包含天然的2'-脱氧和 2 ‘-羟基糖(例如描述于 Kornberg 和 Baker，DNA Replication,第二版(Freeman, San Francisco, 1992))和它们的类似物。关于核苷酸的"类似物"包括合成的具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的核苷酸(参见例如全面描述的下列文献Scheit，Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ；Freier&Altmann, (1997)Nucl. Acid. Res. ,25(22),4429-4443, Toulme, J. J. , (200l)Nature Biotechnology 19 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 :117-139 ；Freier S.Μ. , (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443, UhIman, E. ， (2000)Drug Discovery&Development, 3 :203-213, Herdewin P.， (2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297-310) ；2' -0，3~_C-连接的[3.2.0] 二环阿拉伯糖核苷(参见例如 N. K Christiensen.等，(1998) J. Am. Chem. Soc.，120 5458-5463 ；Prakash TP，Bhat B. (2007)Curr Top Med Chem. 7(7) :641-9 ；Cho EJ,等 (2009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，24H64)。这样的类似物包括被设计为提高结合特征(例如双链体或三链体稳定性、特异性等)的合成核苷酸。本文所用的"杂交"意指寡聚化合物的基本互补链的配对。一种配对机制包括氢键，其可以是寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的华生-克里克、 HoSgsteen或反Hodgsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键形成的配对互补核苷酸。杂交可以在各种条件下发生。反义化合物是"可特异性杂交的"是指反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起功能和/或活性的调节，并且存在足够程度的互补性，从而在期望特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗处理情形的生理条件下，和在体外测定中进行测定的条件下)避免反义化合物非特异性地结合非靶核酸序列。本文所用的短语"严格(的)杂交条件"或"严格(的)条件"是指这样的条件 本发明的化合物将杂交至它的靶序列，且只和最少数量的其它序列杂交。严格条件是序列依赖的，且在不同的条件下不同，在本发明中，寡聚化合物杂交至靶序列的"严格条件"取决于寡聚化合物的本质和组成以及对它们进行研究的测定。一般地，严格(的)杂交条件包括低浓度(<0. 15M)盐和无机阳离子例如Na++或K++(即低离子强度)，温度高于20°C-25°C 但是低于寡聚化合物靶序列复合体的Tm，以及存在变性剂例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜或去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，对于每甲酰胺，杂交率降低1. 1%。高严格杂交条件的实例是0. IX氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0. 1% (重量/体积)SDS，60°C， 30分钟。本文所用的"互补"指在一条或两条寡聚体链上的两个核苷酸之间的精确配对的能力。例如，如果反义化合物的某一位置上的核酸碱基(nucleobase)能与靶核酸的某一位置的核酸碱基形成氢键，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么所述寡核苷酸和靶核酸之间的氢键位置就被看作为互补位置。当每个分子的足够数量的互补位置被能彼此形成氢键的核苷酸占据时，则寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互补的。 因此，术语"(可)特异性杂交(的)"和"互补(的)"是用于指示足够程度的精确配对或者足够数量核苷酸的互补以便寡聚化合物和靶核酸之间发生稳定的特异性结合。本领域应当理解寡聚化合物的序列不需要100%互补于其将特异性杂交的靶核酸序列。而且，寡核苷酸可以杂交一个或多个区段，从而相间隔的区或相邻的区段不参与该杂交事件(例如，环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物与它们将靶向的靶核酸序列内的靶区域具有至少大约70%、或至少大约75%、或者至少大约80%、或者至少大约85%、或者至少大约90%、或者至少大约95%、或者至少大约99%的序列互补性。例如，20个核苷酸的反义化合物中18个核苷酸与靶区域互补并因此而特异性杂交，则该反义化合物表现90%的序列互补性。在该实例中，余下的非互补核苷酸可以与互补核苷酸是成簇的或分散的，且不需要彼此邻接或与互补核苷酸邻接。同样地，长度为18个核苷酸的反义化合物有4个非互补的核苷酸处于靶核酸序列完全互补的两个区域侧翼，该反义化合物与所述靶核酸的总互补性为77. 8%，并且因此属于本发明的范围。反义化合物与靶核酸的某区域的百分互补性可应用本领域公知的BLAST程序(basic local alignment search tools(碱基局部比对检索工具))和PowerBLAST程序常规测定(Altschul等，(1990) J. Mol. Biol.，215，403-410 ；Zhang and Madden, (1997) Genome Res.，7，649—656)。百分同源性、序列同一性或互补性可以通过例如应用Smith和Waterman算法(Adv. Appl. Math.， (1981)2,482-489)白勺 Gap 禾呈· (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8for Unix, genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)利用默认设置确定。本文所用的术语"热熔点(Tm)“指在规定的离子强度、PH和核酸浓度下，50%的互补于靶序列的寡核苷酸与靶序列杂交达到平衡的温度。通常，严格条件是盐浓度至少是大约0. 01到1. OM Na离子浓度(或其它盐)，pH7. 0-8. 3，温度对短寡核苷酸(例如10-50 个核苷酸)是至少大约30°C。严格条件也可以添加去稳定剂例如甲酰胺实现。本文所用的"调节"意指增加(刺激)或降低(抑制)基因的表达。术语"变体"，当用于多核苷酸序列时，可以包含与野生型基因相关的多核苷酸序列。该定义也可以包括，例如"等位基因(的)“、"剪接(的)“、“种(的)“或" 多态性(的)"变体。剪接变体可以和参比分子有显著同一性，但是由于mRNA加工中外显子的可变剪接一般会含有更多或较少数量的多核苷酸。相应的多肽可具有其它的功能性结构域或缺失某些结构域。种变体是种与种之间相异的多核苷酸序列。在本发明特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可以由核酸序列中的至少一个突变所致，且可以导致改变的mRNA或者结构或功能可能有改变或没有改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可能没有等位基因形式，也可能有一种或多种等位基因形式。导致变体的普通突变改变一般见于核苷酸的天然缺失、添加或置换。这些改变类型的每一种都可以在给定序列中单独地、或与其它联合地出现一次或多次。得到的多肽一般彼此具有显著的氨基酸同一性。多态性变体是给定物种中不同个体之间具体基因的多核苷酸序列的变异。多态性变体也可以包括"单核苷酸多态性 (SNP)"，或是多核苷酸序列中一个碱基变化的单碱基突变。SNP的存在可能说明例如某一人群对某一疾病状态的倾向性，即易感性/抵抗性。衍生多核苷酸包含进行了化学修饰的核酸，例如烷基、酰基或氨基基团取代氢。衍生物，例如衍生寡核苷酸，可以包含非天然部分，例如改变的糖部分或糖间键合。其中的示例是硫代磷酸酯和本领域公知的其它含硫种类。衍生核酸也可以包含标记，包括放射性核苷酸、酶、荧光试剂、化学发光试剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。“衍生(的)“多肽或肽是被修饰的多肽或肽，例如糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、 硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学耦合或温和福尔马林处理。衍生物也可以被修饰为直接或间接包含可检测的标记，包括但是不限于放射性同位素、荧光和酶标记。本文所用的术语"动物"或"患者"包括，例如人、绵羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、水貂、 哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类。“哺乳动物"包括通常处于医疗护理下的温血哺乳动物(例如人和家畜)。实例包括猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物和人，以及只包括人。“治疗"覆盖哺乳动物疾病状态的治疗，包括(a)预防疾病状态在哺乳动物出现，特别是当这种哺乳动物对这种疾病状态易感但还没有被诊断为患病时；(b)抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或(c)减轻疾病状态，例如促成疾病状态的消退直至达到所需最终状态。治疗也包括疾病症状的改善(例如减轻疼痛或不适)，其中这种改善可以或不可以直接影响疾病(例如引起、传播、表达等)。本文所用的术语"癌症"指任何恶性肿瘤，特别是源于肺、肾或甲状腺的肿瘤。癌症本身可表现为"肿瘤"或包含这种癌症的恶性细胞的组织。肿瘤的实例包括各种肉瘤和癌，例如但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、 内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms' tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。如上所述，本发明特别允许肺、肾和甲状腺瘤的鉴别诊断。多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子靶/目标在一个实施方案中，靶包含肿瘤抑制基因的核酸序列，包括但不限于和肿瘤抑制基因相关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。肿瘤抑制基因是其产物的作用是控制细胞分裂的基因。它们和癌基因的区别在于如果没有达到生长的条件，肿瘤抑制基因产生抑制细胞分裂的产物。触发细胞‘刹车’的条件包括DNA损伤、缺乏生长因子或分裂装置的缺陷。当肿瘤抑制基因突变而造成其功能丧失或降低时，通常组合其它遗传改变，细胞可能发展为癌症。这和以其突变形式获得功能 (或者丧失被控制的能力)的癌基因相反。肿瘤抑制基因的实例包括P53(TP53)—种调节细胞分裂的转录因子；Rb 改变转录因子的活性和因此控制细胞分裂；APC 控制转录因子的可用性；BRCA 参与DNA修复。ρ53肿瘤抑制基因在各种类型的应激作用下，发挥抗增殖作用，包括生长停滞、凋亡和细胞衰老(Levine A. J.，(1997)Cell 88 :323-31 ；Oren M.，(1999) J. Biol. Chem. 274 36031-034)。p53可被认为是监控来自不同来源的信号传导通路的调节回路的中枢节点，包括DNA损伤反应(例如ATM/ATR激活)、异常致癌事件(例如Myc或Ras激活)和日常细胞活动(例如生长因子刺激)。尽管P53突变见于所有人类肿瘤一半以上(Hollstein等， (1999)Mutat Res. 431 199-209)，但是保有野生型p53的肿瘤细胞中发现p53通路的其它组分(例如 ARF 肿瘤抑制基因)的缺陷(Sherr, C. J.，(2001)Nat Rev Mol Cell Biol 2 731-737 ；Sharpless N. E.等，(2004) J Clin Invest 113:160-8)。p53 通路的激活看起来是人癌症的常见(如果不是普遍的话)特征。调节这些多核苷酸对治疗其中异常细胞增殖起作用的癌症和其它障碍有极大的好处。例如，P53是一种短命的蛋白，其活性在正常细胞中保持低水平。抑制肿瘤需要的p53 的分子功能包括P53作为调节内源基因表达的转录因子的能力。因此p53自身的调节在它对肿瘤发生的作用和维持正常细胞生长都很重要。反义化合物是特异性可杂交的化合物是指反义化合物结合靶DNA或RNA而引起功用丧失，并且具有足够程度的互补性，以避免在特异性结合是理想的条件下时反义化合物非特异性地结合非靶核酸序列，所述条件即体内测定或治疗性处理情形下的生理条件和体外测定时进行测定的条件。表1列出了一些肿瘤抑制基因
权利要求
1.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与一种多核苷酸的反向互补序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含以下核苷酸序列内的5-30个核苷酸SEQ ID NO :4的核苷酸1-1675、或者SEQ ID NO :5的核苷酸1-518、或者SEQ ID NO :6的核苷酸1-759、或者SEQ ID NO :6a的核苷酸 1-25892、或者SEQ ID NO 的核苷酸1-279、或者SEQ ID NO :7的核苷酸1-1982、或者SEQ ID NO 8的核苷酸1-789、或者SEQ ID NO 9的核苷酸1-467(图5)；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。
2.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列的反向互补序列具有至少50% 的序列同一性，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。
3.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%的序列同一性，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。
4.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列的一个区域的至少一种反义寡核苷酸接触，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。
5.权利要求4的方法，其中相对于对照，体内或体外增加肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。
6.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列。
7.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向包含肿瘤抑制基因多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列的核酸序列。
8.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向肿瘤抑制基因多核苷酸的重叠和/或非重叠序列。
9.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包含一种或多种选自以下的修饰至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键合、至少一种修饰的核苷酸以及它们的组合。
10.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包含至少一种选自以下的修饰的糖部分2' -0-甲氧乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2' -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分和它们的组合。
11.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包含至少一种选自以下的修饰的核苷间键合硫代磷酸酯、2' -0-甲氧乙基(M0E)、2'-氟代、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和它们的组合。
12.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包含至少一种选自以下的修饰的核苷酸肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(FANA)、类似物、衍生物和它们的组合。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包含SEQID NO :10-30中的至少一种寡核苷酸序列。
14.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种5-30个核苷酸长度的短干扰RNA(SiRNA)寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA对肿瘤抑制基因多核苷酸的反义多核苷酸是特异性的，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少大约5个连续核酸的互补序列有至少50%的序列同一性；从而在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和/或表达。
15.权利要求14的方法，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少大约5个连续核酸的互补序列有至少80%的序列同一性。
16.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与对肿瘤抑制基因多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码和 /或编码序列特异性的大约5-30个核苷酸长度的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种反义寡核苷酸与 SEQ ID NO :l、la、lb、2、2a、2b、3、3a、4、5、6、6a、6b、7、8 和 9 中的至少一种核酸序列具有至少50%的序列同一性；从而在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中的肿瘤抑制基因的功能和/或表达。
17.一种包含至少一种修饰的合成的修饰寡核苷酸，其中所述至少一种修饰选自至少一种修饰的糖部分；至少一种修饰的核苷酸间键合；至少一种修饰的核苷酸；和它们的组合；和进一步地其中所述寡核苷酸是反义化合物，在体内或体外其杂交至肿瘤抑制基因多核苷酸并且与正常对照相比调节肿瘤抑制基因多核苷酸的功能和/或表达。
18.权利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰包含选自以下的核苷酸间键合 硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和它们的组合。
19.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合
20.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键合的骨^K O
21.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自肽核酸、锁定核酸(LNA)、类似物、衍生物和它们的组合。
22.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包含选自以下的核苷酸间键合硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和它们的组合。
23.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包含选自以下的修饰的核苷酸肽核酸、锁定核酸(LNA)、类似物、衍生物和它们的组合。
24.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种选自以下的修饰的糖部分2' -0-甲氧乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2' -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分和它们的组合。
25.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包含选自以下的修饰的糖部分2' -0-甲氧乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、 2' -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分和它们的组合。
26.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是长度至少大约5-30个核苷酸并且杂交至肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义链的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少大约5个连续核酸的互补序列有至少大约20%的序列同一性。
27.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与肿瘤抑制基因多核苷酸的反义和/ 或有义编码和/或非编码核酸序列的至少大约5个连续核酸的互补序列有至少大约80 %的序列同一性。
28.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸体内或体外与至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸杂交，并且与正常对照相比，调节所述肿瘤抑制基因多核苷酸的表达和/或功能。
29.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQID NO 10-30中的一种序列。
30.一种包含对一种或多种肿瘤抑制基因多核苷酸特异性的一种或多种寡核苷酸的组合物，所述多核苷酸包含反义序列、互补序列、等位基因、同系物、同种型、变体、衍生物、突变体、片段或它们的组合。
31.权利要求30的组合物，其中所述寡核苷酸与SEQID NO 10-30所示的核苷酸序列中的任一种相比，具有至少大约40 %的序列同一性。
32.权利要求30的组合物，其中所述一种或多种寡核苷酸包含SEQID NO :10-30中的任一种核苷酸序列。
33.权利要求32的组合物，其中所述SEQID NO 10-30所示的寡核苷酸包含一种或多种修饰或核苷酸置换。
34.权利要求33的组合物，其中所述一种或多种修饰选自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、锁定核酸(LNA)分子和它们的组合。
35.一种预防或治疗与至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸和/或其至少一种编码产物相关的疾病的方法，所述方法包括给予患者治疗有效剂量的至少一种结合所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸的天然反义序列的反义寡核苷酸，并调节所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸的表达；从而预防或治疗与所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸和/或其至少一种编码产物相关的疾病。
36.权利要求35的方法，其中与所述至少一种肿瘤抑制基因多核苷酸相关的疾病选自凋亡减少或增加相关性疾病；组织/细胞老化；癌症，包括表1所列的癌症；自身免疫性疾病；包括AIDS在内的免疫缺陷病；衰老；神经变性疾病或障碍，例如阿尔茨海默氏病、 运动失调性毛细血管扩张症、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、亨廷顿氏病等；过度增生性疾病，例如瘢痕瘤；类风湿性关节炎；冠心病；局部缺血性细胞死亡；淋巴增生性障碍；动脉粥样硬化；骨质疏松症；骨髓增生异常综合征；毒素诱发性疾病；病毒感染；伤口愈合；考登氏病(CD) ；Lhermitte-Duclos 病(LDD) ；Bannayan-Zonana 综合征(BZS，也称为 Bannayan-Riley-Ruvalcaba 综合征、Ruvalcaba-Myhre-Smith 综合征禾口 Riley-Smith 综合征)；移植；凋亡相关性疾病或障碍；代谢疾病或病症，例如糖尿病；肾病或障碍；心肌梗塞 /心力衰竭；局部缺血；脓毒症；其中特别的造血炎症细胞过量的炎性疾病；增殖性疾病或者其中有治疗范例通过增加凋亡治疗炎症性疾病的疾病或障碍。
37.一种鉴定和选择用于体内给予的至少一种寡核苷酸的方法，所述方法包括选择与疾病状态有关的目标多核苷酸；鉴定至少一种包含与选定目标多核苷酸互补或反义方向的至少5个连续核苷酸的寡核苷酸；检测在严格杂交条件下反义寡核苷酸和所述目标多核苷酸的杂合体的热熔点；以及根据获得的信息选择用于体内给予的至少一种寡核苷酸。
38.权利要求2的方法，其中所述肿瘤抑制基因编码表1所列的一种肿瘤抑制蛋白。
39.权利要求38的方法，其中所述肿瘤抑制基因编码P53、P73或PTEN。
40.权利要求4的方法，其中所述肿瘤抑制基因编码表1所列的一种肿瘤抑制蛋白。
41.权利要求40的方法，其中所述肿瘤抑制基因编码P53、P73或PTEN。
42.权利要求35的方法，其中所述肿瘤抑制基因编码表1所列的一种肿瘤抑制蛋白。
43.权利要求42的方法，其中所述肿瘤抑制基因编码P53、P73或PTEN。
全文摘要
本发明涉及特别通过靶中肿瘤抑制基因的天然反义多核苷酸从而调节肿瘤抑制基因的表达和/或功能的反义寡核苷酸。本发明还涉及鉴定这些反义寡核苷酸以及它们在治疗与肿瘤抑制基因的表达相关的疾病和障碍中的用途。
文档编号A61P35/00GK102361985SQ200980156467
公开日2012年2月22日 申请日期2009年12月3日 优先权日2008年12月4日
发明者J·科拉德, 谢尔曼 O·霍尔科瓦 申请人:欧科库尔纳有限责任公司