重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法

专利名称：重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法。更具体而言，本发明涉及包含作为活性成分的融合肽的重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法，其中所述融合肽由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)(以下也称作"A.pg")血清型A的外膜蛋白的一部分和A. pg血清型C的外膜蛋白的一部分组成。
背景技术：
禽传染性鼻炎(Avian infectious coryza)是由A. pg感染引起的最重要的呼吸疾病之一。患有禽传染性鼻炎的鸡显示出下列主要症状流鼻涕、面肿和溢泪。禽传染性鼻炎引起大量的经济上的损失，因为其导致鸡的繁殖率下降、产蛋的延迟、鸡蛋产量的下降或产蛋的失败。Page等人将A. pg分类为3种血清型A、B和C (见例如，非专利文献1)，Sawata等人将A. pg分类为2种血清型1和2 (见例如，非专利文献2)。此后，Kume等人报道=Page 等人的血清型A对应于Sawata等人的血清型1，Page等人的血清型C对应于Sawata等人的血清型2 (见例如，非专利文献3和4)。现在已经证明禽传染性鼻炎的主要诱因剂是A. pg 血清型A(以下也称作〃 A.pg-A〃)和A.pg血清型C(以下也称作〃 A.pg-C〃)。为了预防禽传染性鼻炎，目前已经广泛使用了灭活的疫苗，所述疫苗是通过以福尔马林、硫柳汞等灭活A. pg-A或A. pg-C的细胞而获得的。然而，此类灭活的疫苗引起的副作用已经成为了一个问题，因为已经有报道指出，当施用这种疫苗时，在接种的鸡中形成局部坏死斑(见例如，非专利文献5)。有鉴于此，为了尝试开发安全的疫苗，研究了通过遗传重组技术制备的包含保护性抗原的重组疫苗以抵抗感染。例如，Tokimaga等人分离并鉴定了编码A. pg-A的外膜蛋白的基因(外膜蛋白基因)并且发现通过在大肠杆菌中表达所述基因的一部分(HPG3. 5kbp,HPG4. lkbp)而获得的肽可用作抵抗禽传染性鼻炎感染的保护性抗原。此外，使用所述DNA片段作为探针，他们获得了来自A. pg-C外膜蛋白基因并且比较了来自A. pg-A和A. pg-C的外膜蛋白基因的开放阅读框的核苷酸序列。结果，他们揭示两个核苷酸序列在整体上具有大约80%的同源性；5'-末端的3.41Λρ的区域(以下也称作"区域1")和3'-末端的大约1.21Λρ的区域(以下也称作"区域3")具有极高的同源性；区域1与区域3之间的大约1. 5kbp的区域(以下也称作"区域2")具有低同源性(见专利文献1)。Noro等人还报道由Tokimaga等人发现的外膜蛋白是针对禽传染性鼻炎的重要的保护性抗原。Noro等人以4，801bp和5，157bp的DNA片段(其是来自A. pg-A的外膜蛋白基因的部分)编码的肽来免疫鸡，以显示所述肽可以诱导针对A. pg-A的HI抗体，并且可以具有疫苗效应(见例如，专利文献2)，另外还报道由大约5. Ikbp和5. 5kbp的DNA片段 (其是来自A. pg-C的外膜蛋白基因的部分)编码的肽具有类似的功能和效应(见例如，专利文献3)。另一方面，Yamamoto等人使用由2，016bp的DNA片段(其包含来自A. pg-A的主要外膜蛋白基因)编码的多肽，以显示所述多肽的有用性(见例如，专利文献4)，但是他们报道的该DNA片段的3'末端的大约300bp的核苷酸序列与Tokimaga等人和Noro等人显示的那些具有极大的差异。专利文献1 :W098/12331专利文献2 日本专利No. 4001117专利文献3 JP 2008-156317专利文献4 JP 2004-57078非专利文献1 :Am. J. Vet. Res. ,23 :85-95,1962非专利文献2 Jpn. J. Vet. Sci. ,40 :645-652,1978非专利文献3 :m. J. Vet. Res. ,41 :757-760,1980非专利文献4 :Am. J. Vet. Res. ,41 :1901-1904，1980非专利文献5 =Avian Dis.，15 :109-117,197
发明内容
(本发明要解决的技术问题)如上所述，已经揭示了来自A. pg-A和A. pg-C (禽传染性鼻炎的主要诱因剂)的外膜蛋白或其部分肽可用作抵抗禽传染性鼻炎的保护性抗原。因此，通过混合这些抵抗感染的保护性抗原，可以有效实现针对禽传染性鼻炎的免疫。然而，简单的混合方法需要单独生产两种感染性保护性抗原，因此是昂贵的。一般而言，与用于人类的疫苗不同，除非用于动物的疫苗质量高、价格低，否则畜牧业者是不会接受这样的疫苗的。因此，为了产生用于动物的疫苗，需要成本较低的生产方法。(解决问题的方法)本发明人经过进行了深入研究，以达到如上所述的目标，结果揭示出由包含来自 A. pg-A和A. pg-C的外膜蛋白基因的区域2 (A. pg-A的3，639bp至5，162bp的核苷酸序列； A. pg-C的4，247bp至5，758bp的核苷酸序列见图1和2)的大约1. 6kbp的序列编码的肽片段(由 A. pg-A 的 3，558bp 至 5，192bp 的 DNA 序列和 A. pg-C 的 4，166bp 至 5，788bp 的 DNA序列编码的肽；以下分别也称作〃 ΑΔ5-1"和〃 C Δ 5-1 “:见图1和2)可用作针对禽传染性鼻炎的保护性抗原。本发明人发现通过将编码ΑΔ5-1的DNA片段与编码C Δ 5-1 的DNA片段连接在一起并表达得到的DNA片段而获得的融合肽(以下也称作"ACA5-1") 在融合后也保持各个抗原的免疫原性，并且该融合肽显示出等同于或高于各自单独表达 ΑΔ5-1或CA5-1时针对禽传染性鼻炎的感染保护效应。此外，本发明人发现当单独表达时，CΔ 5-1作为可溶性级份被表达，而ΑΔ 5-1作为不可溶级份被表达，形成包涵体，从而完成了本发明。因此，本发明的目标是提供包含作为活性成分的融合肽的针对禽传染性鼻炎的疫苗及其制备方法，所述融合肽如下获得将包含来自A. pg-A的外膜蛋白的特定区域的肽片段与包含来自A. pg-C的外膜蛋白的特定区域的肽片段彼此连接。如本文所使用，由Tokimaga等人(专利文献1)分离并鉴定的来自Α. pg-Α和 A. pg-C的外膜蛋白也联合起来被称作“HMTp210蛋白"，源自A. pg-A和A. pg-C的HMTp210 蛋白的肽片段分别也被称作"肽A"和"肽C"。因此，本发明包括下列内容
[1]制备重组禽传染性鼻炎疫苗的方法，该方法包括构建可以产生包涵体形式的融合肽的宿主的步骤，所述融合肽由源自A. pg-A的HMTp210蛋白的肽片段(肽A)和源自A.pg-C的HMTp210蛋白的肽片段(肽C)组成；培养所述宿主并从培养物中收集和纯化包涵体的级份的步骤；和制备包含所述的包涵体的纯化级份的制剂的步骤。[2][1]的方法，其中肽A和肽C由600个或更少的氨基酸残基组成。[3] [1]的方法，其中肽A具有选自 SEQ ID NO :1、27、28、29、30、31、32、33、34和 35 的氨基酸序列；而肽C具有选自SEQ ID N0:2、3、4、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。[4] [3]的方法，其中肽A包含SEQ ID NO 35所示的氨基酸序列；而肽C包含SEQ ID NO :56所示的氨基酸序列。[5] [3]或[4]的方法，其中肽A或肽C包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。[6] [1]-[5]任一项的方法，其中融合肽中肽A与肽C的比例是1至3个肽C比1 个肽A。[7] [1]-[6]任一项的方法，其中融合肽包含至少这样的结构其中肽C与肽A的C 末端连接。[8] [1] - [7]任一项的方法，其中融合肽在肽A与肽A、肽C与肽C、或肽A与肽C之间具有接头。[9] [3]的方法，其中融合肽具有选自 SEQ ID NO :8、9、10、11、12、13、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、61、62、63、64、65、66 和 67 的氨基酸序列。[10]包含作为活性成分的融合肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述融合肽由源自A. pg-A的HMTp210蛋白的肽片段(肽A)和源自A. pg-C的HMTp210蛋白的肽片段(肽 C)组成。[11] [10]的疫苗，其中当由宿主产生时，所述融合肽具有形成包涵体的性质。[12] [10]的疫苗，其中肽A和肽C由600个或更少的氨基酸残基组成。[13] [10]的疫苗，其中肽 A 具有选自 SEQ ID NO :1、27、28、29、30、31、32、33、34 和 35的氨基酸序列；而肽C具有选自SEQ ID NO :2、3、4、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。[14] [13]的疫苗，其中肽A包含SEQ ID NO :35所示的氨基酸序列；而肽C包含 SEQ ID NO :56所示的氨基酸序列。[15] [13]或[14]的疫苗，其中肽A或肽C包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。[16][10]-[15]任一项的疫苗，其中融合肽中肽A与肽C的比例是1至3个肽C比 1个肽A。[17][10]-[16]任一项的疫苗，其中融合肽包含至少这样的结构其中肽C与肽A 的C末端连接。[18] [10]-[17]任一项的疫苗，其中融合肽在肽A与肽A、肽C与肽C、或肽A与肽 C之间具有接头。[19] [13]的疫苗，其中融合肽具有选自 SEQ ID NO :8、9、10、11、12、13、41、42、43、44、45、46、47、48、49、61、62、63、64、65、66 和 67 的氨基酸序列。[20]包含作为活性成分的肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述的肽由包含SEQ ID NO :35所示的氨基酸序列的序列组成，所述序列在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列内， 在其N-末端和/或C-末端添加1-200个氨基酸残基。[21] [20]的疫苗，其中所述疫苗包含作为活性成分的由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列组成的肽。[22]包含作为活性成分的肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述的肽由包含SEQ ID NO :56所示的氨基酸序列的序列组成，所述序列在SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列内， 在其N-末端和/或C-末端添加1-200个氨基酸残基。[23] [22]的疫苗，其中所述疫苗包含作为活性成分的由SEQ ID NO 3或52所示的氨基酸序列组成的肽。[24] [21]或[23]的疫苗，其中所述的肽包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。发明效果根据本发明提供了包含作为活性成分的融合肽的重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法，其中所述融合肽由彼此连接的源自A. pg-A的HMTp210蛋白的肽片段和源自A. pg-C 的HMTp210蛋白的肽片段组成。本发明的禽传染性鼻炎疫苗可以同时提供用于预防由 A. pg-A和A. pg-C引起的禽传染性鼻炎的免疫。根据本发明的方法，可以使C Δ 5-1 (当单独表达时，其以可溶性级份表达)通过其与ΑΔ5-1的融合肽的表达而形成包涵体，从而以不可溶级份来表达。结果是不仅使所述融合肽的纯化变得容易，而且降低了生产成本，因为能够以单次培养来制备针对A. pg-A和 A. pg-C的感染保护性抗原。


图1显示了 ΑΔ5-1片段在A.pg-A的ΗΜΤρ210基因(ΗΜΤρ210Α基因)中的位置， 其中标示的核苷酸编号对应于专利文献1 (Tokimaga等)中公开的核苷酸编号。图 2 显示了 CA4c_l、C Δ 5-1 禾口 CA6b_lb 片段在 A. pg-C 的 HMTp210 基因 (HMTp210C基因)中的位置，其中标示的核苷酸编号对应于专利文献1 (Tokimaga等)中公开的核苷酸编号。图3是照片，其显示了在离心生产融合肽的大肠杆菌的细胞碎片之后，在上清液和沉淀物级份中进行的SDS-PAGE的结果。M 标记物、泳道1 :Α Δ 5-1/C Δ如-1 (沉淀物级份)、泳道2 :Α Δ 5-1/C Δ 4c-l (上清液级份)、泳道3 :AC Δ 5-1 (沉淀物级份)、泳道4 :AC Δ 5-1 (上清液级份)、泳道5 :Α Δ 5-1/C Δ 6b_lb (沉淀物级份)、泳道6 :Α Δ 5-1/ C Δ 6b-lb (上清液级份)。箭头显示了所表达的融合肽。图 4 显示了 A Δ 5-1、A Δ 5-2、A Δ 5-3、A Δ 5-4、A Δ 9-2、A Δ 9-3、A Δ 9-4、C Δ 6-2、 CA 6-3和CA 6-4片段在Α. pg-A的ΗΜΤρ210基因(ΗΜΤρ210Α基因)中的位置，其中标示的核苷酸编号对应于专利文献1 (Tokimaga等)中公开的核苷酸编号。图 5 显示了 C Δ 5-1、C Δ 5-2、C Δ 5-4、C Δ 9-0、C Δ 9-2、C Δ 9-4、C Δ 6-2 禾口 C Δ 6-4 片段在1 8-(的^0^210基因(HMTp210C基因)中的位置，其中标示的核苷酸编号对应于专利文献1 (Tokimaga等)中公开的核苷酸编号。图6是照片，其显示了在离心生产融合肽的大肠杆菌的细胞碎片之后，在沉淀物级份中进行的SDS-PAGE的结果。M 标志物、泳道1 :AC Δ 5_1 (沉淀物级份)、泳道2 =A Δ 5-2/ C Δ 5-1 (沉淀物级份)、泳道3 =A Δ 5-3/C Δ 5-1 (沉淀物级份)、泳道4 :Α Δ 5-4/C Δ 5-1 (沉淀物级份)、泳道5 =A Δ 9-2/C Δ 5-1 (沉淀物级份)、泳道6 =A Δ 9-3/C Δ 5-1 (沉淀物级份)、 泳道7 :Α Δ 9-4/C Δ 5-1 (沉淀物级份)、泳道8 :Α Δ 6-2/C Δ 5-1 (沉淀物级份)、泳道9 A Δ 6-3/C Δ 5-1 (沉淀物级份)、泳道10 :Α Δ 6-4/C Δ 5-1 (沉淀物级份)。箭头显示了所表达的融合肽。图7是照片，其显示了在离心生产融合肽的大肠杆菌的细胞碎片之后，在沉淀物级份中进行的SDS-PAGE的结果。M 标志物、泳道1 ·Μ Δ 5_1 (沉淀物级份)、泳道2 =A Δ 5-1/ C Δ 5-2 (沉淀物级份)、泳道3 =A Δ 5-1/C Δ 5-4 (沉淀物级份)、泳道4 :Α Δ 5-1/C Δ 9-0 (沉淀物级份)、泳道5 =A Δ 5-1/C Δ 9-2 (沉淀物级份)、泳道6 =A Δ 5-1/C Δ 9-4 (沉淀物级份)、 泳道7 =A Δ 5-1/C Δ 6-2 (沉淀物级份)、泳道8 =A Δ 5-1/C Δ 6-4 (沉淀物级份)。箭头显示了所表达的融合肽。图8是照片，其显示了在离心生产肽C的大肠杆菌的细胞碎片之后，在上清液和沉淀物级份中进行的SDS-PAGE的结果。M 标志物、泳道1 :C Δ 5_l_pQE (上清液级份)、泳道 2 =C Δ 5-2-pQE (上清液级份)、泳道3 =C Δ 5-4-pQE (上清液级份)、泳道4 =CA 9-0-pQE (上清液级份)、泳道5 :C Δ 9-2-pQE (上清液级份)、泳道6 :C Δ 9-4-pQE (上清液级份)、泳道7 C Δ 6-2-pQE (沉淀物级份)、泳道8 =C Δ 6-4-pQE (上清液级份)。箭头显示了所表达的融合肽。
具体实施例方式本发明的特征在于制备重组禽传染性鼻炎疫苗的方法，包括下列步骤制备形成包涵体的融合肽，所述融合肽由源自副鸡禽杆菌(Avikicterium paragallinarum)(以下也称作“A. pg 〃 )血清型A的HMTp210蛋白的肽A和源自A. pg-C的HMTp210蛋白的肽C组成。更具体地，本发明的特征在于制备禽传染性鼻炎疫苗的方法，该方法包括构建可以产生包涵体形式的融合肽的宿主的步骤，所述融合肽由源自A. pg-A的HMTp210蛋白的肽片段和源自A. pg-C的HMTp210蛋白的肽片段组成；培养所述宿主、从培养物中收集并纯化包涵体的级份的步骤；和制备包含所述的包涵体的纯化级份的制剂的步骤，以及本发明的特征还在于包含所述融合肽作为活性成分的禽传染性鼻炎疫苗。可以按照下文的描述获得由编码A. pg-A的HMTp210蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 25)的基因(以下也称作"HMTp210A基因")和编码A. pg-C的HMTp210蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 26)的基因(以下也称作"HMTp210C基因")的一部分组成的DNA片段。存在数种A. pg-A和A. pg-C的分离的菌株，任意这些菌株可用于本发明，没有限制。目前已经分离了，例如，A. pg-A的221、083和W菌株等，以及A. pg-C的53-47、Modesto 和HK-I菌株等，其中注意到有一个或数个氨基酸的替换、删除或添加。对于本发明，可以使用任意这些菌株或突变体。对于A. pg-A和A. pg-C的生长，可以使用适宜地含有下列物质的培养基聚胨、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、谷氨酸钠、酵母提取物、氯化钠、鸡肉浸液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (β-NAD)、鸡血清等。本文中，为了以小规模/中等规模生长，使用补充了鸡血清的鸡肉汤， 其在1，OOOmL培养基中含有5g聚胨S、lg酪蛋白氨基酸、5g氯化钠、5g L-谷氨酸钠、Ig葡萄糖、IOg酵母提取物、175mL鸡肉浸液、25mL鸡血清、0.025% β-NAD。培养条件通常可以设定为37°C的温度，16-M小时，该条件可以根据使用目的、培养模式、接种的细菌的量、 培养规模等适宜地变化。可以通过离心(5，800g，20分钟)将培养物中的细胞收集于沉淀物级份中。可以根据 Sambrook 等(Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.，1989)，通过遗传重组技术，从提取自细胞的基因组DNA中制备HMTp210A基因和HMTp210C基因(在不单独指称两个基因的情况下，下文中也联合称作"HMTp210基因")。也可以使用商售试剂盒。例如，为了提取染色体DNA，可以使用 PureGene 试齐[J盒(Gentra Systems)，SepaGene 试齐[J盒(Sanko Junyaku Co.，Ltd.)， IS0PLANT(ffako Pure Chemicallndustries, Ltd.)等。更具体地，可以使用PureGene试剂盒(Gentra Systems)等从通过离心收集的细胞中提取染色体DNA，可以根据Tokimaga等(专利文献1)制备细胞的基因组DNA文库。使用获得的DNA片段作为模板，可以使用 Prime STAR HS DNA Polymerase (TAKARA BIO Inc.) 根据其中随附的说明书进行PCR以扩增想要的大小的DNA片段。可以基于如Tokimaga等 (专利文献1)公开的源自A. pg-A和A. pg-C的HMTp210基因的核苷酸序列来设计用于PCR 的引物。可以通过DNA合成服务承包商(例如Sigma Genosys Japan K. K.)容易地获得用于PCR的引物。在设计的时候，可以在上游引物的5’末端和下游引物的5’末端添加适当的限制性酶切位点的核苷酸序列。可以通过使用DNA合酶将如上所述获得的编码HMTp210A基因的DNA片段和编码 HMTp210C基因的DNA片段直接连接在一起或者使用限制性酶切割后将二者连接在一起来获得编码本发明的融合肽的DNA片段。任选地，可以在编码HMTp210A基因的DNA片段和编码HMTp210C基因的DNA片段之间添加编码由适当大小的氨基酸序列组成的接头的DNA片段。对于接头，优选可以使用具有很大的灵活性的氨基酸，例如，中性氨基酸，例如甘氨酸、 丝氨酸等。可以使用由单一种类的氨基酸或两种或更多种类的氨基酸组成的接头。接头的大小一般可以是5-20个氨基酸，优选是10-15个氨基酸的大小。根据本发明，可以使用HMTp210A基因和HMTp210C基因的编码融合肽的DNA片段， 所述融合肽可以保护免受A. pg-A和A. pg-C感染并形成包涵体。此类DNA片段包括，例如， 编码外膜蛋白的区域2的肽的DNA片段，编码在其N-末端和/或C-末端添加了氨基酸序列的区域2的肽的DNA片段，编码在其N-末端或C-末端添加了氨基酸序列并且在其其余的N-末端或C-末端删除了氨基酸序列的区域2的肽的DNA片段，以及编码在其N-末端和 /或C-末端删除了氨基酸序列的区域2的肽的DNA片段。所添加或删除的氨基酸序列可以是1-200个，优选30-150个氨基酸的长度。优选的是这样的DNA片段，其编码源自具有选自SEQ ID NO :1、27、观、29、30、31、 32、33、34和35的氨基酸序列的A. pg-A的HMTp210蛋白的肽和源自具有选自SEQ ID N0: 2、3、4、5、6、7、50、51、52、53、54、55 和 56 的氨基酸序列的 A. pg-C 的 HMTp210 蛋白的肽。也可以使用编码上述肽的突变体的DNA片段，其中删除、添加或替换了一个或数个氨基酸。如本文使用的“上述肽的突变体，其中删除、添加或替换了一个或数个氨基酸”是指上述肽的突变体，其中删除、添加或替换了 1、2、3、4或5个氨基酸。可以通过在严格条件下与具有互补于编码上述肽的DNA片段的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA片段杂交来获得编码此类突变体肽的DNA片段，或者通过导入突变的方法例如定点诱变来获得。这些可以通过使用商售试剂盒来进行。可以使用源自HMTp210A基因的DNA片段与源自HMTp210C基因的DNA片段的任意组合，只要得到的肽可以形成包涵体。例如，编码融合肽的DNA片段可以是源自HMTp210A 基因的DNA片段的下游与源自HMTp210C基因的DNA片段结合，反之亦可。编码融合肽的DNA片段也可以彼此串联组合。同样，两个或更多个源自HMTp210A基因的DNA片段可以彼此结合，在它们的下游可以再结合两个或更多个源自HMTp210C基因的DNA片段。编码融合肽的DNA可以由比例为1 1至1 3的源自HMTp210A基因的DNA片段和源自 HMTp210C基因的DNA片段组成。优选地，所述比例是1 1。可以在克隆进入pBluescript II SK+(Stratagne)或 pCR2. 1-T0P0Qnvitrogen)之后，使用 DNA 测序仪(ABI Prism 377 Applied Biosystems)测定所获得的DNA片段的核苷酸序列。可以将由此获得的A. pg-A和A. pg-C的DNA片段或编码融合肽的DNA片段引入适当的表达载体中，然后可以将所述表达载体导入宿主中以表达每个DNA片段。对于异源蛋白或肽的表达，通常可以使用细菌、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等，其中可以使用任意宿主，只要可以产生包涵体。对于宿主细胞的转化，可以使用本领域已知的方法。例如， 可以使用磷酸钙，DEAE右旋糖酐，使用脂质体的方法，例如脂质体转染，原生质体的聚乙二醇融合，电穿孔，热激等，根据所用的宿主细胞适当地选择。优选地，可以使用大肠杆菌，其允许大量地表达。对于在大肠杆菌中的表达，已经开发了具有trp启动子、T7启动子、cspA启动子等的多种表达载体，并且是商业上可获得的，可以视情况使用。此类表达载体包括，例如，pET-1 Id (Merck)和pQE30 (Quiagen)。取决于表达载体，可以选择合适的大肠杆菌例如 BL21、HMS174、DH5 α、HBlOU JM109等作为宿主。可以使用商售的感受态细胞根据其中随附的说明书进行大肠杆菌的转化。因此，可以获得产生需要的多肽的重组大肠杆菌。对于用于培养基的大肠杆菌的培养基(例如LB、SOC、SOB等)，用于选择转化体的试剂(例如氨苄青霉素)和用于诱导表达的试剂(例如吲哚乙酸(IAA)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)等)，可以使用商售的那些。培养基的PH可以在适合于大肠杆菌生长的范围内(ρΗ 6 至 8)。可以按照下文的描述进行表达需要的肽(目标物)的重组大肠杆菌的筛选。通过离心(9，100g，5分钟)收集在存在表达诱导剂(在本发明的表达系统中使用的是IPTG)的情况下培养和生长的细胞，将其悬浮于固定体积的蒸馏水或PBS中，通过超声或通过勻浆器例如弗氏细胞压碎器或MantonGolin破碎，并进行离心(例如17，800g, 15分钟)以分离并回收沉淀物和上清液。可以向蒸馏水中适当地加入表面活性剂(例如Triton X-100)、螯合剂(例如EDTA)、溶菌酶等。可以将回收的固定量的上清液和沉淀物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以考马斯亮蓝染色后，可以通过分子大小和染色的图像来确认目标物的表达。 为了确认(或检测)目标物，除了如上所述的基于分子大小的方法之外，还可以使用基于抗原-抗体反应的方法，例如ELISAJestern印迹、斑点印迹等。所有这些方法都普遍被用于检测大肠杆菌中表达的异源蛋白或多肽，可以视情况选择。因此，可以选择在沉淀物中回收的克隆，即，产生可能形成包涵体的融合肽的克隆。可以按照如下的描述从产生融合肽的克隆中回收包涵体。首先，可以使用离心或适当大小的MF膜(Asahi Kasei Corporation)来收集细胞。可以通过合适的方式将收集的细胞破碎，从而将由融合肽组成的包涵体释放到细胞外。可以通过任意已知的方法进行细胞的破碎，包括，例如，以化学物质、表面活性剂、酶来溶解，或物理处理例如弗氏细胞压碎器或超声。通过组合这些方法中的数种，可以更有效地破碎细胞。例如，在以去离子水稀释并浓缩通过MF膜收集的细胞以除掉残余的培养物成分和细胞代谢物之后，可以加入适当的缓冲液和溶菌酶，可以将得到的混合物静置于低温
至15°C )过夜，从而溶解细胞的细胞膜。可以将经处理的细胞溶液以500-600kg/cm2的条件置于弗氏细胞压碎器(或Manton Golin)中以破碎细胞。缓冲液可以是任意种类的， 只要其在7. 5-9的pH范围(在该范围溶菌酶是有活性的)具有缓冲能力，例如Tris缓冲液。可以在缓冲液的通常使用浓度(10-50mM)使用缓冲液。可以在0.3-1. Og/L的浓度使用溶菌酶。例如，可以在加入20mM pH8. 5的Tris缓冲液，可以加入溶菌酶(0.6g/L)，可以将混合物在4°C静置过夜以溶解细胞的细胞壁。以弗氏细胞压碎器破碎细胞之后，可以重复以缓冲液或去离子水和MF膜进行稀释和浓缩，以除掉大部分细胞成分。任选地，可以加入表面活性剂，例如I^riton-XlOO。可以通过离心经浓缩的含有包涵体的溶液而以沉淀物的形式回收包涵体。可以将回收的包涵体溶解于含有变性剂的溶液中。使用的变性剂包括脲、盐酸胍等，其中优选为脲。可以分别在4M-8M和2M-6M的浓度范围内使用此类脲和盐酸胍。对于本发明，优选使用8M的脲。为了溶解变性剂和还原剂，可以使用pH6-9、优选pH7-8的缓冲液。可以使用任何在上述PH范围具有缓冲能力的缓冲液，例如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、 甘氨酸缓冲液、碳酸缓冲液等。可以在40°C或更低的温度进行溶解。可以将溶解时间设定为在观察到包涵体的溶解时，通常是30分钟至1小时。然后，可以通过将10-20倍体积的缓冲液加入到包涵体的溶液中或通过针对缓冲液透析该溶液来进行融合肽的重折叠，即正常空间结构的重构。对于重折叠，可以使用与用于溶解包涵体相同种类、温度和PH的缓冲液。可以在室温或更低的温度进行重折叠，并且静置1-7天，优选3-4天。还可以视偶然需要使含有包涵体的溶液经历纯化程序。对于此类纯化程序，可以使用蛋白质化学领域中通常使用的方法的组合，例如，离心、盐析、超滤、等电聚焦、电泳、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、疏水色谱、羟基磷灰石色谱等。可以使用用于蛋白质测定的试齐U例如 BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce Biotechnology, Inc) ,Protein Assay Kit(BI0-RAD, Inc)等来测定所获得的蛋白或多肽的量。本发明的融合肽作为禽传染性鼻炎疫苗的有用性可以这样证明以含有所述融合肽的溶液免疫鸡，并测定获自所述鸡的血清中的针对A. pg-A和A.pg-C的抗体效价；或者， 以有毒力的细菌攻击所述经免疫的鸡并观察鸡的存活和临床症状，例如流鼻涕、面肿和溢泪。对于鸡的免疫，任选可以添加如通常的药物制剂中所使用的免疫增强剂(佐剂)。给药模式无特定限制，可以通过例如皮下、皮内、腹腔内或鼻内进行给药，通常是每2-4周给药 1-3 次。
为了制备作为疫苗的含有本发明的融合肽的药物制剂，可以通过膜过滤器无菌过滤含有所述融合肽的溶液，可以视偶然需要向过滤物中加入免疫增强剂(佐剂)，例如氢氧化铝、磷酸铝、矿物油或非矿物油；稳定剂，例如聚山梨酯80、氨基酸、以及糖，例如乳糖和蔗糖；以及防腐剂，例如福尔马林、硫柳汞、2-苯氧基乙醇、苯甲醇、苄索氯铵和苯扎氯铵。 同样，通过加入有效作为赋形剂的糖例如乳糖或蔗糖，可以配制冻干的制剂。因此，可以制备包含本发明的融合肽作为活性成分的疫苗。所获得的疫苗可以单独用作禽传染性鼻炎疫苗或者可替代地，与选自针对其它病毒例如禽传染性支气管炎病毒、禽传染性粘液囊病病毒、禽脑脊髓炎病毒和排卵综合征病毒的疫苗；针对细菌例如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门菌 (Salmonella enteritidis)和鸡瘟沙门菌(Salmonella pollorum)的疫苗；和针对原生动物例如考氏住白细胞虫(Leucocytozoon cauleryi)、柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenera)和巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)的疫苗中的至少一种疫苗组合用作混合疫苗。通过以下实施例更具体地解释本发明，但是以下实施例不被解释为限制本发明。实施例1 用于表汰融合肽的质粒的构建根据Tokunaga等(专利文献1)制备A. pg-A 221菌株和A. pg-C 53-47菌株的基因组DNA文库。简而言之，使用PureGene试剂盒(Gentra Systems)从通过离心(Tomy， RD-20PIV，4，400g，20分钟)收集的细胞中提取基因组DNA。使用所获得的DNA作为模板，使用 Prime STAR HS DNA Polymerase (TAKARA BIO Inc.)进行 PCR 以扩增 A. pg-A 和 A. pg-C 的HMTp210蛋白基因的DNA片段。PCR条件如下在98°C反应1分钟后，进行15个循环的 “变性(980C，10秒)、退火(550C，15秒)和延伸反应(72°C，120秒)，，，然后终止反应(72°C， 7分钟)。表1显示了扩增反应中使用的各个DNA片段和PCR引物的名称和序列编号。向 5，-引物添加NcoI识别序列并且向3，-引物添加BamHI识别序列，以用于扩增A. pg-A的 DNA片段；向5’-引物和3’-引物都添加BamHI识别序列，以用于扩增A. pg-C的DNA片段。 图1和2显示了各个DNA片段的相对位置。在表中，DNA片段一栏内标明的SEQ ID NO号表示各个DNA片段编码的氨基酸序列。表 权利要求
1.制备重组禽传染性鼻炎疫苗的方法，该方法包括构建可以产生包涵体形式的融合肽的宿主的步骤，所述融合肽由源自A. pg-A的HMTp210蛋白的肽片段(肽A)和源自A. pg-C 的HMTp210蛋白的肽片段(肽C)组成；培养所述宿主并从培养物中收集和纯化包涵体的级份的步骤；和制备包含所述的包涵体的纯化级份的制剂的步骤。
2.权利要求1的方法，其中肽A和肽C由600个或更少的氨基酸残基组成。
3.权利要求1的方法，其中肽A具有选自SEQID NO :1、27、观、29、30、31、32、33、；34和 35的氨基酸序列；而肽C具有选自SEQ ID N0:2、3、4、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。
4.权利要求3的方法，其中肽A包含SEQID NO :35所示的氨基酸序列；而肽C包含 SEQ ID NO :56所示的氨基酸序列。
5.权利要求3或4的方法，其中肽A或肽C包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中融合肽中肽A与肽C的比例是1至3个肽C比1 个肽A。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中融合肽包含至少这样的结构其中肽C与肽A的C 末端连接。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中融合肽在肽A与肽A、肽C与肽C、或肽A与肽C之间具有接头。
9.权利要求3的方法，其中融合肽具有选自SEQID NO :8、9、10、11、12、13、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、61、62、63、64、65、66 和 67 的氨基酸序列。
10.包含作为活性成分的融合肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述融合肽由源自 A. pg-A的HMTp210蛋白的肽片段(肽A)和源自A. pg-C的HMTp210蛋白的肽片段(肽C)组成。
11.权利要求10的疫苗，其中当由宿主产生时，所述融合肽具有形成包涵体的性质。
12.权利要求10的疫苗，其中肽A和肽C由600个或更少的氨基酸残基组成。
13.权利要求10的疫苗，其中肽A具有选自SEQID NO :1、27、28J9、30、31、32、33、34 和35的氨基酸序列；而肽C具有选自SEQ ID NO :2、3、4、50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。
14.权利要求13的疫苗，其中肽A包含SEQID NO 35所示的氨基酸序列；而肽C包含 SEQ ID NO :56所示的氨基酸序列。
15.权利要求13或14的疫苗，其中肽A或肽C包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
16.权利要求10-15任一项的疫苗，其中融合肽中肽A与肽C的比例是1至3个肽C比 1个肽A。
17.权利要求10-16任一项的疫苗，其中融合肽包含至少这样的结构其中肽C与肽A 的C末端连接。
18.权利要求10-17任一项的疫苗，其中融合肽在肽A与肽A、肽C与肽C、或肽A与肽 C之间具有接头。
19.权利要求13的疫苗，其中融合肽具有选自SEQID NO :8、9、10、11、12、13、41、42、`43、44、45、46、47、48、49、61、62、63、64、65、66 和 67 的氨基酸序列。
20.包含作为活性成分的肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述肽由包含SEQID NO 35所示的氨基酸序列的序列组成，所述序列在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列内，在其 N-末端和/或C-末端添加1-200个氨基酸残基。
21.权利要求20的疫苗，其中所述疫苗包含作为活性成分的由SEQID NO :1所示的氨基酸序列组成的肽。
22.包含作为活性成分的肽的重组禽传染性鼻炎疫苗，其中所述肽由包含SEQID NO 56所示的氨基酸序列的序列组成，所述序列在SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列内，在其 N-末端和/或C-末端添加1-200个氨基酸残基。
23.权利要求22的疫苗，其中所述疫苗包含作为活性成分的由SEQID NO :3或52所示的氨基酸序列组成的肽。
24.权利要求21或23的疫苗，其中所述肽包含其中一个或数个氨基酸被删除、添加或替换的氨基酸序列。
全文摘要
提供了重组禽传染性鼻炎疫苗及其制备方法。提供用于制备重组禽传染性鼻炎疫苗的方法，该方法包括构建可以产生包涵体形式的融合肽的大肠杆菌的步骤，所述融合肽由源自血清型A和血清型C的副鸡禽杆菌的外膜蛋白的肽组成；培养所述大肠杆菌并从培养物中收集并纯化包涵体的步骤；和制备包含所述的纯化的包涵体的制剂的步骤，以及提供包含作为活性成分的融合肽的禽传染性鼻炎疫苗。可以在包含融合肽的各个肽之间插入接头序列。对于源自血清型A和C的肽，可以使用区域2或其附近的负责针对感染的保护的氨基酸序列。
文档编号A61K39/02GK102333539SQ20098015765
公开日2012年1月25日 申请日期2009年12月24日 优先权日2008年12月25日
发明者坂元隆一, 坂口正士, 沟上宽, 马场进 申请人:一般财团法人化学及血清疗法研究所