专利名称：人ski基因真核表达载体、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真核表达载体，尤其涉及人ski基因真核表达载体、制备方法及 应用。
背景技术：
组织修复、创伤愈合是由于外伤或其他因素造成皮肤等组织缺损后，局部组织通过再生、重建进行修补恢复的一系列病理生理过程。目前众多的促修复和愈合措施中，生长 因子的应用最有代表性，如TGF- β，bFGF等，但是其强烈的有丝分裂原活性在促进伤口愈 合同时可带来胶原分泌旺盛，造成瘢痕过度增生和愈合质量的下降，限制了其在临床的应 用；而在目前的瘢痕治疗中，主要是针对于已形成的瘢痕的治疗，如手术、加压、放射、类固 醇注射、干扰素、硅酮及激光等方法(周元国.加强创伤耐受性差异的分子基础研究，促进 分子创伤学的发展.创伤外科杂志2002:4(5) :257-259)，这些方法大都治疗效果不好，有 的副作用很大甚至影响修复和愈合。因此，寻求新的促修复分子，既能正向加速修复细胞增 殖、促进愈合，又能降低胶原合成、负向调节瘢痕的形成，使两个矛盾的过程协调统一，对促 进创伤愈合尤其是放创复合伤、大面积创伤、烧伤等难愈伤口愈合和具有纤维化倾向的组 织修复，降低瘢痕形成，改善修复质量有着十分重要的意义。ski是一种鸟类癌基因v-ski的细胞内同源物，首先发现于禽类动物(Li Y, Turck CM, Teumer JK, et al. J Virol. 1986 ;57 (3) 1065-72)，在不同类型的组织和细胞中分布 广泛。ski参与促进神经系统发育、造血细胞的增殖和分化、肌肉、肝分化及再生等作用 (Mizuide M，Hara T, Furuya T, et al. J Biol Chem. 2003 ；278(1) :531_6)。过去几年，我 们在国际上首先发现ski基因是一种新的创伤修复相关基因(Liu X，Zhang E，Li P，et al. Wound Repair Regen. 2006 ； 14 (2) 163-172)，具有促愈合和减轻瘢痕形成的双重作用， ski基因的这一应用前途已公开于
公开日为2005年01月12日的第ZL 200410022266. 2号 专利中。但是此质粒结构较为复杂并且没有用于人体实验的报道，因此其是否适用于临床 基因治疗还存在着很多未知的问题。为了便于临床实验和研发基因治疗药物，需要构建使 用方便、安全的Ski真核表达质粒。pUCllS结构简单，除含有1个氨苄青霉素抗性基因(Ampr)外，还有1个插入失活 的IacZ基因、自身复制起始位点和多克隆位点，具有临床使用方便、应用安全的特点，国外 已有成功将其应用与临床的报道。因此，我们以PUC118质粒为载体，酶切连接目的基因、 CMV启动子等构建pUC118-Ski真核表达质粒。
发明内容
本发明的目的在于构建一种能在皮肤组织和其它组织中表达的人ski基因表达 载体，其可以作为一种基因药物，直接进行伤口周围局部注射(或静脉注射)、涂敷，使其在 损伤组织长期、稳定、特异表达，应用于皮肤、食道、肠道等上皮组织和其他组织、器官损伤， 尤其是放创复合伤、大面积创伤、烧伤、慢性溃疡和褥疮等难愈伤口以及各种疤痕的预防和治疗，以取得较传统药物更好的疗效。本发明所述的人ski基因真核表达载体，其包含载体pUCl 18片段和人ski基因片段。其中，所述人ski基因片段为SEQ ID NO :3序列，由SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸的 引物从人皮肤原代成纤维细胞(来自临床包皮过长患者，经患者同意)总RNA中扩增获得。本发明所述的人ski真核表达载体，具有CMV启动子和BGH终止子。本发明还提供所述的人ski基因真核表达载体的制备方法，其主要包含步骤1)通过PCR从人包皮培养原代成纤维细胞总RNA中获得人ski基因片段；2)步骤1)获得的人ski基因序列经HindIII和XhoI双酶切后插入pUC118质粒 中获得载体PUC118片段；其中步骤1)中应用的扩增引物为SEQ ID NO 1~2所示的核苷酸；步骤2)还包含 在pUC118质粒上插入CMV启动子和BGH终止子。本发明所述的人ski基因真核表达载体可以应用于制备促进组织修复、伤口愈合 及抑制瘢痕形成的制剂。本发明还提供促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂，其包含上述的人 ski基因真核表达载体。所述制剂为注射液、乳剂、霜剂、膏剂或喷雾剂。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1 真核表达质粒pUC118图谱Ampr-氨苄青霉素抗性基因；kb-千碱基对；EcoR I、Xal I、和Nar I-限制性内切 酶；fIori-线状噬菌体复制起始区；pBR322 ori-大肠杆菌质粒克隆载体复制启始区；pGEX primer-谷胱甘肽转移酶(GST)基因融合系统引物；内切酶EcoR I和Nar I之间的片段为 pUCl 18的多克隆位点，目的DNA连接在插入CMV启动子和BGH终止子之间的内切酶Hindi11 和Xho I之间。图2 :ski基因被克隆到真核表达质粒PUC118上，经HindIII单酶切和 Hindlll+EcoR I双酶切鉴定图谱。图3 :pUC118-Ski转基因治疗，观察大鼠皮肤伤口愈合情况。转pUC118_Ski基因动物实验，大鼠的两侧伤口分别为注射pUC118_Ski质粒侧 和单纯创伤对照侧，从创伤后3、6、12、15天的伤口愈合情况自身对照看来，可以看出注射 pUC118-Ski质粒侧伤口愈合比单纯创伤对照侧明显加快。图4 伤口愈合后30，45天瘢痕面积情况，大鼠的两侧伤口，左侧为单纯创伤对照 侧，右侧为pUC118-Ski质粒注射侧，可以看出，pUC118-Ski质粒注射侧瘢痕面积明显比单 纯创伤对照侧小。
具体实施例方式主要试剂
1.大肠杆菌DH5 α (本实验中心保存)2.质粒pcDNA3. 0和pUC118 (大连宝生物工程有限公司)3. RNA提取试剂盒TRIzol RNA提取试剂盒(GIBCO BRL公司)4.质粒抽提试剂盒小量抽提(GFXTM Micro Plasmid Prep Kit, Pharmacia)大 量抽提(Ε. Ζ. N. A. Plasmid Maxiprep Kit, Omega)5. DNA Marker :DL 15000 (大连宝生物有限公司)6. Hind III、EcoR I、NruI、PvuII和Xho I限制性内切酶(大连宝生物生物工程 有限公司)7.电泳级琼脂糖(BI0WEST，上海YITO公司分装)8.转染试剂lipofectamine2000(invitrogen，美国)主要试剂配制1. LB培养基1000ml IOg蛋白胨，5g酵母提取物，IOgNaCl，溶解后加水至lL，pH调
至7.0，高压灭菌后，4°C保存。2.含Amp的LB固体培养基每升LB培养基加15g琼脂，高压灭菌。冷却至55°C 后，加入Amp至浓度为100μ g/ml，倾至培养基。3.0. IM CaCl2 500ml 称取无水CaCl2 11. lg，溶于400ml的双蒸水中，定容至 500ml，过滤除菌后，室温保存。4. TE 缓冲液(ρΗ8· 0) :10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，调 ρΗ8· 0。5. 10XTBE 电泳缓冲液:Tris 碱 108g，硼酸 55g，0. 5mol/L EDTA 40ml，调 ρΗ8· 0， 加水至1L。实施例1 pUC118-Ski重组质粒的构建、扩增、提取纯化l、pUC118_Ski重组质粒的构建用NruI和PvuII酶切pcDNA3. 0真核表达载体，回收含CMV启动子(真核表达启 动子)和BGH(牛生长激素)终止子的片段插入到PUC118载体上。提取人成纤维细胞中总RNA(按照TRIzol RNA提取试剂盒进行，GIBCO BRL公司)。采用RT-PCR方法扩增出人ski基因(SEQ ID NO 3所示核苷酸序列及SEQ IDNO 4所示氨基酸序列)，根据Genebank上已发表的人ski基因序列进行引物设计，并在基因上 下游分别插入酶切位点HindIII和Xho I。引物序列为上游引物5-AAGCTTCATGGAGGCGGCGG-3(SEQ ID NO 1)下游引物5-TCAAATCCGAAGTGCTCGAG-3(SEQ ID NO 2)人ski基因序列经HindIII和XhoI双酶切插入前期构建的、带有CMV启动子和 BGH终止子片段的pUC118中，构建出pUC118-Ski真核表达质粒。2、感受态细菌的制备从-70°C冰箱内取出冻存的大肠杆菌菌株DH5 α，解冻，用接种环将细菌接种到普 通LB固体培养基，置37°C培养箱内培养过夜。次日挑取单菌落接种到含5ml普通LB液体 培养基的试管中，37°C摇床150rpm振荡培养过夜。取Iml过夜菌加入含100ml普通LB液体 培养基的500ml烧瓶中，37°C振荡培养箱剧烈振荡(200rpm)培养2_3小时，至0D_ (optical density)在0. 3-0. 4。将菌液加入到50ml预冷的离心管中，冰浴10分钟，于4°C 4000rpm离心10分钟，弃上清，加入IOml冰预冷的0. IM CaCl2重悬沉淀，冰浴30分钟。如上离心， 弃上清，加入冰预冷的0. IM CaCl2 2ml重悬沉淀。菌液可直接用于转化，或分装成200 μ 1/ 管，加入70%体积的80%甘油，保存于-70°C低温冰箱备用。3、感受态细菌的转化取上述制备的感受态DH5 α 200 μ 1，室温下加入质粒DNA IOOng,对照感受态菌液 内不加质粒DNA，冰浴30分钟，42°C水浴热休克90秒，37°C水浴5分钟，迅速冰浴1_2分 钟，然后加入37°C预热的普通LB培养基lml，37°C摇床温和振荡(120rpm)复苏1小时，取 100 μ 1涂于LB固体培养基中，培养基分为含Amp (100 μ g/ μ 1)和不含Amp两种，37°C培养 过夜，以长出单菌落为转化成功。4、大量扩增先小量扩增，挑出已转化成功的质粒阳性克隆，接种于5ml含Amp的LB的液体培 养基中，150rpm，37°C培养过夜。然后大量扩增，取上菌液Iml加入500ml含Amp的LB中， 150rpm, 37°C培养过夜(16小时)。(可保存一些含质粒的菌液)5、先小剂量提取并验证扩增是否成功。按照质粒小量抽提试剂盒说明进行 (Ε. Z. N. A plasmid minprep kit, omega)。6、大量提取按照质粒大量抽提试剂盒(Ε· Z. N. Aplasmid maxiprep kit, omega)说明进行将 阳性克隆在500ml含Amp的LB的培养基扩增后，菌液离心，室温，4000g (重力加速度)，10 分钟，倾倒培养基，加入7. Oml solutionl/Rnase A的溶液，旋涡混勻，将细胞悬浮液转入 30ml的离心管中，加入7. Oml solution 2，轻柔颠倒混勻7_10次，获得清亮的裂解液，室温 敷育10分钟，加入IOml的S0luti0n3，颠倒轻柔混勻数次，直到白色絮状沉淀形成。离心， 室温，12，000g, 10分钟，小心将上清吸出，加到一个干净的HiBand DNA过滤柱中(下面接 一个50ml的离心管)，离心，室温，4，000g, 5分钟，弃滤过液，加入5ml的buffer HB到过滤 柱中，离心同上，弃滤过液，加入IOml的DNA Wash Buffer到过滤柱中，离心，室温，4，000g， 5分钟，弃滤过液。加入IOml的纯酒精，离心，室温，4，000g，5分钟，弃滤过液，再次离心同 上，干燥柱子。将过滤柱在65°C的真空烤炉中烘干后，将柱子放入一个干净的50ml的离心 管，加入1. 5ml的无菌TE，离心，室温，3，500g，5分钟，可以重复洗脱一次，或者用第一次的 洗脱液进行第二次洗脱，以获得高浓度。所得质粒-70°C保存。7、鉴定取出5 μ 1，1%的琼脂糖电泳鉴定酶切条带。酶切鉴定体系如下质粒DNA5 μ 1HindIII(EcoRI)2μ 110 X H 缓冲液2μ1H2O9μ 1_20 μ 1结果请见图2 :ski基因中具有EcoR I酶切位点而无Hind III酶切位点，因此 pUC118-Ski质粒用Hind III酶切成1条带，为载体质粒pUC118和目的基因ski约8Kb (泳 道4)，经Hind III和EcoR I酶切成两条带ski基因被酶切成两条片段，一段与载体质粒PUC118连在一起大小约4. 2Kb，另一段大小约为1. 8Kb (泳道3)。泳道2为pUC118质粒对 照，泳道1为分子量marker。8、定量在紫外分光光度计下定量。取样品1 100稀释，后在紫外分光光度计下检测，要注意0D260/280值的稳定。实施例2DUC118-Ski质粒应用于促进皮肤伤口愈合和降低愈合后瘢痕的形成1.模型制备动物=Wister大白鼠，健康状况良好，雌雄不拘，体重200 士 20g。
创伤大鼠经3%戊巴比妥钠腹腔注射(lml/mg)后，以剪毛剪剪去臀部的毛，碘 伏，酒精消毒后，以记号笔在大鼠双侧臀部对应部位各画直径为2. Ocm的圆，沿划线以眼科 剪制成一圆形切割伤，深达皮下组织全层，但勿伤及皮下筋膜层，不缝合，单笼饲养，避免感 染，如发现伤口感染应剔除。2.质粒注射采用大鼠自身对照，大鼠自身两个伤口一侧注射pUC118-Ski质粒，另一侧为空白 创伤对照(注入空PUC118质粒作对照)。注射剂量为100 μ g/每个伤口，质粒溶于生理盐 水中。注射方式为伤口周围的上、下、左、右四个点，距伤口边缘约为5mm的皮下注射，每点 注射25yg。注射时间为创伤后立即注射，每周注射一次。也可以采用将PUCllS-Ski质粒 与赋形剂联合制备成乳剂、霜剂、膏剂等制剂形式涂抹于伤口处。3.动物观察于伤后每3天测一次愈合面积，愈合后10天检测瘢痕面积并取标本用于瘢痕的观 察(免疫组化检测瘢痕的构成)。结果请参见图3A-3D、图4A_4B :pUC118_Ski重组表达体局部皮下注射后可以加 快大鼠皮肤伤口愈合速度，使注射伤口比对照伤口提前约3天愈合；尤为重要的是，应用 PUCllS-Ski的伤口，愈合后的瘢痕面积明显减小，与对照相比瘢痕内的胶原层数量减少， 而且排列有规律。采用兔耳增生性瘢痕模型转PUCllS-Ski基因治疗也验证了此结果，转 PUCllS-Ski基因后创面愈合加速，总愈合时间比对照侧缩短了 15% ；也使愈后兔耳增生性 瘢痕减小，表现为瘢痕高度和体积分别较对照下降，差异非常显著。结论pUC118_Ski具有促进伤口愈合及抑制瘢痕形成的双重作用。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术 领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明 的保护范围当视权利要求所界定者为准。
权利要求
一种人ski基因真核表达载体，其特征在于，包含载体pUC118片段和人ski基因片段。
2.根据权利要求1所述的人ski基因真核表达载体，其特征在于，所述人ski基因片段 由SEQ ID NO 3所示核苷酸构成。
3.根据权利要求1-2任一项所述的人ski基因真核表达载体，其特征在于，所述人ski 基因真核表达载体具有CMV启动子和BGH终止子。
4.权利要求1所述的人ski基因真核表达载体的制备方法，其特征在于，包含步骤1)通过PCR从人成纤维细胞总RNA中扩增获得人ski基因片段；2)步骤1)获得的人ski基因序列经HindIII和XhoI双酶切后插入pUC118载体中获 得pUC118-Ski真核表达质粒；
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中应用的扩增引物为SEQID NO 1-2所示的核苷酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)还包括在pUCl18质粒上插入CMV 启动子和BGH终止子。
7.权利要求1所述的人ski基因真核表达载体在制备促进各种伤口愈合、组织修复及 抑制瘢痕形成的制剂中的应用。
8.一种促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂，其特征在于，其包含权利要求 1所述的人pUC118-Ski真核表达载体。
9.根据权利要求8所述的促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂，其特征在 于，所述制剂制备成注射液、乳剂、霜剂、膏剂或喷雾剂。
全文摘要
本发明涉及一种人ski基因真核表达载体、制备方法及其应用。该人ski基因真核表达载体包含载体pUC118片段和人ski基因片段。本发明还涉及该人ski基因真核表达载体的制备方法及其在制备促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂中的应用。制备成基因注射液或可涂布在伤口处的制剂或利用pUC118-Ski基因注射液进行皮肤注射或与赋形剂联合制备成乳剂、霜剂、膏剂等制剂形式涂抹于损伤处，可以长期、稳定的表达出具有生物活性的Ski，具有促进组织修复、伤口愈合的同时抑制瘢痕形成的双重作用。
文档编号A61P17/02GK101818171SQ20101010642
公开日2010年9月1日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者刘苹, 周元国, 宁亚蕾, 彭艳, 李平, 杨楠, 熊仁平, 赵晓光, 赵艳, 陈星云, 陈磊 申请人:中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所