专利名称：A型和b型流感病毒复制抑制肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及流感病毒复制抑制肽，该肽抑制流感A型和B型病毒复制；抑制流感病毒复制的流感病毒复制抑制剂；用于确定流感病毒聚合酶亚基相互作用抑制剂的方法以及包含流感病毒复制抑制肽的流感治疗剂。
背景技术：
流感病毒是导致每年发作的流行病以及反复发作的流行传染病的负链RNA病毒， 导致很多人患病和严重的经济负担。除了广为人知的A型流行性流感病毒(例如1918年 “西班牙”流感或H5W)，A型和B型病毒均是造成很多人患病和巨额医疗费用的每年再发的流行病的主要原因。WHO推荐针对传播的流感病毒株A(FluA)和B(FluB)每年进行疫苗接种。然而，目前的疫苗针对流感提供的保护并不完全。到目前为止，只有神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(oseltamivir (达菲(Tamiflu)))和扎那米韦(zanamivir (依乐伟(Relenza))) 可用作抵抗全部两种病毒类型的抗病毒治疗。然而，在医学界内存在不断增加的担忧，所述担忧即关于耐这两种药物的流感病毒株正在快速不断的出现。较老的金刚烷药物对FluB 无效，耐奥司他韦的流感病毒的全球分布表明此类药物的局限性。最近在美国的流行病学调查发现98. 5%的Hmi分离株被测试出耐奥司他韦。因此，急需可对抗所述两种病毒类型的新的改进的和替代的抗病毒剂。
发明内容
本发明的一个目的是提供新的、改进的和/或替代的抗流感病毒剂。本发明的另一目的是除去或减轻本领域已知的抗流感病毒剂的至少一个缺点。本发明的又一目的是提供新的改进的和替代的用于确定流感病毒聚合酶亚基相互作用抑制剂的方法。令人意外的是，已发现本发明的新病毒复制抑制肽能够抑制A型和B型流感病毒的异源三聚体病毒RNA聚合酶复合体的PA和PBl亚基的蛋白-蛋白相互作用。所述病毒聚合酶亚基相互作用结构域被证明是所述新抗病毒剂的有效靶标，因为所述三个病毒聚合酶亚基PB1、PB2和PA的正确装配是病毒RNA合成和传染性所需的。目前还没有整个三聚复合体的结构数据。基于与PBl的N末端复合的截短的FluA PA的晶体结构，本发明人确认，PBl的关键PA相互作用结构域由氨基酸(aa 5_11)所形成的31(|螺旋构成。该结构域在A和B型流感病毒中均是高度保守并且是病毒类型特异的(图la)。含有来自A型和B型病毒的氨基酸序列的本发明的新肽结合于A型和B型流感病毒的PA亚基。在所述新肽中，含有来自A型和B型病毒的氨基酸序列的嵌合肽，被鉴定为不仅可结合于两种PA亚基，而且可降低A型和B型流感病毒的病毒聚合酶活性和在细胞培养中的病毒分布。本发明的一个方面提供一种分离的流感病毒复制抑制肽，其已被证明可有效地干扰异源三聚体病毒RNA聚合酶复合体的PA和PBl亚基的蛋白-蛋白相互作用结构域并从而导致对病毒复制的抑制。本发明的另一方面提供一种鉴定变体肽的基于ELISA的筛选方法，该变体肽来源于异源三聚体病毒RNA聚合酶复合体的PBl亚基的PA结合结构域，该结构域可结合于A型和B型流感病毒的PA亚基。本发明使得可容易地使用本发明的肽，以及新的基于ELISA的筛选测定法，所述测定法用于鉴定对A型和B型流感病毒有抗病毒活性的小分子先导化合物。由于这些小分子对所述两种病毒类型均有效，因此它们代表了有吸引力的神经氨酸酶抑制剂的替代品， 并向获得强烈需要的、接近通用的对抗流感病毒的药物的目标迈出了一大步，并且代表这样一种药剂，即由于其靶标是蛋白-蛋白相互作用结构域，因此可能对耐药病毒株的出现 (流感的耐药病毒株的出现是广为人知的)较不敏感。本发明的肽包含氨基酸序列，所述序列与野生型PBIh1A多肽MDVNPTLLFLK具有至少60 %、优选至少70 %、更优选至少80 %或90 %的同一性。一个或多个氨基酸残基可被取代、缺失或添加，并且所述蛋白仍具有对A型和B型流感病毒的PA和PBl亚基的蛋白-蛋白相互作用的抑制活性。然而，已知的野生型PBlwiA被明确地放弃。本发明的肽是合成的或分离的流感病毒复制抑制肽，所述肽竞争性地抑制A型和 B型流感病毒的异源三聚体病毒RNA聚合酶复合体PA和PBl亚基的蛋白-蛋白相互作用。 这些肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含X5X6X7X8X9Xltl序列，其中)(5是？ ；)(6是1\￥、？、 W、H、C、I、L、V、A 或 M ;X7 是 L 或 F ;X8 是 L、I、F 或 M ;X9 是 F、Y、W、H、L、R 或 S ；并且 X10 是 L、I 或 Y。根据本发明的优选实施方案，本发明的肽的氨基酸序列与野生型PBlw5A多肽 MDVNPTLLFLKVPAQ具有至少66%、优选至少73%、更优选至少79%、86%或93%的同一性。 该野生型自身也被放弃。应注意在本申请中全部氨基酸优选地由IUPAC单字母编码标识。在使用三字母编码时，它们也符合IUPAC。字母X用于标识某个位置处的通配符/变量或其他氨基酸。根据本发明的另一方面，流感病毒复制抑制剂包含与细胞穿膜肽(优选HIV-Tat 的细胞穿膜结构域)融合的至少一种上述肽，作为活性成分，并抑制A型和B型流感病毒株的复制。根据其他实施方案，前述肽以与任何衔接肽——其确保被摄入至病毒可感染的细胞中——连接的方式提供，并且/或者作为包含肽和相容载体的盖伦制剂提供。本发明的流感预防/治疗剂包含前述肽的任何一种中的至少一种肽和/或前述抑制剂中的任何一种的至少一种流感病毒复制抑制剂，作为活性成分。此流感预防/治疗剂对A型和B型流感病毒感染均有效。已将包含编码上述肽的多核苷酸的表达载体引入细胞以使它们能够分泌本发明的肽。已经开发了包含权利要求1-7中任一项的流感病毒复制抑制肽的流感治疗剂。本发明的DNA或多核苷酸编码前述肽的任一种，并由DNA、RNA、基因组DNA或PNA 构成。本发明的表达载体包括前述DNA。此外，本发明的细胞被弓I入前述表达载体并分泌前述肽中的任一种。前述肽可包含在脂质体中。根据一个优选实施方案，所述脂质体中的肽被烷基化。
除了上述这些医疗用途之外，本发明的流感病毒复制抑制肽还可用作鉴定抗病毒药物的工具。新肽如PBIh5At6y的鉴定及其抑制FluA和FluB生长的能力证明所述聚合酶亚基PA和PBl的相互作用可作为开发抗病毒药物的新靶标，所述药物包含特异性阻断PA-PBl 相互作用并抑制多种FluA和FluB株生长的小分子或其他化合物，用作广谱抗流感药物。此外，本发明还提供基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的筛选测定法，来鉴定对A型和B型流感病毒有抗病毒活性的小分子前导化合物。由于它们对所述两种病毒类型均有效，因此这些化合物代表有吸引力的神经氨酸酶抑制剂的替代品。因此，本发明代表了向获得强烈需要的、接近通用的对抗流感病毒的药物的目标迈出了一大步，并且代表这样一种药剂，即由于其靶标是蛋白-蛋白相互作用区，因此可能对耐药病毒株的出现(流感病毒株的耐药病毒株的出现是广为人知的)较不敏感。还提供荧光偏振(FP)测定法。建立所述ELISA以更好地分析PBl与PA的结合性质。如图Ib所示，其证实了 FluA PA和FluB PA分别与PBV25A和PBlh25B的类型特异性结合。为了进一步表征各单个aa的作用，使用PBp25A衍生肽进行了竞争性ELISA实验(表2)。缺少构成所述31(Γ螺旋的aa 的肽不能竞争结合，这与所述PA/PB1结合位点的结构吻合。此外，在31(Γ螺旋结构域内含有单个Ala或Asp取代(除了 Τ6Α以外)的肽丧失了其结合FluAPA的能力(表3)。这可能是由于变构效应或是由于氢键接触的丧失。已发现PBl的关键PA相互作用结构域由31(|-螺旋构成，所述31(Γ螺旋由氨基酸 (aa))(5到)Cn构成。该区在A型和B型流感病毒中均是高度保守并且类型特异的(图la)。此外，FluB PBl能够结合于FluA PA，此时这25个aa与FluA PBl序列互换(图 2)。确定了 FluA衍生肽和FluB衍生肽(15-mer)进行PA-PBl^5A相互作用，以及形成一系列FluA/FluB嵌合体的IC50值(表1)。野生型PBl1^15A有效地抑制FluA PA而非FluB PA结合于所述同族肽，而PBlw5B阻断FluB PA而非FluA PA结合。某些嵌合肽丧失了其结合FluA PA的能力(表1)。令人意外的是，肽PBIh5At6y^f不仅竞争结合FluA PA，而且竞争结合FluB PA，虽然亲和力小于PBU。仅在第6位——其在FluB中是高度保守的—— 上引入Tyr (PBIh5At6y),导致FluA PA的结合与所述双突变体相比下降，然而结合仍优于野生型肽；而对于PBIw5At6y来说，其与FluB PA的结合与PBV15At6U7f相比提高。所述L7F取代导致抑制活性的基本丧失(表1)，表明PBIh5At6y, L7F的有利结合性质可归因于T6Y。结构分析表明FluB衍生肽在第6位上的Tyr嵌合进FluA PA的未经利用的疏水口袋中，增强了 PBIh5At6y与FluA PA之间的结合(图Ic)。尽管对于FluA来说， 此疏水相互作用通过在第6位上引入Phe和Trp而增大，但是与FluB PA的结合下降，表明 FluB PA与PBl之间的相互作用的模式有稍许不同。疏水相互作用的增加以及水置换的熵效应可解释PBIt6y与PA的结合的增强。在更大的肽PBL25At6y中保留了有利的双结合性质，该肽还结合于数个FluA和 FluB病毒株的PA亚基(图Ib和图3)，证明了对多种流感病毒亚型的亲和性。聚合酶重构测定法揭示，这些双结合性质会转变为不依赖于病毒类型的对聚合酶活性的抑制。与GFP 融合的PBI^5At6y干扰FluA和FluB的病毒聚合酶活性，而PBIh5A-GFP和PBIh5B-GFP只抑制其同族亚型的活性(图Id)。通过含有这些序列的蛋白的共免疫沉淀实验观察到一致的发现(图4)。
为了提高所述治疗活性分子——即本发明的合成或分离的流感病毒复制抑制肽——的递送，使用了细胞穿膜肽。所述细胞穿膜肽是例如来自慢病毒的蛋白转导结构域(PTD)或反式激活因子蛋白，也称为Tat蛋白。已经显示，与HIV-Tat的穿膜区融合的 PBUt6y (PBlmA^Y-Tat，表4)抑制FluA和FluB的生长但不抑制不相关病毒的生长(图 Ie)。正如根据本发明人的生化表征可预测的，与野生型PBV25-A-Tat相比，PBlimA^-Tat 导致对A/WSN/33 (HlNl)和高病原性H5W病毒株A/Thai land/1 (Kan-I)/2004的生长抑制增加两倍。本发明的流感预防/治疗剂对流感A型和B型病毒广泛有效。有利的是，本发明的制剂可在非常短的时间内根据需要采用合成方法制备。对于由局部或区域爆发(例如亚洲国家的禽流感或者最近墨西哥的猪流感)导致的致命流行病，明显需要具有广泛作用的病毒预防/治疗剂。本领域普通技术人员在阅读以下对本发明具体实施方案连同附图的描述后会明了本发明的其他方面和特征。本领域技术人员会根据本文给出的描述中明了本发明的目的、特征和优点以及其构思。应理解采用下文描述的本发明的实施方案和具体实施例作为本发明的优选实施例。 这些描述仅是为了说明和示例，而不意图将本发明限定于这些实施方案或实施例。本领域技术人员还会明了可基于本文给出的描述在本文公开的本发明目的和范围内进行各种变化和改变。
图1示出了 PBI1J5At6y的结合和抑制活性。图Ia在上图中示出了对FluA PBl和FluB PBl的N-末端25个aa的共有序列的比对。中图和下图示出了对所有可以获得的来源于PBl全长序列的FluA和FluB序列N-末端25个aa的比对。图Ib示出了来自细胞提取物的带有HA标签的PA亚基与固定化肽的结合，所述肽对应FluA PBl和FluB PBl的不同结构域。上图所用的含PA的细胞提取物的蛋白质印迹。图Ic 示出了结合于 FluA PA 的 FluA PBlw5 和 FluA PBIw5t6y 的结构。图Id示出了在FluA和FluB聚合酶重构测定法中PBlh25衍生的GFP融合蛋白的聚合酶抑制活性。图 Ie 示出了使用 PBlH5A-Tat,PBlusA^Y-I^at、PX-Tat (对照肽)对 FluA、FluB 和 VSV(水泡性口炎病毒)进行的空斑减少测定。图2示出了 PA与PBl的病毒类型特异性相互作用。图加示出了在图2b的测试中使用的PBl嵌合体。图2b示出了以表达质粒转染的结果，所述质粒编码所示的FluA的PBl蛋白和 C-末端带有六组氨酸标签的PA (FluA PAHis)。图3示出了 FluA/B肽嵌合体PBI^5At6y与PBl^5A和PBl^5B相比的双结合性质。图如示出了在图4b的测试中使用的GFP-PBl融合蛋白。图4b示出了免疫印迹，所述免疫印迹基于FluA和FluB的PBV25-衍生GFP融合蛋白和带有HA标签的PA的形成。
具体实施例方式现在借助上述附图和附表——只是为了举例——对本发明的实施方案进行描述。材料和方法病毒株对于感染实验，使用根据(ihanemet al. (2007)的 A/WSN/33 (HlNl)、根据 Chockephaibulkit et al. (2005)的A/Thailand/1 (Kan-I)/2004、根据Norton(1987)的B/ Yamagat/73 以及如 khwemmle (1995)所述的 VSV Qndiana 血清型)。质粒构建Ghanem(2007)、Mayer (2007)和 Pleschka (1996)描述了质粒 pCA-Flag-GFP 和 PCA-PBii^25A-GFP, pCA-PBI-HA、FluA微复制子质粒和FluB微复制子的表达质粒。根据 Pleschka(1996)，通过将侧翼连接有B/Yamagata/73的第8段的非编码区的萤火虫萤光素酶ORF(反向)克隆到经Sapl消化的质粒pPolI-SapI-Rib中，从而获得FluB微型基因组表达质粒 pPolI-lucRT_B。对于 PCA-PBv25B-GFP 的构建，将含有 PBl (B/Yamagata/73) 的前25个密码子的接头克隆到pCA-Flag-GFP质粒的EcoRI/NotI位点，用PBln5B替代 Flag编码序列。用PCA-PBlh25A-GFP进行定点诱变以形成质粒pCA-PBlmA^Y-GFP。用在起始密码子上游含有NotI位点(FluA病毒株)或EcoRI位点(FluB病毒株)的正义引物和在缺失的终止密码子后具有Xmal位点、HA标签的编码序列和BioI位点的反义引物，对 PBl (B/Yamagata/73)和 PA(A/SC35M, A/Thailand/1 (ΚΑΝ-Ι)/04、A/Vietnam/1203/04、B/ Yamagata/73、B/Lee/40)的 ORF 进行 PCR 扩增。将 PCR 产物克隆到用 EcoRI/XhoI 或 NotI/ Xhol 消化的经修饰的 pCAGGs 载体(Schneider，2003)中，得到 pCA-PBl-HA 或 pCA-PA-HA 质粒，编码C末端带有标签的聚合酶亚基。为获得pCA-PAA/se35M-His质粒，用XmaIAhol消化pCA-PA/se35M-HA并用6xHis-接头取代HA编码序列。通过使用SC35M和B/Yamagata/73 的pCAPBl-HA质粒的装配PCR并通过将得到的PCR产物克隆到用EcoRI/EcoRV消化的 pCA-PBlB/Yamagata/73-HA 中得到 A/B-嵌合表达质粒。流感病毒聚合酶活性的重建用质粒混合物并用编码所示GFP融合蛋白的表达质粒瞬时转染HEK293T细胞，所述质粒混合物含有FluA-或FluB-衍生的PB1-、PB2-、PA-和NP-表达质粒、聚合酶I (Pol I)-驱动的转录A型或B型流感病毒样RNA (该RNA编码报告蛋白萤火虫萤光素酶以监测病毒聚合酶活性)的质粒。使两种微型基因组RNA的侧翼分别连接于FluA和FluB的第8段的非编码区序列。所述转染混合物还含有组成型表达海肾萤光素酶(Renilla luciferase) 的质粒，其用于标准化转染效率的偏差。在转染后M小时测定报告蛋白活性并使用 Dual-Glu Lufierase Assay System(Promega)进行标准化。将针对含有 Flag-GFP 的转染反应观察到的活性设为100%。肽合成所述肽的固相合成是在Pioneer自动肽合成仪(Applied Biosystems, Foster City, USA)上进行，所述合成采用Fmoc化学法与TBTU/二异丙基乙胺活化。侧链保护如下 Asp，Glu，Ser，Thr和Tyr:t-Bu ；Asn，Gln和His:Trt ；Arg:Pbf ；Lys和Trp:Boc。偶联时间为 1小时。如果根据程序 P印tide Companion (CoshiSoft/PeptiSearch, Tucson, USA)预期到偶联困难，那么就进行双偶联。所有肽均通过在Rapp S RAM树脂(Rapp Polymere, Tubingen, Germany)上进行合成以羧基胺形式产生。用 Fmoc-Lys (Biotin)-OH(NovaBiochem/Merck， Nottingham, UK)在所示肽的C-末端纳入生物素并进行18小时的TBTU/ 二异丙基乙胺活化，然后进行1小时的Fmoc-β -Ala-OH偶联。将肽从所述树脂上切下并通过用含有3%三异丁基硅烷和2%水的TFA(10ml/g树脂)处理3小时去保护。在用叔丁基甲基醚沉淀后， 通过使用含有0. TFA的水/乙腈梯度的制备型HPLC(RP-IS)纯化所得到的粗肽，并用分析型 HPLC 和 MALDI-MS 表征。某些肽通过 ρ印tides&el印hants (Nuthetal，Germany)合成并随后如上所述进行纯化和鉴定。免疫沉淀实验使用 Metafectene (Biontex, Martinsried, Germany)在 6 孑L板中以所示质粒转染HEK293T细胞。在转染后M小时将细胞用裂解缓冲液OOmM Tris pH7. 5、100mM NaCl、 0. 5mM EDTA、0. 5%NP-40、1%蛋白酶抑制剂Mix G(Serva,Heidelberg,Germany), ImM DTT) 在冰上孵育15分钟。在4°C下以13000rpm离心后，将上清液用偶联于琼脂糖珠(Sigma) 的抗HA-特异性抗体于4°C孵育1小时。在用Iml洗涤缓冲液(不含蛋白抑制剂混合物的裂解缓冲液)洗涤三次后，在变性条件下洗脱结合的物质并在SDSPAGE凝胶上分离并转至 PVDF 膜。用特异性抗 HA-(Covance，Berkeley，California)或 His-^jiagen)或 GFP-标签 (Santa Cruz Biotechnology)的抗体检测病毒聚合酶亚基和GFP融合蛋白。空斑减少测定本实验如&111^(11 ^2001)所述进行并进行了改进。于室温下，用溶于含BSA的PBS 中的 100PFU 的 A/WSN/33、B/Yamagata/73、A/KAN-1 或 VSV/lndiana 感染汇合的 MDCK 细胞。 在除去接种物后，用含有Oxoidagar和所示浓度肽的培养基(含有20mM Hepes.0.01% DEAE Dextran、0. 001% NaHCO3的DMEM)覆盖细胞。分别于37°C禾口 5% CO2下孵育24小时 (VSV)、48 小时(A/WSN/33,A/KAN-1)或于 33°C禾口 5% CO2 下孵育 72 小时(B/Yamagata/73) 后，将细胞用甲醛固定并用结晶紫染色。对菌斑进行计数并将水对照的平均菌斑数设为 100%。ELISA将微孔板(Pierce)在室温下用饱和浓度的肽孵育，洗涤，随后在室温下用带有 HA标签的PA孵育。为获得PA-HAJf 细胞接种于94mm培养皿中，用各质粒转染并在转染后M小时用裂解缓冲液处理，如Meyer et al. O007)中详细描述。在洗涤微孔板后，将所述孔用HA特异的一抗(Covance)孵育，然后洗涤三次，再用过氧化物酶偶联的二抗(Jackson lmmuno Research, Newmarket, UK)再孵育30分钟。在最后一步洗涤后，加入 ABTS-底物(Sigma，即用溶液)并在405nm下测定光密度。如上所述进行竞争ELISA，但是先将竞争肽加入具有结合肽的板孔中，然后再加入含有带有HA标签的PA亚基的细胞提取物。荧光偏振(FP)测定法所述测试样品包括已知的包含荧光标记的蛋白或蛋白亚基的结合对，其可通过荧光偏振根据本发明的优选实施方案来分析。这里，本发明人使用A型流感病毒聚合酶亚基 PBl——表示为前25个N-末端氨基酸——与亚基PA的相互作用。然后使所述测试样品接触候选抑制剂化合物并测定荧光偏振。所述化合物导致离解、干扰或者阻止所述蛋白或蛋白亚基结合的能力是通过荧光偏振(FP)监测的。FP量度使得可辨别结合和未结合的经荧光标记的蛋白、肽、亚基或其片段。经荧光标记的第一个片段的FP在溶液中迅速旋转，并因此具有随机的光选择性分布，其导致小的实测FP。当第一种亚基的经荧光标记的第一片段与第二种亚基——其通常为更大的、旋转更慢的分子——的该片段相互作用时，所述经荧光标记的第一片段的旋转变慢并且荧光偏振增强。因此，测试化合物对所述亚基相互作用的破坏可使所述荧光偏振降低，其指示了对所述蛋白相互作用的抑制。可将在存在测试化合物的情况下的FP量度与不存在测试化合物的情况下的FP量度进行比较。比较可由操作者手动进行，也可由计算机自动进行，特别是在使用384孔板的高通量测定法中。对于蛋白纯化，将A型流感病毒聚合酶亚基PA克隆到C末端附有6xHis接头或血凝素表位(HA)的合适表达载体中。用所述质粒转染人细胞。在转染后M小时，用裂解缓冲液(20mM TrisHCl pH 7. 5U00mM NaCl、0. 5mM EDTA、0. 5% NP-40、ImM DTT 和蛋白酶抑制剂混合物)制备细胞裂解物。为从裂解物进行纯化，将PA亚基结合于Ni-或抗-HA-琼脂糖并用没有蛋白酶混合物的裂解缓冲液进行洗涤。在用溶于20mM TrisHCl pH 7. 5、150mM NaCl、0. 5mM EDTAUmM DTT和5 %甘油中的HA-肽洗脱后，在必要时用 ViVaSpin2050K柱浓缩PA-蛋白并于-80°C下冷冻备用。解冻后，将洗脱缓冲液置换为低荧光级的试剂，同时使用IO-DG Bio-Gel柱除去任何HA-肽。将对应于A型流感病毒聚合酶亚基PBl前25个N-末端氨基酸的经荧光标记的肽以 3nM 的浓度加入到溶于 20mM TrisHCl pH 7. 5、150mM NaCl、0. 5mM EDTAUmM DTT、5%甘油和lOOmg/ml牛γ球蛋白中的10 μ M (mikroM) HA-PA中。将所述混合物分加到黑色384孔板中至总体积为每孔20 μ 1并置于冰上。加入溶于DMSO中的测试化合物至终浓度为25 μ Μ。 于室温下孵育10分钟后，用hfinite F200酶标仪(Tecan)读板。将含有测试化合物的孔的FP值与不含测试化合物、不含DMS0、只含肽的孔进行比较。序列比对使用公共流感病毒数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/ FLU/FLU. html)提供的全长序列，用EdgaH2004)中所述的MUSCLE进行比对。建模用Accelrys Discovery Mudio将突变的肽手动泊入PA (C)-PBl (N)晶体结构(He et al.，2008)，然后进行最小化。表格和附图的详细描述表Ia示出了通过竞争性ELISA测定的FluA/FluB衍生肽的抑制浓度。将竞争肽 (0. 048-3000nM)与含有来自FluA或FluB的带有HA标签的PA的细胞提取物混合。表1 列出了 12种竞争性肽。第一种肽PBIh5A是FluA野生型，第二行示出了 FluB野生型。对于3-8行的肽，字母表示FluB特异性氨基酸。9-12行列出了第6位的氨基酸既非FluA特异也非FluB特异的其他竞争性肽。S.D.示于括号中。星号表示未达到50%抑制时使用的肽的最高浓度。未在此表中列出、但在低肽浓度下可有效达到50%抑制的其他竞争性肽是 PBI1^15At61, PBI1^15At6l 和 PBIh5At^ 具有稍低抑制活性的肽为 PBIw5At6a 和 PBI1^At6m,其也未示于表Ia中。表Ia 通过竞争性ELISA测定的FluA/FluB衍生肽的抑制浓度
权利要求
1.一种合成或分离的流感病毒复制抑制肽，所述肽竞争性地抑制A型和B型流感病毒的异源三聚体病毒RNA聚合酶复合体的PA和PBl亚基的蛋白-蛋白相互作用，所述肽包含氨基酸序列，所述序列包含序列AX6X7X8X9Xici，其中)(5是？；)(6是1\￥、？、1、!1、(、1、1^、￥、八或 M ;X7是L或F 是L、I、F或M成是F、Y、W、H、L、R或S ；并且)(1(1是L、I或Y，所述氨基酸序列与野生型PBlwiA的多肽MDVNPTLLFLK具有至少60%、优选至少70%、更优选至少80% 或90%的同一性，其中不包括所述野生型PBU。
2.权利要求1的肽，包含以下氨基酸序列所述氨基酸序列与野生型PBlw5A的多肽 MDVNPTLLFLKVPAQ具有至少66%、优选至少73%、更优选至少79%、86%或93%的同一性， 其中不包括所述野生型PBU。
3.权利要求1或2的肽，包含氨基酸序列AX7X8X9Xici，其中\是T、Y、F、W、H、C、I、L或 V ;x7是L或F J8是L或I ;X9是F、Y或W并且X1。是L。
4.权利要求3的肽，包含氨基酸序列)(6X7，其中&是T、Y、F、W、H、C、I、L或V并且X7 是L或F。
5.权利要求1-4之一的肽，其中所述氨基酸序列包含15个残基&_15。
6.权利要求1-5之一的肽，包含氨基酸序列MDVNPX6X7LFLKVPAQ，其中&选自T、Y、F、 W、H、C、A、I、L、V 或 M，并且 X7 选自 L 或 F。
7.权利要求6的肽，包含选自以下的氨基酸序列MDVNPYFLFLKVPAQ、 MDVNPYLLFLKVPAQ、MDVNPffLLFLKVPAQ 或 MDVNPFLLFLKVPAQ。
8.—种流感病毒复制抑制剂，包含权利要求1-7任一项的肽作为活性成分，所述肽与细胞穿膜肽优选HIV-Tat的细胞穿膜结构域融合。
9.权利要求8的流感病毒复制抑制剂，其抑制A型和B型流感病毒株的复制。
10.一种流感预防/治疗剂，包含权利要求1-7任一项的肽作为活性成分。
11.权利要求10的流感预防/治疗剂，其可有效对抗A型和B型流感病毒株。
12.编码权利要求1-7任一项的肽的多核苷酸。
13.—种盖伦制剂，包含权利要求1-7任一项的肽和相容载体。
14.包含权利要求1-7任一项的肽的药物。
15.用于治疗流感的权利要求1-7任一项的肽。
16.权利要求1-7任一项的肽用于生产治疗流感的药物的用途。
17.一种基于ELISA或荧光偏振测定法确定流感病毒聚合酶亚基相互作用抑制剂的方法，包括使用权利要求1-7任一项的肽，其中包括所述野生型，优选作为竞争性抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一种合成或分离的流感病毒复制抑制肽，所述肽竞争性地抑制A型和B型流感病毒的PA和PB1的蛋白-蛋白相互作用；以及新的用于鉴定具有抗A型和B型流感病毒的抗病毒活性的肽的体外结合筛选。除了广为人知的A型流行性流感病毒(例如1918年“西班牙”流感或H5N1)，A型和B型病毒均是造成很多人患病和巨额医疗费用的每年再发的流行病的主要原因。令人意外的是，已发现所述新的病毒复制抑制能够抑制A型和B型流感病毒的异源三聚体病毒RNA聚合酶复合体的PA和PB1亚基的蛋白-蛋白相互作用。所述病毒聚合酶亚基相互作用结构域被证明是所述新抗病毒剂的有效靶标，因为所述三个病毒聚合酶亚基PB1、PB2和PA的正确装配为病毒RNA合成和传染性所需的。
文档编号A61K38/04GK102439028SQ200980159191
公开日2012年5月2日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者C·拉纳德希拉, D·迈尔, K·文德利希, M·施韦姆勒, U·喀斯乐 申请人:派克制药有限公司