天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途的制作方法

专利名称：：天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途
技术领域：
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背景技术：
：缺血性脑血管病(Ischemiccerebrovasculardiseases,ICVD)是脑血管疾病中最主要的病种之一，例如我国每年新发病例超过150万，死亡人数达IOO万，总患病人数在600万以上，其中约3/4的幸存者留有不同程度的后遗症，重度致残者在40X以上，故ICVD与肿瘤、心血管病并称为严重威胁人类健康的三大疾病，寻找治疗ICVD的有效药物具有重大的现实意义。缺血性脑血管病的药物治疗主要通过两个途径一为溶解血栓，二为神经保护。旨在恢复脑组织缺血区的血液供应，保护脑神经，促进神经结构重塑等。以rt-PA(重组组织型纤溶酶原激活物)为代表的溶栓药是为数不多的得到临床认可的治疗ICVD药物，但由于其治疗的时间窗太短(《3h)，理论上提倡超早期用药，而事实上在临床很难做到超早期用药，因此限制了其临床运用。当发生缺血性脑血管疾病时，由于缺氧缺血使能量代谢发生障碍，细胞膜上Na7K+泵就不能维持正常的离子梯度，细胞膜电位发生改变而导致C^+大量进入胞内，形成钙超载，促使自由基、白三烯类等毒性产物的产生，导致不可逆的线粒体损伤和炎症反应，触发细胞坏死和程序性死亡[18]。目前对于缺血性脑血管病的治疗侧重于两个环节①尽快改善和恢复缺血损伤脑组织的血液供应。②保护脑组织免受代谢毒物进一步的损害。天麻(GastrodiaelataBlume.)具有平肝息风止痉之功效，《本草纲目》记载天麻能治"瘫痪不遂，语多恍惚……"，《本草汇言》"主头风，头痛，头晕虚旋，癫痫强痉，四肢挛急，语言不顺，一切中风，风痰。"从天麻的主治症状来看，与脑缺血缺氧性损伤患者多存在的意识障碍及言语障碍，而恢复期又常有智能障碍、肢体功能障碍等症状极其相似，但其药效研究以往多集中于镇静、催眠等对中枢神经系统作用的研究，而活性成分仅见天麻素研究的报道。虽然近年来报道天麻尚有对心脑血管系统及免疫系统的药理活性，但作用机制及活性成分研究较少。现已开发的天麻产品主要用于神衰、神衰综合征及血管神经性头痛等症的治疗，但尚未发现有天麻乙酸乙酯提取物酚类成分用于缺血性脑血管病的治疗应用。
发明内容本发明的目的正是针对现有技术的不足，提供一种天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途。本发明的技术方案为1.天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途。其特征是，所述天麻乙酸乙酯提取物为天麻粉碎，用乙醇提取，减压浓縮得到醇提物后用乙酸乙酯萃取，浓縮回收乙酸乙酯后取得的部分；该部位活性成分主要为一组酚类成分。天麻乙酸乙酯提取物所含的总酚或其酚类组分、单一酚类成分用于制备治疗缺血性脑血管病的药2.根据权利要求1所述天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途，其特征是，所述成分可单独使用或作为有效成分添加在处方中与其它药物组合用于缺血性脑血管病的治疗。3.根据权利要求1所述天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途，其特征是，所述成分可以与药物载体或赋形剂组合，用于片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂等制备中的应用。上述天麻乙酸乙酯提取物可为市售天麻乙酸乙酯提取部分的总酚或其酚类组分、单一酚类成分，也可按常规方法制备为制剂。必要时，上述成分中可加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂等。本发明的药物可制成片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。研究证明，天麻乙酸乙酯提取物可明显改善脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经病学症状，縮小模型大鼠的脑梗死体积，减少神经细胞坏死；一定程度升高模型大鼠血清中SOD活性，降低MDA含量，增强模型大鼠脑组织内CaMKII的表达；有降低模型大鼠脑指数和脑组织内水分含量的趋势。其作用可能是通过减少脂质过氧化反应，减轻钙超载而起到脑保护作用，在缺血性脑血管病的预防、治疗中发挥重要作用。药效学试验第一部分天麻乙酸乙酯提取物的制备方法实验材料—.实验仪器ZDHW调温电热套北京中兴伟业仪器有限公司SHB-III循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司旋转蒸发仪EYELA二.药品与试剂天麻购自云南昭通天麻研究所，为兰科植物天麻(GastrodiaelataBlume.)的干燥块茎。乙酸乙酯SCRC国药集团化学试剂有限公司批号T20060807三.实验方法与结果天麻的提取分离、步骤见图。第二部分大鼠脑缺血再灌注损伤模型的复制与评价实验材料—.实验动物成年健康雄性(SpragueDawley，SD)大鼠，体重250_300g，SPF级，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，生产许可证号SCXK(川)2004-16。二.实验仪器分析天平PrecisaXS125A20W/200W瞬间加热陶瓷烙铁Pro'skitTHZ-82A恒温振荡器常州国华电器有限公司HJ-Z双头磁力加热搅拌器国华电器低温冰箱SANYOMoticImagesPlus2.0显微图象分析系统麦克奥迪实业集团有限公司三.药品与试剂水合氯醛分析纯天津市瑞金特化学品有限公司20061115红四氮唑(TTC)Sigma公司75%酒精医用酒精肝素注射液上海第一生化药业有限公司批号050102多聚甲醛天津市科密欧化学试剂有限公司批号200608280.1M的PBS缓冲液(K17.2-7.4)自行配制四.其他材料石蜡直径0.26mm的尼龙线日本Prodo公司实验方法与结果一.实验方法(一)栓线的制备取直径为0.26mm的进口钓鱼用尼龙线，长约5cm，分别在其两端18mm、5mm处标取熔点为56°C固体石蜡一块，加热熔化，将栓线-端5mm长的一段垂直在熔化的石蜡中迅速浸入并提起，在空气中冷却，立即凝固的石蜡可牢固的黏附在尼龙线一端的表面，尼龙线的另一端作相同的处理，用75%的酒精擦拭后置于1:2500U的肝素生理盐水中备用。(二)模型复制参照Longa、Kuga等及国内报道的方法，采用线栓法复制短暂性大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。复制方法如下:大鼠以10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，颈正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，电凝ECA分支甲状腺上动脉和枕动脉，并结扎ICA的重要分支翼腭动脉，结扎并游离ECA主干一段，用无创动脉夹分别夹闭CCA近心端和ICA颅底端，在ECA近CCA分岔处打一活结并剪一"V"形口，将制备好的尼龙线顺着ECA的"V"形口插入，将活结扎紧，松开CCA、ICA上的动脉夹，将尼龙线顺势经过CCA分岔处通过ICA入颅至大脑中动脉(MCA)，尼龙线插入深度为18-20mm(ECA与ICA分岔处为起点)，微遇阻力时停止，使尼龙线头端通过MCA起始处，到达较细的大脑前动脉，此时即完成一侧大脑中动脉阻塞(MCAO)，记录此时的时间，便于定时实施再灌注。然后缝合皮肤，切口外留lcm的线栓，MCAO后2h再灌注时缓慢的轻拉尼龙线使其头端回到颈外动脉内，即可实现大脑中动脉再灌注。拔回线栓后，大脑中动脉即可得到前交通动脉、后交通动脉供血，并且不影响颈内动脉的供血，故更有利于大脑中动脉供血区脑血流的恢复，引起再灌注。在缺血期间及再灌注后2h保持大鼠体温在(37±0.5)°C。大鼠清醒后，观察其精神功能缺失症状，在再灌注24h时处死动物。[OO52](三)评价指标1.神经病学评分右侧MCAO后2h，大鼠已清醒。参照Longa并加以改良的5分法进行评分。50分无神经功能缺损症状；1分轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空不能伸展左侧前爪；2分中度局灶性神经功能缺损，即行走向左侧转圈；3分中度局灶性神经功能缺损，即行走困难，并向左侧倾倒；4分不能自发行走，意识水平下降。2.病理学观察TTC染色观察其缺血脑组织病变。2.1TTC染色及脑梗死体积的测定缺血2h再灌注24h时，各组大鼠用10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉后，断头取脑，沿脑桥上界面切断，去除嗅球，称全脑重，立即放入-2(TC冰箱，20min后取出。由前向后做连续冠状切片，共5片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点；第二刀在视交叉处；第三刀在漏斗柄处；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。将脑切片置入0.1%TTC(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride)溶液中，后放入恒温振荡器中，37。C避光染色30min。将脑切片取出后放入4X中性多聚甲醛中固定24h，取出脑片，用数码相机拍照，用MoticImagesPlus2.0显微图象分析系统计算梗塞面积(粉红色为未受损的正常组织，而梗塞区则因线粒体损害不染色，呈白色)，由于水肿对其梗塞体积有影响，故采用公式对其修正。具体公式如下脑梗塞灶体积(mm3)=总梗塞面积X脑片厚度(2mm)水肿修正后的脑梗塞灶体积(mm3)=梗塞体积X对侧半球体积/同侧半球体积梗塞率(％)=水肿修正后的脑梗塞灶体积/双侧大脑半球体积X100%。(四)造模成功标准1.神经病学评分为13分者；2.取脑时无蛛网膜下腔出血者；3.脑组织TTC染色有缺血病理改变者。二.实验结果在该部分实验中，参照Longa、Kuga等及国内报道的方法，采用线栓法复制短暂性大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。该法建立的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型具有不开颅、损伤小、操作简单、不需要特殊设备，缺血区部位较恒定、可准确控制缺血和再灌注时间、全身影响小等优点，是目前国内外流行的模型制作方法。应用该法制作的大鼠MCA0模型神经病学症状明显，缺血侧脑组织TTC染色有病理学改变。其中，神经病学评分为1.75±0.27(分)，水肿修正后脑梗塞体积为60.35±44.40(X10—6mm3)，梗塞率为18.24%。我们复制的线栓法大鼠脑缺血再灌注损伤模型成功率为80%，方法可行，结论可靠，可用此方法复制实验用动物模型。表一大鼠MCAO模型评价数据<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>第三部分天麻乙酸乙酯提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤模型保护作用的实验研究0074]实验材料OO75]—.实验动物0076]成年健康雄性(SpragueDawley，SD)大鼠，体重250_300g，SPF级，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，生产许可证号SCXK(川)2004-16。0077]二.实验药物0078]天麻购自昭通天麻研究所，为兰科植物天麻(GastrodiaelataBlume.)的干燥块0079]0080]0081]0082]0083]0084]0085]0086]0087]0088]0089]0090]0091]0092]0093]0094]0095]0096]0097]0098]0099]0100]0101]0102]0103]0104]0105]0106]0107]0108]0109]0110]尼莫地平山西亚宝药业集团股份有限公司，批号070602天麻素南京青泽医药科技开发有限公司三.实验仪器20W/200W瞬间加热陶瓷烙铁HJ-Z双头磁力加热搅拌器DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥风电子分析天平THZ-82A恒温振荡器分体热泵型落地式房间空调高速台式离心机全自动酶标仪电热恒温干燥箱超纯水机石蜡包埋机轮式切片机石蜡摊片机HI1210Pro'skit国华电器上海一恒科学仪器有限公司PrecisaXS125A常州国华电器有限公司江苏春兰制冷设备股份有限公司昆明安谱科技有限公司昆明倍捷科技有限公司上海跃进医疗器械厂昆明倍捷科技有限公司Leica浙江金华益迪医疗设备厂LeicaMoticImagesPlus2.0显微图象分析系统麦克奥迪实业集团有限公司蜡烘片机HI1220光学显微镜四.药品与试剂水合氯醛分析纯磷酸氢二钠分析纯磷酸二氢钠分析纯氯化钠分析纯二甲苯分析纯75%酒精肝素注射液红四氮唑(TTC)多聚甲醛柠檬酸抗原修复液APEC中性树胶LeicaOlympus天津市瑞金特化学品有限公司批号20061115天津市博迪化工有限公司批号20061028中国成都金山化工试剂厂批号00000718天津市申泰化学试剂有限公司批号070703天津化学试剂有限公司批号20050300医用酒精上海第一生化药业有限公司批号050102Sigma公司天津市科密欧化学试剂有限公司批号20060828福州迈新生物技术开发公司福州迈新生物技术开发公司福州迈新生物技术开发公司S0D、MDA试剂盒CaMKII免疫组化试剂盒福州迈新蛋物技术开发公司南京建成生物工程研究所北京博奥森生物技术有限公司70%、80%、90%、无水乙醇天津市化学试剂三厂实验方法与结果—.实验方法(—)动物分组与给药将56只体重在250-300g的雄性(SpragueDawley，SD)大鼠，SPF级，随机分为7组，即假手术组、模型组、尼莫地平组(3mg/kg体重)、天麻总提物组(以下图表中简称天麻总提组，7.29g生药/kg体重，实际给药量为0.68g总提物/kg体重)、天麻乙酸乙酯提取物高剂量组(以下图表中简称乙高组，7.29g生药/kg体重，实际给药量为0.074g乙酸乙酯提取物/kg体重)和低剂量组(以下图表中简称乙低组，0.81g生药/kg体重，实际给药量为0.0083g乙酸乙酯提取物/kg体重)、天麻素组(200mg/kg体重)，给药组提前五天分别灌胃给予所给药物(1.5ml/100g)，每天一次，手术当天，于造模前0.5h给药，假手术组，模型组分别灌胃给予等量的溶媒。每组动物手术缺血2h，再灌注24h，进行各指标的测定。(二)实验内容1.天麻乙酸乙酯提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经病学的影响方法以经修改的Bederson评分法作为评分标准，具体如下(1)提尾悬空大鼠，手术对侧前肢无屈曲、腕屈及同时腕屈与肘屈分别计为0、1与2分。(2)大鼠行走路径向手术对侧无偏移、有偏移及偏移呈圆形甚至原地旋转分别计为0、1与2分。(3)剌激大鼠手术对侧颊须，反应灵敏、不灵敏及没有反应分别计为0、1与2分。(4)动物躯体向手术对侧无扭转、偶尔扭转及频繁扭转分别计为0、1与2分。(5)总分为8分。指标观察分别于再灌注6h及24h进行1次神经病学评分，以24h内2次评分的平均值作为评价指标。2.天麻乙酸乙酯提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠体质量的影响方法每组动物于手术造模前称取体质量，MCAO后24h再次称重。观察各组动物体质量的改变。指标测定体质量下降的比率=(术前体质量-24h体质量)/术前体质量X100%3.天麻乙酸乙酯提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠血清S0D、MDA的影响方法各组动物于缺血2h，再灌注24h，神经病学末次评分后，用10%水合氯醛麻醉，固定，沿颈正中切口，分离左侧颈总动脉，取血，3000r，10min离心，取血清备用。指标测定按试剂盒法操作采用比色法测定S0D、MDA。4.天麻乙酸乙酯提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑指数和脑组织水分含量的影响脑指数各组动物于缺血2h，再灌注24h，取血后，断头取脑，去除嗅球、小脑，生理盐水洗净，滤纸吸尽水分，称重。指标测定脑指数=脑湿重/体质量(mg/g)脑组织水分含量用干湿重法测定脑组织水分含量。取视交叉至视交叉与脑前极中点处切片，称取湿重，染色后，放入105°C烘箱12h烘至恒重，称取干重，计算脑组织含水量。指标测定脑组织含水量=(脑片湿重_脑片干重)/脑片湿重X100%5.天麻乙酸乙酯提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗塞体积的影响缺血2h再灌注24h时，各组大鼠用10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉后，断头取脑，沿脑桥上界面切断，去除嗅球，称全脑重，立即放入-20°〇冰箱，20min后取出。由前向后做连续冠状切片，共4片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点；第二刀在视交叉处；第三刀在漏斗柄与后叶尾极之间。将脑切片置入O.1%TTC(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride)溶液中，后放入恒温振荡器中，37t:避光染色30min。将脑切片取出后放入4%中性多聚甲醛中固定24h，取出脑片，用数码相机拍照，用MoticImagesPlus2.0显微图象分析系统计算梗塞面积(粉红色为未受损的正常组织，而梗塞区则因线粒体损害不染色，呈白色)。因为脑水肿对其梗塞体积有影响，故采用公式对其修正。具体公式如下脑梗塞灶体积(mm3)=总梗塞面积X脑片厚度(2mm)水肿修正后的脑梗塞灶体积(mm3)=梗塞体积X对侧半球体积/同侧半球体积梗塞率(％)=水肿修正后的脑梗塞灶体积/双侧大脑半球体积X100%。6.天麻乙酸乙酯提取物对脑缺血再灌注损伤大鼠模型脑组织病理改变和CaMKII表达的影响6.l标本的制备6.1.1将TTC染色后的第三片脑片，即视交叉至漏斗柄与后叶尾极之间的切片，用4%中性多聚甲醛固定2周后，用石蜡包埋制成蜡块，备用。6.1.2蜡块制备方法脑组织脱水75%、80%、90%、95%I、95%II、100%I、100%II、100%III的乙醇各30min。透明二甲苯1、二甲苯11、二甲苯III各15min。浸蜡第一缸(50—52°C)30min;第二缸(60—62°C)60min;第三缸(60—62°C)120min。包埋(1)将蜡倒入模子内，要充分倒满，标签贴于包埋盒侧面；(2)将组织放入模子内；(3)盖上包埋盒；(4)将包埋盒移在冰袋上，待冷却后移开；(5)待蜡冷却后将其从模子内取出。6.2HE染色操作步骤脱蜡二甲苯I、II、III各20-30min。亲水无水乙醇I、11，95%乙醇I、11，80%乙醇，70%乙醇各2min，流水冲洗5min。染色改良苏木素染色5min，置水中冲洗两次，流水冲洗5min，放入1%盐酸酒精分化2s，流水冲洗10min，90X乙醇亲和10s，1%伊红液染色5min。脱水70%乙醇1、11，80%乙醇，95%乙醇I、II各来回涮IO次，无水乙醇I、II各2min，无水乙醇1115min。透明100%二甲苯I、II各5min。封固中性树胶封片。指标观察正常脑组织神经元分层排列，各层界限不十分清晰，神经元的胞体、胞核及神经胶质细胞形态正常。6.3CaMKI1表达的测定(1)切片于烘片机上烘烤10min，置64"烘箱内烘烤2-3h，37"过夜。(2)脱蜡至水100%二甲苯I10min、I工5min、III5min，无水乙醇I、II、III，95%乙醇，80%乙醇，75%乙醇各3min。(3)0.OIMPBS冲洗3minX3。(4)微波修复柠檬酸抗原修复液(PH=6.0)修复，中火IO(TC，12min。(5)冷却，0.01MPBS冲洗3minX3。(6)滴加3%!1202，孵育15min。(7)0.OIMPBS冲洗3minX3。(8)滴加试剂A，室温，孵育15min，倾去，勿洗。(9)滴加一抗，37"孵育2-3h。(10)0.OIMPBS冲洗3minX3。(11)滴加试剂B，37t:孵育15min。(12)0.OIMPBS冲洗3minX3。(13)滴加试剂C，37t:孵育15min。(14)0.OIMPBS冲洗3minX3。(15)DAB(现用现配)显色，显微镜观察，自来水冲洗终止显色。(16)苏木素染核5min，取出放入自来水中涮洗几次，95X盐酸乙醇分化(放入来回涮3-5次)，自来水冲洗返蓝l-3min。(17)用滤纸把贴片周围液体吸干后进入脱水程序95%乙醇10min，无水乙醇I、II各5min，晾至近干，放入二甲苯I、II、III中各3min。(18)中性树胶封片(注加盖玻片时不能有气泡)。指标观察在10X40光学显微镜下观察每一组动物同一水肿部位，选择6个不重复视野进行观察，并做定量图像分析，测出每平方微米组织切片的阳性细胞数。阳性细胞为棕黄色，表现为胞浆着色。(三)数据处理与统计分析实验所得数据用均数±标准差(^±5)表示，运用SPSS13.0统计软件包中单因素方差分析法处理数据，方差齐者采用LSD法检验，方差不齐者采用Tamhane's法检验。二.实验结果(—)天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经病学的影响天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物高剂量、低剂量均能明显改善模型大鼠的神经病学症状，其中天麻乙酸乙酯提取物高剂量组、低剂量组与模型组比较P<0.Ol，天麻总提物组与模型组比较P<0.05。天麻素对模型大鼠的神经病学症状有改善趋势，但结果无统计学意义，PX).05。结果见表二。表二天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经病学的影响(6h(分)24h(分)平均值(分)假手术组0士00±00±0模型组6.12±0.995.75±0.715.94±0.78AA尼莫地平组4.11±1.173.33±1.323.72±1.18**天麻总提组4.75±1.164.62±0.924.69±1.00*乙高组3.11±1.543.22±1.303.17±1.30**乙低组4.78±1.094.33±0.714.56±0.85**—4:树:55--------------------—^5.00±0.兮3~-注模型组与假手术组比较AAP<0.01;给药组与模型组比较*P<0.05;给药组与模型组比较^P<0.01。(二)天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠体质量的影响天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物高剂量均能改善模型大鼠体质量的下降，其中，天麻乙酸乙酯提取物高剂量组与模型组比较P〈0.05，天麻总提物组与模型组比较P=0.062(接近0.05)。天麻素对模型大鼠体质量的下降有缓解趋势，但结果无统计学意义。结果见表三。表三天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠体质量的影响(^4,y)分组动物只数体重减少比率(只)(%)假手术组84.40±2.30模型组810.20±2.50AA尼莫地平组87.50±3.00*天麻总提组88.00±1.70乙高组87.20±2.00*乙低组89.80±1.90天麻素组88.80±2.60注模型组与假手术组比较AAP<0.01;给药组与模型组比较*P<0.05。(三)天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠血清中SOD和MDA的影响天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物、天麻素有升高模型大鼠血清SOD活性，降低MDA含量的趋势，但结果无统计学意义。其中SOD活性变化天麻乙酸乙酯提取物高剂量组、低剂量组与模型组比较P=0.080。MDA含量变化天麻乙酸乙酯提取物高剂量组、低剂量组与模型组比较P=0.088。结果见表四、表五。表四天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤模型SOD的影响(^.s)11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表五天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤模型MDA的影响(5±.s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(四)天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑指数和脑组织含水量的影响天麻乙酸乙酯提取物高剂量组与模型组比较脑指数P=0.059;脑组织内水分含量P<0.05。其余各给药组与模型组比较均能降低模型大鼠脑指数和脑组织含水量，但结果无统计学意义，结果见表六、表七。表六天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑指数的影响(；H)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注模型组与假手术组比较AAP<0.01;给药组与模型组比较*P<0.05。表七天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织水分含量的影响(动物只数脑组织水分含量(只)(%)假手术组880.46±1.40模型组882.70±2.37尼莫地平组881.26±1.98天麻总提组881.78±3.14乙高组880.20±1.06*乙低组881.99±4.78天麻素组881.00±0.87注给药组与模型组比较*P<0.05。(五)天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗塞体积的影响天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物高剂量、低剂量均能明显縮小模型大鼠的脑梗塞体积，其中天麻乙酸乙酯提取物高剂量组、低剂量组、天麻总提物组与模型组比较P<0.05，天麻素有縮小模型大鼠脑梗塞体积的趋势，但结果无统计学意义。结果见表八。表八天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤模型脑梗塞体积的的影响f分组动物只数水肿修正后脑梗塞梗塞率(只)体积(xl0-6mm3)(100%)假手术组80±00模型组877.75±45.36A△14.56尼莫地平组835.09±26.82*7.62天麻总提组836.16±28.79*8.15乙高组825.65±18.37*5.58乙低组833.99±33.66*7.38天麻素组842.28±29.989.19注模型组与假手术组比较AAP<0.01;给药组与模型组比较*P<0.05。(六)天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织病理改变和CaMKII表达的影响1.天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织病理改变的影响(HE染色)正常脑组织神经元分层排列，各层界限不十分清晰，神经元的胞体、胞核及神经胶质细胞形态正常。假手术组脑组织疏松，神经细胞轻度肿胀，细胞边缘稍微凸出。模型组脑组织疏松，神经细胞肿胀，细胞边缘稍微凸出，核偏位，着色浅淡，有时可见淡粉染的水肿液。严重者可见神经细胞坏死、消失，嗜酸性染色减弱，呈透亮的筛孔状结构，内有反应性的嗜中性粒细胞浸润，可见格子细胞(泡沫细胞)。给药组给予天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物高剂量、低剂量、天麻素后，模型大鼠脑组织的病理改变得到改善，表现为脑组织疏松，神经细胞轻度肿胀，细胞边缘稍微凸出，有轻度的嗜中性粒细胞浸润，可见少量的格子细胞(泡沫细胞)。由图片可知，其改善程度为天麻乙酸乙酯提取物高剂量>天麻乙酸乙酯提取物低剂量>天麻总提物>天麻素。2.天麻提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织CaMKII表达的影响天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物高剂量、低剂量均能明显增强模型大鼠脑组织内CaMKII表达，其中天麻总提物组与模型组比较P〈0.01，天麻乙酸乙酯提取物高剂量组、低剂量组与模型组比较P<0.05。天麻素有增强模型大鼠脑组织CaMKII表达的趋势，但结果无统计学意义。结果见表九。表九天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤模型脑组织CaMKII的表达(分组动物只数阳性细胞数(只)(个/醫2xl0-4)假手术组————1—_________________________—8.79±1.30模型组86.72±0.31AA尼莫地平组89.02'±2.20*天麻总提组810.30士1.58"乙高组810.01±2.52*乙低组88.94士2.42^天麻素组87.03±2.13注模型组与假手术组比较AAP<0.01;给药组与模型组比较*P<0.05;给药组与模型组比较**P<0.01。三.实验结论(—)由以上实验数据可以看出，天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物高剂量、低剂量能改善模型大鼠神经病学改变，减少体质量下降，改善模型大鼠的体征变化。(二)天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物有升高血清SOD活性，降低MDA含量的趋势，说明天麻提取物可能减少脂质过氧化反应，减轻自由基引起的脑缺血再灌注损伤。(三)天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物高剂量、低剂量均有降低模型大鼠脑指数和脑组织内水分含量的趋势，能在一定程度上减轻脑缺血再灌注损伤引起的脑水肿。但脑组织内水分含量部分，数据离散度大，与样本数相对较少有关。(四)天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物高剂量、低剂量均能减轻模型大鼠缺血侧脑梗塞体积，减少神经细胞坏死。(五)天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物能够改善脑缺血再灌注损伤引起的神经细胞肿胀，核偏位，嗜酸性染色和嗜中性粒细胞浸润，对缺血脑组织起到一定的保护作用。(六)天麻总提物、天麻乙酸乙酯提取物能够增强脑组织CaMKII的表达，说明天麻提取物能够减轻脑缺血再灌注损伤引起的钙超载，减少脑缺血损伤。(七)天麻乙酸乙酯提取物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑保护作用优于天麻素。与现有技术相比，上述药理试验的结果表明天麻乙酸乙酯提取物能够减轻自由基损伤和钙超载，减少氧化损伤，对神经细胞起到保护作用，从而减轻脑损伤，发挥脑保护作用，在治疗缺血性脑血管病方面具有良好的医药价值与前景。图1为本发明提取物提取工艺流程。具体实施方案天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途，其特征是，所述天麻乙酸乙酯提取物为天麻粉碎，用乙醇提取，减压浓縮得到醇提物后用乙酸乙酯萃取，浓縮回收乙酸乙酯后取得的部分；该部位活性成分主要为一组酚类成分；天麻乙酸乙酯提取物所含的总酚或其酚类组分、单一酚类成分用于制备治疗缺血性脑血管病的药物。本发明所述成分可单独使用或作为有效成分添加在处方中与其它药物组合用于缺血性脑血管病的治疗。本发明所述成分可以与药物载体或赋形剂组合，用于片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂等制备中的应用。下面结合具体实施例进一步对本发明进行阐述。实施例1:取天麻原药材共5kg，干燥粉碎至120目细粉，用95%乙醇溶液提取3次，分别为1小时、0.5小时、0.5小时，回收乙醇，得总浸膏467.7g。总浸膏用水溶解后，用乙酸乙酯按l:1.5体积萃取4次，回收乙酸乙酯，所得乙酸乙酯浸膏干燥后即得本发明的药粉51.03g;见图1。实施例2:将实施例1所得药粉10mg500mg，与淀粉10mg200mg混合均匀，加入预先配好的3%的HPMC溶液10mg500mg制成软材，1820目筛制粒，干燥后1620目整粒，加入硬脂酸镁lmg20mg，混匀后压片即得所需的片剂成品。实施例3:将实施例1所得药粉10mg500mg，与淀粉10mg200mg混合均匀，加入10%的淀粉浆制成软材，1820目筛制粒，干燥后1620目整粒，加入硬脂酸镁lmg20mg，混匀后填充普通胶囊，即得所需的胶囊成品。实施例4:取乙二醇6000100g800g与实施方案1所得药粉10g500g在水浴中加热熔化后，在6(TC85t:下滴制，液体石蜡作冷却液，即得所需的滴丸成品。实施例5:实施例1所得乙酸乙酯提取物浓縮至相对密度为1.31.33的浸膏，按浸膏1重量份，蔗糖2重量份、糊精1.3重量，制成颗粒，干燥，即得所需颗粒剂成品。实施例6:实施例l所得乙酸乙酯提取物浓縮，取蔗糖400g制成糖浆，与乙酸乙酯提取物浓縮液合并，用蒸馏水调整总量至1000ml，搅匀，滤过，灌装，每只10ml，灭菌，即得所需口服液。实施例7:取实施例1所得乙酸乙酯提取物浓縮至相对密度为1.211.25的清膏，每100g清膏加红糖200g，加热溶化，混匀，浓縮，即得所需膏剂。上述具体实施方案只是本发明的部分具体实施方案，并不构成对本发明实施范围的限定。1权利要求天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途，其特征是，所述天麻乙酸乙酯提取物为天麻粉碎，用乙醇提取，减压浓缩得到醇提物后用乙酸乙酯萃取，浓缩回收乙酸乙酯后取得的部分；该部位活性成分主要为一组酚类成分；天麻乙酸乙酯提取物所含的总酚或其酚类组分、单一酚类成分用于制备治疗缺血性脑血管病的药物。2.根据权利要求1所述天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途，其特征是，所述成分可单独使用或作为有效成分添加在处方中与其它药物组合用于缺血性脑血管病的治疗。3.根据权利要求1所述天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途，其特征是，所述成分可以与药物载体或赋形剂组合，用于片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂等制备中的应用。全文摘要天麻乙酸乙酯提取物治疗缺血性脑血管病的医药用途，本发明将天麻粉碎，用乙醇提取，减压浓缩得到醇提物后用乙酸乙酯萃取，浓缩回收乙酸乙酯后取得的部位主要为一组酚类成分；将该提取物所含的总酚或其单一酚类成分用于制备治疗缺血性脑血管病的药物；本发明的药物可制成片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂等制剂；其通过减少脂质过氧化反应，减轻钙超载而起到脑保护作用，在缺血性脑血管病的预防、治疗中可以发挥重要作用。文档编号A61P9/10GK101732586SQ20101003915公开日2010年6月16日申请日期2010年1月13日优先权日2010年1月13日发明者代蓉,何晓山,周宁娜,孙衍鲲,李秀芳,林青,淤泽溥申请人:云南中医学院